CN103114042B - 一种座囊霉菌突变株及其催化生产桦木酮醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种座囊霉菌突变株及其催化生产桦木酮醇的方法，该突变株为座囊霉菌（Dothideomycete sp.）UV 14，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO.M 2012523。生产桦木酮醇的方法包括如下步骤：座囊霉菌经活化后，接种至含有氯化钠的土豆葡萄糖液体培养基中，培养1~3天；加入桦木醇和二甲基亚砜后，反应12~60小时过滤，滤液用乙酸乙酯萃取；过滤所得菌体经冻干后，加入乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，经柱层析后，得到产物桦木酮醇。本发明具有区域选择性高、反应条件温和、环境友好、转化效率高，反应时间短、目的产物收率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于天然产物及应用生物催化领域，具体涉及一种座囊霉菌突变株及其催化桦木醇区域选择性氧化制备桦木酮醇的方法。
背景技术
桦木醇是一种羽扇烷类五环三萜化合物,具有抗炎及抗病毒等活性，并且显示出与其它药物不同的作用机制,对肿瘤细胞也具有一定的毒性（林产化学与工业,2009,29(1),87），但较低的生物活性及选择性等阻碍了其在临床上的应用。为此，以桦木醇为先导化合物，对其进行结构修饰以提高其生物活性成为了近年来的研究热点（Natural Product Reports,2006,23,394）。桦木酮醇是桦木醇3-羟基氧化后的羰基衍生物。大量研究表明，桦木酮醇的生物活性远高于桦木醇。例如，桦木酮醇对肺癌NSCLC-N6细胞的毒性远高于桦木醇（Phytochemistry,2004,65,1159）；桦木醇的3-羟基经氧化修饰后，明显增强了其诱导小鼠黑素瘤细胞分化活性（Journal of Natural Products,2002,65,645）。同时桦木酮醇也是制备具有重要应用价值的异构桦木酮醇（allobetulone）的关键合成砌块（Molecules,2011,16,2443）。
尽管许多植物如大柄冬青（Ilex macropoda）及红树林植物瓶花木（Scyphiphora hydrophyllacea）等中均含有桦木酮醇（热带亚热带植物学报,2007,15(3),249;Archives of Pharmacal Research,2002,25,617），但含量甚低，极大地限制了该化合物的研究与应用。因此，必须开发简便的制备桦木酮醇的新技术及新工艺。桦木醇是桦木酮醇的生物合成前提物，在植物中含量较高，尤其是在白桦树皮中其含量高达25%。故以廉价、易得的桦木醇为原料，通过化学/生物催化法制备桦木酮醇是一条极具应用潜力的合成路线。
在桦木醇分子中有三个活性官能团（3-羟基,28-羟基及C20-C29双键），由于化学法的选择性较差，故如想对其中的3-羟基进行选择性氧化修饰时，通常需要繁琐的保护及脱保护步骤，并且通常需要使用化学计量的、环境不友好的氧化剂CrO3和KMnO4等。尽管利用生物催化与生物转化手段能有效避免化学法的上述缺点，但28-羟基为伯羟基，而3-羟基为仲羟基，前者空间位阻相对较小，故前者通常比后者活泼，更易被修饰。事实上，目前已报道的生物催化剂也只能催化28-羟基氧化及环上其他位点的羟基化反应（ProcessBiochemistry 2011,46:1-15;Enzyme and Microbial Technology,2009,45:175-180;Journal of Applied Microbiology,2011,110:90-97），仍无法实现低活性的3-羟基的区域选择性氧化。最近，我们筛选到一株能区域选择性催化桦木醇3-羟基氧化合成桦木酮醇的座囊霉菌HQ 316564，在最适条件下，产率为43%（Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2013,88:32-35）。但以该原始菌株为生物催化剂，转化效率较低、反应时间较长（需预培养菌株3天，加入底物后反应6天），并且产率不高。
发明内容
针对现有技术存在的问题，利用紫外随机突变技术对原始菌株座囊霉菌Dothideomycete sp.HQ 316564进行诱变，筛选获得一株高效催化催化桦木醇区域选择性氧化合成桦木酮醇的突变株。本发明的目的在于提供该座囊霉菌突变株及其催化桦木醇区域选择性氧化合成桦木酮醇的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种座囊霉菌突变株，该突变株为座囊霉菌（Dothideomycete sp.）UV 14，于2012年12月11日，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC NO.M 2012523，保藏地址：武汉，武汉大学。该突变株的菌落形态如图2（b）所示。
利用上述座囊霉菌催化生产桦木酮醇的方法，包括如下步骤：
（1）座囊霉菌（Dothideomycete sp.）UV 14经活化后，在生理盐水中配置浓度为1×107个孢子/mL的种子液，接种至含氯化钠的土豆葡萄糖液体培养基中，培养1~3天；
（2）加入底物桦木醇和助溶剂二甲基亚砜后，调节培养基的pH至5.0~9.0，在23~38℃、160r/min下反应12~60小时后，过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次（等体积是指与滤液体积相等）；过滤所得菌体经冻干后，加入1/2滤液体积的乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，经柱层析后，得到产物桦木酮醇。
优选地，步骤（1）所述座囊霉菌（Dothideomycete sp.）UV 14的活化是在含氯化钠的pH 7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基上，于28°C下活化6天。优选地，所述含氯化钠的土豆葡萄糖琼脂培养基的配方为：2%葡萄糖，20%土豆、1.5%琼脂和0.3%氯化钠。
优选地，步骤（1）所述种子液的接种量为1%。
优选地，步骤（1）所述含氯化钠的土豆葡萄糖液体培养基的配方为：2%葡萄糖，20%土豆和0.3%氯化钠。
优选地，步骤（1）所述培养条件为初始pH 5.0~7.0、23~38℃、140~180r/min。
优选地，步骤（2）所述二甲基亚砜的浓度为0.2~1.0%（v/v）。
优选地，步骤（2）所述桦木醇的浓度为100mg/L。
本发明与现有的技术相比，具有如下的优点：
1)利用座囊霉菌Dothideomycete sp.UV14细胞作为催化剂能高区域选择性地催化桦木醇中空间位阻较高、活性较低的3-位仲羟基氧化。
2)以座囊霉菌Dothideomycete sp.UV14细胞作为催化剂合成桦木酮醇，与原始菌株Dothideomycete sp.相比，具有生物催化效率高、反应时间短、目的产物收率高等优点。
3)本发明方法区域选择性高、工艺简单，避免了费时耗力的保护与脱保护步骤，并且具有反应条件温和、环境友好的优点。
附图说明
图1为桦木醇转化为桦木酮醇的反应式。
图2为原始菌Dothideomycete sp.HQ 316564（a）及突变株（Dothideomycetesp.）UV 14（b）在3%氯化钠、pH 7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基中，于28°C下培养3天后的菌落形态。
图3为桦木醇及桦木酮醇分析的典型液相色谱图（桦木醇及桦木酮醇的保留时间分别为10.09及11.98min）。
具体实施方式
通过实施例进一步说明本发明，但不局限于实施例。
实施例1
座囊霉菌（Dothideomycete sp.）UV 14在含氯化钠、pH 7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基（2%葡萄糖，20%土豆，1.5%琼脂，0.3%氯化钠）上，于28°C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液（1×107个孢子/mL），按1%的接种量接种至50mL含氯化钠、pH 6.0的土豆葡萄糖液体培养基（2%葡萄糖，20%土豆，0.3%氯化钠）中，在28°C、160r/min下培养3天；随后加入5mg桦木醇和0.4%（v/v）二甲基亚砜，调节培养基pH至6.0，在33°C、160r/min下反应；48小时后，过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，过滤所得菌体经冻干后，加入1/2滤液体积的乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入0.5mL的甲醇溶解，离心后利用液相色谱（色谱图如图3所示）测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为44%。
实施例2
座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化钠、pH 7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基上（2%葡萄糖，20%土豆，1.5%琼脂，0.3%氯化钠），于28°C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液（1×107个孢子/mL），按1%的接种量接种至50mL含氯化钠、pH 6.5的土豆葡萄糖液体培养基（2%葡萄糖，20%土豆，0.3%氯化钠）中，在28°C、160r/min下培养1.5天；随后加入5mg桦木醇和0.6%（v/v）二甲基亚砜，调节培养基pH至6.5，在33°C、160r/min下反应；48小时后，过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，过滤所得菌体经冻干后，加入1/2滤液体积乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入0.5mL的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为49%。
实施例3
座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化钠、pH 7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基（2%葡萄糖，20%土豆，1.5%琼脂，0.3%氯化钠）上，于28°C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液（1×107个孢子/mL），按1%的接种量接种至50mL含氯化钠、pH 5.5的土豆葡萄糖液体培养基（2%葡萄糖，20%土豆，0.3%氯化钠）中，在28°C、160r/min下培养1.5天；随后加入5mg桦木醇和0.2%（v/v）二甲基亚砜，调节培养基pH至6.5，在33°C、160r/min下反应；48小时后，过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，过滤所得菌体经冻干后，加入1/2滤液体积乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入0.5mL的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为57%。
实施例4
座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化钠、pH 7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基（2%葡萄糖，20%土豆，1.5%琼脂，0.3%氯化钠）上，于28°C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液（1×107个孢子/mL），按1%的接种量接种至50mL含氯化钠、pH 5.5的土豆葡萄糖液体培养基（2%葡萄糖，20%土豆，0.3%氯化钠）中，在23°C、160r/min下培养1.5天；随后加入5mg桦木醇和0.2%（v/v）二甲基亚砜，调节培养基pH至7.0，在33°C、160r/min下反应；48小时后，过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，过滤所得菌体经冻干后，加入1/2滤液体积乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入0.5mL的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为54%
实施例5
座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化钠、pH 7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基（2%葡萄糖，20%土豆，1.5%琼脂，0.3%氯化钠）上，于28°C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液（1×107个孢子/mL），按1%的接种量接种至50mL含氯化钠、pH 5.5的土豆葡萄糖液体培养基（2%葡萄糖，20%土豆，0.3%氯化钠）中，在28°C、160r/min下培养1.5天；随后加入5mg桦木醇和0.4%（v/v）二甲基亚砜，调节培养基pH至7.0，在28°C、160r/min下反应；48小时后，过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，过滤所得菌体经冻干后，加入1/2滤液体积乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入0.5mL的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为63%。
实施例6
座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化钠、pH 7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基（2%葡萄糖，20%土豆，1.5%琼脂，0.3%氯化钠）上，于28°C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液（1×107个孢子/mL），按1%的接种量接种至50mL含氯化钠、pH 5.5的土豆葡萄糖液体培养基（2%葡萄糖，20%土豆，0.3%氯化钠）中，在28°C、160r/min下培养1.5天；随后加入5mg桦木醇和0.4%（v/v）二甲基亚砜，调节培养基pH至7.0，在33°C、160r/min下反应；36小时后，过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，过滤所得菌体经冻干后，加入1/2滤液体积乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入0.5mL的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为62%。
实施例7
座囊霉菌Dothideomycete sp.UV 14在含氯化钠、pH 7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基（2%葡萄糖，20%土豆，1.5%琼脂，0.3%氯化钠）上，于28°C下活化6天后，在生理盐水中配置种子液（1×107个孢子/mL），按1%的接种量接种至50mL含氯化钠、pH 5.5的土豆葡萄糖液体培养基（2%葡萄糖，20%土豆，0.3%氯化钠）中，在28°C、160r/min下培养1.5天；随后加入5mg桦木醇和0.4%（v/v）二甲基亚砜，调节培养基pH至7.0，在33°C、160r/min下反应；48小时后，过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，过滤所得菌体经冻干后，加入1/2滤液体积乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，得到产物桦木酮醇粗品；随后加入0.5mL的甲醇溶解，离心后利用液相色谱测定产物浓度，根据产物校正曲线计算得到产率为72%。
Claims (9)
1.一种座囊霉菌突变株，其特征在于，该突变株为座囊霉菌（Dothideomycete sp.）UV14，于2012年12月11日，保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC NO.M2012523。
2.利用权利要求1所述座囊霉菌突变株催化生产桦木酮醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）座囊霉菌CCTCC NO.M2012523经活化后，在生理盐水中配置浓度为1×107个孢子/mL的种子液，接种至含有氯化钠的土豆葡萄糖液体培养基中，培养1～3天；
（2）加入底物桦木醇和助溶剂二甲基亚砜后，调节培养基的pH至5.0～9.0，在23～38℃、160r/min下反应12～60小时后，过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取三次；过滤所得菌体经冻干后，加入1/2滤液体积的乙酸乙酯碾磨并萃取三次，合并所得有机相，在真空下除去溶剂，经柱层析后，得到产物桦木酮醇。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述座囊霉菌CCTCCNO.M2012523的活化是在含氯化钠、pH7.0的土豆葡萄糖琼脂培养基上，于28℃下活化6天。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述含氯化钠的土豆葡萄糖琼脂培养基的配方为：2%葡萄糖，20%土豆、1.5%琼脂和0.3%氯化钠。
5.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述种子液的接种量为1%。
6.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述含氯化钠的土豆葡萄糖液体培养基的配方为：2%葡萄糖，20%土豆和0.3%氯化钠。
7.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述培养条件为初始pH5.0～7.0、23～38℃、140～180r/min。
8.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述二甲基亚砜的浓度为0.2～1.0%v/v。
9.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述桦木醇的浓度为100mg/L。
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