CN103127530B - 靶向β淀粉样蛋白显像剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向β淀粉样蛋白显像剂在制备诊断阿尔茨海默病疾病中的应用，所述的靶向β淀粉样蛋白显像剂包括(1-{6-[(丁二酸单乙酯基)(甲基)氨基]-2-萘基}乙叉)丙二腈修饰的磁性纳米颗粒。本发明的靶向β淀粉样蛋白显像剂与缠结Aβ(1～40)具有很强的结合能力，因而能特异识别老年斑。结合MRI检查，可特异显示β淀粉样蛋白，从而靶向早期检测AD。

Description

靶向β淀粉样蛋白显像剂的应用

技术领域

本发明属于显像剂领域，具体涉及一种靶向β淀粉样蛋白显像剂的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)以德国精神病学家Alois Alzheimer名字命名的疾病，是一种退变性脑神经系统疾病，是老年痴呆的主要类型，主要临床表现为记忆力逐渐减退、时间空间定向能力减弱、自理能力丧失，性格淡漠孤僻以及认知功能障碍等，晚期患者可危及生命^[1-5]，对老年人的生活质量和身体及心理健康产生了严重的影响。随着科学的发展，社会的进步，人们生活水平提高，生活条件也得到了很大的改善，医疗技术不断发展进步，以致世界人均寿命延长，老年人人口数量也迅速增长，总人口大于60岁人口比例逐年增长，因此，AD死亡率和患病率也逐年上升，给社会和家庭造成了非常沉重的负担。流行病学研究结果表明，老年痴呆已成为发达国家仅次于癌症、中风、心脏病之后引起老年人死亡的第4位死因。

近年来，全世界大约有数千万老年人正在遭受AD的折磨，普遍发生于世界各个国家、地区。据美国对AD患者的调查研究表明，在美国大约有450万老年人患有阿尔茨海默病，其中65岁以上患病率为10％，70岁以上患病率为15％，85岁以上患病率为30％。截止2011年，据不完全统计，中国患病人数为600万-800万以上，占世界所有患病人数的四分之一，至2050年，世界患AD的人数可能会增加2倍。据美国卫生和公众服务部调查，2012和2013年，财政部将达到一个难以置信的数据1.3亿美元用于AD治疗的研究，比当前每年用于老年痴呆症研究预算又增加了25％以上，给社会带来了沉重的经济负担。

AD临床表现比较隐匿，病程缓慢，逐渐发展且不可逆，偶伴有间歇性，发病后15-25年因各种并发症而导致死亡^[15]。其发病早期症状与其他痴呆相似，例如：抑郁症引起的假性痴呆、血管性痴呆及其他原因(中毒、脑积水、脑外伤)引起的痴呆，往往容易被患者及家人忽视，难以确定病期，等痴呆症状明显时治疗，已属晚期，治疗效果较差，所以早期诊断AD显得尤为重要。

目前，AD发病机理的研究表明，细胞外β-淀粉样斑块沉积(又称老年斑)和细胞内神经纤维缠结是AD临床上两个主要的病理特征，其中脑组织中β-淀粉样蛋白(β-Amyloid，Aβ)的大量沉积是导致AD的核心所在。近年来，随着医学技术的发展和对AD致病原理研究的深入，分子影像学例如PET、SPECT、MRI等广泛应用于AD的早期诊断，从而对靶向Aβ分子显影剂的设计与合成成为了科学研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向β淀粉样蛋白显像剂的制备方法，本发明所制备的显像剂粒径小，有利于穿透血脑屏障，并且分布均匀，稳定性强。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明涉及靶向β淀粉样蛋白显像剂在制备诊断阿尔茨海默病显像剂中的应用，其特征在于所述的现象剂包括式1所示的化合物修饰的磁性四氧化三铁纳米颗粒

式1。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的阿尔茨海默病是β-淀粉样蛋白(β-Amyloid，Aβ)的沉积所引发的阿尔茨海默病。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述制备诊断阿尔茨海默病显像剂中包括磁铁。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的靶向β淀粉样蛋白显像剂X射线衍射峰在2θ＝30.39°、35.78°、43.44°、53.72°、57.46°和62.73°处具有特征峰。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的靶向β淀粉样蛋白显像剂在室温下至少能稳定存在七天以上。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的靶向β淀粉样蛋白显像剂的制备包括如下步骤：

(1)制备油酸修饰的四氧化三铁纳米离子：采用高温热分解法，以三乙酰丙酮铁为铁源，以二苄醚为有机溶剂，1，2-二羟基十六烷为还原剂，油酸油胺为表面活性剂，在180-220℃下加热1-3小时，将有机金属前驱体部分Fe³⁺还原为Fe²⁺，再加热到280-320℃下回流0.5-1.5小时，合成平均粒径为5-7nm的油酸修饰的四氧化三铁纳米粒子；

(2)合成靶向β淀粉样蛋白显像剂：利用配体交换反应，使式1所示的化合物与油酸修饰的四氧化三铁纳米粒子表面的油酸进行配体交换，得到目标化合物5修饰的四氧化三铁纳米粒子，然后将化合物修饰的四氧化三铁纳米粒子配制成显像剂。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的化合物修饰的四氧化三铁纳米粒子的平均粒径在10-13nm之间，优选的，至少80％的纳米粒子的粒径介于10-13nm之间。

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述的合成靶向β淀粉样蛋白显像剂的步骤包括：

①称取油酸修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子溶于甲苯中；

②称取目标化合物5溶于三氯甲烷中，加入到上述的甲苯溶液中并混合均匀；

③通入氮气，常温下磁力搅拌20-28h，反应结束后，加入无水乙醇沉淀；

④将得到的混合物离心处理得到黑色沉淀物；

⑤黑色固体溶解在正己烷中，再离心，除去不溶性杂质；

⑥向正己烷分散液中加入无水乙醇，沉淀，离心，真空干燥箱中50-70℃下干燥1-3h，得到目标化合物修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子。

本发明的靶向β淀粉样蛋白显像剂与缠结Aβ(1～40)具有很强的结合能力，因而能特异识别老年斑，此外，可以配合磁场的使用，控制β淀粉样蛋白显像剂的分布，靶向用于用于早期检测AD。

附图说明

图1为油酸修饰SPIO纳米粒子的XRD图；

图2为修饰SPIO纳米粒子粒径分布；

图3为目标化合物修饰SPIO纳米粒子TEM图；

图4：MRI扫描图(a)PBS，(b)油酸修饰SPIO纳米粒子，(c)目标化合物修饰的SPIO纳米粒子(d)目标化合物修饰的SPIO纳米粒子与Aβ(1-40)结合。从左到右浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.1and0.12mMFe；

图5：目标化合物修饰的SPIO纳米粒子与Aβ(1-40)纤维体外结合后荧光增强；

图6：将靶向显像剂注射于阿尔茨海默病动物模型后，MRI显示右侧海马区局部造影剂的沉积。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明进行详细说明。

实施例1

(1)油酸修饰磁性四氧化三铁(SPIO)纳米粒子的合成

具体实验步骤如下：

①乙酰丙酮铁(1mmol)，1，2-十六醇(5mmol)，二苄基醚(10ml)，油酸(3mmol)，油胺(3mmol)加入100ml的三颈瓶中，混合均匀，通入氮气排出空气；

②在氮气保护下，磁力搅拌，加热至200℃，并在该温度下反应2小时，再加热到300℃回流反应一小时；

③反应完全后停止加热，待冷却至室温，向反应液中加入20ml无水乙醇。

④将得到的混合物离心处理(7000r/min)，离心10min，得到黑色沉淀物。

⑤黑色固体溶解在10ml正己烷中，再离心，除去不溶性杂质。

⑥向正己烷分散液中加入20ml无水乙醇，沉淀，离心，得到平均粒径为6nm的油酸包覆的磁性四氧化三铁纳米粒子。

图1为所制备的油酸包覆SPIO纳米粒子的X射线衍射图，可以观察到主要衍射峰分布在2θ＝30.2°、35.9°、43.4°、53.8°、57.3°、63.0°处，将其与Fe₃O₄纳米粒子的粉末衍射卡(JCPDS，19-629)对比可知，以上衍射峰分别对应于反尖晶石结构Fe₃O₄纳米粒子的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、和(440)晶面的特征衍射峰，说明在本实验采用高温热分解法得到了反尖晶石结构的Fe₃O₄纳米颗粒。而且衍射峰峰形尖锐，说明产物晶粒生长完成，图中无其他杂质晶相衍射峰存在，说明产物纯度较高，所制备纳米粒子的平均尺寸约为5.5-6.5nm。

(2)合成化合物(1-{6-[(丁二酸单乙酯基)(甲基)氨基]-2-萘基}乙叉)丙二腈(5DDNP)

①1-(6-羟基-2-萘)-1-乙酮(2)的合成

1)取2L盐酸(1.16g/ml)于三颈圆底烧瓶中，加热回流；

将溶有6.06g化合物1的二氯甲烷溶液，缓慢滴入反应体系，继续回流2h；

2)趁热过滤，滤液冷却、抽滤，得到的浅黄色固体；

3)溶于130ml乙酸乙酯中，饱和氯化钠溶液洗涤，有机相经无水硫酸镁干燥，旋蒸得粗产品；

4)粗产品溶于少量三乙胺中，加热溶解，趁热过滤，滤液冷却至室温，稀盐酸中和，析出白色晶体，抽滤，蒸馏水洗涤，真空干燥，得化合物2，产率77.8％，mp：174℃-177℃。

②1-{6-[(2-羟乙基)甲氨基]-2-萘}-1-乙酮(3)的合成

1)744mg化合物2、3.5g偏重亚硫酸钠、5.2ml2-甲氨基乙醇、34ml蒸馏水置于100ml高压反应釜中，混合均匀；

2)放于恒温加热箱加热到125～130℃恒温64h，待反应完后，冷却至室温，蒸干溶剂，得到的黄绿色固体；

3)将得到的黄绿色固体溶于CH₂Cl₂/CH₃OH(V∶V＝8∶2)的溶液中，抽滤，滤液蒸干，粗产物用硅胶柱层析分离纯化，CH₂Cl₂、CH₂Cl₂/EtOAc(V∶V＝98∶2)、CH₂Cl₂/EtOAc(V∶V＝96∶4)为洗脱剂，收集第二带，产率：67.2％；mp：99.5℃～105℃。

③(1-{6-[(2-羟乙基)(甲基)氨基]-2-萘基}乙叉)丙二腈(4)的合成

1)421mg化合物3，458mg丙二腈，10ml吡啶置于三颈圆底烧瓶中，混合均匀；

2)通入Ar，恒温油浴加热至105℃，恒温36h，反应过程用TCL检测，反应结束后，蒸干溶剂，甲苯溶解，减压蒸馏，重复三次。

3)粗产物用硅胶柱层析分离纯化，CH₂Cl₂、CH₂Cl₂/EtOAc(V∶V＝98∶2)、CH₂Cl₂/EtOAc(V∶V＝95∶5)为洗脱液，收集第三带，产率82.6％，TLC：R_f＝0.42(CH₂Cl₂/EtOAc V∶V＝95∶5)；mp：126℃～129.5℃。

④DDNP羧酸衍生物的合成

1)三颈圆底烧瓶中加入125mg丁二酸酐、124mg4-二甲氨基吡啶(DMAP)、10ml二氯甲烷，混合均匀；

2)通N₂，室温下反应30min后，加入291mg化合物4，缓慢滴加140μl干燥的三乙胺，继续反应24h，反应过程用TCL检测；

3)反应结束后，蒸发溶剂，用硅胶柱层析分离纯化，CH₂Cl₂、CH₂Cl₂/CH₃OH(V∶V＝99∶1)、CH₂Cl₂/CH₃OH(V∶V＝98∶2)为洗脱液，收集第二带，产率54.1％，mp：135.8℃～137.2℃。

目标化合物的红外光谱图中，在3438、2900-3000、2215、1728、1705、1618，1532.9、1505.3和1380-1300cm^-1有吸收峰。

目标化合物进行热重分析，在136.1℃和302.7℃出现两个吸热峰，第一个温度温度代表了该物质的熔点，第二个温度代表了该物质的沸点。

(3)目标化合物DDNP修饰SPIO纳米粒子的制备

具体实验步骤如下：

①在100ml的三颈圆底烧瓶中，称取10mg油酸修饰的SPIO纳米粒子溶于10ml甲苯；

②称取20mgDDNP羧酸衍生物，溶于10ml的三氯甲烷中，加入到上述三颈圆底烧瓶中，混合均匀；

③通入氮气，常温下磁力搅拌24h，反应结束后，加入20ml无水乙醇，沉淀。

④将得到的混合物离心处理(7000r/min)，离心10min，得到黑色沉淀物。

⑤黑色固体溶解在10ml正己烷中，再离心，除去不溶性杂质。

⑥向正己烷分散液中加入20ml无水乙醇，沉淀，离心，真空干燥箱中60℃下干燥2h，得到平均粒径为11.7nm的DDNP包覆的磁性四氧化三铁纳米粒子。

所制备的目标化合物包覆的SPIO纳米粒子进行X射线衍射，主要衍射峰分布在2θ＝30.39°、35.78°、43.44°、53.72°、57.46°、62.73°处，将其与Fe₃O₄纳米粒子的粉末衍射卡(JCPDS，19-629)对比可知，以上衍射峰分别对应于反尖晶石结构Fe₃O₄纳米粒子的(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、和(440)晶面的特征衍射峰，而且衍射峰峰形尖锐，说明产物晶粒生长完成，衍射图中无其他杂质晶相衍射峰存在，说明产物纯度较高，制备纳米粒子的尺寸约为10-12nm。其粒径分布如图2所示，纳米粒子粒径分布窄，主要大小的粒径分布都大约在80％；所制备的纳米颗粒的透射电镜扫描显微镜照片如图3所示，制备的磁性Fe₃O₄纳米粒子粒径分布均匀，且分散性好，室温下保存七天，未出现明显聚集和沉淀现象。

(4)药效学实验

实验步骤如下：

①Aβ(1～40)纤维的形成：将0.5mg Aβ(1～40)溶于1mL PBS(pH＝7.4)溶液中，得到0.5mg/ml AβPBS溶液，将上述溶液置于恒温摇床内，37℃下，300r/min恒温摇动72h，得到均匀的乳浊液^[121]。

②体外核磁共振成像：将油酸修饰SPIO纳米粒子、DDNP-SPIO纳米粒子溶于2ml的DMSO，用PBS溶液稀释得到10ml铁离子浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.1和0.12mMFe的纳米溶液，然后取各个浓度的DDNP-SPIO纳米粒子溶液5ml，向每份溶液中加入50ul的Aβ(1-40)纤维溶液。将上述溶液置于恒温摇床内，氮气氛围中，37℃下，300r/min恒温摇动30min。以PBS为空白溶液，对以上三种溶液的进行核磁共振成像扫描。MRI扫描观察采用1.5TMR超导核磁共振成像仪(Siemens Sonata，Erlangen，Germany)，成像序列：自旋回波：TR＝2000MS；TE＝30-960ms；视野＝134×67mm；矩阵＝256×256；厚层＝5mm；层数＝2。

③DDNP-SPIO纳米粒子与Aβ(1-40)纤维体外结合实验：将DDNP-SPIO纳米粒子溶于2ml的DMSO溶液中，用PBS溶液稀释，配制0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0×10^-7mol/LDDNP-SPIO纳米粒子的PBS溶液(pH＝7.4)，对每种浓度的溶液进行下列操作：(1)移取化合物5溶液300μL，加到500μL的比色皿中；(2)取化合物5溶液500μL，加入5μLAβ溶液，摇匀，移取300μL加到500μL的比色皿中。将上述两组溶液置于恒温摇床中，在37℃下，300r/min，恒温摇动15min。在荧光分光光度计中，激发波长440nm，狭缝宽5nm，测定上述2组溶液荧光强度(积分峰面积)。每个浓度的溶液平行3份，每份测3次，以DDNP-SPIO浓度的倒数为横坐标，以2组溶液荧光强度差值的倒数为纵坐标，作双倒数图，得到K_d值。

结果如图4和图5所示，从图4中可以看出，随着铁浓度的增加，MR信号越强，图像黑度增加，说明合成的纳米粒子具有良好的磁共振信号敏感性。从图5中可以看出荧光发射光的强度增强，这是由于当DDNP-SPIO纳米粒子与Aβ(1～40)纤维作用时，后者具有较大黏性而限制了配体分子的旋转，使配体分子形成刚性平面结构，提高其量子产率。以DDNP-SPIO纳米粒子的浓度为横坐标，以DDNP-SPIO纳米粒子与Aβ(1～40)结合后和结合前的荧光强度差值(ΔF)为纵坐标作图，得到K_d＝30.9nmol/L，上述表明DDNP-SPIO纳米粒子与体外缠结Aβ(1～40)具有很强的结合能力，说明DDNP-SPIO纳米粒子能在体外与Aβ特异性结合，活体实验也证实DDNP-SPIO纳米粒子能特异性结合老年斑，因而能特异识别老年斑，可以作为AD的核磁共振造影剂用于早期检测AD。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (5)

1.式1所示的化合物修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子在制备靶向诊断β淀粉样蛋白沉积引发的阿尔茨海默病的显像剂中的应用，其特征在于，

所述式1所示的化合物修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子的平均粒径在10-13nm之间，且X射线衍射峰在2θ＝30.39°、35.78°、43.44°、53.72°、57.46°和62.73°处具有特征峰。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述制备靶向诊断β淀粉样蛋白沉积引发的阿尔茨海默病的显像剂的成套包装中包括磁铁。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述式1所示的化合物修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子，至少80％的纳米粒子的粒径介于10-13nm之间。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述的靶向诊断β淀粉样蛋白沉积引发的阿尔茨海默病的显像剂在室温下能稳定存在七天以上。

5.根据权利要求4所述的应用，所述的靶向诊断β淀粉样蛋白沉积引发的阿尔茨海默病的显像剂的制备包括如下步骤：

(1)制备油酸修饰的磁性四氧化三铁纳米离子：采用高温热分解法，以三乙酰丙酮铁为铁源，以二苄醚为有机溶剂，1，2-二羟基十六烷为还原剂，油酸和油胺为表面活性剂，在180-220℃下加热1-3小时，将有机金属前驱体部分Fe³⁺还原为Fe²⁺，再加热到280-320℃下回流0.5-1.5小时，合成平均粒径为5-7nm的油酸修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子；

(2)合成靶向诊断β淀粉样蛋白沉积引发的阿尔茨海默病的显像剂：利用配体交换反应，使式1所示的化合物与油酸修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子表面的油酸进行配体交换，得到式1所示的化合物修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子，然后将式1所示的化合物修饰的磁性四氧化三铁纳米粒子配制成显像剂。