CN101084234A - 作为抗癌药剂的桦木醇衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的式(I)的桦木醇衍生化合物。本发明也公开了式(I)化合物的偶联或免疫偶联衍生物以及制备和使用它们的方法。
Description
本申请要求2004年9月10日递交的第60/609,080号、2004年11月11日递交的第60/630,103号、以及2004年11月11日递交的第60/630,150号美国临时专利申请的优先权，在此将它们的全部内容引入作为参考。
发明领域
本发明主要涉及治疗癌症的方法，还涉及偶联(conjugated)桦木醇衍生化合物和免疫偶联桦木醇衍生化合物以及制备它们的方法。
发明背景
早期诊断方法和治疗癌症药物的开发仍然是医学研究中最具挑战性的需求之一。人们也逐渐关注肿瘤相关抗原作为诊断潜在靶以及作为癌症化学治疗剂的位点导向药物输送靶。药物与导向肿瘤相关抗原的抗体的免疫偶联物的使用将获得较高的生物有效度和药物治疗指数，还将减少通常与化学治疗相关的负作用。
文献中已提及五环苯乙烯(类萜)的抗-肿瘤效果(Agnihotri等人，Indian J.Pharm.Sci.2：42(1987)；Maurua等人，Fitotherapia 60：468-469(1989)；Pisha等人的Nature Medicine 1：1046(1995)；以及Ukkonen等人的Birch Bark Extractive Kemia Kemi 6：217(1979))。其他的桦木醇羽扇多环烷排列(lupan-row)的衍生物，即桦木酸、桦木酮酸、桦木脑醛、以及桦木酮醛，作为新型的抗癌药剂出现。五环苯乙烯(pentacyclicstyrene)显示了对癌肉瘤生长(Sheth等人，J.Pharm.Sci.61：1819(1972))、淋巴样拉吉细胞(Raji cell)中的爱泼斯坦-巴尔病毒(Liu等人，ActaBot.Sin.29：84-87(1987)；Konoshima等人，J.Nat.Prod.50：1166-1170(1987))、以及体外鼻咽癌肉瘤(Miles等人，J.Pharm.Sci.63：613(1974))的抗-肿瘤活性。五环苯乙烯还显示了在体外对MCF-7乳腺瘤和P-333白血病的抗-肿瘤活性(Kahlos，Acta Pharm.Feun.96：33(1987))。桦木酸显示了对大肠的癌细胞系CO-115的细胞毒素活性(LD 50＝0.375mg/ml)(Ukkonen等人，Birch Bark Extractive Kemia Kemi 6：217(1979))。如同对小鼠和大鼠的试验，类萜对Walker-256癌肉瘤的体内抗-癌活性也已被证实。现已提出，桦木酸可能是类萜混合物中主要的抗-肿瘤药剂(Tomas等人，Planta Medicina 54：266-267(1988)；Jumal等人，IndiaChem.Soc.61：92-93(1964))。桦木醇及其衍生物对正常增殖细胞和非靶组织显示最小限度的副作用(Fudal等人，Neoplasia 7：162-170(2005))。
通常，桦木醇衍生物，尤其是桦木酮酸，可溶解在诸如乙醇和DMSO的多种有机溶剂中。然而，桦木酮酸和已知的桦木醇衍生物一般不溶于水环境或其他药物可接受的溶剂中。对药剂而言，在水环境中好的溶解性是一个重要的性质。缺少这种性质，将该药剂给予哺乳动物可能会产生困难，并且其在这些哺乳动物(包括人)中的生物活性可能被阻止或完全失效。由于诸如桦木醇及其衍生物的类萜在水溶液中有限的溶解性，它们作为药物的使用受到限制。作为有效的药剂，尤其是口服药剂，水溶性桦木醇衍生物是人们所期待的。
本发明致力于克服本领域中存在的这些和其它不足。
发明概述
本发明一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。所述方法包括在有效治疗癌症条件下，给予患有所述癌症的个体式I的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，
其中
R1选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼(“DNP”)、以及＝S，
R2选自-H、-CH3、-CHO、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-COCH3、-COOH、以及-CH＝NNH-2，4-DNP。
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生单体化合物或其药物可接受的盐，
其中
R1选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
R3选自H和C1-C5烷基；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
本发明另一方面涉及制备如上所述的偶联桦木醇衍生单体化合物的方法。这种方法包括在有效制备所述偶联桦木醇衍生单体化合物条件下，使下式的反应化合物
与下式的桦木醇衍生化合物反应
其中
R2为含羰基的基团。
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生二聚体化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1和Y2独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
R3选自H和C1-C5烷基；
Z为H或保护基团；以及
n为1至12的整数。
本发明的另一方面涉及制备如上所述的偶联桦木醇衍生二聚体化合物的方法。这种方法包括在有效制备所述偶联桦木醇衍生二聚体化合物条件下，使下式的反应化合物
与下式的化合物反应
本发明的另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生四聚体化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1、Y2、Y3、以及Y4独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
R3选自H和C1-C5烷基；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
本发明的另一方面涉及制备如上所述的偶联桦木醇衍生四聚体化合物的方法。这种方法包括在有效制备所述偶联桦木醇衍生四聚体条件下，使下式的反应化合物
与下式的化合物反应
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生聚合体化合物或其药物可接受的盐，
其中BA为具有下式的化合物
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
*为结合位点；
Q为BA、离去基团、或H；
R3为H或C1-C5烷基；
n为1至12的整数；以及
m为1至6的整数。
本发明另一方面涉及制备如上所述的偶联桦木醇衍生聚合体化合物的方法。这种方法包括在有效制备所述偶联桦木醇衍生聚合体化合物条件下聚合下式的单体
本发明另一方面涉及具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
R1选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
本发明另一方面涉及具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1和Y2独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
本发明另一方面涉及具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1、Y2、Y3、以及Y4独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
本发明另一方面涉及具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、
以及＝S；
*为结合位点；
Q为BA、离去基团、或H；
n为1至12的整数；以及
m为1至6的整数。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括给予患有所述癌症的个体如上所述的单体、二聚体、四聚体、或聚合体偶联或免疫偶联桦木醇衍生化合物。
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点；
X选自
每一R4独立地选自H、CH3、CH2-CH3、NH2以及OH；
Z为H、保护基团、或BA；
n为1至12的整数；
m为1至6的整数；以及
q为0或1。
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
W为H、OX、或CH2-OX；以及
每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
每一X为H或下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点，
n为1至8的整数；
p为0或1；以及
m为1至8的整数；
其中至少一个X不为H。
本发明另一方面涉及下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
R为C1至C5烷基；
n为5至1000的整数；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点；
X选自
每一R4独立地选自H、CH3、CH2-CH3、NH2以及OH；
Z为H、保护基团、或BA；
n为1至12的整数；
m为1至6的整数；以及
q为0或1。
本发明另一方面涉及治疗前列腺癌的方法。这种方法包括在有效治疗人体前列腺癌条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点；
X选自
每一R4独立地选自H、CH3、CH2-CH3、NH2以及OH；
Z为H、保护基团、或BA；
n为1至12的整数；
m为1至6的整数；以及
q为0或1。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
W为H、OX、或CH2-OX；以及
每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及治疗前列腺癌的方法。这种方法包括在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
W为H、OX、或CH2-OX；以及
每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
每一X为H或下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点，
n为1至8的整数；
p为0或1；以及
m为1至8的整数；
其中至少一个X不为H。
本发明另一方面涉及治疗前列腺癌的方法。这种方法包括在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
每一X为H或下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点，
n为1至8的整数；
p为0或1；以及
m为1至8的整数；
其中至少一个X不为H。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
R为C1至C5烷基；
n为5至1000的整数；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及治疗前列腺癌的方法。这种方法包括在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
R为C1至C5烷基；
n为5至1000的整数；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明的桦木醇衍生化合物的优点在于它们可溶在生物相容的溶剂中。这个优点使得本发明的化合物能作为药物化合物用作注射剂，以得到更高的生物利用度，由此使它们在癌症治疗中比先前描述的化合物更加有效。本发明的化合物还适于形成期望的药物和免疫偶联物比率，以便达到最佳剂量响应。
附图简要说明
图1A-C显示了桦木酮酸及其衍生物的色谱图，带有它们相应的保留时间。仔细查看这些色谱图揭示桦木酮酸单体以及二聚体呈现清晰的色谱图。
图2A包括内校准后的桦木酮酸的部分MS图谱，也包括了校准信号：m/z 365.3016、423.3434、481.3853、539.4272、以及597.4690为聚(丙二醇)双(2-氨基丙醚)的计算质量。在图谱中，发现了[M+H]+和[M+NH4]+离子(m/z 455和472，桦木酮酸)，也在MS图谱中看到了源于内源(insource)断裂的减小(m/z为437，桦木酮酸)。图2B显示了桦木酮酸的m/z为544、471、以及455的MS图谱。
图3A-C为单体酯的MS图谱，该图谱显示了单体酯实质上为单一化合物，作为m/z为697的单质子化离子出现(图3A)。从较高分辨率，较慢记录的ESI-MS扫描(图3B)计算出中性化合物的单种同位素分子量为696.5±0.2Da。这种化合物的单质子化正离子是相当不稳定的。正如图3C的产物离子图谱所显示的，m/z为697的离子的碰撞诱导分解(CID)有两种有效途径：一种涉及56Da中性粒子的丢失，另一种涉及100Da中性粒子的丢失。该断裂要求相对较低的碰撞能量(10伏特)。结果表明，在一般的稳定性分子不发生裂解的源条件下，m/z为641和597的离子也出现在图3A的普通质谱图中。
图4A-B显示了二聚体酯的MS图谱。如图4A所示，ESI质谱中最强的峰为m/z为1261的单质子化离子峰。还存在m/z为581、627、639、以及683的少量杂质。由于对该结构的灵敏度低，使用40μM浓度溶液以观察m/z 1261的强峰。如同在单体酯中的断裂，在图4B中主要的断裂过程为丢失100Da的中性粒子，可能以异丁烯+CO2的形式丢失。在另外的，非常弱的产物离子中，那些在m/z为1204和734时的产物离子是有意义的，因为它们能够分别被解释为是C4H8和桦木酮酸残余物的丢失。
图5为显示桦木酮酸浓度对峰面积的标准溶解度曲线。
图6A-D为LNCaP细胞的照片。图6A为对照肿瘤的照片，图6B为使用桦木酮酸处理后的肿瘤照片。图6C为对照肿瘤照片，图6D为使用桦木酮酸处理后的肿瘤照片。
图7A-B为DU145细胞使用桦木酮酸处理后的照片。
图8A-C为PC3细胞使用桦木酮酸处理后的照片。
图9为未转化的正常成纤维细胞系照片，该细胞系在对照组或处理组中没有形成任何集洛。
图10显示了桦木酮酸对无胸腺小鼠体内LNCaP异种移植物生长的影响。具体地，图10显示了从第1天至第10天肿瘤体积的增加百分比。
图11显示了桦木酮酸对无胸腺小鼠LNCaP前列腺癌细胞的影响，与对照比较。
图12以药物治疗的无胸腺小鼠内前列腺癌LNCaP异种移植物的每日肿瘤体积，与对照比较。
图13A-D为照片，显示了赖氨酸化桦木酮酸(单体)对雄性无胸腺小鼠体内LNCaP前列腺癌肿瘤(异种移植物)生长的影响。如图13A和图13C所示的小鼠为对照(未治疗)，如图13B和图13D所示的小鼠被治疗。
图14显示了无胸腺小鼠体内前列腺癌LNCaP异种移植物的药物治疗和对照组的肿瘤体积总体增加百分比。
图15A-N为一系列照片，显示染有Yo-Pro-1的肿瘤的离体生长，该Yo-Pro-1为用于细胞凋亡的免疫组织化学荧光指示剂。蓝色表示非凋亡细胞。
图16A-N为一系列照片，染有Yo-Pro-1的肿瘤的离体生长，该Yo-Pro-1为用于细胞凋亡的免疫组织化学荧光指示剂。绿色表示凋亡细胞。
发明的详细描述
本发明一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括在有效治疗癌症的条件下，给予患有所述癌症的个体式I的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，
其中
R1选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S，
R2选自-H、-CH3、-CHO、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-COCH3、-COOH、以及-CH＝NNH-2，4-二硝基苯基肼。
根据本发明，式I的化合物可以具有例如表1所示的R1和R2的结构。
表1.桦木醇及其衍生物
根据一个优选实施方案，式I化合物为下式的桦木酮酸：
或其药物可接受的盐或衍生物。对于治疗前列腺癌、乳腺癌、和/或膀胱癌，桦木酮酸为优选的式I化合物。
根据另一个优选实施方案，式I化合物为下式的桦木脑二乙酸酯
或其药物可接受盐或衍生物。对于治疗前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、和/或肺癌，桦木脑二乙酸酯为优选的式I的化合物。
根据另一个优选实施方案，式I化合物为下式的桦木酮醛
或其药物可接受盐或衍生物。对于治疗乳腺癌、CNS癌、肺癌、和/或膀胱癌，桦木酮醛为优选的式I化合物。
根据另一个优选实施方案，式I化合物为下式的桦木醇二甲醚
或其药物可接受盐或衍生物。对于治疗乳腺癌、膀胱癌、CNS癌、和/或肺癌，桦木醇二甲醚为优选的式I的化合物。
通过升华(Lowitz，Crell′s Annalen 1：312(1788)和Mason，Silliman′sAm.J.，20：282(1831)，在此引入这些文章的全部内容作为参考)或通过使用诸如乙醇的醇提取(Hunefeld，J.Prakt.Chem.7：53(1836)和Hess，Poggendorff’s Annalen 46：319(1839)，在此引入这些文章的全部内容作为参考)，桦木醇能够从白桦树Betula alba外层树皮中被分离出来。一些文献已描述了桦木醇的其他来源及其分离和提纯的方法，例如，Sheth等人，J.Pharm.Sci.61：1819(1972)(raw vegetables and extracts ofHyptis emory)(生蔬菜和Hyptis emory提取物)和Sheth等人，J.Pharm.Sci.62：139-140(1973)(Alnus oregonu)，在此引入这些文章的全部内容作为参考。
在优选方法中，桦木醇从花卉肥皂(floral soap)的不可皂化物中被提取出来。简言之，将碾碎的最初叶材(leaf wood)和硫酸盐煮沸法(NaOH，Na2SO4，Na2S2O3，Na2SO3)的组分分批或连续放入煮沸锅中。在110℃至120℃的温度下，视情况加压，使木质素(木材的成分)溶解。粗纤维素源于由木质素、纤维素、以及黑灰水(black buck)构成的浆液。黑灰水为黑灰水与妥尔酸(tall acid)的盐和不可皂化物的组合物。该粗纤维素可用于造纸，而通过离心或沉降方法，将硫酸盐皂(sulfate soap)从黑灰水中分离出来。使用硫酸处理硫酸盐皂制成妥尔油(tall oil)。不可皂化物作为粗桦木醇被分离出来。粗桦木醇通过在诸如丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、丁醇、乙醇等中重结晶生成纯桦木醇。有利的是，在离心或沉降后，对黑灰水残余物循环使用。
通过本领域公知的标准方法合成式I的桦木醇衍生化合物。例如，Bomshteyn等人的第6,890,533号美国专利给出了如何合成和制备式I的化合物的详细说明，在此将其全部内容引入作为参考。桦木醇的结构基于四个六元环和一个含有α-异丙基基团的五元E环的30-碳构架。桦木醇的结构组分含有在C-3和C-28上的伯羟基和仲羟基。桦木醇的三个位置-碳3、20、以及28上可发生化学修饰以生成衍生物。下文实施例描述了制备桦木醇衍生化合物的合成方案。
式I化合物的免疫偶联物也适合于实施本发明的方法。在一个实施方案中，通过直接在式I化合物的R1或R2上连接抗体制备免疫偶联物。可选择地，抗体可以经由间隔分子连接到式I化合物。Bomshteyn等人的第6,890,533号美国专利详细描述了抗体与桦木醇、桦木脑相关化合物的连接方法，以及实施本发明方法的优选的免疫偶联物，在此将其全部内容引入作为参考。例如，式I化合物的R1或R2中的一个可能是-肽-Q部分，而R1或R2中的另一个为羟基基团、烷氧基基团、烷酰氧基基团或-肽-Q部分，其中Q为-抗体-OH部分或-NHNH-C(O)-抗体-OH部分。用在本文时，-抗体-OH为具有式H-抗体-OH的抗体的基团形式，其中H-表示抗体的氨基端，以及-OH表示抗体的羧基端。因此，抗体是通过它的氨基端连接到-肽-部分或-肽-NHNHC(O)-部分。
本发明使用的优选抗体类型为免疫球蛋白，它是γ球蛋白。特别优选IgG、IgA、IgE、以及IgM亚类。一些具有代表性的免疫球蛋白为单克隆抗体或多克隆抗体，这些抗体针对人体或动物的肿瘤相关抗原；人B细胞抗原和人T细胞抗原；人Ia抗原；病毒、真菌和细菌抗原；以及与人体炎性反应或过敏反应相关的细胞。
Goding的Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和方法)，2nd.ed.，New York：Academic Press，(1986)；Kennett等人的Monoclonal Antibodies(单克隆抗体)，New York：PlenumPress(1980)；Secher等人的第4,423,147号美国专利；Bieber等人的第4,381,292号美国专利；Kung等人的第4,363,799号美国专利；Galfre等人的第4,350,683号美国专利；Clagett等人的第4,127,124号美国专利中描述了制备针对特定半抗原或抗原靶底物的抗体和单克隆抗体的方法，在此引入这些文章的全部内容作为参考。
“治疗癌症”用在此处特指给予被诊断患癌症的个体(也就是在该个体中已形成癌)治疗剂，以抑制癌组织中的恶性细胞进一步生长和扩散，和/或引起恶性细胞死亡。具体地，前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌服从本发明方法的治疗。治疗癌症也包括对具有恶化前状况的个体的治疗，以使得恶化前状况停止进展，或促使恶化前状况退化。恶化前状况的实例包括超常增生、发育异常、以及组织变形。
在实施本发明治疗个体癌症的方法中，通过口服给药(即式I的化合物)、皮内给药、肌内给药、腹腔内给药、静脉给药、皮下给药、或鼻内给药进行给药步骤。本发明中的药剂可以单独给药或与合适的药物载体一同给药，并且该药剂可以为固体或液体形式，例如片剂、胶囊、粉剂、溶液、混悬液、或乳剂。
通过在动物中的药理研究，例如，根据Nyberg等人的Psychopharmacology 119：345-348(1995)(在此引入该文章的全部内容作为参考)中的方法，可测定式I的化合物的相对活性、功效、以及特异性。虽然通过人体临床研究可以测定患者群中的差异代谢，然而Kerr等人，Biochem.Pharmacol.47：1969-1979(1994)和Karam等人，DrubMetab.Discov.24：1081-1087(1996)中提供了经济并且省时的替代方法，在此引入这些文章的全部内容作为参考。根据Leach等人，Epilepsia37：1100-1106(1996)中的方法可以在临床上鉴定药-药相互作用的可能性，在此引入该文章的全部内容作为参考；或根据Kerr等人，Biochem.Pharmacol.47：1969-1979(1994)和Turner等人，Can.J.Physio.Pharmacol.67：582-586(1989)中的方法可在体外鉴定药-药相互作用的可能性，在此引入这些文章的全部内容作为参考。
药剂、或其药物可接受的盐或衍生物的用量随着待治疗状况的性质和严重度以及给药途径的不同而变化。剂量(可能是剂量频率)也将根据个体的年龄、体重和反应的不同而变化。药剂化合物的总日剂量可以单一剂量或分份剂量给药。
本发明的化合物应按有效量给药。用于口服给药的、提供了有效量桦木醇衍生物的桦木醇衍生物参考剂量通常从每单位剂量1mg至每单位剂量2,000mg，更典型地，从每单位剂量10mg至每单位剂量500mg。优选地，剂量范围为1.0mg/kg/天至200mg/kg/天，并且优选剂量范围为1.0mg/kg/天至50mg/kg/天。
还建议儿童、年龄超过65岁的个体和肾功能或肝功能受损的那些个体开始时接受低剂量，并基于个体反应和血液水平，逐步增加剂量。对本领域普通技术人员来说显而易见的是，在某些情况下有必要使用这些范围以外的剂量。此外，应注意的是，根据个体反应临床医生或治疗医生知道如何并且何时中断、调整或终止治疗。
本发明的药物组合物可以包括药物可接受的载体、以及任选的其他治疗成分或赋形剂。
术语“其药物可接受的盐”指由药物可接受的、无毒性的酸制成的盐。这种酸包括无机酸和有机酸，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸(ethenesulfonic acid)、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、以及对甲苯磺酸。
药物组合物可方便地以单位剂型存在，并且可以通过任何一种制药领域公知的方法制备。优选的单位剂量制剂为那些包含有效量或其适当部分的活性成分的制剂。
本发明的组合物可以包括药物可接受的载体。根据给药所需的方式，例如，口服的或胃肠外的(包括静脉内的)，载体可以采取多种形式。在制备口服剂型组合物中，可以采用任何常见的药物介质，例如，在包括混悬剂、酏剂和溶液在内的口服液体制剂情况下，可使用水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、以及着色剂。在固体口服制剂优于液体口服制剂时，在诸如粉剂、胶囊、囊片的口服固体制剂情况下，可以使用诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘结剂以及崩解剂的载体。由于片剂或胶囊便于给药，因此它们为优选的固体口服制剂。如果需要，可以使用标准的水性或非水性技术对片剂进行包被。也可使用口服或胃肠外缓释剂型。
口服糖浆以及其他口服液体制剂是本领域技术人员公知的，并且在任何规范的药剂学校的课本中都能找到制备它们的通常方法。例如，在第19版的Remington：The Science and Practice of Pharmacy(药物科学和实践)第86章题为：“Solutions，Emulsions，Suspensions andExtracts(溶液、乳剂、混悬剂和提取物)”中详尽描述了糖浆(第1503-1505页，在此引入其全部内容作为参考)和其他口服液的制备的全部细节。
类似地，缓释制剂也是本领域公知的，在该参考文献的第94章题为“Sustained-Release Drug Delivery Systems(缓释药物传递系统)”中描述了较常见类型的口服缓释剂型和胃肠外缓释剂型(第1660-1675页，在此引入其全部内容作为参考)。与常规的口服剂型相比较，由于控释剂型减少了峰值血浆浓度，因此它尤其有益于提供治疗血浆浓度，同时避免了与常规剂型出现的高峰值血浆浓度相关的副作用。
固体单位剂型可以为常规类型。固体形式可以为胶囊，例如普通明胶类型，它含有桦木醇衍生物和诸如润滑剂和惰性填料(如乳糖、蔗糖、或玉米淀粉)的载体。在另一个实施方案中，药剂可以使用常规的片剂基质与粘合剂、崩解剂、以及润滑剂结合制成片剂。其中，片剂基质例如为乳糖、蔗糖、或玉米淀粉；粘合剂例如为阿拉伯胶、玉米淀粉、或明胶；崩解剂例如为玉米淀粉、马铃薯淀粉、或褐藻酸；润滑剂例如为硬脂酸或硬脂酸镁盐。
所述药物组合物还可以以可注射剂型给药，该注射剂型为这些物质与药物载体在生理可接受的稀释剂中的溶液和混悬液。这些载体包括无菌液体，例如添加有或没有添加表面活性剂、辅助剂、赋形剂、或稳定剂的水和油类。可用于举例的油类为源于石油、动物、植物、或合成的那些油，例如花生油、大豆油、或矿物油。通常，尤其对于注射用的溶液，优选的液体载体为水、盐水、葡萄糖溶液和相关的糖溶液、以及诸如丙二醇或聚丙二醇的二醇类。
为了用作气溶胶，在溶液或混悬液中的所述药物组合物可与合适的推进剂和常规辅助剂一起包装进加压的气溶胶容器中，所述推进剂例如为烃类推进剂，例如丙烷、丁烷、或异丁烷。药物组合物也可以以非加压形式给药，例如处于喷雾器或雾化器中。
依照本发明的方法，用于治疗癌症的优选个体包括但不限于任何哺乳动物，优选人。
本发明的另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生单体或其药物可接受的盐，
其中
R1选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
R3选自H和C1-C5烷基；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
合适的保护基团(Z)包括但不限于选自丁氧羰基和苄氧羰基的化合物。
在优选实施方案中，n为2至8的整数。
优选的桦木醇衍生单体化合物具有这样的结构，其中：
R1为＝O、R3为甲基、以及n为4；
R1为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或
R1为-OH、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。R1为＝O、R3为甲基、以及n为4。
本发明的另一方面涉及制备如上所述的偶联桦木醇衍生单体化合物的方法。这种方法包括在有效制备所述偶联桦木醇衍生单体化合物条件下，使下式的反应化合物
与下式的桦木醇衍生化合物反应
其中
R2为含羰基的基团。
在优选实施方案中，R2为-COOH、R1为＝O、R3为甲基、以及n＝4。
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生二聚体化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1和Y2独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
R3选自H和C1-C5烷基；
Z为H或保护基团；以及
n为1至12的整数。
在优选实施方案中，n为2至8的整数。
优选的上述化合物具有这样的结构，其中：
Y1和Y2为＝O、R3为甲基、以及n为4；
Y1和Y2为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或
Y1和Y2为-OH、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
本发明的另一方面涉及制备如上所述的偶联桦木醇衍生二聚体化合物的方法。这种方法包括在有效制备所述偶联桦木醇衍生二聚体化合物条件下，使下式的反应化合物
与下式的化合物反应
本发明的另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生四聚体化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1、Y2、Y3、以及Y4独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
R3选自H和C1-C5烷基；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
在优选实施方案中，n为2至8的整数。
优选的上述化合物具有这样的结构，其中：
Y1、Y2、Y3、以及Y4为＝O、R3为甲基、以及n为4；
Y1、Y2、Y3、以及Y4为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或
Y1、Y2、Y3、以及Y4为-OH、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
本发明的另一方面涉及制备如上所述的偶联桦木醇衍生四聚体化合物的方法。这种方法包括在有效制备所述偶联桦木醇衍生四聚体条件下，使下式的反应化合物
与下式的化合物反应
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生聚合体化合物或其药物可接受的盐，
其中BA为具有下式的化合物
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
*为结合位点；
Q为BA、离去基团、或H；
R3为H或C1-C5烷基；
n为1至12的整数；以及
m为1至6的整数。
在优选实施方案中，n为2至8的整数。
优选的上述化合物具有这样的结构，其中：
Y为＝O且n为4；或
Y为-OH、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
本发明另一方面涉及制备如上所述的偶联桦木醇衍生聚合体化合物的方法。这种方法包括在有效制备所述偶联桦木醇衍生聚合体化合物条件下聚合下式的单体
现已发现，桦木醇衍生物通过与一组增强溶解性的化合物的一种或多种偶联而具有更好的水溶性。该偶联物不仅在水溶液中的溶解性显著增大，它还除了保留高水平的生物活性，例如，对前列腺癌细胞的抑制活性。这是尤其重要的，因为使治疗剂具有较好的溶解性所需的化学作用通常导致治疗剂的生物活性降低，或某些情况下完全丧失其生物活性。
除了制备上述偶联物之外，还可通过多种其他的方法获得提高了溶解性的桦木醇衍生化合物。在一个优选实施方案中，通过在桦木醇衍生物的C28或C3位连接增溶剂获得提高了溶解性的桦木醇衍生化合物。优选的增溶剂包括但不限于聚乙二醇(PEG)或miniPEG。PEG化学是公知的，并且可被用于将PEG连接到桦木醇衍生物。
在另一个优选实施方案中，通过使用亲水性氨基酸获得提高了溶解性的桦木醇衍生化合物。具体地，亲水性碱性氨基酸(Lys、Arg、或His)可连接到桦木醇衍生物。也可使用其他高亲水性氨基酸(Glu、Asp、Gin、或Asn)。2-肽，例如Lys-Lys、Lys-His、Lys-Arg、Arg-His、Lys-Glu、Arg-Gln、Lys-Gln，和3-肽可用于增强桦木醇衍生物的溶解性。此外，2-肽和3-肽可能包括在性质上适度亲水的氨基酸((Tyr、Trp、Ser、Thr、以及Gly)。这些肽的偶合(coupling)可以发生在受阻位(hinderedposition)，使得该肽的亲水部分仍可用于溶剂化。
例如外加用于保护其他残基上活性基团的反应步骤，可采用类似于本文公开的将赖氨酸与桦木醇衍生物偶合的方法进行包含赖氨酸残基的肽的偶合。类似地，可使用与这里公开的赖氨酸偶联类似的方法，将具有伯胺或仲胺(即Arg和His)的氨基酸或包含具有伯胺或仲胺的氨基酸残基的肽连接到桦木醇衍生物。形成的其他氨基酸或肽偶联物的化学反应是本领域所属技术人员所公知的。
在另一个优选实施方案中，诸如亚精胺、腐胺、以及精胺的聚胺可被连接到桦木醇衍生物以提高溶解性。这些化合物通过伯胺或仲胺基团被连接。
碳水化物部分可被连接到桦木醇衍生物以提高溶解性。所述的碳水化物部分包括(1)单糖(例如葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、以及果糖)、(2)二糖(例如蔗糖和麦芽糖)、以及(3)氨基糖(例如葡萄糖胺、半乳糖胺、2-氨基-2-脱氧-葡萄糖醛酸、2-氨基-2-脱氧-葡萄糖、2-氨基-2-脱氧-3-O--D-吡喃葡萄糖基(glucopyranurosyl)-D-半乳糖、galactonojirimycin、gluconojirimycin、以及其衍生物)。环糊精可被连接到桦木醇衍生物以提高溶解性。该环糊精包括，例如，2-氨基-2-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖糖基-D-半乳糖、α-环糊精(6个葡萄糖残基)、β-环糊精(7个葡萄糖残基)、以及γ-环糊精(8个葡萄糖残基)。
应用糖化学领域所熟知的方法可使碳水化物偶合到桦木醇衍生物。
使用下述方法也可提高桦木醇衍生化合物的溶解性：将桦木醇衍生物连接到糖分子的4个甘氨酸链的每一个上(或对于赖氨酸为2个桦木酮酸基团)，其中每个甘氨酸链约含有2-3个甘氨酸分子，所述糖分子预留一个OH基团以与抗体结合。在一个优选实施方案中，使用甘氨酸链可提高在有机溶液中的溶解性并且避免受阻(hinderance)。示例性的结构如下：
其中
BA是具有下式的化合物
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S，
*为结合位点，有助于使BA连接到该示例性结构。
可选择地，与留下OH基团以连接抗体不同，其可被连接到脂。示例性结构如下：
其中
BA是具有下式的化合物
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
*为结合位点，有助于使BA连接到该示例性结构；
p为1至10的整数；
n为1至6的整数；以及
m为1至6的整数。
虽然没有与抗体形成偶联物，然而整个化合物是水溶性的。而且，由于整个化合物是生物相容的，因而没有毒性。
在另一个实施方案中，可以使用含有NH2和COOH基团的长链，交替出现末端OH基团。通过将桦木醇衍生化合物连接到NH2基团可获得这些结构。然后OH基团可用于连接抗体。示例性结构如下：
其中BA为具有下式的化合物
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
*为结合位点，有助于使BA连接到该示例性结构；以及
n为1至6的整数。
可以在链上使用羧酸与胺的不同比例。
本发明的另一方面涉及具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
R1选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
这里，基本上使用与前述相同的方法将抗体连接到偶联物。
本发明另一方面涉及具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1和Y2独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
这里，基本上使用与前述相同的方法将抗体连接到偶联物。
本发明另一方面涉及具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1、Y2、Y3、以及Y4独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
这里，基本上使用与前述相同的方法将抗体连接到偶联物。
本发明另一方面涉及具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
*为结合位点；
Q为BA、离去基团、或H；
n为1至12的整数；以及
m为1至6的整数。
这里，基本上使用与前述相同的方法将抗体连接到偶联物。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括在有效治疗癌症的条件下，给予患有所述癌症的个体如上所述的单体、二聚体、四聚体、或聚合体偶联桦木醇衍生化合物或免疫偶联化合物，或其药物可接受的盐或衍生物。在实施本发明这方面时，可采用上述制剂和给药方式。
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点；
X选自
每一R4独立地选自H、CH3、CH2-CH3、NH2以及OH；
Z为H、保护基团、或BA；
n为1至12的整数；
m为1至6的整数；以及
q为0或1。
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
W为H、OX、或CH2-OX；以及
每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
每一X为H或下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点，
n为1至8的整数；
p为0或1；以及
m为1至8的整数；
其中至少一个X不为H。
在优选实施方案中，上述化合物具有这样的结构，其中：
n＝4且p＝0或
n＝4、p＝1、以及m＝3。
本发明另一方面涉及下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
R为C1至C5烷基；
n为5至1000的整数；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点；
X选自
每一R4独立地选自H、CH3、CH2-CH3、NH2以及OH；
Z为H、保护基团、或BA；
n为1至12的整数；
m为1至6的整数；以及
q为0或1。
本发明另一方面涉及治疗前列腺癌的方法。这种方法包括在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点；
X选自
每一R4独立地选自H、CH3、CH2-CH3、NH2以及OH；
Z为H、保护基团、或BA；
n为1至12的整数；
m为1至6的整数；以及
q为0或1。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
W为H、OX、或CH2-OX；以及
每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及治疗前列腺癌的方法。这种方法包括在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
W为H、OX、或CH2-OX；以及
每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
每一X为H或下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点，
n为1至8的整数；
p为0或1；以及
m为1至8的整数；
其中至少一个X不为H。
本发明另一方面涉及治疗前列腺癌的方法。这种方法包括在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
每一X为H或下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点，
n为1至8的整数；
p为0或1；以及
m为1至8的整数；
其中至少一个X不为H。
本发明另一方面涉及治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌。这种方法包括给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
R为C1至C5烷基；
n为5至1000的整数；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
本发明另一方面涉及治疗前列腺癌的方法。这种方法包括在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
R为C1至C5烷基；
n为5至1000的整数；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
实施例
以下实施例旨在举例说明本发明的实施，而无意限制其范围。
实施例1-桦木醇及其衍生物的分离和结构
桦木醇粗硫酸盐皂的非皂化部分被分离出来，该粗硫酸皂为通过在110℃至120℃的温度下，在NaOH、Na2SO4、Na2SO3、以及Na2S2O3中煮沸白桦树外层树皮而制得。然后采用诸如丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、丁醇、乙醇等的溶剂使桦木醇结晶。桦木醇的化学结构为：
桦木醇是非类固醇的、羽扇豆醇衍生的、五环的、苯乙烯基团的羽扇多环烷排列(lupan-row)醇。桦木醇(也称为桦木脑)的化学式为C30H50O2，分子量为442.7g/mol。桦木醇的结构为基于四个六元环和一个含有α-异丙基基团的五元E环的30-碳构架。桦木醇的结构组分在C-3和C-28位具有伯羟基和仲羟基。桦木醇的三个位置(C-3、C-20、以及C-28)可发生化学修饰生成衍生物。由于可得到桦木醇以及它能够与多种其他有机化合物反应，合成了11种桦木醇衍生物，如方案1所示。
方案1.桦木醇衍生物的合成
可通过多种方式制备烷基化桦木醇衍生物。使用适当的氧化试剂处理桦木醇可得到酮衍生物，所述氧化试剂例如为琼斯试剂(Jone’sreagent)或吡啶鎓氯铬酸盐(PCC)(Kim等人，Synthetic Communications27：1607-1612(1997)；Komissarova等人，Chemistry of NationalCompounds 38：58-61(2002)；Ito等人，J.Nat.Prod.64：1278-1281(2001)，在此引入这些文章的全部内容作为参考)。在优选方法中，首先将桦木醇溶解在丙酮中，然后在0℃下使用氧化剂氧化，合成桦木醇羰基衍生物，例如桦木酮醛、桦木脑醛、桦木酮酸、以及桦木酮酸。通过酰化反应制备桦木脑乙酸酯衍生物-桦木脑二乙酸酯、3-乙酰氧基桦木脑、以及28-乙酰氧基桦木脑(Kim等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8：1707-1712(1998)；Hiroya等人，Bioorg.Med.Chem.10：3229-3236(2002)，在此引入这些文章的全部内容作为参考)。具体地，使用无水乙酐处理桦木醇的干燥吡啶溶液，并搅拌6小时。后处理通过使用乙酸乙酯稀释、并用10％的HCl和饱和NaHCO3洗涤生成的混合物来完成，得到桦木脑二乙酸酯、3-乙酰氧基桦木脑、以及28-乙酰氧基桦木脑。通过烷基化反应制备桦木脑二甲醚。将碘代甲烷加入到NaOH和桦木醇的干燥四氢呋喃溶液中，得到的产物回流40小时。将干燥的四氢呋喃、甲基碘加入到NaOH和桦木醇组成的溶液中，得到的产物回流40小时。逐滴加入蒸馏水以终止反应。使用柱色谱后获得桦木脑二甲醚。通过使用草酰氯处理获得氯羰基桦木脑(Sun等人，J.Med.Chem.45：4271-4275(2002)，在此引入该文章的全部内容作为参考)。将草酰氯溶液加入到桦木酸中并搅拌2小时。在真空下除去大部分溶剂。另加入干燥CH2Cl2，随后浓缩得到氯羰基桦木脑。
表2给出了桦木脑衍生物在体外对不同癌细胞的细胞毒性测试的总结。
表2.桦木醇衍生物在体外对不同癌细胞的细胞毒性
| 癌 | 药物 | 细胞系 | 药物浓度(M)/杀死百分比 | ||||
| 1×10-8 | 1×10-7 | 1×10-6 | 1×10-5 | 1×10-4 | |||
| 前列腺(1) | 桦木酮酸 | PC-3 | 41 | 54 | |||
| 前列腺(1) | 桦木酮酸 | LNCaP | 75 | 81 | |||
| 前列腺(1) | 桦木酮酸 | DU-145 | 51 | 54 | |||
| 前列腺(1) | 桦木酮酸 | 成纤维细胞 | 无效 | 无效 | |||
| 前列腺(2) | 桦木醇二乙酸酯 | PC-3 | 15 | 25 | |||
| 前列腺(2) | 桦木醇二乙酸酯 | DU-145 | 27 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 肾(2) | 桦木醇二乙酸酯 | CAKI-1 | 100 | 100 | 100 | ||
| 肾(2) | 桦木醇二乙酸酯 | RXF 393 | 15 | 97 | 100 | 100 | 100 |
| 肾(2) | 桦木醇二乙酸酯 | TK-10 | 49 | 100 | 100 | ||
| 乳腺(2) | 桦木醇二乙酸酯 | MCF7 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| 乳腺(2) | 桦木酮醛 | MCF7 | 68 | ||||
| 乳腺(2) | 桦木醇二甲醚 | MCF7 | 97 | ||||
| 乳腺(2) | 桦木醇二乙酸酯 | T-47d | 23 | 100 | 100 | 100 | |
| 乳腺(1) | 桦木醇二甲醚 | 184B5/HER | 有毒 | ||||
| 乳腺(1) | 桦木酮酸 | 184B5/HER | 有毒 | ||||
| 卵巢(2) | 桦木醇二乙酸酯 | OVACR-5 | 100 | 100 | 100 | ||
| 卵巢(2) | 桦木醇二乙酸酯 | OVACR-3 | 96 | 100 | 100 | ||
| CNS(2) | 桦木醇二乙酸酯 | U251 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| CNS(2) | 桦木醇二乙酸酯 | SF-268 | 15 | 75 | 100 | 100 | 100 |
| CNS(2) | 桦木酮醛 | SF-268 | 27 | ||||
| CNS(2) | 桦木醇二甲醚 | SF-268 | 100 | ||||
| 黑素瘤(2) | 桦木醇二乙酸酯 | MALME | 98 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| -3M | |||||||
| 肺(2) | 桦木醇二乙酸酯 | HOP-92 | 100 | 100 | 100 | ||
| 肺(2) | 桦木醇二乙酸酯 | NCI-H460 | 25 | 100 | 100 | 100 | |
| 肺(2) | 桦木酮醛 | NCI-H460 | 89 | ||||
| 肺(2) | 桦木醇二甲醚 | NCI-H460 | 80 | ||||
| 肺(2) | 桦木醇二乙酸酯 | NCI-H322M | 100 | 100 | 100 | ||
| 膀胱(1) | 桦木酮酸 | 37 | |||||
| 膀胱(1) | 桦木酮醛 | 29 | |||||
| 膀胱(1) | 桦木醇二甲醚 | 30 |
实施例2-从桦木醇合成桦木酮酸
在典型的方法中，将500mg桦木醇(1)加入到1.2g新活化的4分子筛、1.2g C盐、1.2g硅酸镁载体(florisil)、500mg乙酸钠、以及1.2g吡啶鎓氯铬酸盐在25mL CH2Cl2中形成的悬浮液中。将混合物搅拌2小时，然后通过230-400目和60的2.5×15cm硅胶柱(HF-254，E.Merck)过滤。在真空中蒸发滤液。所得残余物经硅胶柱色谱后回收370mg白色固态桦木酮醛(2)。将桦木酮醛溶解在17mL含有877mgNaH2PO4·H2O的CH3CN-H2O中并冷却到0℃-5℃。先后加入220μL、30％的H2O2水溶液和溶解在16mL水中的200mg NaClO2。让混合物升至室温并搅拌1小时。通过加入380mg的Na2S2O5使反应终止。使用300mL的乙酸乙酯萃取桦木酮酸。用水和盐水洗涤该有机萃取液，并用100mg Na2SO4干燥。有机溶液经滤纸过滤，蒸发滤液。所得残余物经硅胶柱色谱后回收347mg白色固体粉末状的桦木酮酸(3)。将使用上述方法制备的桦木酮酸的产率和活性与使用琼斯试剂制备的桦木酮酸(Kim等人的Synthetic Communications 27：1607-1612(1997)，在此引入该文章的全部内容作为参考)进行比较。
实施例3-化学特性的结果：GC
通过进行气相色谱研究桦木酮酸及其衍生物的纯度。每个样品各取8μL注射，得到下列保留时间(tR)：
表3.气相色谱图中的保留时间
| 样品 | 保留时间(tR) |
| 桦木酮酸 | 11.044 |
| 单体 | 10.936 |
| 二聚体 | 10.793 |
图1A-C显示了典型的桦木酮酸及其衍生物的色谱图，带有它们相应的保留时间。仔细查看这些色谱图揭示桦木酮酸、单体以及二聚体呈现清晰的色谱图。
实施例4-光谱分析
表4总结了合成的桦木酮酸衍生物的NMR位移。
表4.桦木酮酸衍生物的NMR化学位移
为了解析桦木酮酸及其衍生物的分子结构，随后对它们进行光谱分析。电喷雾质谱分析证实这些化合物的五环苯乙烯特征。在带有电喷雾(ES)离子化的Micromass Quattro II三级四极杆仪器上使用正离子模式对样品进行质谱分析。样品作为在75∶25∶2(v/v)的乙腈-水-乙酸中标称的(nominal)200μM浓度溶液，以5μL/min的速率被连续注入。必要时，通过在仪器的轰击小室内维持4×10-3mBar的氩气压力来获得产物离子图谱。
图2A包括内校准后的桦木酮酸的部分MS图谱，也包括了校准信号：m/z 365.3016、423.3434、481.3853、539.4272、以及597.4690为聚(丙二醇)双(2-氨基丙醚)的计算质量。在图谱中，发现了[M+H]+和[M+NH4]+离子(m/z 455和472，桦木酮酸)，也在MSMS图谱中看到了源于内源(insource)断裂的减小(m/z为437，桦木酮酸)。图2B显示了桦木酮酸的m/z为544、471、以及455的MSMS图谱。
单体酯的MS图谱(图3A-C)显示了单体酯实质上为单一化合物，作为m/z为697的单质子化离子出现(图3A)。从较高分辨率、较慢记录的ESI-MS扫描(图3B)计算出中性化合物的单种同位素分子量为696.5±0.2Da。这种化合物的单质子化正离子是相当不稳定的。正如产物离子图谱(图3C)所显示的，m/z为697的离子的碰撞诱导分解(CID)有两种有效途径：一种涉及56Da中性粒子的丢失，另一种伴随100Da中性粒子的丢失。该断裂要求相对较低的碰撞能，10伏特。结果表明，在一般的稳定性分子不发生裂解的源条件下，m/z为641和597的离子也出现在图3A的普通质谱图中。
图4A-B显示了二聚体酯的MS谱图。如图4A所示，ESI质谱中最强的峰为m/z为1261的单质子化离子峰。还存在m/z为581、627、639、以及683的少量杂质。由于对该结构的灵敏度低，使用40μM浓度溶液以观察m/z 1261的强峰。如同在单体酯中的断裂，在图4B中主要的断裂过程为丢失100Da的中性粒子，可能以异丁烯+CO2的形式丢失。在另外的、非常弱的产物离子中，那些m/z为1204和734的产物离子是有意义的，因为它们能够分别被解释为是C4H8和桦木酮酸残基的丢失。
实施例5-单赖氨酸化(Monolvsinated)桦木酮酸的合成
从Sigma-Aldrich获得具有下式(4)的Nα-丁氧羰基-Nε-苄氧羰基-赖氨酸(Boc-Lys(Cbz)-OH)。丁氧羰基(Boc)和苄氧羰基(Cbz)分别保护C-2和C-6位的两个胺。
按照Kobayashi等人，J.Org.Chem.66：6626-6633(2001)所描述的方法制备Nα-丁氧羰基-Nε-苄氧羰基-赖氨酸甲酯(Boc-Lys(Cbz)-OMe)，在此引入该文章的全部内容作为参考。在室温下，边搅拌边将5mL的无水甲醇加入到含有1.0g(Boc-Lys(Cbz)-OH)(4)的7.5mL三甲基甲硅烷基重氮甲烷中。在室温下搅拌混合物20分钟，真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱得到1.0g下式(5)的Boc-Lys(Cbz)-OMe：
将1.0g Boc-Lys(Cbz)-OMe(5)溶解在40mL的MeOH：乙酸乙酯中。向该溶液中加入100mg处于活性碳上的钯(Pd/C)。该溶液在氢气下搅拌2小时。有机溶液经C盐过滤，并以10mL MeOH洗涤。滤液经减压蒸馏得到式(6)的白色固态Boc-Lys-OMe，它可直接用于桦木酮酸(3)的偶联。
按照Zhao等人，J.Org.Chem.69：270-279(2004)描述的方法进行桦木酮酸和Boc-Lys-OMe单体的偶联，在此引入该文章的全部内容作为参考。边搅拌边将940mg的桦木酮酸(3)、350mg的1-羟基苯并三唑水合物(“HOBt”)、530mg的1，3-二环己基碳二亚胺(“DCC”)、以及435μL的三乙胺加入到冰浴的30mL溶有Boc-Lys-OMe(6)的无水四氢呋喃(“THF”)溶液中。在0℃下搅拌混合物2小时，然后在室温下搅拌48小时。得到的悬浮液经滤纸过滤，滤液真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱获得1.3g下式(7)的白色固态单体。
实施例6-两个单赖氨酸化桦木酮酸的偶联
将150mg的单体(7)和10.9mg的一水合氢氧化锂(LiOH·H2O)溶解在3mL的THF和100μL的H2O中。在室温下搅拌所得溶液直至通过薄层色谱(“TLC”)的监测显示(7)完全反应。该溶液在真空中浓缩。所得固体经硅胶柱色谱获得142.6mg下式(7a)的白色固态单体-Boc。
按照Chun等人，J.Org.Chem.69：7344-7347(2004)描述的方法制备单体-OMe(Nε-桦木酮羰基-赖氨酸甲酯)，在此引入该文章的全部内容作为参考。具体地，在0℃下将20mg的单体(7)溶解在1mL的无水CH2Cl2中。将11μL三氟乙酸(TFA)在11μL CH2Cl2中的溶液逐滴加入。反应混合物在室温下搅拌12小时。溶剂在真空下被蒸发。使用石油醚研磨所得残余物。该有机溶剂在真空下被蒸发获得下式(7b)的粗单体-OMe：
在0℃下，将6mg的DCC加入到19mg单体-Boc(7a)和4.1mg HOBt在0.5mL干燥二甲基甲酰胺(DMF)中形成的溶液中。搅拌混合物30分钟后，逐滴加入11.6μL三乙胺和(7b)在0.5mL干燥DMF中形成的溶液。在0℃下持续搅拌4小时，然后在室温下持续搅拌3天。溶剂被减压蒸发，所得的残余物经硅胶柱色谱获得28.3mg的下式(8)的白色固态二聚体。
实施例7-两个二聚体的偶联
将150mg二聚体(8)和10.9mg LiOH·H2O溶解在3mL THF和100μL H2O中。在室温下搅拌所得溶液直至经TLC监测到(8)完全反应。该溶液在真空中浓缩。所得固体经硅胶柱色谱获得142.6mg下式(8a)的白色固态二聚体-Boc。
在0℃下，将100mg二聚体(8)溶解在1mL无水CH2Cl2中。逐滴加入31μL TFA在31μL CH2Cl2中形成的溶液。反应混合物在室温下搅拌12小时。溶剂在真空下被蒸发。使用石油醚研磨所得残余物。该有机溶剂在真空下被蒸发，获得下式(8b)的粗二聚体-OMe。
在0℃下，将18mg DCC加入到100mg二聚体-Boc(8a)和12mg的HOBt在2mL干燥DMF中形成的溶液中。混合物被搅拌30min后，逐滴加入22μL三乙胺和(8b)在1.7mL干燥DMF中形成的溶液。在0℃下持续搅拌4小时，然后在室温下持续搅拌5天。溶剂被减压蒸发，所得的残余物经硅胶柱色谱得到20.8mg式(9)的白色固态四聚体。
将8.3mg四聚体(9)和1mg LiOH·H2O溶解在300μL MeOH和50μLH2O中。在室温下搅拌所得溶液直至通过TLC监测到(9)完全反应。溶液在真空中浓缩。所得固体经硅胶柱色谱得到3mg白色固态四聚体-Boc(10)和3.4mg未反应的四聚体(9)。
缩写为
的四聚体(9)可用于式(15)的五聚体-BA的合成，该五聚体-BA包含6分子的桦木酮酸(3)。具体地，四聚体(9)可进行选择性脱保护以除去Boc基团，生成式(11)的四聚体-OMe。(11)与式(12)的单体衍生物的偶联可以生成式(13)的五聚体-OMe。(13)经水解选择性除去甲酯可形成五聚体(15)：
另外，四聚体-OMe(11)可直接与桦木酮酸(3)而不是单体衍生物(12)连接。这将产生式(16)的四聚体-BA，该四聚体-BA包含5分子的桦木酮酸(3)。(11)与桦木酮酸(3)的偶联生成式(14)的四聚体-BA-OMe。(14)经相同的水解除去甲酯生成式(16)的四聚体-BA。
实施例8-使用6分子桦木酮酸制备五聚体
五赖氨酸与桦木酮酸的偶联是制备五聚体的简单且直接的方法。然而，因为五赖氨酸自身容易聚合和环化，所以不含有任何保护基团的五赖氨酸不稳定。五赖氨酸的C-1a羧基基团很容易与C-2e上的α-胺或与另一分子C6(a-e)上的伯胺偶合形成聚合物。该聚合物由不同数目的氨基酸基团组成，可产生不同长度的肽。另外，偶合反应可在同一分子中发生，所述的偶联反应连接五赖氨酸的氨基和羧基末端并环化，如下图所示：
需要五赖氨酸衍生物与桦木酮酸偶联。此外，式(17)的五赖氨酸甲酯具有被酯保护的C-1a羰基，其他的所有胺均可进行偶联。具体地，五赖氨酸甲酯(17)能与6分子的桦木酮酸(3)反应，并在DCC和HOBt的催化下生成式(18)的五聚体甲酯。使酯通过水解除去甲基保护基团，生成式(19)的五聚体，该五聚体含有6分子的桦木酮酸。带有6分子桦木酮酸和自由羧基的五聚体(19)可以用于与抗体的免疫偶联。
实施例9-免疫偶联物
通过α-球蛋白和赖氨酸化桦木酮酸的偶联制备桦木脑衍生物的免疫偶联物。先前描述的合成结构修饰方案被看作是一个开端，它创造了单克隆抗体结合的位点。作为探查性的可行性研究，将单体经活化的羰基基团(COOH)与兔的γ-球蛋白偶联。目前，正在验证碳二亚胺法。这种生物偶联反应使用了不同的活化中间体。
按照以1，3-二环己基碳二亚胺(“DCC”)进行的碳二亚胺法，将上述的单体(13mg、0.02mmol)溶解在0.2mL含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(3.3mg、0.03mmol)和20％摩尔过量的DCC的干燥DMF中。在4℃下搅拌18小时后，在有力搅拌下将得到的活化酯缓慢加入到蛋白溶液(溶有10mg γ-球蛋白的2mL 0.1M碳酸盐缓冲液，pH＝9.6的)。在4℃下，反应混合物被轻度搅拌24小时直至偶联完成，然后使用pH＝7.2的含有0.015M NaCl的250mL 0.01M磷酸钠缓冲液(PBS)对反应混合物完全透析(Spectra/Por 7，Spectrum Laboratories)72h，更换两次缓冲液，获得单体-抗体偶联物。该混合物被离心(10,500rpm)6分钟，然后贮存上清液用于细胞培养。
按照以1-乙基-3，3-二甲基氨基丙基碳二亚酰(“EDC”)进行的碳二亚胺法，新鲜配制EDC溶液(将0.4mg EDC溶于50μL DMF)和NHS溶液(将0.4mg NHS溶于25μL DMF)并将其加入到单体溶液(将0.2mg单体溶于500μL DMF)中。将反应保持在室温下30分钟，然后保持在4℃下过夜。将混合物缓慢加入到2mg γ蛋白，其在4℃下对pH＝9.4的250mL 0.1M碳酸盐缓冲液透析18小时。在4℃下反应过夜。使该反应混合物对pH＝7.2的含有0.015 NaCl的250mL 0.01M磷酸钠缓冲液(PBS)透析72h，更换两次缓冲液，获得单体-抗体偶联物。该混合物被离心(10,500rpm)6分钟，贮存沉淀物用于细胞培养。
实施例10-一般实验步骤
色谱法
采用230-440目的9385级硅胶(E.Merck)进行快速柱色谱(“FCC”)。采用步级溶剂极性梯度。在预先涂覆至0.25mm厚的硅胶60(HF-254，E.Merck)的铝片上进行TLC。
NMR谱
适度纯的产物使用Varian Inova AS 500光谱仪在500MHz下操作，其配有5mm三重共振三轴梯度探头。使用100％甲醇进行温度较准，校准值由Varian Instruments(Palo Alto，CA)提供。质子频率参照CDCl3。采用提供的VNMR软件进行NMR数据处理和VarianInstruments光谱积分。所有的NMR谱图取自NMR Core FacilityDepartment of Chemistry，Hunter College，The City University of NewYork。
质谱
在Biopolymer Mass Spectrometry Core Facility(Cornell University)获得的精确质量分析是在带有电喷雾离子化的Micromass Quattro II三联四极杆仪器上以正离子模式进行的。样品作为在75∶25∶2(v/v)的乙腈-水-乙酸中标称的200μM浓度溶液，以5μL/min的速率被连续注入。必要时，通过在仪器的轰击小室内维持4×10-3mBar的氩气压力来获得产物离子图谱。
气相色谱
为了避开评估桦木脑衍生化合物的纯度的问题，开发了快速气相色谱法。30mm×25mm×0.25μm薄膜厚度的含5％苯基和95％二甲基聚硅氧烷的石英玻璃毛细管柱SAC-5为桦木脑衍生物提供可复现的相对保留时间。所有的色谱分析均在Shimadzu Gas Chromatograph-14A上进行，典型的设置为：
GC柱：含5％苯基和95％二甲基聚硅氧烷的SAC-5石英玻璃毛
细管柱；
30mm×25mm×0.25μm薄膜厚度；
在运行所有样品前老化(conditioned)过夜
流速：60mL/min
气体压力：空气(50kPa)；H2(55kPa)；p1(80kPa)；p2(150kPa)
温度：300℃进样器/柱/检测器
进样器：分流
检测器：FID
样品体积：氯仿中8μL
实施例11-桦木酮酸的标准溶解度曲线
为了确定桦木酮酸及其衍生物在不同溶剂中的溶解度，生成了氯仿中不同浓度的桦木酮酸(表5)相对来自气相色谱的相应峰面积的标准溶解度曲线。
表5.桦木酮酸在氯仿中的标准度曲线
| BA浓度(mol/L) | BA浓度(mg/mL) | 峰面积(×10-4) |
| 0.5 | 227 | 286.5 |
| 0.25 | 113.5 | 78.0 |
| 0.125 | 56.8 | 46.8 |
| 0.0625 | 28.4 | 51.4 |
| 0.01 | 4.5 | 17.4 |
| 0.005 | 2.3 | 5.3 |
| 0.001 | 0.5 | 9.5 |
通过气相色谱(“GC”)分析8μL各已知浓度的桦木酮酸和未知浓度的溶液。桦木酮酸浓度对峰面积的标准溶解度曲线如图5所示。含有未知浓度桦木酮酸的溶剂被蒸发。将残余物溶解氯仿中，在GC上分析。应用色谱中相应的峰值从标准曲线确定未知浓度桦木酮酸的浓度。
桦木酮酸的标准溶液的制备如下：将45.4mg桦木酮酸溶解在200μL纯氯仿中，得到浓度为0.5mol/L的桦木酮酸。在三次两倍稀释后，获得三种不同的已知浓度(0.25mol/L、0.125mol/L、0.0625mol/L)的桦木酮酸。将2.27mg桦木酮酸溶解在500μL纯氯仿中，得到浓度为0.01mol/L的桦木酮酸。两倍稀释该溶液得到浓度为0.005mol/L的桦木酮酸。将0.227mg桦木酮酸溶解在500μL纯氯仿中，得到浓度为0.001mol/L的桦木酮酸。
实施例12-桦木酮酸及其衍生物在用培养基稀释的DMSO中的溶解度
将3mg桦木酮酸溶解在200μL纯DMSO中。然后使用含10％胎牛血清(“FBS”)的培养基稀释在纯DMSO中的桦木酮酸溶液，得到DMSO的浓度为1％，桦木酮酸的浓度为1×10-3mol/L(0.5mg/mL)。由于桦木酮酸不能完全溶解，在10,500rpm下将该悬浮液离心5分钟。通过标准溶解度曲线确定在沉淀物和上清液中的桦木酮酸的浓度。3mg桦木酮酸中仅有0.4mg被溶解。剩余的2.6mg桦木酮酸为沉淀。因此，13％桦木酮酸完全溶解。
由于培养液中1％DMSO不足以溶解3mg的桦木酮酸，因此逐步增加培养液中DMSO浓度直至桦木酮酸完全溶解。表6列出了逐步增加DMSO的实验结果。如表6所示，用培养液稀释到20％的220μL纯DMSO可完全溶解0.5mg桦木酮酸及其衍生物，得到澄清溶液。
表6.逐步增加DMSO浓度的实验结果
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| BA(mg) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 溶解BA的纯DMSO的体积(μL) | 33 | 103 | 153 | 220 |
| 培养基体积(mL) | 1.07 | 1.0 | 0.95 | 0.88 |
| 稀释后总体积(mL) | 1.1 | 1.1 | 1.1 | 1.1 |
| BA浓度(mg/mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| BA浓度(mol/L) | 1×10-3 | 1×10-3 | 1×10-3 | 1×10-3 |
| 总体积中DMSO的％ | 3％ | 9％ | 14％ | 20％ |
| 溶液状态 | 悬浮液 | 悬浮液 | 混浊 | 澄清溶液 |
如表6所示，用培养基稀释到20％的220μL的纯DMSO可完全溶解0.5mg桦木酮酸及其衍生物，得到澄清溶液。
冻干每种桦木酮酸及其衍生物的溶液并用乙醚提取。然后将乙醚蒸发。包含桦木酮酸和/或其衍生物的残余物在氯仿中重溶解并在GC上分析。用GC分析上述溶液中的药物浓度，并从标准溶解度曲线中确定其浓度。计算的在20％DMSO的培养液的桦木酮酸和/或其衍生物的浓度如表7所示。
表7.BA或衍生物在20％DMSO中的浓度
| 药物量(mg) | 含20％DMSO的培养基的体积(ml) | 药物浓度(mg/mL) | 药物浓度(mol/L) | |
| Boc-单体 | 1.0 | 1.5 | 0.7 | 1×10-3 |
| Boc-二聚体 | 1.0 | 1.6 | 0.6 | 5×10-4 |
| Boc-四聚体 | 1.0 | 1.7 | 0.6 | 2.5×10-4 |
由GC测定的桦木酮酸的浓度接近于计算值(表8)，因此确定大部分桦木酮酸和/或其衍生物完全溶解。
表8.计算的桦木酮酸和衍生物的浓度值
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 化合物名称 | 桦木酮酸 | Boc-单体 | Boc-二聚体 | Boc-四聚体 |
| 在含20％DMSO的培养基中的浓度(mol/L) | 1×10-3 | 1×10-3 | 5×10-4 | 2.5×10-4 |
| 桦木酮酸部分的浓度(mol/L) | 1×10-3 | 1×10-3 | 1×10-3 | 1×10-3 |
| 总体积(mL) | 1.4 | 0.75 | 0.75 | 0.93 |
| 氯仿(μL) | 100 | 100 | 100 | 100 |
| GC谱面积(×10-4) | 6.9 | 4.0 | N/A | 3.7 |
| 计算的桦木酮酸浓度(mol/L) | 0.92×10-3 | 0.97×10-3 | N/A | 0.72×10-3 |
这些试验提供了对体外细胞毒性分析中在DMSO的培养液中的化合物的精确溶解度。
实施例13-桦木酮酸在乙醇和培养基中的溶解度
选择乙醇作为生物相容溶剂用于体内研究。多至43.3mg的桦木酮酸完全溶解在1mL纯(100％)乙醇中，得到饱和溶液。可用培养基稀释该溶液，使得0.8mg桦木酮酸完全溶解在1.76mL含有10％人血清以及10％乙醇浓度的培养基中，得到1×10-3mol/mL(0.5mg/mL)浓度的桦木酮酸。
实施例14-桦木酮酸在含有人γ-球蛋白、人白蛋白和乙醇的磷酸盐缓冲液(PBS)中的溶解性
人γ-球蛋白和人白蛋白是人血清中两种主要的生物相容成分。将桦木酮酸溶解在纯乙醇中，并用含有不同浓度的人γ-球蛋白和人白蛋白的PBS稀释(表9)。
表9.用不同浓度的PBS稀释桦木酮酸
| 桦木酮酸(mg) | 乙醇(μL) | 人γ-球蛋白(在PBS中为27mg/mL)(mL)* | 人白蛋白(在PBS中为42mg/mL)(mL)* | 浓度(mol/L) | 现象 |
| 1.3 | 280 | 2.50 | 0 | 1×10-3 | 悬浮液 |
| 1.0 | 220 | 1.48 | 0.49 | 1×10-3 | 浑浊 |
| 1.5 | 330 | 1.48 | 1.48 | 1×10-3 | 轻微浑浊 |
| 1.4 | 308 | 0.69 | 2.07 | 1×10-3 | 近似澄清 |
| 1.6 | 352 | 0.32 | 2.85 | 1×10-3 | 澄清溶液 |
| 1.3 | 280 | 0 | 2.50 | 1×10-3 | 完全澄清 |
*人γ-球蛋白或人白蛋白在PBS中的百分比与在人血清中的百分比相同。
如表9所示，随着人白蛋白浓度的增加，桦木酮酸可以溶解在PBS中。桦木酮酸可完全溶解在含10％乙醇的人白蛋白PBS溶液中，得到浓度为1×10-3摩尔/L的桦木酮酸。
实施例15-桦木酮酸在人血清中的溶解度
用纯人血清稀释溶解在纯乙醇中的桦木酮酸以使其保持溶液状态，如表10所示。
表10.用人血清稀释溶解在纯乙醇中的桦木酮酸
| 桦木酮酸(mg) | 乙醇体积(μL) | 人血清体积(μL) | 总体积(mL) | 桦木酮酸浓度(mol/L) | 桦木酮酸浓度(mg/mL) | 现象 |
| 1.34 | 31 | 700 | 731 | 4×10-3 | 1.8 | 澄清溶液 |
表10的结果表明了：1.34mg桦木酮酸溶解在31μL纯乙醇中，并用人血清稀释，得到乙醇的最终浓度为4.2％，药物的浓度为4×10-3mol/L。该化合物保持溶解，适于体内研究。
另外，桦木酮酸及其赖氨酸化衍生物可完全溶解在纯乙醇中，用含4％人白蛋白(与人血清中自蛋白浓度类似)的PBS稀释得到乙醇的最终浓度为10％，桦木酮酸的浓度为1×10-3mol/L。这些体外研究结果与以前的结果一致。体内研究中，具有前列腺癌细胞异种移植物的小鼠对终浓度为22％的乙醇和2×10-3mol/L的桦木酮酸的溶解桦木酮酸及单体-Boc有很好的耐受。
额外加入10％甘油有助于延长桦木酮酸及其衍生物的处于溶液状态的时间。
实施例16-桦木酮酸和衍生物对前列腺癌细胞的细胞毒性：评价细胞成活力
人前列腺癌LNCaP、PC-3和DU-145细胞系，以及人成纤维细胞系，从美国典型菌种收藏所(“ATCC”)获得，分别维持在RPMI-1640、F-12k和MEM培养基中，添加了10％FBS。细胞系维持在37℃、湿润的空气及5％CO2中，用于试验桦木醇衍生物的细胞毒性。根据ATCC方案的说明，细胞毒性测定采用MTT测定法进行。将细胞接种到96孔培养板(Costar)中，1×105细胞处于0.1ml/孔中，并用不同稀释度的桦木醇衍生物孵育24、48和72小时。在各孵育期结束时加入10μL的3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓溴化物。反应产物甲
溶解在去污剂中，在540nm读取吸收值(Ref)。
实施例17-锚定不依赖性生长的测定(Anchorage-independenceGrowth Assay)
进行锚定不依赖性生长的测定，用于确定癌细胞在软琼脂中形成集落的能力。在具有或没有桦木醇衍生物情况下，将1.0×104癌细胞悬浮在含有0.33％琼脂的2ml DMEM培养基中。该化合物覆盖在0.6％琼脂形成的2ml基质上。培养物在没有培养基更换情况下在37℃、湿润的环境及5％CO2中孵育14天。将培养物在Cornoy固定剂(乙酸/100％乙醇1∶3v/v)中固定，在10×放大率下对形成的锚定不依赖性的三维集落(≥40μm直径)计数(Katdare等人，Cancer Lett.111：141-47(1997)，将其整体在此引入作为参考)。
实施例18-体内抗肿瘤研究(无胸腺小鼠中LNCaP前列腺癌异种移植物)
所有动物的研究根据纽约康奈尔大学Weill医学院的公共动物管理和使用委员会以及研究动物资源中心的指导和许可进行。12只13周龄的小鼠购自国家癌症研究所(NCI)，将其饲养在控制光和湿度条件下的无病原体环境中，自由进食和饮水。LNCaP细胞在具有10％FBS的RPMI-1640中生长，直到80-90％融合。将细胞刮进PBS中，离心收集。将LNCaP细胞沉淀以2.5×107细胞/ml悬浮在Matrigel(Ref)中。在小鼠侧腹一位点皮下(“s.c”)注射200μl(5×106细胞)细胞悬浮液。在植入7-8天后有可见的肿瘤生长，将小鼠分为三组，每组四只。
将桦木酮酸以2.5mg/ml溶液溶解在具有1％DMSO的PBS中。每天对小鼠皮下注射，持续10天。对照组接受单独的溶剂，而其他组接受在200μl溶剂中的桦木酮酸(20mg/kg)。每天用测径器测量肿瘤，肿瘤体积根据式：π/6(1×w×h)计算。每天还对动物称重，监测整体健康状况及由于治疗引起的可能毒性的生命体征。治疗周期结束时，杀死动物，切除肿瘤，称重并准备用于免疫组织化学和组织学研究。
另外的12只无胸腺雌性小鼠每个皮下注射10,000,000 LNCaP细胞，并分为四组，每组三只。接种24小时后对照组注射单独的溶剂作为对照，而治疗组的小鼠注射含有10-2和10-3摩尔桦木酮酸的0.5mL桦木酮酸。在第10天杀死小鼠，对其组织进行组织学研究。
实施例19-肿瘤的免疫组织化学研究
在治疗结束时杀死所有小鼠，每只小鼠肿瘤的一部分立即用液氮冷冻。由于前列腺特异抗原(PSA)和前列腺特异膜结合抗原(PSMBA)是LNCaP前列腺癌细胞的公认标志物，所以采用针对PSA和PSMA的抗体对肿瘤组织的冷冻切片进行免疫组织化学研究。这种染色法为鉴别前列腺癌细胞中膜结合抗原提供了手段，并使得能检测肿瘤中的变化(Liu等人，Cancer Res.57：3629-3634(1997)，将其整体在此引入作为参考)。
肿瘤组织的其他部分在4％甲醛溶液中固定，转移到70％乙醇中进行细胞类型和结构的组织学研究。
实施例20-桦木酮酸及其衍生物对人前列腺癌细胞的细胞毒性
通过修饰桦木醇结构化学合成了一系列化合物，如表1所示。由NCI对化合物2、3、4和5在体外测试细胞毒性，以确定它们对不同肿瘤细胞系的细胞生长抑制特性，所述不同肿瘤细胞系包括黑素瘤、膀胱癌、乳腺癌、CNS癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌和肾癌。化合物5显示了对细胞生长的最有效抑制，但没有选择活性。然而，NCI未对在前列腺癌LNCaP细胞系上测试这些化合物。用MTT测定法对化合物1、2、3、4、5、6、7和8在人前列腺癌细胞LNCaP中进行了评价。三种剂量上测定化合物的抗肿瘤活性，在24、48和72小时，相对于对照的总生长抑制杀伤作用如表11所示。与其他化合物相比，桦木酮酸对LNCaP细胞生长显示了最强的杀伤作用。
表11.桦木醇衍生物对LNCaP细胞系的生长抑制％
| 化合物 | 24小时 | 48小时 | ||||
| 2.5×10-7(M) | 2.5×10-6(M) | 2.5×10-5(M) | 2.5×10-7(M) | 2.5×10-6(M) | 2.5×10-5(M) | |
| 1 | 8.24 | 11.9 | 47.2 | 10.6 | 13.8 | 31 |
| 2 | 11.72 | 24.6 | 41.0 | 62.8 | 69.4 | 73.3 |
| 3 | 6.34 | 11.0 | 29.5 | 27.6 | 40.9 | 72.3 |
| 4 | 3.01 | 14.7 | 11.4 | 28.3 | 43 | 32.65 |
| 5 | 6.34 | 21.9 | 19 | 29.8 | 47.4 | 40.2 |
| 6 | 0 | 18.7 | 17 | 27.9 | 46.7 | 56.6 |
| 7 | 7.76 | 18.1 | 45 | 27.9 | 44.0 | 50.9 |
| 8 | 0 | 10.4 | 12.4 | 17.4 | 44.7 | 28.3 |
为确定桦木酮酸特异的抗肿瘤活性，对桦木酮酸在成纤维细胞和不同的前列腺细胞系如DU-145和PC-3细胞上进行了评价。结果如表12所示。
表12.BA对前列腺肿瘤细胞系的生长抑制％
| 细胞系 | 24小时 | 48小时 |
| 1×10-5 | 1×10-5 | |
| LNCaP | 38±8 | 75±9 |
| DU-145 | 33 | 51 |
| PC-3 | 9.7 | 41.1 |
| 成纤维细胞 | 0 | 0 |
如表12所示，桦木酮酸确实也抑制所有三种前列腺癌细胞的生长。然而，桦木酮酸显示了LNCaP细胞生长的最有效抑制。桦木酮酸对正常成纤维细胞没有细胞毒性作用。因此LNCaP细胞被选择用于进一步的桦木酮酸剂量依赖研究
在24、48和72小时孵育时，桦木酮酸也以剂量依赖模式抑制LNCaP细胞生长，如表13所示。
表13.BA对LNCaP前列腺肿瘤细胞的生长抑制％
| 时间(小时) | 1×10-6 | 1×10-5 | 1×10-4(M) |
| 24 | 9.2±6.1 | 24.2±10.8 | 70.4±19.1 |
| 48 | 27.75±11.4 | 69.5±20.2 | 81.0±12.6 |
| 72 | 45.0±12.3 | 88.4±7.96 | 80.8±15.8 |
如表13所示，在MTT测定法中，孵育24小时时，浓度为1×10-5和1×10-4M的桦木酮酸对LNCaP细胞的细胞毒性作用为24.2±10.8％和70.4±19.1％。孵育48小时后，细胞毒性作用增加到69.5±20.2％和81.0±12.6％。相比于孵育24小时，孵育48和72小时后，低浓度1×10-6M的桦木酮酸显示了对细胞生长的高抑制。相同浓度的桦木酮酸对正常成纤维细胞几乎没有细胞毒性作用。
赖氨酸化的桦木酮酸对LNCaP前列腺癌细胞也具有细胞毒性。在细胞用连接了一个赖氨酸的桦木酮酸(单体)(表14)处理48小时后，在浓度为1×10-5M时可抑制LNCaP细胞生长36.75％，而在药物浓度为1×10-4M时，几乎80％的细胞被杀死。
表14.与赖氨酸偶联的桦木酮酸对LNCaP前列腺肿瘤细胞的生长抑制％
| 时间(小时) | 1×10-6 | 1×10-5 | 1×10-4(M) |
| 24 | 5.5±7.32 | 19.0±14.4 | 76.5±22.6 |
| 48 | 15.0±11.2 | 36.75±19.2 | 82.75±14.3 |
| 72 | 17.25±32.5 | 40.5±33.6 | 79.25±16.5 |
如表15所示，带有两个赖氨酸的桦木酮酸(二聚体)显示了比单体更强的LNCaP细胞杀伤作用。在低浓度5×10-6M时，与细胞孵育48小时后，二聚体显示了34.5％的杀伤作用。
表15.连接了两个赖氨酸的桦木酮酸对LNCaP前列腺癌细胞的生长抑制％
| 时间(小时) | 5×10-7 | 5×10-6 | 5×10-5(M) |
| 24 | 13.5±17.4 | 24.0±22.3 | 67.5±22.8 |
| 48 | 14.75±13.9 | 34.5±20.9 | 78.25±18.1 |
| 72 | 20.0±16.3 | 33.75±16.4 | 85.25±7.84 |
实施例21-桦木酮酸对软琼脂中人前列腺癌细胞集落生长的作用：锚定不依赖性测定
在软琼脂集落形成测定中，使用最小有效剂量的桦木酮酸评价桦木酮酸对三种前列腺癌细胞系DU145、LNCaP和PC-3的锚定不依赖性生长的作用。将癌细胞悬浮在含有1×10-5M桦木酮酸的软琼脂中。与相应的未处理对照相比，在连续暴露14天期间，桦木酮酸显示了锚定不依赖性集落形成生长的减少(LNCaP：图6A-D；DU145：图7A-B；PC3：图8A-C)。非转化的正常成纤维细胞系在对照组或处理组中都不形成任何集落(图9)。
经处理的细胞在形成的集落大小上显示了非常显著的差异，表明了桦木酮酸抑制了细胞生长，因此减小了集落大小。有趣的是，对照细胞以3D管状结构生长，表现了这些细胞极高的转移性。经处理的细胞完全缺乏这种能力。
与对照相比，PC-3细胞对药物显示了较高的敏感性(表16)。
表16.1×10-5M BA对锚定不依赖性生长的抑制％
| 细胞系 | DU-145 | PC-3 | LNCaP |
| 桦木酮酸 | 12.5 | 26.1 | 0 |
处理组中形成的集落大小比对照的小，表明生长被桦木酮酸抑制。
实施例22-桦木酮酸对生长在无胸腺小鼠中LNCaP异种移植物的影响
在无胸腺小鼠皮下移植接种由LNCaP细胞形成的肿瘤。持续给予桦木酮酸10天。在全部的试验过程中，小鼠表现健康、机警，没有显示生命体征的负作用。10天处理后，对照组肿瘤体积几乎双倍于第一天注射时的肿瘤体积。第10天，桦木酮酸组的肿瘤体积与第一天相比仅增加了20.3％(图10)。从第1天到第10天的肿瘤体积百分比变化已示出(图11)。对照组肿瘤体积一直增加到第10天。然而，处理组在第三天给予桦木酮酸后，显示了持续减少肿瘤体积到第10天。
实施例23-肿瘤切片的免疫组织化学研究
应用抗前列腺特异抗原(“PSA”)和前列腺特异膜结合抗原(“PSMA”)的抗体，通过免疫组织化学染色检测肿瘤的冷冻切片，如先前所述(Liu等人，Cancer Res.57：3629-3634(1997)，将其整体在此引入作为参考)。药物在低剂量时，细胞显示存在所述抗原，但没有检测这些细胞在细胞培养基中的成活力。然而，在注射高剂量药物的小鼠的肿瘤中没有发现PSA和PSMA抗原，表明了多数细胞不能存活，可能被消灭。
实施例24-苏木精-曙红染色的肿瘤切片的组织化学研究
由于异物反应，存在更多的溶组织巨噬细胞侵入和坏死炎症。炎症和坏死也使得从10天前直到21天不能精确测量肿瘤体积。
实施例25-与IgG/Fab结合的桦木酮酸五聚体的其它合成方法
从桦木脑经琼斯试剂衍生桦木酮酸
从桦木醇(10g)的丙酮(300mL)溶液开始，在0℃逐滴加入新鲜制备的琼斯试剂。搅拌5小时，用100mL甲醇终止，随后搅拌5分钟并加入H2O(200mL)。真空除去有机溶剂，随后过滤分离沉淀物。用预冷的水洗涤滤器上的沉淀物，并干燥，以获得粗原料。将这些干燥的原料溶解在30mL苯中。溶液随后通过氧化铝层过滤，洗出液用10％KOH水溶液处理直到完全沉淀。沉淀随后经过滤分离，用10mL预冷的苯洗涤，干燥，获得白色固体。将该盐溶解在30mL甲醇中，所得溶液倒入100mL 15％的HCL水溶液中。过滤沉淀，用水洗涤并干燥后得到桦木酮酸(2.7g)。
琼斯试剂的制备：将10mL H2SO4加至粉红色固体CrO3(11.2g)。在0℃，将水(44mL)缓慢倒入该悬浮液中。固体完全溶解后，得到红色溶液备用。
从桦木醇经过氧化氢衍生桦木酮酸的另一方法
将桦木醇(500mg)加入到如下悬浮液中：新活化的粉末状4A分子筛(1.2g)、C盐(1.2g)、硅酸镁载体(1.2g)、乙酸钠(500mg)和氯铬酸吡啶鎓(1.2g)在CH2Cl2(25mL)中。搅拌混合物2小时，随后通过短硅胶柱过滤。滤出液在真空中蒸发。残余物随后经柱色谱得到白色固体桦木酮醛(370mg)。
将最后一步制备的桦木酮醛溶解在NaH2PO4·H2O(877mg)和CH3CN-H2O(17mL)的混合物中，悬浮液冷却至0-5℃。随后相继加入30％H2O2水溶液(220μL)和NaClO2(200mg)水(16mL)溶液，混合物加热到室温，在室温搅拌1小时。加入Na2S2O5(380mg)终止反应，用乙酸乙酯萃取。用水和盐水洗涤有机提出物，干燥(Na2SO4)、过滤和浓缩。残余物随后经柱色谱得到白色固体桦木酮酸(550mg)。
将桦木酮酸偶联到五赖氨酸-(预期的实施例(prophetic example))
接着，由封闭的五赖氨酸三甘氨酸(在C端用叔丁基酯封闭)开始，加入桦木酮酸。加入HATU偶合试剂和DIEA。加入DMF直到完全溶解。搅拌直到TLC显示完全产生五聚体。经柱层析分离终产物，洗涤和干燥产物。
五聚体去保护-(预期的实施例)
将蒙脱土KSF粘土(粘土质量＝1g/10mL溶液)加入到5mmol被保护的五聚体与乙腈的溶液中，在回流温度搅拌直至TLC表明完全反应(＜5小时)。
将五赖氨酸偶联到抗体/抗体片段-(预期的实施例)采用下面所示的Woodward′s Reagent K方法：
将去保护的五聚体加入到含Woodward′s Reagent K的溶液中，搅拌，在TLC分析显示反应完成后，加入抗体，搅拌直到反应完成。
实施例26-小鼠研究
在本实验中，使用了12只雄性无胸腺小鼠。将来自前列腺癌LNCaP细胞系培养物中的7-10百万个细胞同质地悬浮在Matrigel基底膜基质中，并作为异种移植物移植进小鼠。一周内肿瘤是可见的。对小鼠每天注射赖氨酸化的桦木酮酸。对照组小鼠每天也注射含有4％白蛋白和22％乙醇的磷酸盐缓冲液(PBS)，持续24天。每天称重小鼠，精确到0.1克，观察小鼠任何异常的生命体征或反常行为。每天用测径器测量肿瘤体积以观察肿瘤体积的任何变化(图12)，根据式π/6(1×w×h)计算体积。在第一次注射后的第24天用CO2窒息杀死小鼠(图13A-D)。评价药物处理组和对照组中肿瘤体积增加的总百分数(图14)。
切除肿瘤。立即在-80℃下在最佳切割温度胶(OCT胶)中冷冻肿瘤的一部分。切下肿瘤的冷冻切片，并放在载玻片上染色。采用特异性抗体通过免疫组织化学检测肿瘤切片是否存在前列腺特异抗原(PSA)和前列腺特异膜结合抗原(PSMA)，以测定细胞的成活。这些抗原(PSA和PSMBA)是LNCaP前列腺癌细胞的标志物。
将肿瘤组织的另一部分在4％甲醛溶液中固定，转移到70％的乙醇中。24小时后，切除固定的组织切片，用苏木精-曙红染色，进行细胞类型和结构的组织学检测。
用三维培养体系(matrigel)评价肿瘤的离体生长。将肿瘤的第三部分切成非常小的小块，放入侵在含有1∶1比例的matrigel基底膜基质和RPMI培养基的溶液中的培养板内。matrigel溶液固化后将培养基加入到孔中。将肿瘤块培养12天，每天用Olympus IX 70倒置显微镜和DP11图像分析仪照相。培养的第5天，将药物加入到试验的肿瘤组。用Western印迹(切割的caspase-3)和yo-pro-1免疫荧光评价凋亡(图15A-N和图16A-N)。
尽管已在本文中详细叙述和描述了优选的实施方案，但相关领域技术人员显然可在不脱离本发明的精神下做出各种各样的修改、添加和置换等，因此，这些应被认为处于所附权利要求定义的本发明的范围内。
Claims (99)
1.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
在有效治疗癌症条件下，给予患有所述癌症的个体式I的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，
其中
R1选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S，
R2选自-H、-CH3、-CHO、-CH2OH、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-COCH3、-COOH、以及-CH＝NNH-2，4-二硝基苯基肼。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物为桦木酮酸、或其药物可接受的盐或衍生物。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述癌症选自前列腺癌、乳腺癌、以及膀胱癌。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物为桦木醇二乙酸酯、或其药物可接受的盐或衍生物。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、以及肺癌。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物为桦木酮醛、或其药物可接受的盐或衍生物。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、CNS癌、肺癌、以及膀胱癌。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述化合物为桦木醇二甲醚、或其药物可接受的盐或衍生物。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、膀胱癌、CNS癌、以及肺癌。
10.具有下式的偶联桦木醇衍生单体化合物或其药物可接受的盐，
其中
R1选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
R3选自H和C1-C5烷基，
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
11.如权利要求10所述的单体化合物，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。
12.如权利要求10所述的单体化合物，其中R1为＝O且R3为甲基。
13.如权利要求10所述的单体化合物，其中R1为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
14.如权利要求10所述的单体化合物，其中R1为-OH、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
15.如权利要求10所述的单体化合物，其中n为2至8的整数。
16.如权利要求15所述的单体化合物，其中n＝4。
17.具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
R1选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
18.制备权利要求10所述的偶联桦木醇衍生单体化合物的方法，所述方法包括：
在有效制备偶联桦木醇衍生单体化合物条件下，使下式的反应化合物：
与下式的桦木醇衍生化合物反应：
其中
R2为含羰基的基团。
19.如权利要求18所述的方法，其中R2为-COOH、R1为＝O、以及R3为甲基。
20.如权利要求18所述的方法，其中n＝4。
21.如权利要求18所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。
22.如权利要求18所述的方法，还包括：
在有效形成下式的免疫偶联物条件下，使所述偶联桦木醇衍生单体与抗体反应
23.具有下式的偶联桦木醇衍生二聚体化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1和Y2独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
R3选自H和C1-C5烷基；
Z为H或保护基团；以及
n为1至12的整数。
24.如权利要求23所述的二聚体化合物，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。
25.如权利要求23所述的二聚体化合物，其中Y1和Y2为＝O且R3为甲基。
26.如权利要求23所述的二聚体化合物，其中Y1和Y2为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
27.如权利要求23所述的二聚体化合物，其中Y1和Y2为-OH、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
28.如权利要求23所述的二聚体化合物，其中n为2至8的整数。
29.如权利要求23所述的二聚体化合物，其中n为4。
30.具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1和Y2独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2.4-DNP、以及＝S；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
31.制备权利要求23所述的偶联桦木醇衍生二聚体化合物的方法，所述方法包括：
在有效制备所述偶联桦木醇衍生二聚体化合物条件下，使下式的反应化合物：
与下式的化合物反应：
32.如权利要求31所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。
33.如权利要求31所述的方法，其中Y1和Y2为＝O且R3为甲基。
34.如权利要求33所述的方法，其中n＝4。
35.如权利要求31所述的方法，还包括：
在有效形成下式的免疫偶联物条件下，使所述偶联桦木醇衍生二聚体与抗体反应
36.具有下式的偶联桦木醇衍生四聚体化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1、Y2、Y3、以及Y4独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
R3选自H和C1-C5烷基；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
37.如权利要求36所述的四聚体化合物，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。
38.如权利要求36所述的四聚体化合物，其中Y1、Y2、Y3、以及Y4为＝O，且R3为甲基。
39.如权利要求36所述的四聚体化合物，其中Y1、Y2、Y3、以及Y4为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
40.如权利要求36所述的四聚体化合物，其中Y1、Y2、Y3、以及Y4为-OH、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
41.如权利要求36所述的四聚体化合物，其中n为2至8的整数。
42.如权利要求36所述的四聚体化合物，其中n＝4。
43.具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
Y1、Y2、Y3、以及Y4独立地选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
n为1至12的整数；以及
Z为H或保护基团。
44.制备权利要求36所述的偶联桦木醇衍生四聚体化合物的方法，所述方法包括：
在有效制备所述偶联桦木醇衍生四聚体条件下，使下式的反应化合物：
与下式的化合物反应：
45.如权利要求44所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。
46.如权利要求44所述的方法，其中Y1、Y2、Y3、以及Y4为＝O，且R3为甲基。
47.如权利要求44所述的方法，其中n＝4。
48.如权利要求44所述的方法，还包括：
在有效形成下式的免疫偶联物条件下，使所述偶联桦木醇衍生四聚体与抗体反应
49.具有下式的偶联桦木醇衍生聚合体化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
*为结合位点；
Q为BA、离去基团、或H；
R3为H或C1-C5烷基；
n为1至12的整数；以及
m为1至6的整数。
50.如权利要求49所述的聚合体化合物，其中Y为含羰基的基团。
51.如权利要求49所述的聚合体化合物，其中BA为桦木酮酸衍生物。
52.如权利要求49所述的聚合体化合物，其中Y为＝O且n为4。
53.如权利要求49所述的聚合体化合物，其中Y为-OH且n为4。
54.如权利要求49所述的聚合体化合物，其中n为2至8的整数。
55.如权利要求49所述的聚合体化合物，其中m为4。
56.具有下式的免疫偶联化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；
*为结合位点；
Q为BA、离去基团、或H；
n为1至12的整数；以及
m为1至6的整数。
57.制备权利要求49所述的偶联桦木醇衍生聚合体化合物的方法，所述方法包括：
在在有效形成所述偶联桦木醇衍生聚合体化合物条件下聚合下式的单体
58.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体权利要求10所述的化合物。
59.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求10所述的化合物，其中R1为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
60.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求10所述的化合物，其中R1为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
61.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的人体有效量的权利要求10所述的化合物，其中R1为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
62.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求10所述的化合物，其中R1为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4，并且其中所述化合物被作为片剂以10mg-500mg的剂量范围给药。
63.药物组合物，包含权利要求10所述的化合物和药物载体。
64.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体权利要求23所述的化合物。
65.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求23所述的化合物，其中Y1和Y2为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
66.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求23所述的化合物，其中Y1和Y2为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
67.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的人体有效量的权利要求23所述的化合物，其中Y1和Y2为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
68.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求23所述的化合物，其中Y1和Y2为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4，并且其中所述化合物被作为片剂以10mg-500mg的剂量范围给药。
69.药物组合物，包含权利要求23所述的化合物和药物载体。
70.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体权利要求36所述的化合物。
71.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求36所述的化合物，其中Y1、Y2、Y3、以及Y4为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
72.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求36所述的化合物，其中Y1、Y2、Y3、以及Y4为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
73.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的人体有效量的权利要求36所述的化合物，其中Y1、Y2、Y3、以及Y4为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。
74.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求36所述的化合物，其中Y1、Y2、Y3、以及Y4为＝O、R3为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4，并且其中所述化合物被作为片剂以10mg-500mg的剂量范围给药。
75.药物组合物，包含权利要求36所述的化合物和药物载体。
76.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体权利要求49所述的化合物。
77.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求49所述的化合物，其中Y为＝O且n为4。
78.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求49所述的化合物，其中Y为＝O且n为4。
79.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的人体有效量的权利要求49所述的化合物，其中Y为＝O且n为4。
80.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的哺乳动物有效量的权利要求49所述的化合物，其中Y为＝O且n为4，并且其中所述化合物被作为片剂以10mg-500mg的剂量范围给药。
81.药物组合物，包含权利要求49所述的化合物和药物载体。
82.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体权利要求17所述的化合物。
83.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体权利要求30所述的化合物。
84.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体权利要求43所述的化合物。
85.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体权利要求56所述的化合物。
86.具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点；
X选自
每一R4独立地选自H、CH3、CH2-CH3、NH2以及OH；
Z为H、保护基团、或BA；
n为1至12的整数；
m为1至6的整数；以及
q为0或1。
87.具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
W为H、OX、或CH2-OX；以及
每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
88.具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
每一X为H或下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点，
n为1至8的整数；
p为0或1；以及
m为1至8的整数；
其中至少一个X不为H。
89.如权利要求88所述的化合物，其中n＝4且p＝0。
90.如权利要求88所述的化合物，其中n＝4、p＝1、以及m＝3。
91.具有下式的偶联桦木醇衍生物或其药物可接受的盐，
其中
R为C1至C5烷基；
n为5至1000的整数；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
92.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点；
X选自
每一R4独立地选自H、CH3、CH2-CH3、NH2以及OH；
Z为H、保护基团、或BA；
n为1至12的整数；
m为1至6的整数；以及
q为0或1。
93.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括：
在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点；
X选自
每一R4独立地选自H、CH3、CH2-CH3、NH2以及OH；
Z为H、保护基团、或BA；
n为1至12的整数；
m为1至6的整数；以及
q为0或1。
94.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
W为H、OX、或CH2-OX；以及
每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
95.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括：
在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
W为H、OX、或CH2-OX；以及
每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
96.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
每一X为H或下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点，
n为1至8的整数；
p为0或1；以及
m为1至8的整数；
其中至少一个X不为H。
97.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括：
在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
每一X为H或下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；
*为结合位点，
n为1至8的整数；
p为0或1；以及
m为1至8的整数；
其中至少一个X不为H。
98.治疗癌症的方法，所述癌症选自前列腺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、CNS癌、黑素瘤、肺癌、以及膀胱癌，所述方法包括：
给予患有所述癌症的个体具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
R为C1至C5烷基；
n为5至1000的整数；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
99.治疗前列腺癌的方法，所述方法包括：
在有效治疗人体前列腺癌的条件下，给予需要这种治疗的人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，
其中
R为C1至C5烷基；
n为5至1000的整数；以及
BA为具有下式的化合物：
其中
Y选自-CH3、＝O、-OH、-OCH3、-OC(O)CH3、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及
*为结合位点。
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