CN103130774A - 具有酪氨酸激酶抑制作用的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药化工领域，尤其涉及一种具有酪氨酸激酶抑制作用的化合物，该化合物名称为N-｛5-[5-氟-2-氧代-1,2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2,4-二甲基-1H-吡咯-3-基｝-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺，该物质具有极高的酪氨酸激酶抑制作用，同时发明人还发现上述化合物药学上可接受的盐或溶剂组合物等均具有相同的酪氨酸激酶抑制作用，具有极高的社会和科学价值。

Description

具有酪氨酸激酶抑制作用的化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药化工领域，尤其涉及具有酪氨酸激酶抑制作用的化合物，该化合物为N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺及其溶剂合物或可药用盐。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一，据世界卫生组织(WHO)统计，全世界每年死于肿瘤的患者约690万。由于生存环境和生活习性的改变，在不良环境和一些不利因素的作用下，肿瘤的发病率和死亡率近年呈逐步上升趋势。

以往对肿瘤的治疗是通过发现肿瘤并破坏来实现的，现在随着对细胞信号传导途径研究的不断深入，人们对肿瘤细胞内部的癌基因及抗癌基因的作用了解的越来越深入，针对肿瘤的特异性分子靶点设计新的抗肿瘤药物越来越受到关注，成为研究的热点领域，而靶向抗肿瘤药物作为一种新的治疗方法也已经应用于临床，并在短短几年内取得了显著的进展。现在已知，蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinases，PTK)信号通路与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和凋亡有密切关系(Sun L.，et al.，Drug Discov Today，2000，5，344-353)，利用蛋白酪氨酸激酶抑制剂干扰或阻断酪氨酸激酶通路可以用于肿瘤治疗(Fabbro D.，et al.，Curr Opin Pharmacol，2002，2，374-381)。

近年来，人们致力于抑制细胞信号转导途径以开发新型靶点抗肿瘤药物。信号转导抑制剂下调肿瘤的生存和增殖信号，促进细胞凋亡，而不是通过细胞毒作用，因此选择性较高、毒副作用较小。目前已有十多种信号转导抑制剂应用于临床治疗肿瘤，主要为酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物。其中作为多靶点的吲哚酮结构类型的化合物开发的比较成熟，如已上市的辉瑞公司的多靶点酪氨酸激酶抑制剂舒尼替尼，处于三期临床的勃林格殷格翰公司(BoehringerIngelheim)开发的BIBF-1120，还有其他SU系列化合物(Abrams TJ.Mol CancerTher.，2003，2：1011-21)等。

舒尼替尼(Sunitinib)，商品名Sutent，是辉瑞公司开发的吲哚酮类小分子多靶点RTKIs，对多种酪氨酸激酶受体有抑制作用，可同时抑制VEGFR(-1、-2、-3)、PDGFR-β、c-kit、FLT-3等靶标，通过特异性阻断这些信号传导途径来达到抗肿瘤效应，具有更显著的抑制血管生成和抗肿瘤活性。该药自2006年1月经美国FDA批准上市以来，临床疗效确切，目前已在包括美、欧、日、韩等61个国家获准上市，用于治疗经伊马替尼治疗而疾病仍在进展或不能耐受该药治疗的胃肠道基质瘤和进行性肾细胞癌。

此外，WO2008067756、WO2008138184、WO2008138232、WO2007085188、WO2005058309和WO2006002422等公开了吡咯取代的二氢吲哚酮结构类型的衍生物，具有抑制酪氨酸激酶的活性。

小分子酪氨酸激酶抑制剂作为新的靶向抗肿瘤药物，为肿瘤的治疗和预防打开了一扇新窗口，而且其副作用轻微，有良好的耐受性。虽然目前已有10多个小分子酪氨酸激酶抑制剂为临床肿瘤治疗作出了很大贡献，但仍然需要发现一些较之现有的酪氨酸激酶抑制剂具有更好的体内活性和/或改良的药理学特性的另外的化合物。因此开发新的改进的或更高效的酪氨酸激酶抑制剂，更深入地了解该类药物与已知靶蛋白之间的关系以及其发挥抗肿瘤作用的机理对肿瘤临床治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明基于上述小分子酪氨酸激酶抑制剂的研究成果，进一步需找到了一种新的具有高的酪氨酸激酶抑制作用同时具有较低毒性的新化合物，该化合物为N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺，其化学式I如下：

本发明同时公开了该化合物的制备方法。

本发明所述的该化合物的制备方法，具体包括如下步骤：

1)由3，5-甲基-2-醛基吡咯合成3，5-二甲基-4-硝基-2-醛基吡咯化合物：

由3，5-甲基-2-醛基吡咯经合适的硝化剂硝化直接合成3，5-二甲基-4-硝基-2-醛基吡咯化合物：

或者由2-位酯基取代的3，5-甲基-吡咯经先硝化后脱羧再经氧化剂氧化间接合成3，5-二甲基-4-硝基-2-醛基吡咯化合物：

2)由3，5-二甲基-4-硝基-2-醛基吡咯与5-氟吲哚-2-酮在碱性试剂中反应再经还原剂还原制得(3Z)-[(3，5-二甲基-4-氨基-1-氢吡咯-2-基)亚基甲基]-5-氟吲哚-2-酮(中间体A)：

3)由中间体A与丙烯酸经缩合剂缩合反应获得中间体B后再与哌嗪反应合成式I化合物：

或者中间体A先与丙稀酰氯反应获得中间体B，再生成式I化合物：

上述制备方法中，步骤1)中两种方法中所述的硝化剂均选自硝酸钾-浓硫酸、硝酸-浓硫酸、发烟硝酸-浓硫酸、发烟硝酸-冰醋酸；第二种方法中所采用的氧化剂选自三氯化磷、五氯化磷、高碘酸钠。

步骤2)中所述的还原剂为为硝基还原常用还原剂，选自SnCl₂浓盐酸、Zn粉醋酸、Fe粉醋酸和Pd-C催化加氢；所述的碱性试剂为四氢吡咯或4-二甲氨基吡啶或N，N-二异丙基乙胺或吡啶等，其中优选采用四氢吡咯。

步骤3)中所述的适当的缩合剂为氨基与羧酸缩合常用的缩合剂，选自N，N′-羰基二咪唑(CDI)、卡特缩合剂(BOP)或4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)。

通过上述方法制备的目标化合物，再与相应的酸反应可以制得相应的酸式盐。

同时，本发明的发明人还发现，设计一种药物组合物，其中其包含上述的N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺或其药学上可接受的盐、溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体和/或辅料，该药物组合物即可应用于酪氨酸激酶的抑制。

除此之外，发明人还公开了本发明所述的N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺、其药学上可接受的盐、所述化合物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在制备用于治疗和/或预防哺乳动物中与受体酪氨酸激酶相关疾病的药物中的用途，以及其再用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物由受体酪氨酸激酶介导的肿瘤或由受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞增殖和迁移的药物中的用途；

同时发明人还公开了一种治疗和/或预防哺乳动物中与酪氨酸激酶相关的疾病的方法，所述方法包括施用有效量的本发明的N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺、其药学上可接受的盐、所述化合物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物，或者上述的各种药物组合物。

基于该化合物的性质，还可以进一步的将本发明所述的化合物及其其药学上可接受的盐、所述化合物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物，或者上述的各种药物组合物应用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物(包括人)哺乳动物中由酪氨酸激酶介导的肿瘤或由酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞增殖和迁移的方法，以及哺乳动物(包括人)的肿瘤或癌症的方法，只需提供有效量的上述物质即可。

根据本发明，完全可以预期本发明化合物可用于治疗VEGFR或PDGFR等酪氨酸激酶敏感癌症，如VEGFR、PDGFR高表达及VEGF驱动的肿瘤，包括实体肿瘤如胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺(尤其是非小细胞肺癌)、神经元、食道、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴等的癌症，和非实体肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤等。本发明所述的衍生物能够调节蛋白激酶的活性，可以用于蛋白激酶相关性细胞功能障碍的预防和治疗，从而本发明的化合物还可以用于预防和治疗涉及异常蛋白激酶活性的功能障碍。

本发明人惊奇地发现，N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺在大鼠动脉环的试验和细胞毒性试验中证实具有较好的抑制血管新生和较低的细胞毒性。从裸鼠移植瘤试验中也发现这些化合物具有较好的体内活性，且部分化合物对肿瘤的抑制作用与阳性对照Sunitinib相当或好于阳性对照。此外，从动物的死亡率中分析，部分活性较好的化合物显示出比阳性对照Sunitinib更小的毒性。进而证实了其具有令人意外高的酪氨酸激酶抑制作用。

进一步的，本发明中合成式I化合物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以作适当改变的。或者，本领域技术人员也可以根据本发明的合成本发明未具体列举的其它式I化合物。

本发明的式I化合物可以与其它活性成分组合使用，只要它不产生其他不利作用，例如过敏反应。

本发明式I所示的活性化合物可作为唯一的抗癌药物使用，或者可以与一种或多种其他抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。

本文所用的术语“组合物”意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。

本发明的化合物可以以衍生自无机酸或有机酸的药学上可接受的盐的形式使用。词语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge，et al.，J.Pharmaceutical Sciences，1977，66：1中对药学上可接受的盐进行了详细描述。所述盐可通过使本发明化合物的游离碱官能度与合适的有机酸反应，在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备或者单独制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硫酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(异硫代硫酸盐，isothionate)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、苹果酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。同样，碱性含氮基团可用以下物质季铵化：低级烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；长链卤化物如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物如苄基溴和苯乙基溴及其他。

可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

当用于上述治疗和/或预防或其他治疗和/或预防时，治疗和/或预防有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。词语“治疗和/或预防有效量”的本发明化合物指以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。但应认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明式I化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001～1000mg/kg体重/天，例如介于0.01～100mg/kg体重/天，例如介于0.01～10mg/kg体重/天。

运用本领域技术人员熟悉的药物载体可以制备成含有效剂量的本发明化合物的药物组合物。因此本发明还提供包含与一种或多种无毒药物可接受载体配制在一起的本发明化合物的药物组合物。所述药物组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服给药、供胃肠外注射或供直肠给药。

所述的药物组合物可配制成许多剂型，便于给药，例如，口服制剂(如片剂、胶囊剂、溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射水可立即使用)。所述的药物组合物中载体包括：口服制剂使用的粘合剂(如淀粉，通常是玉米、小麦或米淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)，稀释剂(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素，和/或甘油)，润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，通常是硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇)，以及如果需要，还含有崩解剂，如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐，通常是藻酸钠，和/或泡腾混合物，助溶剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等，可注射的制剂使用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可以将其配制成肠衣片剂。

更具体地说，本发明的药物组合物可通过口服、直肠、胃肠外、池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、口颊给予人类和其他哺乳动物，或者作为口腔喷雾剂或鼻腔喷雾剂给予。本文所用术语“胃肠外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液的给药方式。

适合于胃肠外注射的组合物可包括生理上可接受的无菌含水或非水溶液剂、分散剂、混悬剂或乳剂，及供重构成无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌散剂。合适的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄榄油)、可注射有机酯如油酸乙酯及它们的合适混合物。

这些组合物也可含有辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，可确保防止微生物的作用。还期望包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等。通过使用能延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶，可达到可注射药物形式的延长吸收。

混悬剂中除活性化合物外还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或者这些物质的混合物等。

在一些情况下，为延长药物的作用，期望减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬剂来实现。这样，药物的吸收速度取决于其溶解速度，而溶解速度又可取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外给药的药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解于或悬浮于油媒介物中来实现。

可注射贮库制剂形式可通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯(polylactide-polyglycolide)中形成药物的微胶囊基质来制备。可根据药物与聚合物之比和所采用的具体聚合物的性质，对药物释放速度加以控制。其他生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯类(poly(orthoesters))和聚酐类(poly(anhydrides))。可注射贮库制剂也可通过将药物包埋于能与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

可注射制剂可例如通过用滤菌器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述固体组合物可在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质。

本发明化合物或其组合物可用口服方法或非胃肠道给药方式。口服给药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂，肠道外用药制剂有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟悉的方法制备的。为了制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的辅料，例如淀粉、明胶、阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂如水、乙醇、丙二醇、植物油(如玉米油、花生油、橄榄油等)。含有本发明化合物的制剂中还有其它辅料，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂和色素等。在片剂、胶囊剂、包衣剂、注射剂和栓剂中含有本发明式I化合物的剂量是以单元剂型中存在的化合物量计算的。在单元剂型中本发明式I化合物一般含量为1-5000mg，优选的单元剂型含有10-500mg，更优选的单元剂型含有20-300mg。具体地说，本发明可以提供的供口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的药物可接受赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物使用赋形剂例如乳糖及高分子量聚乙二醇等，也可用作软胶囊和硬胶囊中的填充物。

片剂、糖衣丸剂(dragees)、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可与包衣和壳料如肠溶衣材和医药制剂领域公知的其他衣材一起制备。这些固体剂型可任选含有遮光剂，且其组成还可使其只是或优先地在肠道的某个部位任选以延迟方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括高分子物质和蜡类。如果适合，活性化合物也可与一种或多种上述赋形剂配成微囊形式。

供口服给药的液体剂型包括药学可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型除含有活性化合物外还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇(tetrahydrofurfuryl alcohol)、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。口服组合物除包含惰性稀释剂外还可包含辅料，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香味剂。

供直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂。栓剂可通过将本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，它们在室温下为固体，但在体温下则为液体，因此可在直肠腔或阴道腔内熔化而释放出活性化合物。

本发明的化合物及其组合物还考虑用于局部给药。供局部给予本发明化合物的剂量形式包括散剂、喷雾剂、软膏剂和吸入剂。在无菌条件下将活性化合物与药学可接受的载体和任何所需的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼用制剂、眼软膏剂、散剂和溶液剂也被考虑在本发明范围内。

本发明化合物也可以脂质体形式给药。如本领域所公知，脂质体通常用磷脂或其他脂类物质制得。脂质体由分散于含水介质中的单层或多层水化液晶所形成。任何能够形成脂质体的无毒、生理上可接受和可代谢的脂质均可使用。脂质体形式的本发明组合物除含有本发明化合物外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，它们可单独或者一起使用。形成脂质体的方法是本领域公知的。参见例如Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，Volume XIV，Academic Press，New York，N.Y.(1976)，p.33。

综上所述，本发明提供的化合物及其衍生物具有极高的酪氨酸激酶抑制作用，同时发明人还发现上述化合物药学上可接受的盐或溶剂组合物等均具有相同的酪氨酸激酶抑制作用，具有极高的社会和科学价值。对更深入地了解该类药物与已知靶蛋白之间的关系以及其发挥抗肿瘤作用的机理对肿瘤临床治疗具有重要的意义。

具体实施方式

下面通过具体的制备实施例和生物学试验例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例和试验例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

在本中，除非另外说明，其中：(i)温度以摄氏度(℃)表示，操作在室温或温度环境下进行；(ii)有机溶剂用无水硫酸钠干燥，溶剂的蒸发用旋转蒸发仪减压蒸发，浴温不高于60℃；(iii)反应过程用薄层色谱(TLC)跟踪；(iv)终产物具有满意的质子核磁共振光谱(1H-NMR)和质谱(MS)数据。

实施例1

N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺的合成：

a.2-醛基-3，5-二甲基-4-硝基-1-氢吡咯的合成：

将原料2-醛基-3，5-二甲基-1-氢吡咯(5.0g，1.0e)分批加入到浓硫酸(60ml)中，温度保持在0～-5℃，红棕色澄清液，分批加入硝酸钾(4.35g，1.05e)，温度保持在-8～-2℃，加毕后，-7℃左右反应20min，升至室温反应20min，TLC检测反应完毕，将反应液加入到1500ml冰水中，析出土黄色固体，过滤，水洗至中性，干燥得灰色产物6.7g(产率98％)。

b.(3Z)-[(3，5-二甲基-4-硝基-1-氢吡咯-2-基)亚基甲基]-5-氟吲哚-2-酮的合成：

将步骤a中获得的2-醛基-3，5-二甲基-4-硝基-1-氢吡咯(0.75g，1.0e)和5-氟吲哚-2-酮(1.0g，1.2e)加入到20ml无水乙醇中，搅拌下加入四氢吡咯(1.2e)，升温回流反应，随反应进行析出橙红色固体(反应粘稠可适当补加无水乙醇)，TLC检测反应完毕，降至室温过滤，乙醇洗，乙酸乙酯洗，干燥得目标产物1.3g(产率96％)。

c.中间体A(3Z)-[(3，5-二甲基-4-氨基-1-氢吡咯-2-基)亚基甲基]-5-氟吲哚-2-酮的合成：

将步骤b中获得的(3Z)-[(3，5-二甲基-4-硝基-1-氢吡咯-2-基)亚基甲基]-5-氟吲哚-2-酮(1g)加入到乙醇/乙酸乙酯(100ml/50ml)的混合溶剂中，搅拌下加入锌粉(2.16g，约10e)，醋酸(20ml)，升至50℃反应，红棕色浑浊液，TLC检测反应完毕，降至室温，加入20ml乙酸乙酯，过滤，少量乙醇和乙酸乙酯洗。滤饼加入乙酸乙酯100ml，饱和碳酸钠洗至碱性，水洗，饱和氯化钠洗，无水硫酸钠干燥，过滤蒸干得红棕色固体0.63g(产率70％)。

1H-NMR(600MHz，DMSO-d6，δppm)：13.56(s，1H)，7.58(d，1H，J＝9.0)，7.46(s，1H)，6.79(m，1H)，6.78(m，1H)，2.24(s，3H)，2.14(s，3H).ESI-MS：[M+H]+272，[M-H]-270。

d.中间体B  N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}丙烯酰胺的合成：

氮气保护下，将中间体A(3Z)-[(3，5-二甲基-4-氨基-1-氢吡咯-2-基)亚基甲基]-5-氟吲哚-2-酮(5g，1.0e)混悬于450ml THF中，加入三乙胺(3.4g，1.8e)，混合均匀后，降温至5℃，滴入丙烯酰氯(6.7g，4e)，维持反应温度10℃左右，TLC跟踪检测至中间体A反应完毕。抽滤，滤饼依次用20ml水和20ml丙酮洗涤，真空干燥得目标产物为深黄色固体，(5.1g，产率85％)。

e.N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺(化合物I)的合成：

中间体B

氮气保护下，将中间体B N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺(1g，1.0e)溶于100ml二甲基亚砜(DMSO)中，加入无水哌嗪(16g，60e)，混合均匀后，升温至60℃搅拌反应，TLC跟踪检测至中间体B反应完毕。降至室温25℃，向反应液中加入100ml水，有大量固体析出，抽滤，真空干燥得目标产物为黄色固体，(0.96g，产率78％)。

1H-NMR(600MHz，DMSO-d6，δppm)：13.57(s，1H)，10.81(s，1H)，9.20(s，1H)，7.69(d，1H，J＝9.0)，7.66(s，1H)，6.88(m，1H)，6.83(m，1H)，2.61(t，2H)，2.42(t，4H)，2.20(s，3H)，2.17(s，3H)。

ESI-MS：[M+H]+398.3，[2M+H]+795.2。

实施例2：由(3Z)-[(3，5-二甲基-4-氨基-1-氢吡咯-2-基)亚基甲基]-5-氟吲哚-2-酮(中间体A)合成N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺(化合物I)：

a.N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}丙烯酰胺的合成：

氮气保护下，将中间体A(3Z)-[(3，5-二甲基-4-氨基-1-氢吡咯-2-基)亚基甲基]-5-氟吲哚-2-酮(0.5g，1.0e)溶于10ml二甲基甲酰胺(DMF)中，加入丙烯酸(0.15g，1.1e)，搅拌均匀后，加入4-(4，6-二甲氧基三嗪)氯化4-甲基吗啉(DMTMM)(0.6g，1.1e)，TLC跟踪检测至反应完毕，将反应液加入到500ml乙酸乙酯中，析出固体，过滤，乙酸乙酯洗，干燥，柱层析分离得到目标产物0.3g(产率51％)。

b.N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺的合成：

中间体B

氮气保护下，将中间体B N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺(1g，1.0e)溶于100ml二甲基亚砜(DMSO)中，加入无水哌嗪(16g，60e)，混合均匀后，升温至60℃搅拌反应，TLC跟踪检测至中间体B反应完毕。降至室温25℃，向反应液中加入100ml水，有大量固体析出，抽滤，真空干燥得目标产物为黄色固体，(0.96g，产率78％)。

试验例

生物学实验

可以使用以下实验来测定本发明所述化合物在体外对新生血管生成的抑制作用，对所选肿瘤细胞株的毒性作用(所有肿瘤细胞株均购自中科院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所)以及对体内裸鼠移植瘤的抑制作用。

A)对大鼠动脉环血管新生的抑制作用

该试验参考R.F.Nicosia等描述的方法进行(Nicosia，R.F.，et al.Am J Pathol.，1997，151，1379-1386)。

大鼠脱颈椎处死，小心分离胸主动脉，放入盛有生理盐水的器皿中，仔细剪掉多余的组织，用眼科剪将血管剪成1mm厚的血管环薄片，在预冷的96孔细胞培养板中，每孔中央加入1个分离好的血管环，小心加入预先融化的Matrigel胶70μl将血管环覆盖，37℃孵育1h，使其凝固。将供试品用含10％FBS的RPMI1640培养基稀释为终浓度的2倍，每孔加入70μl，放入培养箱中常规培养，每个化合物至少两个复孔，每个试验重复两次。阳性对照品Sunitinib与本发明化合物的浓度梯度设定为5、1、0.2μg/ml，并设不加本发明化合物的阴性对照孔，每3天更换新鲜培养液，同时换药。显微镜下观察血管环的存活状况，同时拍照，运用Image Pro Plus软件计算微血管所覆盖的面积，通过公式：抑制率(％)＝(面积对照孔-面积给药孔)/面积对照孔×100％，计算平均抑制率，结果见表1。

表1：本发明化合物对大鼠动脉环血管新生的抑制作用分析

B)细胞毒性试验

细胞毒性试验采用人非小细胞肺癌细胞A549、人官颈癌Hela细胞、人皮肤癌细胞A431，参考Rusnak等描述的方法进行(Rusnak D.W.，et al.，CellProlif.，2007，40，580-94)。

在含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和非必需氨基酸的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中，在37℃、5％CO2细胞培养箱中培养细胞，应用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)从细胞培养瓶中收获细胞。细胞以4000/孔(0.1ml培养基)加入96孔细胞培养板贴壁过夜，加入0.1ml待测化合物的稀释液，DMSO的最终浓度为0.25％，将细胞培养板在37℃，5％的CO2条件下温育72h。然后在显微镜下观察细胞形态的变化，然后每孔加入50％(质量/体积)的三氯乙酸(TCA)50μl固定细胞。TCA的终浓度为10％，静置5min后在4℃冰箱中放置1h，培养板各孔用去离子水冲洗5遍，以去除TCA，甩干，空气干燥至无湿迹。每孔加0.4％(质量/体积)的SRB100μl，室温放置10min，弃去各孔内液体后用1％乙酸冲洗5遍，空气干燥后用pH为10.5，10mM Trisbase(三羟甲基氨基甲烷)150μl萃取，检测540nm的吸收波长。采用Logit方法计算化合物的IC50(μM)，结果见表2。

表2：本发明化合物对三种肿瘤细胞的毒性分析

在大鼠动脉环的试验和细胞毒性试验结果表明，该发明化合物具可以较好的抑制体外新生血管的形成并且对肿瘤细胞具有较低的细胞毒性。在大鼠动脉环试验中，在0.2μg/ml的浓度下几乎完全抑制微血管的生成，活性好于或接近于阳性对照Sunitinib；在细胞毒性试验中，发现化合物的细胞毒性明显小于阳性对照Sunitinib，研究结果提示，本发明化合物能有效地抑制新生血管的生成，并且具有较低的细胞毒性，具有通过抑制肿瘤新生血管形成而抑制人体肿瘤生长的潜在抗肿瘤作用。

C)裸鼠移植瘤试验

裸鼠移植瘤试验动物选用雌性Balb/cA裸小鼠，瘤株采用人结肠癌HT29瘤株。

于无菌条件下，取生长旺盛期的瘤组织剪切成1.5mm3左右小块，接种于裸小鼠右侧腋窝下。用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至约120mm3后将动物随机分组，阳性对照组与受试化合物动物组每天灌胃给药60mg/kg，连续治疗20天，阴性对照组给予等量含0.1％Tween 80的注射用水。每周测量肿瘤直径2-3次，同时称量小鼠体重。试验中观察指标有相对肿瘤增殖率体重以及一般状态等相关毒性指标。肿瘤体积(tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b2，其中a、b分别表示肿瘤长径和短径。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为给药前测量的肿瘤体积，Vt为每次给药后测量的肿瘤体积。

抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％，TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV。

相对肿瘤生长抑制率＝(1-T/C)×100％

评价标准：相对肿瘤生长抑制率＜40％为无效，相对肿瘤生长抑制率≥40％，且统计学处理P＜0.05为有效。试验结果见表3。

表3.本发明化合物对人结肠癌SW620裸小鼠移植瘤的治疗作用分析

注：(1)RTV：相对肿瘤体积；V ave：平均肿瘤体积；Wave：裸鼠平均体重；(2)*：与对照组相比，P＜0.05；#：与阳性对照组相比，P＜0.05

从裸鼠移植瘤试验中可以发现，本发明化合物具有较好的抑制SW620体内移植瘤活性，对肿瘤的抑制作用与阳性对照Sunitinib相当。本发明化合物用药后状态较好，未见明显的毒性。

综上所述，本发明化合物在体外与体内都表现出较好的生物活性，体内抗肿瘤试验表明化合物疗效与阳性对照Sunitinib相当。结果提示，本发明的化合物可以开发成为较有前景的高效、低毒的抗肿瘤药物。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (10)

1.具有酪氨酸激酶抑制作用的化合物，该化合物包括式I所示的N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺化合物、其药学上可接受的盐、所述化合物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物：

2.一种药物组合物，其主要有效成分包含权利要求1中所述的N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺、其药学上可接受的盐、所述化合物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体和/或辅料。

3.制备权利要求1所述式I所示的N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺的方法，具体步骤如下：

1)由3，5-甲基-2-醛基吡咯合成3，5-二甲基-4-硝基-2-醛基吡咯化合物：

由3，5-甲基-2-醛基吡咯经合适的硝化剂硝化直接合成3，5-二甲基-4-硝基-2-醛基吡咯化合物：

2)由3，5-二甲基-4-硝基-2-醛基吡咯与5-氟吲哚-2-酮在碱性试剂中反应再经还原剂还原制得(3Z)-[(3，5-二甲基-4-氨基-1-氢吡咯-2-基)亚基甲基]-5-氟吲哚-2-酮(中间体A)：

3)由中间体A与丙烯酸经缩合剂缩合反应获得中间体B后再与哌嗪反应合成式I化合物：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)由3，5-甲基-2-醛基吡咯合成3，5-二甲基-4-硝基-2-醛基吡咯化合物为：

由2-位酯基取代的3，5-甲基-吡咯经先硝化后脱羧再经氧化剂氧化间接合成3，5-二甲基-4-硝基-2-醛基吡咯化合物：

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)为：

中间体A先与丙稀酰氯反应获得中间体B，再缩合生成式I化合物：

6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的硝化剂均选自硝酸钾-浓硫酸或硝酸-浓硫酸或发烟硝酸-浓硫酸或发烟硝酸-冰醋酸；所采用的氧化剂选自三氯化磷或五氯化磷或高碘酸钠。

7.根据权利要求3或5所述的制备方法，其特征在于：步骤2)中所述的还原剂为为硝基还原常用还原剂，选自SnCl₂浓盐酸或Zn粉醋酸或Fe粉醋酸和Pd-C催化加氢中的一种；步骤3)中所述的碱性试剂为四氢吡咯或4-二甲氨基吡啶或N，N-二异丙基乙胺或吡啶；步骤3)中所述的缩合剂为氨基与羧酸缩合常用的缩合剂，选自N，N′-羰基二咪唑或卡特缩合剂或4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐中的一种。

8.如权利要求1所述N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺化合物、其药学上可接受的盐、所述化合物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在制备酪氨酸激酶抑制剂中的用途。

9.如权利要求1所述N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺化合物、其药学上可接受的盐、所述化合物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在制备用于治疗和/或预防哺乳动物中与受体酪氨酸激酶相关疾病的药物中的用途。

10.如权利要求1所述N-{5-[5-氟-2-氧代-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-基}-3-(哌嗪-1-基)丙酰胺化合物、其药学上可接受的盐、所述化合物的溶剂合物、或者所述盐的溶剂合物在制备用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物由受体酪氨酸激酶介导的肿瘤或由受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞增殖和迁移的药物中的用途。