CN103109728A

CN103109728A - 一种长白松试管内快速育苗方法

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Publication number: CN103109728A
Application number: CN2013100744534A
Authority: CN
Inventors: 顾地周; 顾川岳; 姜云天; 朱俊义; 程广有; 潘雨; 禚玲玲; 张学士; 王秋爽; 付航
Original assignee: Tonghua Normal University
Current assignee: Tonghua Normal University
Priority date: 2013-03-10
Filing date: 2013-03-10
Publication date: 2013-05-22
Anticipated expiration: 2033-03-10
Also published as: CN103109728B

Abstract

本发明涉及一种植物繁殖技术，即一种长白松试管内快速育苗方法。其步骤如下：（1）将长白松野生植株主干枝条水培，处理后留茎段和茎尖作为外植体备用；（2）基本培养基＋吲哚丁酸0.07～0.08mg·L^-1＋萘乙酸0.03～0.04mg·L^-1＋玉米素0.16～0.17mg·L^-1＋赤霉素2.90～3.20mg·L^-1；（3）长白松植株的快速繁殖、炼苗和移栽。采用长白松野生植株的主干茎段为材料，在试管内调控主干茎段生根同时主干芽萌发生长，以达到茎节增殖的一步快繁目标，解决了种子繁殖困难和扦插繁殖生根率和移栽成活率低及野生资源受灭绝性威胁等问题，为进一步人工规模化繁殖和栽培长白松提供优质种苗。

Description

一种长白松试管内快速育苗方法

技术领域　

本发明涉及一种植物繁殖技术，即一种长白松试管内快速育苗方法。

背景技术

在现有技术中，长白松[Pinus sylvestris var. sylvestriformis（Takenouchi）Cheng et C. D. Chu]又称美人松，松科松属常绿乔木，是长白松特有种。该种在长白山区数量稀少，分布区域十分狭窄，仅集中分布在长白山国家级自然保护区（100余hm²）和安图县二道白河镇（100余hm²），其余散生在二道白河和三道白河沿岸的针阔混交林和针叶林中。被《中国珍稀濒危保护植物名录（第一册）》定为渐危种，国家三级重点保护植物。被《国家重点保护野生植物名录（第一批）》定为国家一级重点保护植物。被《中国物种红色名录》定为濒危种（NE）。在《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》一文中被定为省级一类重点保护植物。长白松材质好，易加工，耐腐蚀，不扭不裂，是良好的材用树种。松节和花粉入药，主治风湿性关节炎、大骨节病、眩晕、胃痛等。也可作东北及华北地区的绿化及造林树种。

长白松通常以插条扦插或种子繁殖为主，但其种子小、种皮坚硬，种子萌发率较低；插条扦插繁殖不仅生根率和移栽成活率极低，而且导致野生资源受到灭绝性威胁。长白松大规模人工栽培、开发和利用受到极大限制。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种利于长白松茎段生根同时顶芽萌发生长成苗，满足人工规模化繁殖和栽培的长白松试管内快速育苗方法。

本发明的技术解决方案是：一种长白松试管内快速育苗方法，其步骤如下：

（1）将长白松野生植株主干枝条水培使其主干芽萌发生长，处理后留茎段和茎尖作为外植体备用。

（2）基本培养基中进行茎段生根同时顶芽萌发生长成苗：基本培养基成分和含量为：100.0 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，650.0 mg·L^-1KNO₃，32.0 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，38.0 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，90.0 mg·L^-1KH₂PO₄；2.8 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，2.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.30 mg·L^-1KI，1.0 mg·L^-1H₃BO₃；4.5 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.0 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；0.2 mg·L^-1烟酸，0.2 mg·L^-1盐酸吡哆醇(VB₆)，1.30 mg·L^-1甘氨酸；附加吲哚丁酸0.07～0.08 mg·L^-1＋萘乙酸0.03～0.04 mg·L^-1＋玉米素0.16～0.17 mg·L^-1＋赤霉素2.90～3.20 mg·L^-1 ；琼脂条7.5 g·L^-1，添加食用白糖30.0 g·L^-1，调节pH值至5.8，嫩茎段在光照周期8 h·d^-1、光照强度1000 lx和温度24±2℃条件下培养。优选吲哚丁酸0.08 mg·L^-1＋萘乙酸0.04 mg·L^-1＋玉米素0.17 mg·L^-1＋赤霉素3.20 mg·L^-1 。

（3）长白松植株的快速繁殖、炼苗和移栽。

步骤（1）中水培前把将长白松野生植株主干枝条置于-10～0 ℃的冰柜中休眠50 d。

步骤（1）的处理是指待主干萌发生长至3.0～4.0 cm时，将主干剪下并切割成段后，摘去嫩针叶及短小叶柄，用5%碳酸钠溶液浸泡3 min以除去表面油脂，75%乙醇涮洗30 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡8 min，无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分。

步骤（3）中的快速繁殖是指按每瓶接种8个茎段，40天为1个周期，每个茎段在1个培养周期内平均可切割成4～5段计算，每年有多个周期进行扩繁。

步骤（3）的炼苗和移栽是指种苗扩繁到一定数量后，选取1.00 cm以上的小植株进行炼苗移栽，小植株成活率可达到92.8%以上。

本发明的优点是：1、本发明利用植物组织培养技术，采用长白松野生植株的主干茎段为材料，在试管内调控主干茎段生根同时主干芽萌发生长，以达到茎节增殖的一步快繁目标，利于长白松茎段生根同时顶芽萌发生长成苗，解决了种子繁殖困难和扦插繁殖生根率和移栽成活率低及野生资源受灭绝性威胁等问题。2、本发明为进一步人工规模化繁殖和栽培长白松提供优质种苗。3、成苗率达99.5%以上；小植株成活率可达到92.8%以上。

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

具体实施方式

一种长白松试管内快速育苗方法：

1 材料与方法

1.1 材料及处理

11月上旬，取长白松野生植株主干枝条，置于-10～0 ℃的冰柜（保证芽充分休眠）中休眠50 d后取出进行水培促使其主干芽萌发生长，待主干萌发生长至3.0～4.0 cm时，将主干剪下并切割成段(长度为1.5 cm)后，摘去嫩针叶及短小叶柄，用5%碳酸钠溶液浸泡3 min以除去表面油脂，75%乙醇（体积分数）涮洗30 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡8 min，无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分，切除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后留1.0 cm的茎段和茎尖作为外植体备用。

1.2 长白松茎段生根同时顶芽萌发生长、植株快速和炼苗栽培

基本培养基成分和含量：100.0 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，650.0 mg·L^-1KNO₃，32.0 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，38.0 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，90.0 mg·L^-1KH₂PO₄；2.8 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，2.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.30 mg·L^-1KI，1.0 mg·L^-1H₃BO₃；4.5 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.0 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；0.2 mg·L^-1烟酸，0.2 mg·L^-1盐酸吡哆醇(VB₆)，1.30 mg·L^-1甘氨酸。培养基中附加吲哚丁酸IAA(0.12～0.17 mg·L^-1)、萘乙酸NAA(0.08～0.13 mg·L^-1)、玉米素ZT(0.10～0.15 mg·L^-1)和赤霉素GA₃(1.70～2.80 mg·L^-1)，琼脂条7.5 g·L^-1，添加食用白糖30.0 g·L^-1，调节pH值至5.8，嫩茎段在光照周期8 h·d^-1、光照强度1000 lx和温度(24±2) ℃条件下培养。为提高长白松嫩茎段生根的速度及生根率和顶芽萌发生长速度，通过均匀设计法设计实验，选用U₁₂(12⁴)均匀表，每个处理接种10个主干嫩茎段，重复3次取平均值，筛选确定影响长白松主干茎段生根同时顶芽萌发生长的吲哚丁酸、萘乙酸、玉米素和赤霉素最佳浓度配比。主干茎段培养40 d统计生根率和苗的长度，以均出现茎段生根和顶芽萌发生长的苗为准。生根率（%）=(生根的茎段数/接种的茎段总数)×100%，生长率（%）=(苗总长度-1.0)/1.0×100%。

茎段生根后顶芽萌发生长至3.00 cm时，在无菌条件下打开培养瓶，将茎段留3个针叶剪下苗干，并将苗干切割成0.5 cm 的茎段，再次将小茎段转接到茎段生根同时顶芽萌发生长培养基中，计算出每个茎段生根同时顶芽萌发生长的增殖倍数和周期。

当种苗扩繁到需要数量后，且小植株长至1.00 cm时，将小植株从培养瓶中取出，放在高锰酸钾溶液（浓度为5 mg·L^-1）中洗净根上的琼脂，将小植株栽植到经多菌灵（300倍液）消毒过的腐熟草炭土、腐烂松针和珍珠岩 (3: 3: 1)的基质中，覆盖塑料薄膜（透性好）进行保温保湿，温度控制在(20±2) ℃，保持相对湿度在70%，自然光照10 h·d^-1，温度升高时，适当通风换气。

2 结果与分析

2.1 吲哚丁酸、萘乙酸、玉米素和赤霉素对长白松茎段生根的影响

数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=104－278X ₁－340X ₂＋375X ₃，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9942，剩余标准差S＝1.1400，检验值F _t＝227.9﹥临界值F _(0.05,3,8)＝4.066，回归方程具有显著性，吲哚丁酸、萘乙酸和玉米素对茎段的生根影响具有显著性，赤霉素对茎段的生根影响不显著。通过计算吲哚丁酸、萘乙酸和玉米素对生根的贡献值和贡献率可知，U ₁＝214，U ₁/U＝24.0%；U ₂＝319，U ₂/U＝35.8%；U ₃＝492，U ₃/U＝55.3%，说明3个因素对长白松茎段生根的贡献顺序为：玉米素>萘乙酸>吲哚丁酸，又因玉米素与生根率呈正相关，而吲哚丁酸、萘乙酸与生根率呈负相关。由此推测，玉米素质量浓度高于0.15 mg·L^-1的，吲哚丁酸和萘乙酸质量浓度分别低于0.12 mg·L^-1和0.08 mg·L^-1可能生根率更高。为验证此推测，又以吲哚丁酸质量浓度为0.12、0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01 mg·L^-1，萘乙酸质量浓度为0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01 mg·L^-1，玉米素为0.15、0.16、0.17、0.18、0.19和0.20 mg·L^-1开展12个水平的验证试验，重复3次。结果发现，玉米素质量浓度为(0.15～0.17 mg·L^-1)，吲哚丁酸质量浓度为(0.07～0.09 mg·L^-1)和萘乙酸质量浓度为(0.03～0.05 mg·L^-1)时，长白松嫩茎段生根率最高，平均生根率达98.6%以上。均高于表1所列12个处理的生根率。

表1 影响长白松节增殖因素筛选的U₁₂(12⁴)试验设计与结果。

Figure 2013100744534100002DEST_PATH_IMAGE001

2.2 吲哚丁酸、萘乙酸、玉米素和赤霉素对长白松顶芽萌发生长的影响

数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=－105－444X ₁-－161X ₂＋1200X ₃＋50.9X ₄，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9566，剩余标准差S＝3.2400，检验值F _t＝18.86﹥临界值F _(0.05,4,7)＝4.120，回归方程显著。吲哚丁酸、萘乙酸、玉米素和赤霉素均对长白松嫩茎段丁芽萌发生长的影响具有显著性。同理，计算吲哚丁酸、萘乙酸、玉米素和赤霉素对茎段顶芽萌发生长的贡献值和贡献率可知，U ₁＝538，U ₁/U＝68.1%；U ₂＝71.7，U ₂/U＝9.07%；U ₃＝104，U ₃/U＝13.1%；U ₄＝76.7，U ₄/U＝9.71%，说明4个因素对长白松茎段顶芽萌发生长的贡献顺序为：吲哚丁酸>玉米素>赤霉素>萘乙酸，又因玉米素和赤霉素与茎段顶芽萌发生长呈正相关，而吲哚丁酸和萘乙酸与茎段顶芽萌发生长呈负相关。推测吲哚丁酸和萘乙酸质量浓度分别低于0.12 mg·L^-1和0.08 mg·L^-1，玉米素和赤霉素的质量浓度分别高于0.15 mg·L^-1和2.80 mg·L^-1时，茎段顶芽萌发生长率可能更高。为验证此可能性，又以吲哚丁酸质量浓度为0.12、0.11、0.10、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01 mg·L^-1，萘乙酸质量浓度为0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01 mg·L^-1，玉米素为0.15、0.16、0.17、0.18、0.19和0.20 mg·L^-1，赤霉素为2.80、2.90、3.00、3.10、3.20、3.30、3.40和3.50 mg·L^-1开展12个水平的验证试验，重复3次取平均值。结果发现，吲哚丁酸质量浓度在0.06～0.08 mg·L^-1、萘乙酸质量浓度在0.02～0.04 mg·L^-1、玉米素质量浓度在0.16～0.18 mg·L^-1和赤霉素质量浓度在2.90～3.20 mg·L^-1范围内时，长白松茎段顶芽萌发生长更好，顶芽萌发后的平均生长率为178.6%，比表1所列12个处理的生长率均大。

由以上实验结果可知，由于影响长白松嫩茎段生根的因素和浓度范围是培养基、玉米素质量浓度为0.15～0.17 mg·L^-1、吲哚丁酸质量浓度为0.07～0.09 mg·L^-1和萘乙酸质量浓度为0.03～0.05 mg·L^-1；而茎段顶芽萌发生长的主要影响因素和浓度范围为培养基、吲哚丁酸质量浓度在0.06～0.08 mg·L^-1、萘乙酸质量浓度在0.02～0.04 mg·L^-1、玉米素质量浓度在0.16～0.18 mg·L^-1和赤霉素质量浓度在2.90～3.20 mg·L^-1。

因此，将长白松野生植株主干枝条置于-10～0 ℃的冰柜中休眠50 d后取出进行水培促使其主干芽萌发生长，待主干萌发生长至3.0～4.0 cm时，将主干剪下并切割成段(长度为1.5 cm)后，摘去嫩针叶及短小叶柄，用5%碳酸钠溶液浸泡3 min以除去表面油脂，75%乙醇（体积分数）涮洗30 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡8 min，无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分，切除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后留1.0 cm的茎段和茎尖接种到附加吲哚丁酸IBA(0.07～0.08 mg·L^-1)＋萘乙酸NAA(0.03～0.04 mg·L^-1)＋玉米素ZT(0.16～0.17 mg·L^-1)＋赤霉素GA₃(2.90～3.20 mg·L^-1) 的基本培养基中进行茎段生根同时顶芽萌发生长，成苗率达99.5%以上。

2.3 长白松植株的快速繁殖

按1.2方法，按每瓶接种8个茎段，40天为1个周期，每个茎段在1个培养周期内平均可切割成4～5段计算，每年有n个周期（长白松每年9个周期）进行扩繁，年生产长白松种苗数为：∑年产试管苗=[8×(4～5)⁹×99.5%×92.8%]株，可见，本发明可以满足长白松工厂化育苗和规模化栽培的需要。

2.4 长白松小植株的炼苗和移栽

根据1.2中的方法，当种苗扩繁到一定数量后，选取1.00 cm以上的小植株进行炼苗移栽，经统计计算，小植株成活率可达到92.8%以上。

Claims

1.一种长白松试管内快速育苗方法，其特征在于步骤如下：

（1）将长白松野生植株主干枝条水培使其主干芽萌发生长，处理后留茎段和茎尖作为外植体备用；

（2）基本培养基中进行茎段生根同时顶芽萌发生长成苗：基本培养基成分和含量为：100.0 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，650.0 mg·L^-1KNO₃，32.0 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，38.0 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，90.0 mg·L^-1KH₂PO₄；2.8 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，2.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.30 mg·L^-1KI，1.0 mg·L^-1H₃BO₃；4.5 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.0 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；0.2 mg·L^-1烟酸，0.2 mg·L^-1盐酸吡哆醇，1.30 mg·L^-1甘氨酸；附加吲哚丁酸0.07～0.08 mg·L^-1＋萘乙酸0.03～0.04 mg·L^-1＋玉米素0.16～0.17 mg·L^-1＋赤霉素2.90～3.20 mg·L^-1 ；琼脂条7.5 g·L^-1，添加食用白糖30.0 g·L^-1，调节pH值至5.8，嫩茎段在光照周期8 h·d^-1、光照强度1000 lx和温度24±2℃条件下培养；

（3）长白松植株的快速繁殖、炼苗和移栽。

2.按照权利要求1所述的一种长白松试管内快速育苗方法，其特征在于步骤（1）中水培前把将长白松野生植株主干枝条置于-10～0 ℃的冰柜中休眠50 d。

3.按照权利要求1所述的一种长白松试管内快速育苗方法，其特征在于步骤（1）的处理是指待主干萌发生长至3.0～4.0 cm时，将主干剪下并切割成段后，摘去嫩针叶及短小叶柄，用5%碳酸钠溶液浸泡3 min以除去表面油脂，75%乙醇涮洗30 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡8 min，无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分。

4.按照权利要求1所述的一种长白松试管内快速育苗方法，其特征在于步骤（3）中的快速繁殖是指按每瓶接种8个茎段，40天为1个周期，每个茎段在1个培养周期内平均可切割成4～5段计算，每年有多个周期进行扩繁。

5.按照权利要求1所述的一种长白松试管内快速育苗方法，其特征在于步骤（3）的炼苗和移栽是指种苗扩繁到一定数量后，选取1.00 cm以上的小植株进行炼苗移栽，小植株成活率可达到92.8%以上。

6.按照权利要求1所述的一种长白松试管内快速育苗方法，其特征在于步骤（2）中吲哚丁酸0.08 mg·L^-1＋萘乙酸0.04 mg·L^-1＋玉米素0.17 mg·L^-1＋赤霉素3.20 mg·L^-1 。