CN101083997A

CN101083997A - 用作抗hiv药剂的桦木醇衍生物

Info

Publication number: CN101083997A
Application number: CN 200580037790
Authority: CN
Inventors: 布里杰·B·萨克塞纳; 普蕾米拉·拉思纳姆
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 2004-09-10
Filing date: 2005-09-12
Publication date: 2007-12-05
Also published as: CN101084234A

Abstract

本发明涉及治疗个体HIV－1感染的方法。这些方法包括在有效治疗个体HIV－1感染条件下，给予HIV－1感染个体治疗有效量的偶联或免疫偶联桦木醇衍生化合物、或其药物可接受的盐或衍生物。本发明也公开了抑制细胞内HIV－1活性的方法。这些方法包括提供感染HIV－1的细胞，并在有效抑制细胞内HIV－1活性条件下使细胞与偶联或免疫偶联桦木醇衍生化合物、或其药物可接受的盐或衍生物接触。

Description

用作抗HIV药剂的桦木醇衍生物

本申请要求2004年9月10日递交的第60/609,080号、2004年11月11日递交的第60/630,103号、以及2004年11月11日递交的第60/630,150号美国临时申请的优先权，将它们的全部内容通过参考引入本文。

发明领域

本申请主要涉及使用桦木醇衍生化合物治疗个体HIV-1感染的方法以及抑制细胞中HIV-1活性的方法。

发明背景

引发爱滋病(AIDS)的人类免疫缺陷病毒(“HIV”)已经在世界范围内广泛流传。全世界有超过四千万人感染HIV，仅美国就约有一百万人感染HIV。每天，大约有12,000成人和1,800儿童被感染。当前，存在三类HIV药物治疗，即逆转录酶(“RT”)抑制剂，例如AZT(3’-叠氮-3’-脱氧胸苷)、蛋白酶抑制剂和融合抑制剂。普通的HIV药物治疗包括混合药物方案，它可以例如使用诸如AZT，2’，3’-双脱氧肌苷和2’，3’-双脱氧胞苷的核苷类似物。这些药物通过抑制HIV逆转录酶活性和/或通过寡聚核苷酸链终止机制起作用。

然而，当前这些可接受的治疗药物不是被他们的毒性限制，就是被出现的抗药性HIV株所限制(Evers等人，J.Med.Chem.39：1056-1063(1996))。另外，这些药物昂贵、难以生产并且具有副作用。个体也经常对这些药物产生耐药性。因此，寻求新型抗HIV化合物是及时和重要的。

桦木脑(betulin)，或桦木醇(betulinol)是较为丰富的三萜烯中的一种，多至构成白桦树(Betula alba)外层树皮的24％以及多达构成中国东北白桦树(Betula platyphylla)外层树皮的35％和内层树皮的大约5％(Hirota等人，J.S.C.I.Japan 47：922(1944))。桦木脑也以游离状态出现在黄色和黑色桦树(Steiner，Mikrochemie，Molisch-Festschrift，p.405(1936))、欧榛(Corylusavellana)和欧洲鹅耳枥(Carpinus betulus)(Feinberg等人，Monatsh44：261(1924)；Brunner等人，Monatsh 63：368(1934)；Brunner等人，Monatsh 64：21(1934))、以及毒性卫矛科(Lophopetalum toxicum)(Dieterle等人，Arch.Pharm.271：264(1933))的树皮中。来自昆栏树(Trochodendron aralioide)树皮的分泌液含有桦木脑棕榈酸酯，该分泌液构成日本粘鸟胶(Shishido等人，J.S.C.I.Japan 45：436(1942))。桦木脑也已从蔷薇果(rosehip)(Zimmermann，Helv.Chim.Acta27：332(1944))和从Zizyphus vulgaris Lamarck var.spinosus Bunge(Rhamnaceae)的种子(Kawaguti等人，J.Pharm.Soc.Japan 60：343(1940))中分离出来。Ruhemann等人，Brennstoff-Ch.13：341(1932)公开了在德国中部褐煤的苯醇提取物的可皂化部分中存在桦木脑，异桦木脑(allobetulin)和“氧异桦木脑”(oxyallobetulin)。另外，下列所示为从白桦皮层提取物中已鉴别出下列lupon-row衍生物：(a)桦木醇、(b)桦木酸、(c)桦木脑醛、(d)桦木酮酸、以及(e)桦木酮醛(betulone aldehyde)(Rimpler等人，Arch.Pharm.Und.Ber.Dtsh.Ppharmaz Jes.299：422-428(1995)；Lindgren等人，Acta Chem.20：720(1966)；以及Jaaskelainen，P.Papperi Ja Puu-Papper Och Tra.63：599-603(1989))。

桦树皮层提取的桦木醇于1899年作为防腐剂被首次提及。随后，从Hyptis emory和赤杨皮(Alnus oregonu)的提取物中选出的化合物(被鉴定为五环苯乙烯和它们的衍生物)被证实抑制癌肉瘤生长(Sheth等人，J. Pharm.Sci.61：1819(1972)；Sheth等人，J. Pharm.Sci.62：139-140(1973))。现已提出，桦木酸是类萜混合物中的主要抗肿瘤剂(Tomas等人，Planta Medicina 54：266-267(1988)；Ahmat等人，J.Indian Chem.Soc.61：92-93(1964))。具体地，桦木酸显示了对大肠的癌细胞系CO-115的细胞毒素活性(LD50＝0.375mg/ml)(Ukkonen等人，Birch Bark Extractive Kenzia Kemi 6：217(1979))。Bomshteyn等人，第6,890,533号美国专利公开了可用于治疗癌症的桦木醇衍生物和桦木醇-抗体偶联物。

桦木醇(羽扇-20(29)-烯-3.β.，28-二醇)为可购得的(例如，SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)并且例如描述在“Merck 1212，”TheMerck Index，11th ed.(1989)和Simonsen等人，The Terpenes卷IV，Cambridge U.Press，pp.187-328(1957)中。

桦木醇的化学结构为：

桦木醇已被证实具有抗病毒活性，包括抗疱疹病毒活性(Carlson等人，第5,750,578号美国专利)和抗HIV活性(Lee等人，第6,172,110号美国专利；Sun等人，J.Med.Chem.41：4648-4657(1998))。也对某些桦木醇衍生物进行了潜在抗病毒活性研究。

对桦木酮酸及其衍生物(Hashimoto等人，Bioorg.Med.Chem.5：2133-2143(1997)；Sun等人，J.Med.Chem.41：4648-4657(1998))、桦木酸及其衍生物，二氢桦木酸及其衍生物(Hashimoto等人，Bioorg.Med.Chem.5：2133-2143(1997)；Sun等人，J.Med.Chem.45：4271-4275(2002)；Kashiwada等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.11：183-185(2001)；Kashiwada等人，J.Med.Chem.39：1016-1017(1996)；Flekhter等人，Bioorg.Khim.28：543-550(2003)；“BetulinicAcid Derivatives in AIDS(爱滋病中的桦木酸衍生物)，”Marketletter(1994年5月2日)；DeClercq，Med.Res.Rev.20：323-349(2000)；Vlietinck等人，Plant Med.64：97-109(1998)；Soler等人，J. Med.Chem.39：1069-1083(1996)；Evers等人，J.Med.Chem.39：1056-1068(1996)；Bouboutou等人，第5,468,888号美国专利；Lee等人，第5,697,828号美国专利；Pezzuto，第5,869,535号，第6,225,353号，第6,495,600号和第6,569,842号美国专利；Ramadoss等人，第6,048,847号美国专利和Jaggi等人，第6,403,816号美国专利；以及Lee等人公开号WO96/39033的PCT申请)、桦木醇二乙酸酯(Sun等人，Med.Chem.41：4648-4657(1998))、以及桦木酮醛(Pezzuto第5,869,535号，第6,225,353号，和第6,495,600号美国专利)进行了潜在抗病毒活性研究。另外，某些包括桦木脑二乙酸酯(Carlson第5,750,578号美国专利)和桦木酸(Hwang第6,214,350号美国专利)在内的桦木脑衍生物已被证实表现出抗疱疹病毒活性。

然而不幸地，这些桦木醇衍生化合物中的很多种在使用中存在严重的缺陷。例如，桦木脑二乙酸酯和桦木酮酸呈现低的治疗指数(Sun等人，J.Med.Chem.41：4648-4657(1998))。另外，诸如桦木酮酸的某些桦木酸衍生物被发现具有细胞毒性，干扰细胞增殖(Hashimoto等人，Bioorg.Med.Chem.5：2133-2143(1997))。另外，除α干扰素外，目前没有抗HIV试剂影响病毒从慢性感染细胞中释放。因此，寻求新型抗HIV化合物仍是适时和重要的。

通常，桦木醇衍生物，特别是桦木酮酸，可溶解在许多有机溶剂中，如乙醇和二甲亚砜(DMSO)。然而桦木酮酸和已知的桦木醇衍生物一般不溶在水环境或其它药物可接受的溶剂中。对药剂而言，在水环境中好的溶解性是一个重要的性质。缺少这种特性，将该药剂给予哺乳动物可能会产生困难，并且其在这些哺乳动物(包括人)中的生物活性可能被阻止或完全失效。由于萜类化合物，如桦木醇及其衍生物在水溶液中有限的溶解性，它们作为药剂的用途被限制。作为有效的药剂，尤其是口服药剂，水溶桦木醇衍生物是人们所期待的。

本发明致力于克服本领域中存在的这些和其它不足。

发明概述

本发明一方面涉及治疗个体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗个体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，

其中

R₁选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-二硝基苯基肼(“DNP”)、以及＝S，

R₃选自H和C₁-C₅烷基，

N为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

本发明的另一方面涉及治疗个体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗个体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，

其中

R₁选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、以及＝S，

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

其中

Y₁和Y₂独立地选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

其中

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

其中

Y₁、Y₂、Y₃和Y₄独立地选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

其中

Y₁，、Y₂、Y₃、以及Y₄独立地选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

Y选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃，-NNH-2，4-DNP、以及＝S；

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

R₃为H或C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

Y选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

本发明的另一方面涉及抑制细胞中HIV-1活性的方法。该方法包括提供感染HIV-1的细胞，并在有效抑制细胞中HIV-1活性条件下使细胞与具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物接触，

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基，

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

其中

R₁选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、以及＝S

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

其中

Z为H或保护基团，以及

n为1至12的整数。

其中

Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄独立地选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

R₃为H或C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

本发明的另一方面涉及治疗和/或抑制人体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗和/或抑制人体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染人体治疗有效量的具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

本发明的另一方面涉及治疗和/或抑制人体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗和/或者抑制人体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染人体治疗有效量的具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，

其中

Z为H或保护基团。

本发明的另一方面涉及治疗和/或抑制个体HIV-1感染的方法。该方法包括给予HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

Y选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；

^*为结合位点；

X选自

每一R₄独立地选自H、CH₃、CH₂-CH₃、NH₂以及OH；

Z为H、保护基团、或BA；

n为1至8的整数；

m为1至6的整数；以及

q为0或1。

本发明的另一方面涉及治疗个体HIV-1感染的方法。该方法包括给予HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，

其中

W为H、OX、或CH₂-OX；以及

每一X独立地为H、糖、或BA，以及其中至少一个X为BA；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

Y选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S；以及

^*为结合位点。

本发明的另一方面涉及治疗人体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗人体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染人体治疗有效量的具有下式的化合物，或其药物可接受的盐，

其中

W为H、OX、或CH₂-OX；以及

每一X独立地为H、糖、或BA，以及其中至少一个X为BA；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

其中

每一X为H或下式的化合物：

其中

^*为结合位点，

n为1至8的整数；

p为0或1；以及

m为1至8的整数；

其中至少一个X不为H。

本发明的另一方面涉及治疗人体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗人体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，

其中

每一X为H或下式的化合物：

其中

^*为结合位点，

n为1至8的整数；

p为0或1；以及

m为1至8的整数；

其中至少一个X不为H。

其中

R为C₁至C₅烷基；

n为5至1000的整数；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

其中

R为C₁至C₅烷基；

n为5至1000的整数；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

虽然现有技术公开了许多不同的具有抗病毒活性的桦木醇衍生物，然而本发明的桦木醇衍生物对人类免疫缺陷病毒特别有效，尤其对HIV-1特别有效。而且，本发明的桦木醇衍生物产生的抗HIV-1活性优于本领域已知的其它桦木醇衍生物。另外，本发明的化合物在不影响细胞增殖的情况下提供了这种较好的抗HIV-1活性。

附图简要说明

图1A-C显示了桦木酮酸及其衍生物的色谱图，带有它们相应的保留时间。仔细查看这些色谱图揭示偶联桦木酮酸单体以及二聚体呈现清晰的色谱图。

图2A包括内校准后的桦木酮酸的部分MS图谱，也包括了校准信号：m/z 365.3016、423.3434、481.3853、539.4272、以及597.4690为聚(丙二醇)双(2-氨基丙醚)的计算质量。在图谱中，发现了[M+H]⁺和[M+NH₄]⁺离子(m/z 455和472，桦木酮酸)，也在MS图谱中看到了源于内源(insource)断裂的减小(m/z为437，桦木酮酸)。图2B显示了桦木酮酸的m/z为544、471、以及455的MS图谱。

图3A-C为单体酯的MS图谱，该图谱显示了单体酯实质上为单一化合物，作为m/z为697的单质子化离子出现(图3A)。从较高分辨率，较慢记录的ESI-MS扫描(图3B)计算出中性化合物的单种同位素分子量为696.5±0.2Da。这种化合物的单质子化正离子是相当不稳定的。正如图3C的产物离子图谱所显示的，m/z为697的离子的碰撞诱导分解(CID)有两种有效途径：一种涉及56Da中性粒子的丢失，另一种涉及100Da中性粒子的丢失。该断裂要求相对较低的碰撞能量(10伏特)。结果表明，在一般的稳定性分子不发生裂解的源条件下，m/z为641和597的离子也出现在图3A的普通质谱图中。

图4A-B显示了二聚体酯的MS图谱。如图4A所示，ESI质谱中最强的峰为m/z为1261的单质子化离子峰。还存在m/z为581、627、639、以及683的少量杂质。由于对该结构的灵敏度低，使用40μM浓度溶液以观察m/z 1261的强峰。如同在单体酯中的断裂，在图4B中主要的断裂过程为丢失100Da的中性粒子，可能以异丁烯+CO₂的形式丢失。在另外的，非常弱的产物离子中，那些在m/z为1204和734时的产物离子是有意义的，因为它们能够分别被解释为是C₄H₈和桦木酮酸残余物的丢失。

图5显示了桦木酮酸浓度相对峰面积的标准溶解度曲线。

图6显示了多种桦木醇衍生物的HIV抑制效果。

图7显示了一些桦木醇衍生物对HIV感染的抑制百分比。

图8显示了一些桦木醇衍生物的不同剂量对HIV感染的抑制百分比。

图9显示了桦木醇的不同剂量对HIV感染的抑制百分比。

图10显示了28-乙酰氧基桦木脑的不同剂量对HIV抑制效果。

图11比较了AZT和桦木酮酸对感染HIV-IIIB的H9细胞的抑制百分比。

图12比较了AZT和桦木酮酸存在条件下，H9(淋巴瘤)细胞的细胞成活力。

图13显示了桦木醇衍生物在CEM(CD4+T)细胞中的抗-HIV活性。

图14显示了患有HIV的患者对AZT抗药性的结果。

图15显示了患有HIV的患者对AZT抗药性的结果。

发明详细说明

本发明涉及治疗个体HIV-1感染的方法。这些方法包括在有效治疗个体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染个体治疗有效量的桦木醇衍生化合物、或其药物可接受的盐或衍生物。

桦木醇和桦木醇衍生物为具有式I的一般化学结构的化合物

其中

R¹选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、以及＝S；以及

R²选自-H、-CH₃、-CHO、-CH₂OH、-CH₂OCH₃、-CH₂OC(O)CH₃、-COCH₃、-COOH、以及-CH＝NNH-2，4-DNP。

表1中总结了桦木醇及其衍生物的具体结构

表1.桦木醇及其衍生物

4.桦木酮酸	R₁-OR₂-COOH	C₃₀H₄₇O₃455
4.桦木酮酸	R₁-OR₂-COOH	C₃₀H₄₇O₃455	5.桦木酮醛	R₁-OR₂-CHO	C₃₀H₄₇O₂439
6.桦木脑二乙酸酯	R₁-OCOCH₃R₂-CH₂OCOCH₃	C₃₄H₅₄O₄526	5.桦木酮醛	R₁-OR₂-CHO	C₃₀H₄₇O₂439
6.桦木脑二乙酸酯	R₁-OCOCH₃R₂-CH₂OCOCH₃	C₃₄H₅₄O₄526	7.桦木脑二甲醚(Cornelon)	R₁-OCH₃R₂-CH₂OCH₃	C₃₂H₅₄O₂470
8.3-乙酰氧基桦木脑	R₁-OCOCH₃R₂-OH	C₃₂H₅₄O₃484	7.桦木脑二甲醚(Cornelon)	R₁-OCH₃R₂-CH₂OCH₃	C₃₂H₅₄O₂470
8.3-乙酰氧基桦木脑	R₁-OCOCH₃R₂-OH	C₃₂H₅₄O₃484	9.28-乙酰氧基桦木脑	R₁-OHR₂-CH₂OCOCH₃	C₃₂H₅₄O₃484
10.3，28-2，4-DNP桦木脑腙	R₁-NNH-2，4-DNPR₂-CH＝NNH-2，4-DNP	C₄₂H₅₅O₈N₆800	9.28-乙酰氧基桦木脑	R₁-OHR₂-CH₂OCOCH₃	C₃₂H₅₄O₃484
10.3，28-2，4-DNP桦木脑腙	R₁-NNH-2，4-DNPR₂-CH＝NNH-2，4-DNP	C₄₂H₅₅O₈N₆800	11.桦木脑3-硫酮	R₁＝SR₂-COOH	C₃₀H₄₆O₂S470

通过升华(Lowitz，Crell′s Annalen 1：312(1788)和Mason，Silliman′s Am.J.，20：282(1831)，在此引入这些文章的全部内容作为参考)或通过使用诸如乙醇的醇提取(Hunefeld，J.Prakt.Chem.7：53(1836)和Hess，Poggendorff′s Annalen 46：319(1839)，在此引入这些文章的全部内容作为参考)，桦木醇能够从白桦树Betula alba外层树皮中被分离出来。一些文献已描述了桦木醇的其他来源及其分离和提纯的方法，例如，Sheth等人，J.Pharm.Sci. 61：1819(1972)(raw vegetables and extracts of Hyptis emory)(生蔬菜和Hyptis emory提取物、)和Sheth等人，J.Pharm．Sci.62：139-140(1973)(Alnusoregonu)，在此引入这些文章的全部内容作为参考。

在优选方法中，桦木醇从花卉肥皂(floral soap)的不可皂化物中被提取出来。简言之，将碾碎的最初叶材(leaf wood)和硫酸盐煮沸法(NaOH，Na₂SO₄，Na₂S₂O₃，Na₂SO₃)的组分分批或连续放入煮沸锅中。在110℃至120℃的温度下，视情况加压，使木质素(木材的成分)溶解。粗纤维素源于由木质素、纤维素、以及黑灰水(blackbuck)构成的浆液。黑灰水为黑灰水与妥尔酸(tall acid)的盐和不可皂化物的组合物。该粗纤维素可用于造纸，而通过离心或沉降方法，将硫酸盐皂(sulfate soap)从黑灰水中分离出来。使用硫酸处理硫酸盐皂制成妥尔油(tall oil)。不可皂化物作为粗桦木醇被分离出来。粗桦木醇通过在诸如丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、丁醇、乙醇等中重结晶生成纯桦木醇。有利的是，在离心或沉降后对黑灰水残余物循环使用。

通过本领域公知的标准方法合成式I的桦木醇衍生化合物。例如，Bomshteyn等人的第6,890,533号美国专利给出了如何合成和制备式I的化合物的详细说明，在此将其全部内容引入作为参考。桦木醇的结构基于四个六元环和一个含有α-异丙基基团的五元E环的30-碳构架。桦木醇的结构组分含有在C-3和C-28上的伯羟基和仲羟基。桦木醇的三个位置一碳3、20、以及28上可发生化学修饰以生成衍生物。下文实施例描述了制备桦木醇衍生化合物的合成方案。

现已发现通过偶联(conjugate)一组溶解性增强化合物的一种或多种可制备水溶性较好的桦木醇衍生物。该偶联物不仅在水溶液中的溶解性显著增大，它还保持了高水平的生物活性，例如包括抗HIV-1感染活性。这是尤为重要的，因为使治疗剂具有更好的溶解性所需的化学作用往往造成该治疗剂生物活性下降，或在某些情况下完全丧失其生物活性。

可用于本发明方法中的偶联桦木醇衍生化合物和免疫偶联桦木醇衍生化合物也可以从桦木醇合成。下文实施例中描述了制备偶联桦木醇衍生化合物和免疫偶联桦木醇衍生化合物的合成方案。

本发明一方面涉及治疗个体HIV-1感染的方法。该方法在包括有效治疗个体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，

其中

R₁选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、和＝S，

R₃选自H和C₁-C₅烷基，

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，n为2至8的整数。

优选上述化合物具有这样的结构，其中：

R₁为＝O、R₃为甲基、以及n为4；

R₁为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或

R₁为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

在实施本发明的这种方法和其他方法中，保护基团Z为H或选自叔丁氧羰基和苄氧羰基。优选地，Z为叔丁氧羰基。

上述方法使用了偶联桦木醇衍生单体化合物，该偶联桦木醇衍生单体化合物可由以下方法制备，该方法包括在有效制备偶联桦木醇衍生单体化合物条件下，由下式的反应物

与下式的桦木醇衍生化合物反应，

其中

R₂为含羰基的基团。

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

在优选实施方案中，n为2至8的整数。

优选上述化合物具有这样的结构，其中：

Y₁和Y₂为＝O、R₃为甲基、以及n为4；

Y₁和Y₂为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或

Y₁和Y₂为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

上述方法使用了偶联桦木醇衍生二聚体化合物，该偶联桦木醇衍生二聚体化合物可通过以下方法制备，该方法包括在有效制备偶联桦木醇衍生二聚体化合物条件下，由下式的反应物

与下式的化合物反应，

本发明的另一方面涉及治疗个体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗个体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式的化合物、或药物可接受的盐或其衍生物，

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，n为2至8的整数。

优选上述化合物具有这样的结构，其中：

Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O、R₃为甲基、以及n为4；

Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或

Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

上述方法使用了偶联桦木醇衍生四聚体化合物，该偶联桦木醇衍生四聚体化合物可由以下方法制备，该方法包括在有效制备偶联桦木醇衍生四聚体化合物条件下，由下式的反应物

与下式的化合物反应，

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

R₃为H或C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

在优选实施方案中，n为2至8的整数。

优选上述化合物具有这样的结构，其中：

Y为＝O、n为5、以及m为4；

Y为＝O、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或

Y为-OH、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

上述方法使用了偶联桦木醇衍生聚合化合物，该偶联桦木醇衍生聚合化合物可通过如下方法制备，该方法包括在有效制备偶联桦木醇偶联聚合化合物条件下，使下式的单体聚合，

本发明的另一方面涉及治疗和/或抑制人体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗和/或抑制人体HIV-1感染条件下，给予感染HIV-1人体治疗有效量的具有下式的化合物、或药物可接受的盐或其衍生物，

其中

n为1至12的整数以及

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，上述化合物作为片剂以1mg-500mg的剂量范围给药。

本发明的另一方面涉及治疗和/或抑制人体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗和/或抑制人体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染人体治疗有效量的具有下式的化合物、或药物可接受的盐或其衍生物，

其中

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，上述化合物作为片剂以1mg-500mg剂量范围给药。

出于本发明的目的，适于实施上述方法的化合物被称为偶联桦木醇衍生化合物，包括偶联桦木醇衍生单体、二聚体、四聚体、以及聚合体。在这里称作免疫偶联桦木醇衍生化合物的化合物也适于实施本发明的方法。通过直接在偶联桦木醇衍生化合物上连接抗体制备免疫偶联桦木醇衍生化合物，包括单体、二聚体、四聚体、以及聚合体。

因此，本发明的另一方面涉及治疗个体HIV-1感染的方法，该方法通过在有效治疗个体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式的化合物、或药物可接受的盐或其衍生物，

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，R₁为＝O且n＝4。

其中

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

在优选实施方案中，Y₁和Y₂为＝O且n＝4。

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O且n＝4。

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合部位；

Q为BA、离去基团、或H；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

在优选实施案中，Y为＝O、n＝5、以及m＝4。

用于制备上述免疫偶联桦木醇衍生化合物和用于上述方法的优选的抗体类型为γ球蛋白。特别优选IgG、IgA、IgE、以及IgM亚类。一些具有代表性的免疫球蛋白为单克隆抗体或多克隆抗体，这些抗体针对人体或动物的肿瘤相关抗原；人B细胞抗原和人T细胞抗原；人Ia抗原；病毒、真菌和细菌抗原；以及与人体炎性反应或过敏反应相关的细胞。

Goding的Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和方法)，2nd.ed.，New York：Academic Press，(1986)；Kennett等人的Monoclonal Antibodies(单克隆抗体)，New York：Plenum Press(1980)；Secher等人的第4,423,147号美国专利；Bieber等人的第4,381,292号美国专利；Kung等人的第4,363,799号美国专利；Galfre等人的第4,350,683号美国专利；Clagett等人的第4,127,124号美国专利中描述了制备针对特定半抗原或抗原靶底物的抗体和单克隆抗体的方法，在此引入这些文章的全部内容作为参考。

依照本发明中的方法，治疗HIV-1感染的优选的个体包括但不限于任何哺乳动物，优选人。

在实施本发明治疗个体HIV-1感染的方法中，优选给予个体治疗有效量的桦木醇衍生化合物以治疗个体的AIDS。可选择地，进行所述给药步骤以阻止感染HIV-1个体的AIDS。

这里所使用的术语“治疗”指改善、阻止、或减轻与HIV-1感染相关的症状和/或影响，包括为了大大减少该状况的可能性或严重性而预防性给予偶联或免疫偶联桦木醇衍生化合物、或其药物可接受的盐或衍生物。

通过在动物中的药理研究，例如，根据Nyberg等人的Psychopharmacology 119：345-348(1995)(在此引入该文章的全部内容作为参考)中的方法，可测定所述化合物的相对活性、功效、以及特异性。虽然通过人体临床研究可以测定患者群中的差异代谢，然而Kerr等人，Biochem.Pharmacol.47：1969-1979(1994)和Karam等人，Drub Metab.Discov.24：1081-1087(1996)中提供了经济并且省时的替代方法，在此引入这些文章的全部内容作为参考。根据Leach等人，Epilepsia 37：1100-1106(1996)中的方法可在临床上鉴定药-药相互作用的可能性，在此引入该文章的全部内容作为参考；或根据Kerr等人，Biochem.Pharmacol.47：1969-1979(1994)和Turner等人，Can.J. Physio.Pharmacol.67：582-586(1989)中的方法可在体外鉴定药-药相互作用的可能性，在此引入这些文章的全部内容作为参考。

化合物的预防剂量或治疗剂量的大小随着待治疗状况的性质和严重度以及给药途径的不同而变化。剂量(可能是剂量频率)也将根据个体的年龄、体重和反应的不同而变化。化合物的总日剂量可以单一剂量或分份剂量给药。

化合物应按有效量给药。用于口服给药的、提供了有效量桦木醇衍生物的桦木醇衍生物参考剂量通常从每单位剂量1mg至每单位剂量2,000mg，更典型地，从每单位剂量10mg至每单位剂量500mg。优选地，剂量范围为1.0mg/kg/天至200mg/kg/天，并且优选剂量范围为1.0mg/kg/天至50mg/kg/天。

还建议儿童、年龄超过65岁的个体和肾功能或肝功能受损的那些个体开始时接受低剂量，并基于个体反应和血液水平，逐步增加剂量。对本领域普通技术人员来说显而易见的是，在某些情况下有必要使用这些范围以外的剂量。此外，应注意的是，根据个体反应临床医生或治疗医生知道如何并且何时中断、调整或终止治疗。

可采用任何适当的给药途径，包括但不限于口服给药、皮内给药、肌内给药、腹膜内给药、静脉内给药、皮下给药、或鼻内给药。药剂可单独给药或与适当的药物载体一同给药，并且该药剂可以为固体形式或液体形式，例如片剂、胶囊、粉剂、溶液、混悬液、或乳剂。剂型例如包括片剂、锭剂、分散体、混悬液、溶液、胶囊、粉剂、溶液、混悬液、乳剂和贴剂。

本发明的药物组合物包括至少一种桦木醇衍生化合物、其药物可接受的盐或衍生物，或它们的组合。这些组合物可以包括药物可接受的载体、以及任选的其他治疗成分或赋形剂。

术语“其药物可接受的盐”指由药物可接受的、无毒性的酸制成的盐。所述的酸包括无机酸和有机酸，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸(ethenesulfonic acid)、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、以及对甲苯磺酸。

药物组合物可方便地以单位剂型存在，并且可以通过任何一种制药领域公知的方法制备。优选的单位剂量制剂为那些包含有效量或其适当部分的活性成分的制剂。

本发明的组合物可以包括药物可接受的载体。根据给药所需的方式，例如，口服的或胃肠外的(包括静脉内的)，载体可以采取多种形式。在制备口服剂型的组合物中，可以采用任何常见的药物介质，例如，在包括混悬剂、酏剂和溶液在内的口服液体制剂情况下，可使用水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、以及着色剂。在固体口服制剂优于液体口服制剂时，在诸如粉剂、胶囊、囊片的口服固体制剂情况下，可以使用诸如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘结剂以及崩解剂的载体。由于片剂或胶囊便于给药，因此它们为优选的固体口服制剂。如果需要，可以使用标准的水性或非水性技术对片剂进行包被。也可使用口服或胃肠外缓释剂型。

口服糖浆以及其他口服液体制剂是本领域技术人员公知的，并且在任何规范的药剂学校的课本中都能找到制备它们的通常方法。例如，在第19版的Remington：The Science and Practice ofPharmacy(药物科学和实践)第86章题为：“Solutions，Emulsions，Suspensions and Extracts(溶液、乳剂、混悬剂和提取物)”中详尽描述了糖浆(第1503-1505页，在此引入其全部内容作为参考)和其他口服液的制备的全部细节。

类似地，缓释制剂也是本领域公知的，在该参考文献的第94章题为“Sustained-Release Drug Delivery Systems(缓释药物传递系统)”中描述了较常见类型的口服缓释剂型和胃肠外缓释剂型(第1660-1675页，在此引入其全部内容作为参考)。与常规的口服剂型相比较，由于控释剂型减少了峰值血浆浓度，因此它尤其有益于提供治疗血浆浓度，同时避免了与常规剂型出现的高峰值血浆浓度相关的副作用。

固体单位剂型可以为常规类型。固体形式可以为胶囊，例如普通明胶类型，它含有桦木醇衍生物和诸如润滑剂和惰性填料(如乳糖、蔗糖、或玉米淀粉)的载体。在另一个实施方案中，这些桦木醇衍生物可以使用常规的片剂基质与粘合剂、崩解剂、以及润滑剂结合制成片剂。其中，片剂基质例如为乳糖、蔗糖、或玉米淀粉；粘合剂例如为阿拉伯胶、玉米淀粉、或明胶；崩解剂例如为玉米淀粉、马铃薯淀粉、或褐藻酸；润滑剂例如为硬脂酸或硬脂酸镁盐。

所述药物组合物还可以以可注射剂型给药，该注射剂型为这些物质与药物载体在生理可接受的稀释剂中的溶液和混悬液。这些载体包括无菌液体，例如添加有或没有添加表面活性剂、辅助剂、赋形剂、或稳定剂的水和油类。可用于举例的油类为源于石油、动物、植物、或合成的那些油，例如花生油、大豆油、或矿物油。通常，尤其对于注射用的溶液，优选的液体载体为水、盐水、葡萄糖溶液和相关的糖溶液、以及诸如丙二醇或聚丙二醇的二醇类。

为了用作气溶胶，在溶液或混悬液中的所述药物组合物可与合适的推进剂和常规辅助剂一起包装进加压的气溶胶容器中，所述推进剂例如为烃类推进剂，例如丙烷、丁烷、或异丁烷。药物组合物也可以以非加压形式给药，例如处于喷雾器或雾化器中。

本发明也涉及使用桦木醇衍生化合物抑制细胞内HIV-1活性的方法。

因此，依据本发明的一个方面，提供感染HIV-1的细胞，并在有效抑制细胞内HIV-1活性条件下使细胞与具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物接触，

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基，

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，n为2至8的整数。

优选上述化合物具有这样的结构，其中：

R₁为＝O、R₃为甲基、以及n为4；

R₁为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或

R₁为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

本发明的另一方面涉及抑制细胞内HIV-1活性的方法。该方法包括提供感染HIV-1的细胞，并在有效抑制细胞内HIV-1活性条件下使细胞与具有下式的化合物、或药物可接受的盐或衍生物接触，

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，R₁为＝O且n＝4。

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

在优选实施方案中，n为2至8的整数。

优选上述化合物具有这样的结构，其中：

Y₁和Y₂为＝O、R₃为甲基、以及n为4；

Y₁和Y₂为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或

Y₁和Y₂为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

本发明的另一方面涉及抑制细胞内HIV-1活性的方法。该方法包括提供感染HIV-1的细胞，并在有效抑制细胞内HIV-1活性条件下使细胞与具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物接触，

其中

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

在优选实施方案中，Y₁和Y₂为＝O且n＝4。

本发明的另一方面涉及抑制细胞内HIV-1活性的方法。该方法包括提供感染HIV-1的细胞，并在有效抑制细胞HIV-1活性条件下使细胞与具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物接触，

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，n为2至8的整数。

优选上述化合物具有这样的结构，其中：

Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O、R₃为甲基、以及n为4；

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

在优选实施方案中，Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O且n＝4。

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

R₃为H或C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

在优选实施方案中，n为2至8的整数。

优选上述化合物具有这样的结构，其中：

Y为＝O、n为5、以及m为4；

Y为＝O、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4；或

Y为-OH、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

在优选实施方案中，Y为＝O、n＝5、以及m＝4。

在实施本发明抑制细胞内HIV活性的方法中，“接触”可随意进行，包括但不限于在适合的生长培养基中接触培养的细胞。或者，小鼠、大鼠或其他哺乳动物可被注射所述化合物。

其他桦木醇衍生化合物也服从本发明的方法。特别地，除上述偶联物和免疫偶联物的制备外，还可通过多种其他的方法获得提高了溶解性的桦木醇衍生化合物。在一个优选实施方案中，通过在桦木醇衍生物的C28或C3位连接增溶剂获得提高了溶解性的桦木醇衍生化合物。优选的增溶剂包括但不限于聚乙二醇(PEG)或miniPEG。PEG化学是公知的，并且可被用于将PEG连接到桦木醇衍生物。

在另一个优选实施方案中，通过使用亲水性氨基酸获得提高了溶解性的优选桦木醇衍生化合物。具体地，亲水性碱性氨基酸(Lys、Arg、或His)可连接到桦木醇衍生物。也可使用其他高亲水性氨基酸(Glu、Asp、Gln、或Asn)。2-肽，例如Lys-Lys、Lys-His、Lys-Arg、Arg-His、Lys-Glu、Arg-Gln、Lys-Gln，和3-肽可用于增强桦木醇衍生物的溶解性。此外，2-肽和3-肽可能包括在性质上适度亲水的氨基酸((Tyr、Trp、Ser、Thr、以及Gly)。这些肽的偶合(coupling)作用可以发生在受阻位(hindered position)，使得该肽的亲水部分仍可用于溶剂化。

例如外加用于保护其他残基上活性基团的反应步骤，可采用类似于本文公开的将赖氨酸与桦木醇衍生物偶合的方法进行包含赖氨酸残基的肽的偶合。类似地，可使用与这里公开的赖氨酸偶联类似的方法，将具有伯胺或仲胺(即Arg和His)的氨基酸或包含具有伯胺或仲胺的氨基酸残基的肽连接到桦木醇衍生物。形成的其他氨基酸或肽偶联物的化学反应是本领域所属技术人员所公知的。

在另一个优选实施方案中，诸如亚精胺、腐胺、以及精胺的聚胺可被连接到桦木醇衍生物以提高溶解性。这些化合物通过伯胺或仲胺基团被连接。

碳水化物部分可被连接到桦木醇衍生物以提高溶解性。所述的碳水化物部分包括(1)单糖(例如葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、以及果糖)、(2)二糖(例如蔗糖和麦芽糖)、以及(3)氨基糖(例如葡萄糖胺、半乳糖胺、2-氨基-2-脱氧-葡萄糖醛酸、2-氨基-2-脱氧-葡萄糖、2-氨基-2-脱氧-3-O-_-D-吡喃葡萄糖基(glucopyranurosyl)-D-半乳糖、galactonojirimycin、gluconojirimycin、以及其衍生物)。环糊精可被连接到桦木醇衍生物以提高溶解性。该环糊精包括，例如，2-氨基-2-脱氧-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-半乳糖、α-环糊精(6个葡萄糖残基)、β-环糊精(7个葡萄糖残基)、以及γ-环糊精(8个葡萄糖残基)。

应用糖化学领域所熟知的方法可使碳水化物偶合到桦木醇衍生物。

使用下述方法也可提高桦木醇衍生化合物的溶解性：将桦木醇衍生物连接到糖分子的4个甘氨酸链的每一个上(或对于赖氨酸为2个桦木酮酸基团)，其中每个甘氨酸链约含有2-3个甘氨酸分子，所述糖分子预留一个OH基团以与抗体结合。在一个优选实施方案中，使用甘氨酸链可提高在有机溶液中的溶解性并且避免受阻。示例性的结构如下：

其中

为BA-氨基酸-O；

BA是具有下式的化合物

其中

Y选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-DNP、以及＝S，以及

^*为结合位点，有助于使BA连接到该示例性结构。

可选择地，与留下OH基团以连接抗体不同，其可被连接到脂。示例性结构如下：

其中

为BA-氨基酸-BA；

BA是具有下式的化合物

其中

^*为结合位点，有助于使BA连接到该示例性结构；

p为1至10的整数；

n为1至6的整数；以及

m为1至6的整数。

虽然没有与抗体形成偶联物，然而整个化合物是水溶性的。而且，由于整个化合物是生物相容的，因而没有毒性。

在另一个实施方案中，可以使用含有NH₂和COOH基团的长链，交替出现末端OH基团。通过将桦木醇衍生化合物连接到NH₂基团可获得这些结构。然后OH基团可用于连接抗体。示例性结构如下：

其中BA是具有下式的化合物

其中

^*为结合位点，有助于使BA连接到该示例性结构；以及

n为1至6的整数。

可以在链上使用羧酸与胺的不同比例。

其中

BA是具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

X选自

每一R₄独立地选自H、CH₃、CH₂-CH₃、NH₂以及OH；

Z为H、保护基团、或BA；

n为1至8的整数；

m为1至6的整数；以及

q为0或1。

本发明的另一方面涉及治疗个体HIV-1感染的方法。该方法包括给予HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式化合物或其药物可接受的盐，

其中

W为H、OX、或CH₂-OX；以及

每一X独立地为H、糖、或BA，以及其中至少一个X为BA；

以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

本发明的另一方面涉及治疗人体HIV-1感染的方法。该方法包括在有效治疗人体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染人体治疗有效量的具有下式的化合物或药物可接受的盐，

其中

W为H、OX、或CH₂-OX；以及

每一X独立地为H、糖、或BA，且其中至少有一个X为BA；

以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

其中

每一X为H或具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

n为1至8的整数；

p为0或1；以及

m为1至8的整数；

其中至少一个X不为H。

其中

每一X为H或具有下式的化合物：

其中

Y选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-二

硝基苯基肼、以及＝S；

^*为结合位点；

n为1至8的整数；

p为0或1；以及

m为1至8的整数；

其中至少一个X不为H。

其中

R₁为C₁至C₅烷基；

n为5至1000的整数；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

其中

R₁为C₁至C₅烷基；

n为5至1000的整数；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

实施例

以下实施例旨在举例说明本发明的实施，而无意限制其范围。

实施例1-桦木醇及其衍生物的分离和结构

桦木醇从粗硫酸盐皂的非皂化部分中被分离出来，该粗硫酸皂盐为通过在110℃至120℃的温度下，在NaOH、Na₂SO₄、Na₂S₂O₃和Na₂SO₃中煮沸白桦树外层树皮而制得。然后采用诸如丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、丁醇、乙醇等的溶剂使桦木醇结晶。桦木醇的化学结构为：

桦木醇是非类固醇的、羽扇豆醇衍生的、五环的、苯乙烯基团的羽扇多环烷排列(lupan-row)醇。桦木醇(也称为桦木脑)的化学式为C₃₀H₅₀O₂，分子量为442.7g/mol。桦木醇的结构为基于四个六元环和一个含有α-异丙基基团的五元E环的30-碳构架。桦木醇的结构组分在C-3和C-28位具有伯羟基和仲羟基。桦木醇的三个位置(C-3、C-20、以及C-28)可发生化学修饰生成衍生物。由于可得到桦木醇以及它能够与多种其他有机化合物反应，合成了11种桦木醇衍生物，如方案1所示。

方案1.桦木醇衍生物的合成

可通过多种方式制备烷基化桦木醇衍生物。使用适当的氧化试剂处理桦木醇可得到酮衍生物，所述氧化剂例如为琼斯试剂(Jone’s reagent)或吡啶鎓氯铬酸盐(PCC)(Kim等人，SyntheticCommunications 27：1607-1612(1 997)；Komissarova等人，Chemistryof National Compounds 38：58-61(2002)；Ito等人，J.Nat.Prod.64：1278-1281(2001)，在此引入这些文章的全部内容作为参考)。在优选方法中，首先将桦木醇溶解在丙酮中，然后在0℃下使用氧化剂氧化，合成桦木醇羰基衍生物，例如桦木酮醛、桦木脑醛、桦木酮酸、以及桦木酮酸。通过酰化反应制备桦木脑乙酸酯衍生物-桦木脑二乙酸酯、3-乙酰氧基桦木脑、以及28-乙酰氧基桦木脑(Kim等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，8：1707-1712(1998)；Hiroya等人，Bioorg.Med.Chem.10：3229-3236(2002)，在此引入这些文章的全部内容作为参考)。具体地，使用无水乙酐处理桦木醇的干燥吡啶溶液，并搅拌6小时。后处理通过使用乙酸乙酯稀释、并用10％的HCl和饱和NaHCO₃洗涤生成的混合物来完成，得到桦木脑二乙酸酯、3-乙酰氧基桦木脑、以及28-乙酰氧基桦木脑。通过烷基化反应制备桦木脑二甲醚。将碘代甲烷加入到NaOH和桦木醇的干燥四氢呋喃溶液中，得到的产物回流40小时。将干燥的四氢呋喃、甲基碘加入到NaOH和桦木醇组成的溶液中，得到的产物回流40小时。逐滴加入蒸馏水以终止反应。使用柱色谱后获得桦木脑二甲醚。通过使用草酰氯处理获得氯羰基桦木脑(Sun等人，J.Med.Chem.45：4271-4275(2002)，在此引入该文章的全部内容作为参考)。将草酰氯溶液加入到桦木酸中并搅拌2小时。在真空下除去大部分溶剂。另加入干燥CH₂Cl₂，随后浓缩得到氯羰基桦木脑。

实施例2-由桦木醇合成桦木酮酸

在典型的方法中，将500mg桦木醇(1)加入到1.2g新活化的4_分子筛、1.2gC盐、1.2g硅酸镁载体(florisil)、500mg乙酸钠、以及1.2g吡啶鎓氯铬酸盐在25mL CH₂Cl₂中形成的悬浮液中。将混合物搅拌2小时，然后通过230-400目和60_的2.5×15cm硅胶柱(HF-254，E.Merck)过滤。在真空中蒸发滤液。所得残余物经硅胶柱色谱后回收370mg白色固态桦木酮醛(2)。将桦木酮醛溶解在17mL含有877mg NaH₂PO₄·H₂O的CH₃CN-H₂O中并冷却到0℃-5℃。先后加入220μL、30％的H₂O₂水溶液和溶解在16mL水中的200mg NaClO₂。让混合物升至室温并搅拌1小时。通过加入380mg的Na₂S₂O₅使反应淬灭。使用300mL的乙酸乙酯萃取桦木酮酸。用水和盐水洗涤该有机萃取液，并用100mg Na₂SO₄干燥。有机溶液经滤纸过滤，蒸发滤液。所得残余物经硅胶柱色谱后回收347mg白色固体粉末状的桦木酮酸(3)。将使用上述方法制备的桦木酮酸的产率和活性与使用琼斯试剂制备的桦木酮酸(Kim等人的Synthetic Communications 27：1607-1612(1997)，在此引入该文章的全部内容作为参考)进行比较。

实施例3-化学特性的结果：GC

通过进行气相色谱研究桦木酮酸及其衍生物的纯度。每个样品各取8μL注射，得到下列保留时间(t_R)：

表2.气相色谱中的保留时间

样品	保留时间(t_R)
样品	保留时间(t_R)	桦木酮酸	11.044
单体	10.936	桦木酮酸	11.044
单体	10.936	二聚体	10.793

图1A-C显示了典型的桦木酮酸及其衍生物的色谱图，带有它们相应的保留时间。仔细查看这些色谱图揭示偶联桦木酮酸单体以及二聚体呈现清晰的色谱图。

实施例4-光谱分析

表3总结了总结了合成的桦木酮酸衍生物的NMR位移。

表3.桦木酮酸衍生物的NMR化学位移

为了解析桦木酮酸及其衍生物的分子结构，随后对它们进行光谱分析。电喷雾质谱分析证实这些化合物的五环苯乙烯特征。在带有电喷雾(ES)离子化的Micromass Quattro II三联四极杆仪器上使用正离子模式对样品进行质谱分析。样品作为在75∶25∶2(v/v)的乙腈-水-乙酸中标称的(nominal)200μM浓度溶液，以5μL/min的速率被连续注入。必要时，通过在仪器的轰击小室内维持4×10^-3mBar的氩气压力来获得产物离子图谱。

图2A包括内校准后的桦木酮酸的部分MS谱图，也包括了校准信号：m/z 365.3016、423.3434、481.3853、539.4272、以及597.4690为聚(丙二醇)双(2-氨基丙醚)的计算质量。在谱图中，发现了[M+H]⁺和[M+NH₄]⁺离子(m/z 455和472，桦木酮酸)，也在MSMS图谱中看到了源于内源(insource)断裂的减小(m/z为437，桦木酮酸)。图2B显示了桦木酮酸的m/z为544、471、以及455的MSMS图谱。

单体酯的MS图谱(图3A-C)显示了单体酯实质上为单一化合物，作为m/z为697的单质子化离子出现(图3A)。从较高分辨率、较慢记录的ESI-MS扫描(图3B)计算出中性化合物的单种同位素分子量为696.5±0.2Da。这种化合物的单质子化正离子是相当不稳定的。正如产物离子图谱(图3C)所显示的，m/z为697的离子的碰撞诱导应分解(CID)有两种有效途径：一种涉及56 Da中性粒子的丢失，另一种伴随100Da中性粒子的丢失。该断裂要求相对较低的碰撞能，10伏特。结果表明，在一般的稳定性分子不发生裂解的源条件下，m/z为641和597的离子也出现在图3A的普通质谱图中。

图4A-B显示了二聚体酯的MS谱图。如图4A所示，ESI质谱中最强的峰为m/z为1261的单质子化离子峰。还存在m/z为581、627、639、以及683的少量杂质。由于对该结构的灵敏度低，使用40μM浓度溶液以观察m/z 1261的强峰。如同在单体酯中的断裂，在图4B中主要的断裂过程为丢失100Da的中性粒子，可能以异丁烯+CO₂的形式丢失。在另外的、非常弱的产物离子中，那些m/z为1204和734的产物离子是有意义的，因为它们能够分别被解释为是C₄H₈和桦木酮酸残基的丢失。

实施例5-单赖氨酸化桦木酮酸的合成

从Sigma-Aldrich获得具有下式(4)的N_α-丁氧羰基-N_ε-苄氧羰基-赖氨酸(Boc-Lys(Cbz)-OH)。丁氧羰基(Boc)和苄氧羰基(Cbz)分别保护C-2和C-6位的两个胺。

按照Kobayashi等人，J.Org.Chem.66：6626-6633(2001)所描述的方法制备N_α-丁氧羰基-N_ε-苄氧羰基-赖氨酸甲酯(Boc-Lys(Cbz)-OMe)，在此引入该文章的全部内容作为参考。在室温下，边搅拌边将5mL的无水甲醇加入到含有1.0g(Boc-Lys(Cbz)-OH)(4)的7.5mL三甲基甲硅烷基重氮甲烷中。在室温下搅拌混合物20分钟，真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱得到1.0g下式(5)的Boc-Lys(Cbz)-OMe：

将1.0g Boc-Lys(Cbz)-OMe(5)溶解在40mL的MeOH∶乙酸乙酯中。向该溶液中加入100mg处于活性碳上的钯(Pd/C)。该溶液在氢气下搅拌2小时。有机溶液经C盐过滤，并以10mL MeOH洗涤。滤液经减压蒸馏得到式(6)的白色固态Boc-Lys-OMe，它可直接用于桦木酮酸(3)的偶联。

按照Zhao等人，J.Org.Chem.69：270-279(2004)描述的方法进行桦木酮酸和Boc-Lys-OMe单体的偶联，在此引入该文章的全部内容作为参考。边搅拌边将940mg的桦木酮酸(3)、350mg的1-羟基苯并三唑水合物(“HOBt”)、530mg的1，3-二环己基碳二亚胺(“DCC”)、以及435μL的三乙胺加入到冰浴的30mL溶有Boc-Lys-OMe(6)的无水四氢呋喃(“THF”)溶液中。在0℃下搅拌混合物2小时，然后在室温下搅拌48小时。得到的悬浮液经滤纸过滤，滤液真空浓缩。所得残余物经硅胶柱色谱获得1.3g下式(7)的白色固态单体。

实施例6-两个单赖氨酸化桦木酮酸的偶联

将150mg的单体(7)和10.9mg的一水合氢氧化锂(LiOH·H₂O)溶解在3mL的THF和100μL的H₂O中。在室温下搅拌所得溶液直至通过薄层色谱(“TLC”)的监测显示(7)完全反应。该溶液在真空中浓缩。所得固体经硅胶柱色谱获得142.6mg下式(7a)的白色固态单体-Boc。

按照Chun等人，J.Org.Chem.69：7344-7347(2004)描述的方法制备单体-OMe(N_ε-桦木酮羰基-赖氨酸甲酯)，在此引入该文章的全部内容作为参考。具体地，在0℃下将20mg的单体(7)溶解在1mL的无水CH₂Cl₂中。将11μL三氟乙酸(TFA)在11μL CH₂Cl₂中的溶液逐滴加入。反应混合物在室温下搅拌12小时。溶剂在真空下被蒸发。使用石油醚研磨所得残余物。该有机溶剂在真空下被蒸发获得下式(7b)的粗单体-OMe：

在0℃下，将6mg的DCC加入到19mg单体-Boc(7a)和4.1mgHOBt在0.5mL干燥二甲基甲酰胺(DMF)中形成的溶液中。搅拌混合物30分钟后，逐滴加入11.6μL三乙胺和(7b)在0.5mL干燥DMF中形成的溶液。在0℃下持续搅拌4小时，然后在室温下持续搅拌3天。溶剂被减压蒸发，所得的残余物经硅胶柱色谱获得28.3mg的下式(8)的白色固态二聚体。

实施例7-两个二聚体的偶联

将150mg二聚体(8)和10.9mg LiOH·H₂O溶解在3mL THF和100μL H₂O中。在室温下搅拌所得溶液直至经TLC监测到(8)完全反应。该溶液在真空中浓缩。所得固体经硅胶柱色谱获得142.6mg下式(8a)的白色固态二聚体-Boc。

在0℃下，将100mg二聚体(8)溶解在1mL无水CH₂Cl₂中。逐滴加入31μL TFA在31μL CH₂Cl₂中形成的溶液。反应混合物在室温下搅拌12小时。溶剂在真空下被蒸发。使用石油醚研磨所得残余物。该有机溶剂在真空下被蒸发，获得下式(8b)的粗二聚体-OMe。

在0℃下，将18mg DCC加入到100mg二聚体-Boc(8a)和12mg的HOBt在2mL干燥DMF中形成的溶液中。混合物被搅拌30min后，逐滴加入22μL三乙胺和(8b)在1.7mL干燥DMF中形成的溶液。在0℃下持续搅拌4小时，然后在室温下持续搅拌5天。溶剂被减压蒸发，所得的残余物经硅胶柱色谱得到20.8mg式(9)的白色固态四聚体。

将8.3mg四聚体(9)和1mg LiOH·H₂O溶解在300μL MeOH和50μL H₂O中。在室温下搅拌所得溶液直至通过TLC监测到(9)完全反应。溶液在真空中浓缩。所得固体经硅胶柱色谱得到3mg白色固态四聚体-Boc(10)和3.4mg未反应的四聚体(9)。

缩写为

的四聚体(9)可用于式(15)的五聚体-BA的合成，该五聚体-BA包含6个桦木酮酸(3)分子。具体地，四聚体(9)可进行选择性脱保护以除去Boc基团，生成式(11)的四聚体-OMe。(11)与式(12)的单体衍生物的偶联可以生成式(13)的五聚体-OMe。(13)经水解选择性除去甲酯可形成五聚体(15)：

另外，四聚体-OMe(11)可直接与桦木酮酸(3)而不是单体衍生物(12)连接。这将产生式(16)的四聚体-BA，该四聚体-BA包含5个桦木酮酸(3)分子。(11)与桦木酮酸(3)的偶联生成式(14)的四聚体-BA-OMe。(14)经相同的水解除去甲酯生成式(16)的四聚体-BA。

实施例8-使用6分子桦木酮酸制备五聚体

五赖氨酸与桦木酮酸的偶联是制备五聚体的简单且直接的方法。然而，因为五赖氨酸自身容易聚合和环化，所以不含有任何保护基团的五赖氨酸不稳定。五赖氨酸的C-1a羧基基团很容易与C-2e上的α-胺或与另一分子C6(a-e)上的伯胺偶合形成聚合物。该聚合物由不同数目的氨基酸基团组成，可产生不同长度的肽。另外，偶合反应可在同一分子中发生，所述的偶联反应连接五赖氨酸的氨基和羧基末端并环化，如下图所示：

需要五赖氨酸衍生物与桦木酮酸偶联。此外，式(17)的五赖氨酸甲酯具有被酯保护的C-1a羰基，其他的所有胺均可进行偶联。具体地，五赖氨酸甲酯(17)能与6分子的桦木酮酸(3)反应，并在DCC和HOBt的催化下生成式(18)的五聚体甲酯。使酯通过水解除去甲基保护基团，生成式(19)的五聚体，该五聚体含有6分子的桦木酮酸。带有6分子桦木酮酸和自由羧基的五聚体(19)可以用于与抗体的免疫偶联。

实施例9-免疫偶联物

通过α-球蛋白和赖氨酸化桦木酮酸的偶联制备桦木脑衍生物的免疫偶联物。先前描述的合成结构修饰方案被看作是一个开端，它创造了单克隆抗体结合的位点。作为探查性的可行性研究，将单体经活化的羰基基团(COOH)与兔的γ-球蛋白偶联。目前，正在验证碳二亚胺法。这种生物偶联反应使用了不同的活化中间体。

按照以1，3-二环己基碳二亚胺(“DCC”)进行的碳二亚胺法，将上述的单体(13mg、0.02mmol)溶解在0.2mL含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)(3.3mg、0.03mmol)和20％摩尔过量的DCC的干燥DMF中。在4℃下搅拌18小时后，在有力搅拌下将得到的活化酯缓慢加入到蛋白溶液(溶有10mgγ-球蛋白的2mL 0.1M碳酸盐缓冲液，pH＝9.6的)。在4℃下，反应混合物被轻度搅拌24小时直至偶联完成，然后使用pH＝7.2的含有0.015M NaCl的250mL 0.01M磷酸钠缓冲液(PBS)对反应混合物完全透析(Spectra/Por 7，SpectrumLaboratories)72h，更换两次缓冲液，获得单体-抗体偶联物。该混合物被离心(10,500rpm)6分钟，然后贮存上清液用于细胞培养。

按照以1-乙基-3，3-二甲基氨基丙基碳二亚酰(“EDC”)进行的碳二亚胺法，新鲜配制EDC溶液(将0.4mg EDC溶于50μL DMF)和NHS溶液(将0.4mg NHS溶于25μL DMF)并将其加入到单体溶液(将0.2mg单体溶于500μL DMF)中。将反应保持在室温下30分钟，然后保持在4℃下过夜。将混合物缓慢加入到2mgγ球蛋白，其在4℃下对pH＝9.4的250mL 0.1M碳酸盐缓冲液透析18小时。在4℃下反应过夜。使该反应混合物对pH＝7.2的含有0.015 NaCl的250mL0.01M磷酸钠缓冲液(PBS)透析72h，更换两次缓冲液，获得单体-抗体偶联物。该混合物被离心(10,500rpm)6分钟，贮存沉淀物用于细胞培养。

实施例10-一般实验步骤

色谱法

采用230-440目的9385级硅胶(E.Merck)进行快速柱色谱(“FCC”)。采用步级溶剂极性梯度。在预先涂覆至0.25mm厚的硅胶60(HF-254，E.Merck)的铝片上进行TLC。

NMR谱

适度纯的产物使用Varian Inova AS 500光谱仪在500MHz下操作，其配有5mm三重共振三轴梯度探头。使用100％甲醇进行温度较准，校准值由Varian Instruments(Palo Alto，CA)提供。质子频率参照CDCl₃。采用提供的VNMR软件进行NMR数据处理和Varian Instruments光谱积分。所有的NMR谱图取自NMR CoreFacility Department of Chemistry，Hunter College，The CityUniversity of New York。

质谱

在Biopolymer Mass Spectrometry Core Facility(CornellUniversity)获得的精确质量分析是在带有电喷雾离子化的Micromass Quattro II三重四极杆仪器上以正离子模式进行的。样品作为在75∶25∶2(v/v)的乙腈-水-乙酸中标称的200μM浓度溶液，以5μL/min的速率被连续注入。必要时，通过在仪器的轰击小室内维持4×10^-3mBar的氩气压力来获得产物离子图谱。

气相色谱

为了避开评估桦木脑衍生化合物的纯度的问题，开发了快速气相色谱法。30mm×25mm×0.25μm薄膜厚度的含5％苯基和95％二甲基聚硅氧烷的石英玻璃毛细管柱SAC-5为桦木脑衍生物提供可复现的相对保留时间。所有的色谱分析均在Shimadzu GasChromatograph-14A上进行，典型的设置为：

GC柱：含5％苯基和95％二甲基聚硅氧烷的SAC-5石英玻璃毛

细管柱；

30mm×25mm×0.25μm薄膜厚度；

在运行所有样品前老化(conditioned)过夜

流速：60mL/min

气体压力：空气(50kPa)；H₂(55kPa)；p1(80kPa)；p2(150kPa)

温度：300℃进样器/柱/检测器

进样器：分流

检测器：FID

样品体积：氯仿中8μL

实施例11-桦木酮酸的标准溶解度曲线

为了确定桦木酮酸及其衍生物在不同溶剂中的溶解度，生成了氯仿中不同浓度的桦木酮酸(表4)相对来自气相色谱的相应峰面积的标准溶解度曲线。

表4.桦木酮酸在氯仿中的标准度曲线

BA的浓度(mol/L)	BA的浓度(mg/mL)	峰面积(×10^-4)
BA的浓度(mol/L)	BA的浓度(mg/mL)	峰面积(×10^-4)	0.5	227	286.5
0.25	113.5	78.0	0.5	227	286.5
0.25	113.5	78.0	0.125	56.8	46.8
0.0625	28.4	51.4	0.125	56.8	46.8
0.0625	28.4	51.4	0.01	4.5	17.4
0.005	2.3	5.3	0.01	4.5	17.4
0.005	2.3	5.3	0.001	0.5	9.5

通过气相色谱(“GC”)分析8μL各已知浓度的桦木酮酸和未知浓度的溶液。桦木酮酸浓度对峰面积的标准溶解度曲线如图5所示。含有未知浓度桦木酮酸的溶剂被蒸发。将残余物溶解氯仿中，在GC上分析。应用色谱中相应的峰值从标准曲线确定未知浓度桦木酮酸的浓度。

桦木酮酸的标准溶液的制备如下：将45.4mg桦木酮酸溶解在200μL纯氯仿中，得到浓度为0.5mol/L的桦木酮酸。在三次两倍稀释后，获得三种不同的已知浓度(0.25mol/L、0.125mol/L、0.0625mol/L)的桦木酮酸。将2.27mg桦木酮酸溶解在500μL纯氯仿中，得到浓度为0.01mol/L的桦木酮酸。两倍稀释该溶液得到浓度为0.005mol/L的桦木酮酸。将0.227mg桦木酮酸溶解在500μL纯氯仿中，得到浓度为0.001mol/L的桦木酮酸。

实施例12-桦木酮酸及其衍生物在用培养基稀释的DMSO中的溶解度

将3mg桦木酮酸溶解在200μL纯DMSO中。然后使用含10％胎牛血清(“FBS”)的培养基稀释在纯DMSO中的桦木酮酸溶液，得到DMSO的浓度为1％，桦木酮酸的浓度为1×10^-3mol/L(0.5mg/mL)。由于桦木酮酸不能完全溶解，在10,500rpm下将该悬浮液离心5分钟。通过标准溶解度曲线确定在沉淀物和上清液中的桦木酮酸的浓度。3mg桦木酮酸中仅有0.4mg被溶解。剩余的2.6mg桦木酮酸为沉淀。因此，13％桦木酮酸完全溶解。

由于培养液中1％DMSO不足以溶解3mg的桦木酮酸，因此逐步增加培养液中DMSO浓度直至桦木酮酸完全溶解。表5列出了逐步增加DMSO的实验结果。如表5所示，用培养液稀释到20％的220μL纯DMSO可完全溶解0.5mg桦木酮酸及其衍生物，得到澄清溶液。

表5.逐步增加DMSO浓度的实验结果

	1	2	3	4
	1	2	3	4	BA(mg)	0.5	0.5	0.5	0.5
用于溶解BA的纯DMSO的体积(μL)	33	103	153	220	BA(mg)	0.5	0.5	0.5	0.5
用于溶解BA的纯DMSO的体积(μL)	33	103	153	220	培养基体积(mL)	1.07	1.0	0.95	0.88
稀释后总体积(mL)	1.1	1.1	1.1	1.1	培养基体积(mL)	1.07	1.0	0.95	0.88
稀释后总体积(mL)	1.1	1.1	1.1	1.1	BA浓度(mg/mL)	0.5	0.5	0.5	0.5
BA浓度(mol/mL)	1×10^-3	1×10^-3	1×10^-3	1×10^-3	BA浓度(mg/mL)	0.5	0.5	0.5	0.5
BA浓度(mol/mL)	1×10^-3	1×10^-3	1×10^-3	1×10^-3	DMSO在总体积中的％	3％	9％	14％	20％
溶液状态	悬浮液	悬浮液	浑浊	澄清溶液	DMSO在总体积中的％	3％	9％	14％	20％

冻干每种桦木酮酸及其衍生物的溶液并用乙醚提取。然后将乙醚蒸发。包含桦木酮酸和/或其衍生物的残余物在氯仿中重溶解并在GC上分析。用GC分析上述溶液中的药物浓度，并从标准溶解度曲线中确定其浓度。计算的在20％DMSO的培养液的桦木酮酸和/或其衍生物的浓度如表6所示。

表6.BA或衍生物在20％DMSO中的浓度

	药物量(mg)	含20％DMSO的培养基的体积(ml)	药物浓度(mg/mL)	药物浓度(mol/L)
	药物量(mg)	含20％DMSO的培养基的体积(ml)	药物浓度(mg/mL)	药物浓度(mol/L)	Boc-单体	1.0	1.5	0.7	1×10^-3
Boc-二聚体	1.0	1.6	0.6	5×10^-4	Boc-单体	1.0	1.5	0.7	1×10^-3
Boc-二聚体	1.0	1.6	0.6	5×10^-4	Boc-四聚体	1.0	1.7	0.6	2.5×10^-4

由GC测定的桦木酮酸的浓度接近于计算值(表7)，因此确定大部分桦木酮酸和/或其衍生物完全溶解。这些试验为体外细胞毒性测定提供了化合物在培养液基中的DMSO中的精确溶解度。

表7.计算的桦木酮酸和衍生物的浓度值

	1	2	3	4
	1	2	3	4	化合物名称	桦木酮酸	Boc-单体	Boc-二聚体	Boc-四聚体
在含20％DMSO的培养基中的浓度(mol/L)	1×10^-3	1×10^-3	5×10^-4	2.5×10^-4	化合物名称	桦木酮酸	Boc-单体	Boc-二聚体	Boc-四聚体
在含20％DMSO的培养基中的浓度(mol/L)	1×10^-3	1×10^-3	5×10^-4	2.5×10^-4	桦木酮酸部分的浓度(mol/L)	1×10^-3	1×10^-3	1×10^-3	1×10^-3
总体积(mL)	1.4	0.75	0.75	0.93	桦木酮酸部分的浓度(mol/L)	1×10^-3	1×10^-3	1×10^-3	1×10^-3
总体积(mL)	1.4	0.75	0.75	0.93	氯仿(μL)	100	100	100	100
GC谱面积(×10^-4)	6.9	4.0	N/A	3.7	氯仿(μL)	100	100	100	100
GC谱面积(×10^-4)	6.9	4.0	N/A	3.7	计算的桦木酮酸浓度(mol/L)	0.92×10^-3	0.97×10^-3	N/A	0.72×10^-3

实施例13-桦木酮酸在乙醇和培养基中的溶解度

选择乙醇作为生物相容溶剂用于体内研究。多至43.3mg的桦木酮酸完全溶解在1mL纯(100％)乙醇中，得到饱和溶液。可用培养基稀释该溶液，使得0.8mg桦木酮酸完全溶解在1.76mL含有10％人血清以及10％乙醇浓度的培养基中，得到1×10^-3mol/mL(0.5mg/mL)浓度的桦木酮酸。

实施例14-桦木酮酸在含有人γ-球蛋白、人白蛋白和乙醇的磷酸盐缓冲液(PBS)中的溶解性

人γ-球蛋白和人白蛋白是人血清中两种主要的生物相容成分。将桦木酮酸溶解在纯乙醇中，并用含有不同浓度的人γ-球蛋白和人白蛋白的PBS稀释(表8)。

表8.用不同浓度的PBS稀释桦木酮酸

桦木酮酸(mg)	乙醇(μL)	人γ-球蛋白(在PBS中为27mg/mL)(mL)^*	人白蛋白(在PBS中为42mg/mL)(mL)^*	浓度(mol/L)	现象
桦木酮酸(mg)	乙醇(μL)	人γ-球蛋白(在PBS中为27mg/mL)(mL)^*	人白蛋白(在PBS中为42mg/mL)(mL)^*	浓度(mol/L)	现象	1.3	280	2.50	0	1×10^-3	悬浮液
1.0	220	1.48	0.49	1×10^-3	混浊	1.3	280	2.50	0	1×10^-3	悬浮液
1.0	220	1.48	0.49	1×10^-3	混浊	1.5	330	1.48	1.48	1×10^-3	轻微混浊
1.4	308	0.69	2.07	1×10^-3	近似澄清	1.5	330	1.48	1.48	1×10^-3	轻微混浊
1.4	308	0.69	2.07	1×10^-3	近似澄清	1.6	352	0.32	2.85	1×10^-3	澄清溶液
1.3	280	0	2.50	1×10^-3	完全澄清	1.6	352	0.32	2.85	1×10^-3	澄清溶液

^*人γ-球蛋白或人白蛋白在PBS中的百分比与在人血清中的百分比相同。

如表8所示，随着人白蛋白浓度的增加，桦木酮酸可以溶解在PBS中。桦木酮酸可完全溶解在含10％乙醇的人白蛋白PBS溶液中，得到浓度为1×10^-3摩尔/L的桦木酮酸。

实施例15-桦木酮酸在人血清中的溶解度

用纯人血清稀释溶解在纯乙醇中的桦木酮酸以使其保持溶液状态，如表9所示。表9的结果表明了：1.34mg桦木酮酸溶解在31μL纯乙醇中，并用人血清稀释，得到乙醇的最终浓度为4.2％，药物的浓度为4×10^-3mol/L。该化合物保持溶解，适于体内研究。因此，桦木醇及其衍生物在生物相容介质中的溶解性已被改善。

表9.用人血清稀释溶解在纯乙醇中的桦木酮酸

桦木酮酸(mg)	乙醇体积(μL)	人血清体积(μL)	总体积(mL)	桦木酮酸浓度(mol/L)	桦木酮酸浓度(mg/mL)	现象
桦木酮酸(mg)	乙醇体积(μL)	人血清体积(μL)	总体积(mL)	桦木酮酸浓度(mol/L)	桦木酮酸浓度(mg/mL)	现象	1.34	31	700	731	4×10^-3	1.8	澄清溶液

另外，桦木酮酸及其赖氨酸化衍生物可完全溶解在纯乙醇中，用含4％人白蛋白(与人血清中白蛋白浓度类似)的PBS稀释得到乙醇的最终浓度为10％，桦木酮酸的浓度为1×10^-3mol/L。这些体外研究结果与以前的结果一致。体内研究中，具有前列腺癌细胞异种移植物的小鼠对终浓度为22％的乙醇和2×10^-3mol/L的桦木酮酸的溶解桦木酮酸及单体-Boc有很好的耐受。

额外加入10％甘油有助于延长桦木酮酸及其衍生物的处于溶液状态的时间。

实施例16-细胞样品的制备

在37℃下，将人T-B杂交瘤细胞系174XCEM暴露在低感染复数(“MOI”)(MOI＝1.0)的储备(stock)HIV-1 IIIB分离株(isolate)中2小时，使用磷酸盐缓冲液(“PBS”)洗涤3次，然后在表10所示的各种药剂存在下以250,000细胞/孔接种。二甲亚砜(“DMSO”)缓冲液用作“无病毒”对照。已知具有HIV-1抑制活性的可购得的合成肽-血小板反应蛋白肽(“TSP”)用作“抑制活性”对照。使用两种HIV分离株：患者分离株(“子HIV”)和利用标准CXCR4共受体的分离株IIIB。

表10.测试药剂

药剂	浓度
药剂	浓度	TSP肽(“对照”)	1μg/ml
桦木醇(“OL”)	1μg/ml(溶于DMSO)	TSP肽(“对照”)	1μg/ml
桦木醇(“OL”)	1μg/ml(溶于DMSO)	桦木酮酸(“BOA”)	1μg/ml(溶于DMSO)
3-乙酰氧基桦木脑(“BL”)	1μg/ml(溶于DMSO)	桦木酮酸(“BOA”)	1μg/ml(溶于DMSO)
3-乙酰氧基桦木脑(“BL”)	1μg/ml(溶于DMSO)	桦木脑二甲酯(“BDE”)	1μg/ml(溶于DMSO)
28-乙酰氧基桦木脑(“BU”)	1μg/ml(溶于DMSO)	桦木脑二甲酯(“BDE”)	1μg/ml(溶于DMSO)
28-乙酰氧基桦木脑(“BU”)	1μg/ml(溶于DMSO)	桦木酮醛(“AL”)	1μg/ml(溶于DMSO)
桦木脑二乙酸酯(“BA”)	1μg/ml(溶于DMSO)	桦木酮醛(“AL”)	1μg/ml(溶于DMSO)

实施例17-HIV抑制效果的测定

这里描述的测定方法在本领域是公知的，该测试方法例如被详细描述在Crombie等人的J.Exp.Med.187：25-35(1998)，在此引入该文章的全部内容作为参考。

将培养物维持在培养基(RPMI-1640+10％胎牛血清(“FBS”))中4天，然后收集培养上清液，使用Triton^_-X100表面活性剂进行溶解，采用标准技术-抗原捕获ELISA(酶联免疫吸附测定)(Roche-NEN)评估HIV-1 gag(p24)抗原活性。

结果如图6所示，以光密度(“OD”)单位表示数据，在0.15 OD至1.5 OD范围内与p24的浓度ng/ml呈线性关系。使用标准曲线可以将该数据转换为HIV-1抗原浓度pg/ml。(注：“无病毒”DMSO对照的OD读取值＜0.05，该值未出现在图6中；“对照”代表TSP肽的“抑制作用”对照。)

令人惊讶地，如从图6中可清楚看到的，桦木脑二甲酯(BDE)、3-乙酰氧基桦木脑(BL)以及28-乙酰氧基桦木脑(BU)提供的抗HIV-1活性优于本领域先前公开的其他桦木醇衍生物。桦木酮酸和桦木脑二乙酸酯的抗HIV活性之前已被公开，例如，Lee等人的第6,172,110号美国专利，在此引入该文章的全部内容作为参考。桦木酮醛的抗HIV活性之前已被公开，例如，Pezzuto等人的第5,869,535号和第6,225,353号美国专利，在此引入这些文章的全部内容作为参考。

实施例18-对细胞存活的影响

在第4天和第7天利用锥虫蓝排除评估细胞样品。与现有技术桦木脑衍生物如桦木酮酸不同，桦木脑二甲酯、3-乙酰氧基桦木脑、以及28-乙酰氧基桦木脑对总细胞数或细胞存活没有影响。

实施例19-抗HIV-1效果

已知的抗HIV-1抑制性肽血小板反应蛋白(TSP)产生92％的抑制作用。DMSO对照和OL显示无效果。如图7所示，桦木酮醛(AL)显示出37％的抑制作用，桦木醇二乙酸酯(BA)显示出57％的抑制作用。

实施例20-剂量依赖性抗HIV-1效果

如图8所示，以剂量为0.5μg/ml、1.5μg/ml、以及2μg/ml的桦木酮醛(AL)和桦木脑二乙酸酯(BA)测试剂量相关效果。图8显示了抗HIV-1效果逐步递增，且也无细胞毒性。如图9所示，不同剂量的母体化合物桦木醇(OL)(1.3μg/ml、1.6μg/ml、以及2μg/ml)显示逐渐增加的抗-HIV效果。如图10所示，不同剂量的28-乙酰氧基桦木脑(BU)(0.5μg/ml、1μg/ml、1.5μg/ml、以及2μg/ml)显示出类似的抗-HIV-1活性。由于对当前培养体系而言，用于溶解这些药剂的介质(DMSO)浓度不能太高，所以不能使用高于2μg/ml的剂量。

实施例21-对另一种HIV-1分离株慢性感染的174XCEM细胞的作用

还评估了药剂对另一种HIV-1分离株慢性感染的174XCEM细胞的作用。在这种体系中，标准的抗HIV TSP肽没有作用。桦木醇和桦木酮醛稍有影响。当单次测试剂量为1μg/ml时，桦木脑二乙酸酯显示20％的抑制作用。虽然在用慢性感染细胞所做的本试验中观察的活性度是有限的，但是应当指出除α干扰素外，目前没有抗HIV药剂对病毒从慢性感染细胞中释放有任何影响。

实施例22-桦木醇衍生物与已知的HIV抑制剂的抗-HIV-1活性的比较

病毒分离株：对所有已知的抗-HIV化合物具有高灵敏度的标准HIV-1实验室分离株IIIB，以及两种对抗-HIV药物有不同灵敏度的从海地(Haiti)获取的患者分离株。

靶细胞：生长在培养基(RPMI 1640+10％热灭活的FBS)中的CD4+Jurkat和CEM-SS人T淋巴母细胞。使用Ficol-paque(Amersham-Pharmacia)经密度梯度离心从肝素化静脉血中得到人外围血单核细胞(“PBMC”)。为了感染HIV，在暴露于HIV-1之前，使用1μg/ml植物凝集素(“PHA”)和32U/ml白细胞介素-2(“IL-2”)对PBMC预活化2-3天。

HIV感染：如之前所述进行HIV-1感染。简言之，在37℃下，使2.5×10⁵个靶细胞(细胞系或PHA-活性PBMC)暴露于储备病毒(500pg HIV-1 p24抗原)2小时，用PBS洗涤两次，并用新鲜培养基接种。每3-4天从每孔中取出一半的培养上清液，并用新鲜培养基替换。在病毒接种后不同时间点，用抗原捕获ELISA(Roche-NEN)测定HIV-1活性，该ELISA是针对被Triton^_-X 100溶解的培养上清液中的HIV-1 p24 gag蛋白质。

药物：逆转录酶抑制剂AZT和HIV蛋白酶抑制剂利托那韦(ritonavir)和那非那韦(nelfinavir)被单独使用，以及在潜在协同试验中与式I的化合物一起使用。在靶细胞接种病毒之前或之后两小时，将药物加入到靶细胞培养物中。AZT的使用浓度为0.01μM-5μM，蛋白酶抑制剂的使用浓度为0.5μM-10μM。

实施例23-使用纯化的病毒酶，桦木醇衍生物对HIV-1 RT和蛋白酶的作用

为了评估式I的化合物的反应机理，测定了式I的化合物对两种关键病毒酶的直接作用。

纯化的病毒酶：对应于天然RT二聚体(66kd/51kd)纯度＞98％的逆转录酶得自National Institute of Health(“NIH”)AIDS Researchand Reference Reagent Program(目录号3555)。HIV-1蛋白酶(KIIA，分子量为10.7kd)从同样来源(目录号4375)获得。该蛋白酶除了有四个氨基酸置换外，它与野生型HIV-1 IIIB(HXB2克隆)相同，其中所述置换赋予对自身蛋白酶解和氧化失活的高度抗性，使体外测定更容易。

HIV酶测定：加入不同浓度的式I的化合物，使用polyrA/T作为底物以及AZT作为阳性对照，通过ELISA(Roche-NEN)测定HIVRT。使用跨越HIV gag的p17/p24接合点的9氨基酸合成肽作为底物，HIV蛋白酶被类似地测定。在10min内，对这种肽的特异活性为12.1μM/min/mg。

实施例24-桦木醇衍生物对细胞增殖的影响

评估式I的化合物对细胞的影响，该影响可指出毒性或非特异的抗病毒性质。通过标准方法评估不同剂量的式I的化合物对T细胞增殖的影响。另外，评估了这些化合物在所用的抗-HIV剂量时以及这些化合物在高浓度时可能的细胞凋亡诱导作用。

细胞凋亡鉴定：用TO-PRO-3染色法评估细胞凋亡水平(VanHooijdonk等人的Cytometry 17：185-189(1994)，在此引入该文章的全部内容作为参考)。简言之，使细胞在载玻片上风干，在室温下用4％低聚甲醛固定10min，使用PBS洗涤，并在-20℃下用70％EtOH处理15min。将载玻片在1∶9的乙酸∶乙醇溶液中固定1小时，洗涤，然后用2％Triton^_-X 100处理2min，接着在4℃下暴露于RNAse A 20min。加入2-3滴0.5μM的TO-PRO-3溶液(MolecularProbes，Invitrogen Life Technologies，Eugene，OR)，室温下，使载玻片在暗处孵育10min。然后洗涤载玻片，用抗淬灭剂Vectashield(Vector Labs，Inc.，Burlingame，CA)处理载玻片，封片，以及利用荧光显微镜观察膜和核的完整性情况。

实施例25-桦木醇衍生物对HIV结合靶细胞的影响

该实施例是对式I的化合物作用机制的进一步研究，确定这些化合物是否具有一些膜特异性，干扰HIV gp120被膜结合到两个病毒受体：CD4和共受体(CXCR4或CCRS)。

HIV被膜蛋白：采用CXCR4表型(从如上所述的NIH AIDSProgram得到)和CCR5表型的重组体HIV-1 gp120。

靶细胞：采用具有HIV共受体和CD4(CEM-T)或共受体但没有CD4(CEM-SS)的靶T细胞。也采用具有CRCR4但没有CCR5(M07E)的不同的靶细胞。

细胞表面SDF-1/gp120结合测定法：HIV被膜与CXCR4的结合及其与SDF-1的竞争通过非常灵敏的荧光结合测定法来评估。这涉及到寡聚物X4 gp160(代表gp120的多聚体)和其非共价结合的跨膜部分：gp41。这种类型的测定为gp120-CXCR4在体外相互作用的低亲和性所必需，与gp120结合到其另一趋化因子受体CCR5不同(Linet al.，J. Virol.77：931-942(2003)，将其整体在此引入作为参考)。详细的方法(包括证实该结合测定法的特异性和独立于CD4)已出版(Staudinger et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.280：1003-1007(2001)；Bandres et al.，J.Virol，72：2500-2504(1998)，将其整体在此引入作为参考)。

在37℃将不同浓度的寡聚物X4 gp160加入到靶细胞1小时。随后洗涤细胞，并与特异于gp120的C端的10μg/ml人mAb 1331A一起孵育，或与针对HIV-1核心蛋白p24的人mAb一起孵育(作为对照)，两者都被偶联到藻红蛋白(“PE”)，并评估荧光强度。可检测到由人抗gp120 mAb所检测到的固定量的寡聚病毒被膜被增加量的式I的化合物所置换。对CD4(单克隆抗体)CXCR4(SDF-1,500至1500ng/ml)和CCP5(1500ng/ml RANTES)的阳性对照包括在内。

实施例26-桦木醇衍生物对HIV启动子(LTR)驱动的转录的影响评估了式I的化合物对HIV启动子(LTR)驱动的转录的影响，着重于HIV-1 Tat和NPκB的活性。

质粒构建、质粒转染和报告基因测定法：报告质粒pC15CAT(Arya et al.，Science 229：69-73(1985)，将其整体在此引入作为参考)包含SV40调节基因、细菌氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)和HIV-1长末端重复(“LTR”)序列。HIV-1 tat质粒pCV-1(Arya et al.，Science229：69-73(1985)，将其整体在此引入作为参考)包含具有tat两个外显子的1.8kb cDNA片段。为了转染，细胞用无血清RPMI-1640洗涤，每种条件下将2×10⁶个细胞随同2-6μg质粒DNA和DMRIE-C转染试剂(Gibco，Life Technologies，Gaithersburg，MD)一起在1mlOptimum培养基(Gibco，Life Technologies，Gaithersburg，MD)中悬浮。细胞在37℃孵育5小时，加入含有10％FBS的新鲜RPMI 1640。转染36小时后，用化合物处理所选的样品。采用试剂盒(Roche)按照厂商的说明进行CAT测定。

电泳迁移率变动分析(“EMSA”)：它是评价NFκ活性的标准分析法。靶细胞在存在已知的NFκB活化剂(TNF-α)或与HIV-1一起暴露于单独的式I的化合物48小时。随后用核提取试剂盒(Sigma)制备核提取物。10μg的核提取物溶解在包含如下成分的缓冲液中：1 ng32P-5′末端标记的κB探针、1μg聚(dI-dC)、50ng超声处理的鲑鱼精DNA、10mM MgCl₂、25mM KCl、1mM DTT、12.5mM HEPES pH7.8、10％甘油、以及0.05％Nonidet p-40。混合物在4℃孵育15分钟，结合蛋白质的DNA复合物在6％的聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳进行分析。对照包括以对探针50倍过量加入的未标记的κB寡核苷酸进行的竞争分析法。

实施例27-应用H9(淋巴瘤细胞)测定桦木醇衍生物对HIV感染的抑制作用

将1.5×10⁵的H9细胞在37℃暴露于储备HIV-1 IIIB分离株(MOI为1.0)2小时，用PBS洗涤3次，在存在桦木酮酸、有或没有AZT的情况下，接种在含10％FBS的1mL的RPMI培养基中。在第三天，一半的培养基(0.5mL)用新鲜的培养基和适合的药物替代。在第七天，收集培养上清液，溶解在Triton-X100中，应用标准测定法(p24ELISA Kit，来自Perkin Elmer，Wellesley，MA)评价HIV-1 Gag抗原p24，并用光密度(“OD”)单位表示。结果如图11所示。OD单位的减少表示药物对HIV感染的抑制效果。这些方法来自Crombie et al.，J.Exp.Med.187：25-35(1998)，将其整体在此引入作为参考。

实施例28-比较存在AZT和桦木酮酸时淋巴瘤细胞的成活力

将1.5×10⁵的H9(淋巴瘤)细胞在存在0、2、5、10和20mM的桦木酮酸和AZT时，接种在含有10％FBS的1mL的RPMI培养基中，并在37℃孵育。在第三天，药物对细胞成活力的影响应用锥虫蓝染料排除分析法(Trypan Blue Dye Exclusion Assay)评价。结果如图12所示。数据代表了活细胞数和百分比。化学物质从Sigma Aldrich购得。

实施例29-应用克伦比方法(Crombie′s Method)测定桦木醇衍生物对HIV感染的抑制作用

采用HIV-1分离株IIIB储备病毒进行急性HIV感染。简言之，使CEM(CD4+T)细胞(2.5×10⁵个靶细胞)在37℃以0.02或0.15的MOI暴露于储备病毒2小时，用PBS洗涤两次，再接种在具有0.3ml新鲜培养基的组织培养微孔中。将溶解在DMSO中的式I的化合物加入到培养物中，并参照已知的抗HIV药物血小板反应蛋白(TSP)确定抗HIV活性。接种三天后，将每个孔的培养上清液的一半用新鲜培养基替换。在第七天利用Triton X-100溶解的培养上清液测定HIV活性，其采用针对HIV-1 p24(Gag)核心蛋白(Dupont MedicalProducts，Boston，MA)的ELISA抗原捕获分析法。抑制作用以对照的百分数计算。血小板反应蛋白(TSP)的使用浓度为1mg/mL，产生51％的抑制。式I的化合物的使用浓度也为1ug/mL。结果如图13所示。

实施例30-桦木酮酸作为抗AZT抗性的化合物

为了评价桦木酮酸和其衍生物的抗HIV活性，从用AZT治疗之前和之后的HIV患者中获得分离株。这些分离株用于在体外感染MT-2细胞。第五天(图14)和第八天(图15)的试验结果表明了从治疗后的患者中得到的分离株变得抗AZT。AZT和桦木酮酸对抗AZT分离株的作用显示了在第五天AZT是无效的，然而桦木酮酸在HIV感染中显示了44％的抑制作用。在第八天，桦木酮酸的抑制作用进一步增强。预期其他的桦木醇衍生物会对抗-AZT的HIV株产生显著更高的抑制作用，这些桦木醇衍生物如桦木醇醛和二乙酸酯以及它们的偶联物，包括肽偶合的化合物(例如，通过赖氨酸、组氨酸、精氨酸连接)。

这些结果提示了治疗对AZT或其他抗HIV治疗变得有抗性的患者的可能性。

尽管已在本文中详细叙述和描述了优选的实施方案，但相关领域技术人员显然可在不脱离本发明的精神下作出各种各样的修改、添加和置换等，因此，这些应被认为处于所附权利要求定义的本发明的范围内。

Claims

1.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

在有效治疗个体HIV-1感染条件下，给予所述HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，

其中

R₁选自-CH₃、＝O、-OH、-OCH₃、-OC(O)CH₃、-NNH-2，4-二硝基苯基肼、以及＝S，

R₃选自H和C₁-C₅烷基，

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述个体为哺乳动物。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述化合物作为片剂以1mg-500mg的剂量范围给药。

4.如权利要求1所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

5.如权利要求1所述的方法，其中R₁为＝O、R₃为甲基、以及n为4。

6.如权利要求1所述的方法，其中R₁为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

7.如权利要求1所述的方法，其中R₁为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

8.如权利要求1所述的方法，其中n为2-8。

9.如权利要求1所述的方法，其中为治疗所述个体的AIDS而进行所述给药。

10.如权利要求1所述的方法，其中为阻止感染HIV-1的所述个体的AIDS而进行所述给药。

11.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

12.如权利要求11所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

13.如权利要求11所述的方法，其中R₁为＝O且n为4。

14.如权利要求11所述的方法，其中为治疗所述个体的AIDS而进行所述给药。

15.如权利要求11所述的方法，其中为阻止感染HIV-1的所述个体的AIDS而进行所述给药。

16.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述个体为哺乳动物。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述化合物作为片剂以1mg-500mg的剂量范围给药。

19.如权利要求16所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

20.如权利要求16所述的方法，其中Y₁和Y₂为＝O、R₃为甲基、以及n为4。

21.如权利要求16所述的方法，其中Y₁和Y₂为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

22.如权利要求16所述的方法，其中Y₁和Y₂为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

23.如权利要求16所述的方法，其中n为2-8。

24.如权利要求16所述的方法，其中为治疗所述个体的AIDS而进行所述给药。

25.如权利要求16所述的方法，其中为阻止感染HIV-1的所述个体的AIDS而进行所述给药。

26.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

27.如权利要求26所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

28.如权利要求26所述的方法，其中Y₁和Y₂为＝O且n为4。

29.如权利要求26所述的方法，其中为治疗所述个体的AIDS而进行所述给药。

30.如权利要求26所述的方法，其中为阻止感染HIV-1的所述个体的AIDS而进行所述给药。

31.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述个体为哺乳动物。

33.如权利要求31所述的方法，其中所述化合物作为片剂以1mg-500mg的剂量范围给药。

34.如权利要求31所述的方法，其中Z选自叔丁氧羰基和苄氧羰基。

35.如权利要求31所述的方法，其中Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O、R₃为甲基、以及n为4。

36.如权利要求31所述的方法，其中Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

37.如权利要求31所述的方法，其中Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

38.如权利要求31所述的方法，其中n为2-8。

39.如权利要求31所述的方法，其中为治疗所述个体的AIDS而进行所述给药。

40.如权利要求31所述的方法，其中为阻止感染HIV-1的所述个体的AIDS而进行所述给药。

41.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

42.如权利要求41所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

43.如权利要求41所述的方法，其中Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O且n为4。

44.如权利要求41所述的方法，其中为治疗所述个体的AIDS而进行所述给药。

45.如权利要求41所述的方法，其中为阻止感染HIV-1的所述个体的AIDS而进行所述给药。

46.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

R₃为H或C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述个体为哺乳动物。

48.如权利要求46所述的方法，其中所述化合物作为片剂以1mg-500mg的剂量范围给药。

49.如权利要求46所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

50.如权利要求46所述的方法，其中Y为＝O、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

51.如权利要求46所述的方法，其中Y为-OH、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

52.如权利要求46所述的方法，其中n为2-8。

53.如权利要求46所述的方法，其中为治疗所述个体的AIDS而进行所述给药。

54.如权利要求46所述的方法，其中为阻止感染HIV-1的所述个体的AIDS而进行所述给药。

55.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

56.如权利要求55所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

57.如权利要求55所述的方法，其中Y为＝O、n为5、以及m＝4。

58.如权利要求55所述的方法，其中为治疗所述个体的AIDS而进行所述给药。

59.如权利要求55所述的方法，其中为阻止感染HIV-1的所述个体的AIDS而进行所述给药。

60.抑制细胞中HIV-1活性的方法，所述方法包括：

提供感染HIV-1的细胞，以及

在有效抑制细胞内HIV-1活性条件下使所述细胞与具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物接触，

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基，

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

61.如权利要求60所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

62.如权利要求60所述的方法，其中R₁为＝O、R₃为甲基、以及n为4。

63.如权利要求60所述的方法，其中R₁为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

64.如权利要求60所述的方法，其中R₁为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

65.如权利要求60所述的方法，其中n为2-8。

66.抑制细胞内HIV-1活性的方法，所述方法包括：

提供感染HIV-1细胞，以及

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

67.如权利要求66所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

68.如权利要求66所述的方法，其中R₁为＝O且n为4。

69.抑制细胞内HIV-1活性的方法，所述方法包括：

提供感染HIV-1的细胞，以及

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

70.如权利要求69所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

71.如权利要求69所述的方法，其中Y₁和Y₂为＝O、R₃为甲基、以及n为4。

72.如权利要求69所述的方法，其中Y₁和Y₂为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

73.如权利要求69所述的方法，其中Y₁和Y₂为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

74.如权利要求69所述的方法，其中n为2-8。

75.抑制细胞内HIV-1活性的方法，所述方法包括：

提供感染的HIV-1细胞，以及

其中

Z为H或保护基团；以及

n为1至12的整数。

76.如权利要求75所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

77.如权利要求75所述的方法，其中Y₁和Y₂为＝O且n为4。

78.抑制细胞内HIV-1活性的方法，所述方法包括：

提供感染HIV-1的细胞，以及

其中

R₃选自H和C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

79.如权利要求78所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

80.如权利要求78所述的方法，其中Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O、R₃为甲基、以及n为4。

81.如权利要求78所述的方法，其中Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

82.如权利要求78所述的方法，其中Y₁，Y₂，Y₃、以及Y₄为-OH、R₃为H、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

83.如权利要求78所述的方法，其中n为2-8。

84.抑制细胞内HIV-1活性的方法，所述方法包括：

提供感染HIV-1的细胞，以及

其中

n为1至12的整数；以及

Z为H或保护基团。

85.如权利要求84所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

86.如权利要求84所述的方法，其中Y₁、Y₂、Y₃、以及Y₄为＝O且n为4。

87.抑制细胞内HIV-1活性的方法，所述方法包括：

提供感染HIV-1的细胞，以及

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

R₃为H或C₁-C₅烷基；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

88.如权利要求87所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

89.如权利要求87所述的方法，其中Y为＝O、n为5、以及m为3。

90.如权利要求87所述的方法，其中Y为＝O、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

91.如权利要求87所述的方法，其中Y为-OH、Z为-C(＝O)-O-叔丁基、以及n为4。

92.如权利要求87所述的方法，其中n为2-8。

93.抑制细胞内HIV-1活性的方法，所述方法包括：

提供感染HIV-1的细胞，以及

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

Q为BA、离去基团、或H；

n为1至12的整数；以及

m为1至6的整数。

94.如权利要求93所述的方法，其中Z选自丁氧羰基和苄氧羰基。

95.如权利要求93所述的方法，其中Y为＝O、n＝5、以及m＝4。

96.治疗和/或抑制人体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

在有效治疗和/或抑制人体HIV-1感染条件下，给予所述HIV-1感染人体治疗有效量的具有下式的化合物、或其药物可接受的盐或衍生物，

其中

n为1至12的整数，以及

Z为H或保护基团。

97.如权利要求96所述的方法，其中所述化合物作为片剂以1mg-500mg的剂量范围给药。

98.治疗和/或抑制人体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

Z为H或保护基团。

99.如权利要求98所述的方法，其中所述化合物作为片剂以1mg-500mg的剂量范围给药。

100.治疗和/或抑制个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

给予HIV-1感染个体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，

其中

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点；

X选自

每一R₄独立地选自H、CH₃、CH₂-CH₃、NH₂以及OH；

Z为H、保护基团、或BA；

n为1至8的整数；

m为1至6的整数；以及

q为0或1。

101.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

W为H、OX、或CH₂-OX；以及

每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

102.治疗人体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

在有效治疗人体HIV-1感染条件下，给予HIV-1感染人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，

其中

W为H、OX、或CH₂-OX；以及

每一X独立地为H、糖、或BA，并且其中至少一个X为BA；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

103.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

每一X为H或下式的化合物：

其中

^*为结合位点，

n为1至8的整数；

p为0或1；以及

m为1至8的整数；

其中至少一个X不为H。

104.治疗人体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

在有效治疗人体HIV-1感染条件下，给予所述HIV-1感染人体治疗有效量的具有下式的化合物或其药物可接受的盐，

其中

每一X为H或下式的化合物：

其中

^*为结合位点，

n为1至8的整数；

p为0或1；以及

m为1至8的整数；

其中至少一个X不为H。

105.治疗个体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

R为C₁至C₅烷基；

n为5至1000的整数；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。

106.治疗人体HIV-1感染的方法，所述方法包括：

其中

R为C₁至C₅烷基；

n为5至1000的整数；以及

BA为具有下式的化合物：

其中

^*为结合位点。