CN103073539A - 4-(取代苯氨基)喹唑啉衍生物及其制备方法、药物组合物和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及4-(取代苯氨基)喹唑啉衍生物及其制备方法、药物组合物和用途。具体地说，本发明涉及式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其中，R₁、R₂和R₃的定义如说明书中所述。本发明还涉及式I化合物的制备方法，包括它的药物组合物以及它们用于制备治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的与受体酪氨酸激酶相关的疾病或病症药物的用途。本发明的式I化合物是有效的酪氨酸激酶不可逆抑制剂。

Description

4-(取代苯氨基)喹唑啉衍生物及其制备方法、药物组合物和用途

技术领域

本发明属于医药化工领域，具体涉及一类新的具有抗肿瘤活性的4-(取代苯氨基)喹唑啉类衍生物及其制备方法，以及4-(取代苯氨基)喹唑啉衍生物在作为用于治疗或辅助治疗哺乳动物(包括人)的由受体酪氨酸激酶介导的肿瘤或受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞的增殖和迁移的药物方面的应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一，据WHO统计，全世界每年死于肿瘤的患者约690万。由于生存环境和生活习性的改变，在不良环境和一些不利因素的作用下，肿瘤的发病率和死亡率近年呈逐步上升趋势。

以往对肿瘤的治疗是通过发现肿瘤并破坏来实现的，现在随着对细胞信号传导途径研究的不断深入，人们对肿瘤细胞内部的癌基因及抗癌基因的作用了解的越来越深入，针对肿瘤的特异性分子靶点设计新的抗肿瘤药物越来越受到关注，成为研究的热点领域，而靶向抗肿瘤药物作为一种新的治疗方法也已经应用于临床，并在短短几年内得到了显著的进展。现在已知，蛋白酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinases，PTK)信号通路与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和凋亡有密切关系(Li Sun，et al.，Drug Discov Today，2000，5，344-353)，利用蛋白酪氨酸激酶抑制剂干扰或阻断酪氨酸激酶通路可以用于肿瘤治疗(Fabbro D.，et al.，CurrOpin Pharmacol，2002，2，374-381)。

近年来，人们致力于抑制细胞信号转导途径以开发新型靶点抗肿瘤药物。信号转导抑制剂下调肿瘤的生存和增殖信号，促进细胞凋亡，而不是通过细胞毒作用，因此选择性较高、毒副作用较小。目前已有十几种信号转导抑制剂应用于临床治疗肿瘤，主要为酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物，其中4-(取代苯氨基)喹唑啉结构类型的化合物开发的比较成熟，如针对表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)酪氨酸激酶靶点的小分子抑制剂吉非替尼(Iressa)、埃罗替尼(Tarceva)和拉帕替尼(Lapatinib)等。

此外，专利申请WO 96/33977、WO 97/30035、WO 98/13354、WO00/55141、WO 02/41882、WO 03/82290和EP 837063等公开了在4-位上携带苯氨基取代和在6-和/或7-位上携带取代基的某些喹唑啉衍生物，它们具有受体酪氨酸激酶活性。

然而随着激酶变异以及肿瘤耐药性的出现，第二代针对EGFR家族靶点的不可逆抑制剂应运而生。不可逆抑制剂有许多优点，如与ATP结合位点共价键结合，因此结合牢固，不需要维持较高的细胞内药物浓度，可以降低用药量，延长给药时间，降低耐药性等。目前已经处于临床III期的不可逆抑制剂有HKI-272和BIBW-2992。作为第二代针对EGFR靶点的不可逆抑制剂中的优良品种，HKI-272和BIBW-2992临床疗效确切，对第一代EGFR靶点抑制剂耐药性肿瘤依然有效，毒副作用相对较小(最大耐受剂量分别为400mg/day和90mg/day)，目前处于临床3期研究中。

小分子酪氨酸激酶抑制剂作为新的靶向抗肿瘤药物，为肿瘤的治疗和预防打开了一扇新窗口，而且其副作用轻微，有良好的耐受性。虽然目前已有10多个小分子酪氨酸激酶抑制剂为临床肿瘤治疗作出了很大贡献，但仍然需要发现一些较之现有的酪氨酸激酶抑制剂具有更好的体内活性和/或改良的药理学特性的另外的化合物，或者发现一些强大的或针对变异激酶仍然有效的抑制剂如不可逆抑制剂等。因此开发新的改进的或更高效的酪氨酸激酶抑制剂，更深入地了解该类药物与已知靶蛋白之间的关系以及其发挥抗肿瘤作用的机理对肿瘤临床治疗具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是寻找具有有效的酪氨酸激酶不可逆抑制作用的新化合物。本发明人令人意外的发现，具有式I结构的炔苯基取代的喹唑啉衍生物具有有效的酪氨酸激酶不可逆抑制作用和/或具有良好的体内药物动力学行为。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了式I化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，

R₁选自氢或N，N-二甲氨基甲基；

R₂选自四氢吡喃-4-基、N-甲基哌啶-4-基甲基、N-甲基哌啶-4-基；

R₃选自氢、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基；

n选自0～4，例如为0、1、2、3或4。

根据本发明第一方面所述的式I化合物，其中所述的卤素选自氟、氯或溴。在一个实施方案中，其中所述的卤素选自氟或氯。

根据本发明第一方面所述的式I化合物，其中所述的烷基是直链或支链的烷基基团，例如C₁-C₁₀烷基或C₁-C₆烷基。

根据本发明第一方面所述的式I化合物，其中所述的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和己基。在一个实施方案中，其中所述的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。在一个实施方案中，其中所述的烷基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基。

根据本发明第一方面所述的式I化合物，其中所述的烷氧基为C_1-6直链或支链烷氧基或一个或多个卤素取代的直链或支链烷氧基，比如甲氧基、乙氧基、三氟甲氧基，所述卤素为氟、氯或溴。

根据本发明第一方面所述的式I化合物，其中所述的卤代烷基为C_1-6直链或支链的烷基上的1个或多个氢原子被卤素取代，比如三氟甲基、三氟乙基，所述卤素为氟、氯或溴。

根据本发明第一方面所述的式I化合物，其中所述的药学上可接受的盐选自盐酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、富马酸盐、马来酸盐和苹果酸盐，或者这些盐的溶剂合物例如水合物。

根据本发明第一方面所述的式I化合物，其选自：

6-(丙烯酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

6-(丙烯酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基甲氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基甲氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

6-(丙烯酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(2-氟-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(2-氟-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基甲氧基)-N-(2-甲基-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

6-(丙烯酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基氧基)-N-(2-甲基-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

6-(丙烯酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

本发明第二方面提供了本发明第一方面所述式I化合物的制备方法，其包括以下步骤：

a)由6-硝基-7-氟-4-羟基喹唑啉在适宜的碱存在下与R₂OH反应生成相应的中间体II；

b)中间体II氯代后，与炔基取代的取代苯胺反应生成中间体III；

c)中间体III与适宜的还原剂反应得中间体IV；

中间体IV合成化合物I，可选择以下两种方法：

d)中间体IV与相应的酰氯反应生成化合物I；

或者

e)中间体IV与二乙基磷乙酸用适当的缩合剂反应生成中间体后，再与相应的醛反应生成化合物I；

其中R₁、R₂、R₃和R₄各基团具有本发明第一方面任一实施方案中所定义的含义。

根据本发明第二方面所述的制备方法，其中步骤a)中所述的适宜碱选自氢化钠、氢化钾和氢化钙、叔丁醇钾等。在一个实施方案中，所述的适宜碱为叔丁醇钾。

根据本发明第二方面所述的制备方法，其中步骤b)中所述的氯化剂可选自氯化亚砜、草酰氯、三氯化磷和五氯化磷。在一个实施方案中，所述的氯化剂为氯化亚砜。

根据本发明第二方面所述的制备方法，其中步骤c)中所述的还原剂为硝基还原常用还原剂，例如可以为SnCl₂浓盐酸、Zn粉醋酸、Fe粉醋酸、Zn甲酸铵、Fe粉甲酸铵和Pd-C催化加氢等。在一个实施方案中，所述的还原剂为Fe粉甲酸铵。在另一个实施方案中，所述的还原剂为Zn粉醋酸。

根据本发明第二方面所述的制备方法，其中步骤e)中所述的适当的缩合剂为氨基与羧酸缩合常用的缩合剂，例如可以为N，N′-羰基二咪唑(CDI)、卡特缩合剂(BOP)或4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)等。在一个实施方案中，所述的缩合剂为CDI。

在本发明第二方面的制备方法中，在必要情况下，在式I化合物制备过程中，为防止有些基团(如氨基、羟基等)发生不希望的反应，需要对这些基团予以保护，同时，在适当的时候予以去除保护基。这些实例不胜枚举，没有具体提及的保护基的使用和脱保护的方法也属于本发明的范围之内。

本发明第三方面涉及一种药物组合物，其包含本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，任选地，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明第四方面涉及本发明第一方面任一项所述的式I化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的与受体酪氨酸激酶相关的疾病或病症。

本发明第四方面还涉及本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的由受体酪氨酸激酶介导的肿瘤或由受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞的增殖和迁移。

可以预期本发明化合物可用于治疗erbB受体酪氨酸激酶敏感癌症，如EGFR或Her2高表达及EGF驱动的肿瘤，包括实体肿瘤如胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺(尤其是非小细胞肺癌)、神经元、食道、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴等的癌症，和非实体肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤等。为此，本发明上述短语“与受体酪氨酸激酶相关的疾病或病症”以及“由受体酪氨酸激酶介导的肿瘤”或“由受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞的增殖和迁移”中所涉及的肿瘤或癌症可以包括上述erbB受体酪氨酸激酶敏感癌症，如EGFR或Her2高表达及EGF驱动的肿瘤，包括实体肿瘤如胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺(尤其是非小细胞肺癌)、神经元、食道、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴等的癌症，和非实体肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤等。在本发明的一个实施方案中，所述erbB受体酪氨酸激酶敏感癌症为鳞状细胞癌；在本发明的一个具体实施方案中，所述erbB受体酪氨酸激酶敏感癌症为EGFR高表达的人鳞状表皮癌。

本发明第五方面涉及一种在有需要的哺乳动物中治疗和/或预防与受体酪氨酸激酶相关的疾病或病症的方法，该方法包括给该有需要的哺乳动物施用治疗有效量的本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

本发明第五方面还涉及一种在有需要的哺乳动物中治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的由受体酪氨酸激酶介导的肿瘤或由受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞的增殖和迁移的方法，该方法包括给该有需要的哺乳动物施用治疗有效量的本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

本发明第五方面进一步涉及一种在有需要的哺乳动物中治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的肿瘤或癌症的方法，该方法包括给该有需要的哺乳动物施用治疗有效量的本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，所述的肿瘤或癌症包括erbB受体酪氨酸激酶敏感癌症，如EGFR或Her2高表达及EGF驱动的肿瘤，包括实体肿瘤如胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺(尤其是非小细胞肺癌)、神经元、食道、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴等的癌症，和非实体肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤等。

本发明第六方面涉及用于治疗和/或预防与受体酪氨酸激酶相关的疾病或病症的药物组合物，该药物组合物包含本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，任选地，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明第六方面还涉及用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的由受体酪氨酸激酶介导的肿瘤或由受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞的增殖和迁移的药物组合物，该药物组合物包含本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，以及任选的一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明第六方面进一步涉及用于治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的肿瘤或癌症的药物组合物，该药物组合物包含本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，任选地，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，所述的肿瘤或癌症包括erbB受体酪氨酸激酶敏感癌症，如EGFR或Her2高表达及EGF驱动的肿瘤，包括实体肿瘤如胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺(尤其是非小细胞肺癌)、神经元、食道、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴等的癌症，和非实体肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤等。

本发明第七方面涉及用于治疗和/或预防与受体酪氨酸激酶相关的疾病或病症的本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

本发明第七方面还涉及用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的由受体酪氨酸激酶介导的肿瘤或由受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞的增殖和迁移的本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

本发明第七方面进一步涉及用于治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的肿瘤或癌症的本发明第一方面任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，所述的肿瘤或癌症包括erbB受体酪氨酸激酶敏感癌症，如EGFR或Her2高表达及EGF驱动的肿瘤，包括实体肿瘤如胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺(尤其是非小细胞肺癌)、神经元、食道、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴等的癌症，和非实体肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤等。

本发明第八方面涉及本发明第一方面任一项所述的式I化合物用于抑制酪氨酸激酶活性的用途。

本发明任一方面或该方面的任一项所具有的特征同样适用于其它方面或该其它方面的任一项，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。

下面对本发明作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

在本发明的式I化合物中，其中喹唑啉环可按如下示例性的顺序编号：

术语“卤素”或“卤代”是指氟、氯和溴。

本发明中所采用的术语“烷基”、“烯基”和“炔基”具有本领域公知的一般含义，它们是直链或支链的烃基基团，例如但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、烯丙基、丙烯基、丙炔基等，并且所述的“烷基”、“烯基”和“炔基”可以统称为“烃基”或“链烃基”。

在本发明合成式I化合物的方法中，反应所用的各种原材料是本领域技术人员根据已有知识可以制备得到的，或者是可以通过文献公知的方法制得的，或者是可以通过商业购得的。以上反应方案中所用的中间体、原材料、试剂、反应条件等均可以根据本领域技术人员已有知识可以作适当改变的。或者，本领域技术人员也可以根据本发明第二方面方法合成本发明未具体列举的其它式I化合物。

本发明的式I化合物可以与其它药物活性成分组合使用，只要它不产生其他不利作用，例如过敏反应。

本发明式I所示的活性化合物可以单独作为抗癌药物使用，或者可以与一种或多种其他抗肿瘤药物联合使用。联合治疗通过将各个治疗组分同时、顺序或隔开给药来实现。

本文所用的术语“组合物”意指包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。

本发明的化合物可以以衍生自无机酸或有机酸的药学上可接受的盐的形式使用。术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。所述盐可通过使本发明化合物的游离碱官能度与合适的有机酸反应，在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备或者单独制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。同样，碱性含氮基团可用以下物质季铵化：低级烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；长链卤化物如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物如苄基溴和苯乙基溴及其他。因此得到可溶于或分散于水或油的产品。可用来形成药学上可接受的酸加成盐的酸实例包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。

碱加成盐可通过使本发明化合物的含羧酸部分与合适的碱反应，在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，所述的碱例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐，或者氨或有机伯胺、仲胺或叔胺。

药学上可接受的盐还包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等，以及无毒的季铵和胺阳离子，包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙基铵、二乙基铵和乙基铵等。可用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。

本发明式I化合物还包括其异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物和酯，本发明式I化合物以及它的异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物和酯还可以形成溶剂合物，例如水合物、醇合物等。上述化合物还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术。一般来说，对于本发明的目的，与药学上可接受的溶剂如水、乙醇等的溶剂合物形式与非溶剂合物形式相当。

可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

当用于上述治疗和/或预防或其他治疗和/或预防时，治疗和/或预防有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用，或者以药学上可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。词语“治疗和/或预防有效量”的本发明化合物指以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。但应认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明式I化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001～1000mg/kg体重/天，例如介于0.01～100mg/kg体重/天，例如介于0.01～10mg/kg体重/天。

运用本领域技术人员熟悉的药物载体可以制备成含有效剂量的本发明化合物的药物组合物。因此本发明还提供包含与一种或多种无毒药物可接受载体配制在一起的本发明化合物的药物组合物。所述药物组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服给药、供胃肠外注射或供直肠给药。

所述的药物组合物可配制成许多剂型，便于给药，例如，口服制剂(如片剂、胶囊剂、溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射水可立即使用)。所述的药物组合物中载体包括：口服制剂使用的粘合剂(如淀粉，通常是玉米、小麦或米淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)，稀释剂(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素，和/或甘油)，润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，通常是硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇)，以及如果需要，还含有崩解剂，如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐，通常是藻酸钠，和/或泡腾混合物，助溶剂、稳定剂、悬浮剂、色素、矫味剂等，可注射的制剂使用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可以将其配制成肠衣片剂。

更具体地说，本发明的药物组合物可通过口服、直肠、胃肠外、池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、口颊给予人类和其他哺乳动物，或者作为口腔喷雾剂或鼻腔喷雾剂给予。本文所用术语“胃肠外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液的给药方式。

适合于胃肠外注射的组合物可包括生理上可接受的无菌含水或非水溶液剂、分散剂、混悬剂或乳剂，及供重构成无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌散剂。合适的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄榄油)、可注射有机酯如油酸乙酯及它们的合适混合物。

这些组合物也可含有辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，可确保防止微生物的作用。还期望包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等。通过使用能延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶，可达到可注射药物形式的延长吸收。

混悬剂中除活性化合物外还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或者这些物质的混合物等。

在一些情况下，为延长药物的作用，期望减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬剂来实现。这样，药物的吸收速度取决于其溶解速度，而溶解速度又可取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外给药的药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解于或悬浮于油媒介物中来实现。

可注射贮库制剂形式可通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微胶囊基质来制备。可根据药物与聚合物之比和所采用的具体聚合物的性质，对药物释放速度加以控制。其他生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯类和聚酐类。可注射贮库制剂也可通过将药物包埋于能与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

可注射制剂可例如通过用滤菌器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述固体组合物可在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质。

本发明化合物或其组合物可用口服方法或非胃肠道给药方式。口服给药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂，肠道外用药制剂有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟悉的方法制备的。为了制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的辅料，例如淀粉、明胶、阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂如水、乙醇、丙二醇、植物油(如玉米油、花生油、橄榄油等)。含有本发明化合物的制剂中还有其它辅料，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂和色素等。在片剂、胶囊剂、包衣剂、注射剂和栓剂中含有本发明式I化合物的剂量是以单元剂型中存在的化合物量计算的。在单元剂型中本发明式I化合物一般含量为1-5000mg，优选的单元剂型含有10-500mg，更优选的单元剂型含有20-300mg。具体地说，本发明可以提供的供口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的药物可接受赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物使用赋形剂例如乳糖及高分子量聚乙二醇等，也可用作软胶囊和硬胶囊中的填充物。

片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可与包衣和壳料如肠溶衣材和医药制剂领域公知的其他衣材一起制备。这些固体剂型可任选含有遮光剂，且其组成还可使其只是或优先地在肠道的某个部位任选以延迟方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括高分子物质和蜡类。如果适合，活性化合物也可与一种或多种上述赋形剂配成微囊形式。

供口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型除含有活性化合物外还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。口服组合物除包含惰性稀释剂外还可包含辅料，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香味剂。

供直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂。栓剂可通过将本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，它们在室温下为固体，但在体温下则为液体，因此可在直肠腔或阴道腔内熔化而释放出活性化合物。

本发明的化合物及其组合物还考虑用于局部给药。供局部给予本发明化合物的剂量形式包括散剂、喷雾剂、软膏剂和吸入剂。在无菌条件下将活性化合物与药学上可接受的载体和任何所需的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼用制剂、眼软膏剂、散剂和溶液剂也被考虑在本发明范围内。

本发明化合物也可以脂质体形式给药。如本领域所公知，脂质体通常用磷脂或其他脂类物质制得。脂质体由分散于含水介质中的单层或多层水化液晶所形成。任何能够形成脂质体的无毒、生理上可接受和可代谢的脂质均可使用。脂质体形式的本发明组合物除含有本发明化合物外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，它们可单独或者一起使用。形成脂质体的方法是本领域公知的。

本发明人意外地发现，结构式I所示的喹唑啉衍生物对EGFR和Her2酪氨酸激酶都显示了抑制活性，同时，对EGFR和Her2酪氨酸激酶高表达的细胞株有抑制作用，因此，本发明的化合物可用于EGFR和Her2受体酪氨酸激酶单独或部分介导的疾病，主要通过抑制一种或多种EGFR家族酪氨酸激酶，并通过抑制激酶的活性产生抗增殖、抗迁移、促凋亡作用。具体地说，本发明的化合物可通过对EGFR和Her2酪氨酸激酶的抑制作用，用于预防和治疗一种或多种erbB受体酪氨酸激酶敏感的肿瘤，尤其是EGFR或Her2高表达及EGF驱动的肿瘤。包括实体肿瘤如胆管、骨、膀胱、脑/中枢神经系统、乳房、结直肠、子宫内膜、胃、头和颈、肝、肺(尤其是非小细胞肺癌)、神经元、食道、卵巢、胰腺、前列腺、肾脏、皮肤、睾丸、甲状腺、子宫和外阴的癌症，非实体肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤。

具体实施方式

下面通过具体的制备实施例和生物学实验进一步说明本发明，但是，应当理解，这些实施例和生物学实验仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应将其理解为用于以任何形式限制本发明。

虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，所用的材料和操作方法是本领域公知的。

在本发明中，除非另外说明，其中：(i)温度以摄氏度(℃)表示，操作在室温或温度环境下进行；(ii)有机溶剂用无水硫酸钠干燥，溶剂的蒸发用旋转蒸发仪减压蒸发，浴温不高于60℃；(iii)反应过程用薄层色谱(TLC)跟踪；(iv)终产物具有满意的质子核磁共振光谱(¹H-NMR)和质谱(MS)数据。

实施例1：6-(丙烯酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物1)的合成

化合物1

a.N-(3-乙炔基苯基)-6-硝基-7-(四氢吡喃-4-基氧基)喹唑啉-4-胺 的合成

Step 1.6-硝基-7-(四氢吡喃-4-基氧基)喹唑啉-4-醇(中间体A) 的合成：

3L三口瓶中加入四氢吡喃-4-醇47.2g(2eq)，四氢呋喃2L，机械搅拌。室温下分批加入叔丁醇钾(138g，2eq)，加完后室温反应0.5h，向体系中分批加入原料7-氟-6-硝基喹唑啉-4-醇(100g)，加完后升温60℃反应9h，TLC检测原料剩余基本反应完全，将反应液冷至室温，向反应溶液中加水2L，浓盐酸调pH＝5～6，向体系中加入二氯甲烷500ml，有固体析出，室温搅拌1h，抽滤，60℃烘干得淡黄色固体，后用CHCl₃打浆，抽滤干燥后得中间体A(125.6g，收率90.1％)。

Step 2～3.N-(3-乙炔基苯基)-6-硝基-7-(四氢吡喃-4-基氧基)喹唑 啉-4-胺的合成(中间体B)的合成：

3L三口瓶中加入中间体A(125g)，乙腈1.5L，机械搅拌及氮气保护下，降温至0℃后滴加三氯氧磷(246g，4eq)，后慢慢滴加TEA(182g，4.5eq)，滴完后升温80℃，TLC检测原料消失，在该温度下向反应体系中加入3-乙炔苯胺(2eq)，继续搅拌，TLC跟踪检测，约6h反应完全，抽滤得淡黄色固体，滤饼用水分3次洗涤打浆。烘干得淡黄色固体中间体B(114.4g，收率72.8％)。

b.N-(3-乙炔基苯基)-6-硝基-7-(四氢吡喃-4-基氧基)喹唑啉-4-胺 的合成

Step 4.N-(3-乙炔基苯基)-6-氨基-7-(四氢吡喃-4-基氧基)喹唑啉-4- 胺的合成(中间体C)的合成：

3L三口瓶中加入中间体B 115g，乙醇1000ml，水300ml，机械搅拌下向体系中加入还原Fe粉64g(4eq)，氯化铵61.4g(4eq)升温80℃，TLC检测反应完全，反应过程中颜色由绿色逐渐变成红色，冷却，加入珍珠盐抽滤，固体用乙醇洗涤三次，氯仿洗涤三次，滤液加水(400ml)，用氯仿萃取三次(500mlx3)，合并有机相，水洗、饱和氯化钠洗、无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩得绿色固体，用PE/EtOAc打浆，过滤，50℃烘干得黄绿色固体中间体C(73.3g，收率71.1％)。

Step 5.6-(丙烯酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物1)的合成：

取N-(3-乙炔基苯基)-6-氨基-7-(四氢吡喃-4-基氧基)喹唑啉-4-胺的合成(中间体C)7.2g(20m mol)混悬于400ml乙腈和20ml的NMP的混合溶液中，降温至-5℃以下，滴加丙烯酰氯的乙腈溶液，TLC实时检测，至原料完全消失，加入10ml水萃灭，室温减压浓缩至不再有溶剂蒸出，300ml水稀释，冰的氢氧化钠溶液调PH＝6～8，有大量固体析出，过滤，滤液用等量乙酸乙酯萃取3次，干燥浓缩后，与滤饼合并柱层析得目标产物为黄绿色颗粒状晶体3.3g(40％产率)。

¹H-NM(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：9.78(s，1H)，8.96(s，1H)，8.63(s，1H)，7.95(s，1H)，8.01(s，1H)，7.87(d，1H，J＝7.8Hz)，7.39(t，1H，J＝8.4Hz)，7.25(s，1H)，7.20(d，1H，J＝8.4Hz)，6.76(dd，1H，J＝10.2Hz，J＝17.2Hz)，6.33(dd，1H，J＝2.4Hz，J＝17.2Hz)，5.82(t，1H，J＝10.2Hz)，4.95(m，1H)，4.22(s，1H)，3.92(m，2H)，3.55(m，2H)，2.06(m，2H)，1.77(m，2H)。

MS(m/z)：[M+H]⁺415.1。

实施例2：(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物2)的合成

化合物2

a.(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺的合成

Step 1.2-(4-(3乙炔基苯胺基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)喹唑啉6- 氨基)-2-氧代乙基磷酸酯(中间体D)的合成：

将二乙基磷乙酸(3.92g，1eq)和120ml四氢呋喃加入三口瓶中，机械搅拌室温条件下加入CDI(6.4g，2eq)，加入过程中有大量气泡产生，加完后室温反应2h，定为溶液A.

将N-(3-乙炔基苯基)-6-氨基-7-(四氢吡喃-4-基氧基)喹唑啉-4-胺(中间体C，合成方法见实施例1)(7.2g，1eq)加入30ml四氢呋喃中，室温搅拌混合溶解，定为溶液B，将溶液B分批加入溶液A中，加完后溶液变澄清，室温搅拌过夜。

有类白色固体析出，TLC检测原料消失，加入CHCl₃150ml，该有机相用水洗三次，饱和氯化钠洗一次，无水硫酸镁干燥，过滤，蒸干得灰色固体，用乙酸乙酯打浆得灰白色固体6.8g，乙酸乙酯蒸干后再次打浆得1.4g，共得产物8.2g(收率76％)。

Step 2.(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺的合成

三口瓶中加入中间体D(6g，1eq)，无水乙醇60ml，机械搅拌下加入氯化锂0.5g(1.05eq)，降温至-5℃，向体系中滴加3.2g(5eq)氢氧化钾的水溶液(15ml)，加完后再滴加2-二甲胺基-1-羟基乙磺酸钠盐5(3.1g，1.4eq)水溶液(40ml)，2.5h后TLC检测原料消失，向体系中加入纯化水50ml，机械搅拌，有固体析出，降温3℃，搅拌0.5h，抽滤，50℃烘干得黄色固体，后用EtOH/H2O(V/V＝1∶1)重结晶，得黄色固体4.5g(收率85％)，HPLC纯度97.3％。

¹H-NM(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：9.78(s，1H)，8.93(s，1H)，8.60(s，1H)，7.97(s，1H)，7.85(d，1H，J＝7.8Hz)，7.41(t，2H)，7.24(d，1H，J＝7.8Hz)，4.96(m，1H)，6.80(m，2H)，4.22(s，1H)，3.99(d，2H，J＝5.4Hz)，3.90(m，2H)，3.58(m，2H)，2.83(s，6H)，2.06(m，2H)，1.76(m，2H)。

ESI-MS(m/z)：[M+H]⁺472.3。

实施例3：6-(丙烯酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基甲氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物3)的合成

化合物3

与实施例1类似的合成方法，以1-甲基-4-哌啶甲醇为原料，可以 得到桔黄色固体化合物3(45％产率)。

¹H-NM(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：9.80(s，1H)，9.63(s，1H)，8.89(s，1H)，8.55(s，1H)，8.02(s，1H)，7.85(d，1H，J＝7.8Hz)，7.39(t，1H，J＝8.4Hz)，7.29(s，1H)，7.21(d，1H，J＝8.4Hz)，6.84(dd，1H，J＝10.2Hz，J＝17.2Hz)，6.32(dd，1H，J＝2.4Hz，J＝17.2Hz)，5.82(t，1H，J＝10.2Hz)，4.24(s，1H)，4.10(d，2H)，2.62(s，3H)，1.92(m，2H)，1.56(m，2H)。

ESI-MS(m/z)：[M+H]⁺422.4。

实施例4：（E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基甲氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物4)的合成

化合物4

以1-甲基-4-哌啶甲醇为原料，与化合物2类似的制备方法，可以得到化合物4(39％产率)，为棕黄色块状固体，略发粘。

ESI-MS(m/z)：[M+H]⁺499.3。

实施例5：6-(丙烯酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(2-氟-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物5)的合成

化合物5

与化合物1的制备类似的方法，以四氢吡喃-4-醇和2-氟-5-炔基苯胺为原料，可以得到化合物5(31％产率)，为黄色固体。

¹H-NM(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：9.95(s，1H)，9.58(s，1H)，8.95(s，1H)，8.56(s，1H)，8.39(dd，1H，J＝3.0Hz，J＝6.0Hz)，8.18(m，1H)，7.55(t，1H，J＝9.0Hz)，7.27(s，1H)，6.76(dd，1H，J＝10.2Hz，J＝16.8Hz)，6.33(dd，1H，J＝1.8Hz，J＝17.4Hz)，5.82(dd，1H，J＝1.2Hz，J＝9.6Hz)，5.31(d，1H，J＝2.4Hz)，4.21(s，1H)，3.91(m，2H)，3.56(m，2H)，2.06(m，2H)，1.76(m，2H)。

MS(m/z)：[M+H]⁺433.2。

实施例6：(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(2-氟-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物6)的合成

化合物6

与化合物2的制备类似的方法，以四氢吡喃-4-醇和2-氟-5-炔基苯胺为原料，可以得到化合物6(63％产率)，为黄色块状固体。

ESI-MS(m/z)：[M+H]⁺490.3。

实施例7：(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基甲氧基)-N-(2-甲基-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物7)的合成

化合物7

与化合物2的制备类似的方法，以四氢吡喃-4-醇和2-甲基-5-炔基苯胺为原料，可以得到化合物7(87％产率)，为黄色颗粒状晶体。

ESI-MS(m/z)：[M+H]⁺486.4。

实施例8：6-(丙烯酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基氧基)-N-(2-甲基-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物8)的合成

化合物8

与化合物1的制备类似的方法，以四氢吡喃-4-醇和2-甲基-5-炔基苯胺为原料，可以得到化合物8(38％产率)，为黄色粉末。

MS(m/z)：[M+H]⁺429.2。

实施例9：(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物9)的合成

化合物9

与化合物2的制备类似的方法，以1-甲基-4-哌啶醇为原料，可以得到化合物9(57％产率)，为黄色块状固体。

¹H-NM(600MHz，DMSO-d₆，δ_ppm)：9.73(s，1H)，9.44(s，1H)，8.89(s，1H)，8.52(s，1H)，8.01(s，1H)，7.88(dd，1H)，7.38(t，2H)，7.32(s，1H)，7.19(d，1H，J＝7.2Hz)，6.80(m，1H)，6.56(d，1H，J＝15.6Hz)，4.72(m，1H)，4.20(s，1H)，3.36(broad s，2H)，3.09(d，2H，J＝5.4Hz)，2.64(m，2H)，2.26(m，1H)，2.20～2.19(s，9H)，2.00(m，2H)，，1.81(m，2H)。

ESI-MS(m/z)：[M+H]⁺485.3。

实施例10：6-(丙烯酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺(化合物10)的合成

化合物10

与化合物1的制备类似的方法，以1-甲基-4-哌啶醇为原料，可以得到化合物10(29％产率)，为黄色固体。

ESI-MS(m/z)：[M+H]⁺428.2。

生物学实验

可以使用以下试验来测定本发明所述化合物对EGFR酪氨酸激酶的抑制作用以及在体内对EGFR高表达的人鳞状表皮癌A431细胞株裸鼠移植瘤的生长抑制作用。

A)EGFR激酶活性分析

体外激酶分析用Cell Signaling Technology公司的HTScan EGFReceptor Kinase Assay Kit(#7909)检测。操作步骤参照试剂盒说明书，该方法在体外检测待测化合物对EGFR受体酪氨酸激酶对底物肽磷酸化的抑制作用。室温下激酶反应缓冲液中温育ATP和底物肽以及待测化合物，孵育一段时间后，加入终止液终止反应并将样品转移到链霉亲和素包被的96孔板中，洗板并用HRP标记的抗底物磷酸化抗体检测底物肽上的磷酸化水平，用TMB显色，2M硫酸中止反应。检测450nm吸收波长，计算IC₅₀值(μM)。结果如表1所示。

表1：本发明化合物对EGFR激酶活性的抑制作用

测试物	IC50(μM)
		化合物1	0.121
化合物2	0.006
		化合物3	0.008
化合物4	0.01
		化合物5	0.10
化合物6	0.26
		化合物7	0.001
化合物8	0.032
		化合物9	0.008
化合物10	0.105

从实验结果可以看出，本发明化合物能够有效抑制EGFR受体酪氨酸激酶对底物肽的磷酸化作用，并且具有较高的生物活性。

B)本发明化合物对A431细胞表面EGFR磷酸化的抑制作用分析

人表皮生长因子受体(EGFR)磷酸化测定采用Western Blot方法，该方法检测本发明化合物对EGFR磷酸化活化的抑制作用。

A431细胞在含10％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺和非必需氨基酸的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养细胞，应用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)从细胞培养瓶中收获细胞。细胞以20000/孔(1ml培养基)加入24孔细胞培养板在37℃、5％CO₂细胞培养箱中贴壁培养48小时，换含不同浓度待测化合物的新鲜培养基，DMSO的最终浓度为0.25％，将细胞培养板在37℃，5％的CO₂条件下温育2h，然后收集细胞。细胞用1×SDS凝胶上样缓冲液(50mMTris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT，2％SDS，10％甘油，0.1％溴酚蓝)裂解。细胞裂解物在沸水浴中加热变性。

取上清液进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用半干转膜系统将蛋白转移至NC膜(Millipore，USA)，将NC膜置于封闭液中4℃过夜，然后将膜分别与I抗、II抗反应。洗膜后，用ECL试剂发光，压片，显影，底片上条带的强度表明对EGFR磷酸化抑制作用强弱，结果如表2所示。

表2：本发明化合物对A431细胞表面EGFR磷酸化的抑制作用分析

测试物	IC50
		化合物1	+++
化合物2	++++
		化合物3	+++
化合物4	++++
		化合物5	+++
化合物6	+++
		化合物7	+++

化合物8	+++
		化合物9	++++
化合物10	++

(IC₅₀：++++表示浓度在1～10nM；+++表示浓度在10～100nM；++表示浓度在100～1000nM；+表示浓度＞1000nM)

从上述实验结果中可以看到，本发明化合物具有较强的生物学活性，许多化合物在nM水平就能有效抑制酪氨酸激酶的活性。

C)体内药效评价

BALB/cA裸小鼠，雌性，4～6周龄，体重22±2g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，SPF级环境饲养。

将体外培养的A431细胞接种于裸鼠右侧腋窝皮下，每只约接种5×10⁶个细胞，成瘤后体内传代两次。无菌条件下，取生长旺盛的瘤组织修剪成1.5mm³左右的瘤块，接种于裸小鼠右侧腋窝下。用游标卡尺测量瘤径，待肿瘤生长至100～200mm³后将动物随机分组。化合物2、4、9及阳性对照给药剂量为20mg/kg，灌胃给药，每天一次，连续14天(d14)，阴性对照组给等量溶剂(药用蓖麻油∶乙醇∶注射用水＝1∶1∶8(体积比))。给药期及恢复期间，每周测量小鼠体重和瘤径2～3次。根据测量数据计算肿瘤体积和相对肿瘤体积，肿瘤体积(tumorvolume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a×b²，其中a、b分别表示肿瘤长径和短径。据测量的结果计算出相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝Vt/V0。其中V0为试验开始时的肿瘤体积，Vt为每一次测量的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率T/C(％)，计算公式如下：T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％，T_RTV为治疗组RTV；C_RTV为阴性对照组RTV，相对肿瘤生长抑制率(抑瘤率)％＝(1-T/C)×100％。结果如表3所示。

表3.本发明化合物对A431裸小鼠移植瘤的治疗作用(

n＝8)

注：(1)与阳性对照组相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

(2)d₁₄：末次给药时间。

(3)阳性对照药物：N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺。

结果显示：化合物2、4、9的抑瘤率(连续给药14天后的肿瘤抑制率分别为92.8％、78.2％、95.1％)，好于阳性对照(71.9％)。化合物2和9给药组全部出现肿瘤消退，阳性对照组2只出现肿瘤消退。

以上体内实验结果显示，本发明化合物对酪氨酸激酶驱动的肿瘤具有较好的抑瘤效果。

Claims (10)

1.式I化合物：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，

其中，

R₁选自氢或N，N-二甲氨基甲基；

R₂选自四氢吡喃-4-基、N-甲基哌啶-4-基甲基、N-甲基哌啶-4-基；

R₃选自氢、卤素、烷基、烷氧基和卤代烷基；

n选自0～4。

2.权利要求1所述的式I化合物，其中所述的卤素选自氟、氯或溴。

3.权利要求1所述的式I化合物，其中所述的药学上可接受的盐选自盐酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、富马酸盐、马来酸盐和苹果酸盐。

4.权利要求1所述的式I化合物，其选自下组化合物：

6-(丙烯酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

6-(丙烯酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基甲氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基甲氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

6-(丙烯酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(2-氟-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(四氢吡喃-4-基氧基)-N-(2-氟-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基甲氧基)-N-(2-甲基-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

6-(丙烯酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基氧基)-N-(2-甲基-5-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

(E)-6-(4-(二甲氨基)巴豆酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

6-(丙烯酰氨基)-7-(N-甲基哌啶-4-基氧基)-N-(3-乙炔基苯基)喹唑啉-4-胺；

或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

5.制备权利要求1所述的式I化合物的方法，其包括以下步骤：

a)由6-硝基-7-氟-4-羟基喹唑啉在适宜的碱存在下与R₂OH反应生成相应的中间体II；

b)中间体II氯代后，与炔基取代的取代苯胺反应生成中间体III；

c)中间体III与适宜的还原剂反应得中间体IV；

中间体IV合成化合物I，可选择以下两种方法：

d)中间体IV与相应的酰氯反应生成化合物I；

或者

e)中间体IV与二乙基磷乙酸用适当的缩合剂反应生成中间体后，再与相应的醛反应生成化合物I；

其中R₁、R₂、R₃和R₄各基团的定义同权利要求1。

6.权利要求5所述的方法，其中步骤a)中所述的适宜碱选自氢化钠、氢化钾和氢化钙、叔丁醇钾；和/或

步骤b)中所述的卤化剂可选自氯化亚砜、草酰氯、三氯化磷和五氯化磷；和/或

步骤c)中所述的还原剂选自SnCl₂浓盐酸、Zn粉醋酸、Fe粉醋酸、Zn甲酸铵、Fe粉甲酸铵和Pd-C催化加氢；和/或

步骤e)中所述的适当的缩合剂选自N，N′-羰基二咪唑(CDI)、卡特缩合剂(BOP)和4-(4，6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐(DMTMM)。

7.一种药物组合物，其包含权利要求1至6任一项所述的式I化合物或其药学上可接受的盐或溶剂合物，任选地，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

8.权利要求1至6任一项所述的式I化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的与受体酪氨酸激酶相关的疾病或病症。

9.权利要求1至6任一项所述的式I化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或辅助治疗和/或预防哺乳动物(包括人)的由受体酪氨酸激酶介导的肿瘤或由受体酪氨酸激酶驱动的肿瘤细胞的增殖和迁移。

10.权利要求1至6任一项所述的式I化合物用于抑制酪氨酸激酶活性的用途。