CN103096924A - 多糖组合物和用于治疗和预防与祖细胞动员相关联的病症的方法 - Google Patents

Abstract

在此提供了缺少实质性抗凝剂活性的多糖制剂。提供了制造和使用这样的制剂的方法。

Description

多糖组合物和用于治疗和预防与祖细胞动员相关联的病症的方法

本申请是2010年4月16日提交的美国序号12/762,268的部分继续申请并要求它的优先权，美国序号12/762,268是2008年11月3日提交的PCT申请号PCT/US2008/082223的部分继续申请并要求它的优先权，PCT申请号PCT/US2008/082223要求2007年11月2日提交的美国临时申请序号60/985123的优先权。在先申请的披露被视为本申请的披露的一部分(并且通过引用结合在本申请的披露中)。

背景

肝素(由肥大细胞产生并从自然的来源中分离的一种高度硫酸化的肝素样葡糖胺多糖(HLGAG))是一种被广泛使用的临床抗凝剂。然而，天然的或未分级肝素的作用是很难预测的，并且必须密切监护患者以防止过度抗凝作用或抗凝作用不足。与未分级肝素(UFH)相比，通过不同的聚合性肝素的分级或解聚的方法而获得的低分子量肝素(LMWH)作为抗凝剂具有更可以预测性的药理作用，减少的副作用、持续的抗血栓活性、以及更好的生物利用率。数个LMWH已被批准用于血栓性病况的门诊治疗。

在治疗癌症患者中，对抗血栓剂的潜在作用存在着越来越多的兴趣。来自几个最近的临床试验的结果提示了对于用LMWH治疗的某些类形的癌症患者的一种生存优势(综述于Lemoine(雷蒙恩)，2005，临床肿瘤学杂志(Journalof Clinical Oncology)，23：2119-20)。

发明概述

本发明部分地基于多糖制剂(例如衍生自肝素的多糖制剂)的开发，这些制剂缺少实质性抗凝剂活性(例如，具有降低的抗凝剂活性的多糖的制剂)，但在其他非凝结介导的生物学过程中仍保持着活性。这些化合物可以具有以下特点中的一种或多种：1)抗Xa活性，例如小于50IU/mg、20IU/mg、10IU/mg、5IU/mg或5IU/mg或更小，和2)抗转移、抗血管生成、抗纤维化和/或抗炎活性。在此提供的多糖制剂还可以具有以下特点中的一个或多个：该制剂具有乙二醇裂解的糖醛酸残基(例如小于50％、40％、30％、20％乙二醇裂解的糖醛酸残基)；该制剂具有每条多糖链不大于3个乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G)；该制剂具有大于40％的U_2SH_NS，6S二糖残基；该制剂的脱硫酸化程度小于40％(例如N-脱硫酸化程度小于40％)；该制剂中的一条或多条多糖链具有一个非还原端糖醛酸残基的一个4，5-不饱和结构；该制剂中的一条或多条多糖链在还原端具有一个2，5-脱水甘露醇残基；该制剂的重均分子量在3,500与8,000Da之间，例如在4,000与8,000Da之间；以及在此所述的一个分子量分布。本披露包括具有这些特性和特点中的一种或多种的制剂连同制备和使用这些制剂的方法。

因此，在第一方面，本发明的特征是具有以下特点的一种多糖制剂(例如，一种肝素衍生的制剂)：在该制剂中(a)重均分子量在3,500与8,000Da之间，例如在此所述的一个重均分子量；(b)抗-Xa活性和/或抗-IIa活性，例如小于50IU/mg(例如抗-Xa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg或3IU/mg和抗-IIa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg或3IU/mg)；以及(c)小于50％的乙二醇裂解的糖醛酸残基(例如小于40％、30％、25％或20％的乙二醇裂解的糖醛酸残基，但大于1％、5％、10％、15％)。在一些实施方案中，该制剂含有在5％与50％之间的乙二醇裂解的糖醛酸残基(例如，在5％与40％、5％与30％、10％与50％、10％与40％、10％与30％、或10％与20％之间的乙二醇裂解的糖醛酸残基)。在一些实施方案中，该制剂具有在此所述的一个分子量分布。

在第二方面，本发明的特征是具有以下特点的一种多糖制剂(例如，一种肝素衍生的制剂)：(a)重均链分子量在3,500与8,000Da之间，例如在此所述的一个重均分子量；(b)抗-Xa活性和/或抗-IIa活性各自小于50IU/mg(例如抗-Xa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg或3IU/mg和抗-IIa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg或3IU/mg)；以及(c)该制剂的多条多糖链具有每条多糖链不大于3个乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G)(例如各多糖链具有每条多糖链不大于2个或不大于1个乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G))。该多糖制剂包括具有一个乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G)的一条或多条链。在一些实施方案中，该制剂具有在此所述的一个分子量分布。

在第三方面，本发明的特征是具有以下特点的一种多糖制剂(例如，一种肝素衍生的制剂)：(a)重均链分子量在3,500与8,000Da之间，在此所述的一个重均分子量；(b)抗-Xa活性和抗-IIa活性例如各自小于50IU/mg(例如抗-Xa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、3IU/mg和抗-IIa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg或3IU/mg)；以及(c)该制剂的多条多糖链具有每条多糖链平均不大于3个乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G)(例如每条多糖链平均不大于2.5个、不大于2个、不大于1.5个或不大于1个乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G))。在一些实施方案中，该制剂具有在此所述的一个分子量分布。

在第四方面，本发明的特征是具有以下特点的一种多糖制剂(例如，一种肝素衍生的制剂)：(a)重均链分子量在3,500与8,000Da之间，例如在此所述的一个重均分子量；(b)抗-Xa活性和/或抗-IIa活性例如各自小于50IU/mg(例如抗-Xa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、3IU/mg和抗-IIa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg或3IU/mg)；以及(c)该制剂具有大于40％的U_2SH_NS，6S二糖残基(例如大于50％、60％、70％或80％的U_2SH_NS，6S二糖残基)。在一些实施方案中，该制剂具有小于40％(例如，小于30％、20％或10％)的一个脱硫酸化程度。在一些实施方案中，该制剂具有小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％的一个N-脱硫酸化、6-O脱硫酸化和/或2-O脱硫酸化程度。在一些实施方案中，N-脱硫酸化和6-O脱硫酸化程度小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％、小于2％、小于1％。在一些实施方案中，6-O脱硫酸化程度大于N-脱硫酸化的水平。在一些实施方案中，N-脱硫酸化程度小于40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％，6-O脱硫酸化程度小于40％、30％、20％、10％、5％，并且6-O脱硫酸化程度大于N-脱硫酸化程度。例如，在一个实施方案中，N-脱硫酸化程度小于5％、4％、3％、2％、1％，而6-O脱硫酸化程度大于5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％。在一些实施方案中，该制剂具有在此所述的一个分子量分布。

在第五方面，本发明的特征是一种缺少实质性抗凝剂活性(例如，具有降低的抗凝剂活性)的多糖制剂(例如，一种肝素衍生的制剂)，其中该制剂包括多种多糖，这些多糖包括式I：

[U_w-H_x，y，z]_m～[U_G-H_x，y，z]_n

其中U表示一个糖醛酸残基，并且H表示一个己糖胺残基；

其中m和n是整数，以使

m＝4至16(例如，4至8、4至9、4至10、4至11、4至12、4至13、4至14、或4至15)，并且

n＝1至4(例如，1至2或1至3)；

w＝-2OS或-2OH；

x＝-NS或-NAc；

y＝-3OS或-3OH；

z＝-6OS或-6OH；

并且

其中符号～表示m和n标记的单元是沿着该多糖链分布的并且并非必须按照顺序。例如，本实施方案涵盖以下多糖链：

[U_G-H_x，y，z]-[U_w-H_x，y，z]-[U_G-H_x，y，z]-[U_w-H_x，y，z]-[U_w-H_x，y，z]-[U_w-H_x，y，z]

此外，对于[U_w-H_x，y，z]的各次出现，w、x、y以及z各自可以相同或不同，并且对于[U_G-H_x，y，z]的各次出现，x、y以及z各自可以相同或不同。U的各次出现可以独立地为一种艾杜糖醛酸(I)或一种葡糖醛酸(G)。在一些实施方案中，该制剂具有小于50IU/mg、40IU/mg、30IU/mg或20IU/mg但大于0.1IU/mg、0.5IU/mg、1IU/mg或2IU/mg的抗-Xa活性，和/或小于50IU/mg、40IU/mg、30IU/mg或20IU/mg但大于0.1IU/mg、0.5IU/mg、1IU/mg或2IU/mg的抗-IIa活性。在一些实施方案中，该制剂具有在此所述的一个分子量分布。

在第六方面，本发明的特征是缺少实质性抗凝剂活性(例如，基本上不具有抗凝剂活性)并且具有抗转移活性的一种多糖制剂(例如，一种肝素衍生的制剂)，其中该制剂包括多种多糖，这些多糖包括式II：

[U_w-H_x，y，z]_m-[U_G-H_x，y，z]_n-[U_w-H_x，y，z]_o-[U_G-H_x，y，z]_p-[U_w-H_x，y，z]_q

其中U表示一个糖醛酸残基，并且H表示一个己糖胺残基；

其中m至r是整数，以使：

m＝0至10；

n＝0至3；

o＝0至10；

p＝0至3；

q＝0至10；

w＝-2OS或-2OH；

x＝-NS或-NAc；

y＝-3OS或-3OH；

z＝-6OS或-6OH；

并且

在一些实施方案中，n与p的和为4、3、2或1。在一些实施方案中，m、o与q的和在4与18之间，例如4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15、4-16或4-17。

此外，对于[U_w-H_x，y，z]的各次出现，w、x、y以及z各自可以相同或不同，并且对于[U_G-H_x，y，z]的各次出现，x、y以及z各自可以相同或不同。U的各次出现可以独立地为一种艾杜糖醛酸(I)或一种葡糖醛酸(G)。

在一些实施方案中，该制剂具有小于50IU/mg、40IU/mg、30IU/mg或20IU/mg但大于0.5IU/mg、1IU/mg或2IU/mg的抗-Xa活性，和/或小于50IU/mg、40IU/mg、30IU/mg或20IU/mg但大于0.5IU/mg、1IU/mg或2IU/mg的抗-IIa活性。在一些实施方案中，该制剂具有的重均链分子量在3,500与8,000Da之间，例如在4,000与7000Da、4,500与7,000Da、4,700与7,000Da以及5,000与7,000Da之间。在一些实施方案中，该制剂具有在此所述的一个分子量分布。

本发明还包括在此所述(例如上述)的任何制剂的药学上可以接受的盐，和包含在此所述的制剂和/或它们的药学上可以接受的盐的组合物(例如药物组合物)。

在此所述的(例如，上述)制剂中的任何一种可以具有其他特性。例如，上述制剂或药物组合物之一可以进一步具有以下阐述的功能特性或结构特性中的一种或多种。

在一个实施方案中，在该制剂中的这些多糖链中至少有一个在非还原端具有以下结构之一：

其中X为H或Me，并且R为H或SO₃。例如，该制剂或药物组合物的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或基本上所有的非还原端具有该结构。

在一个实施方案中，在该制剂或药物组合物中的这些多糖链中至少有一个在还原端包括一个2，5-脱水甘露醇残基。例如，在该制剂或药物组合物中约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或基本上所有的多糖链在该还原端包括一个2，5-脱水甘露醇残基。

在一个实施方案中，该制剂或药物组合物具有一种分子量分布，使得该制剂的10％至50％(例如，10％至40％、10％至30％、15％至30％或15％至25％)的寡糖具有＜3000Da的一个分子量；40％至65％(例如，45％至65％、50％至65％、或55％至65％)的寡糖具有在3000-8000Da之间的一个分子量，并且5％至30％(例如，10％-30％、15％-30％、10％-25％、或15％-25％)的寡糖具有＞8000Da的一个分子量。

在一个实施方案中，该制剂具有约1.2至1.7的多分散性(例如，约1.3至1.7、1.4至1.6、或1.3至1.6)。

在一个实施方案中，该制剂或组合物具有抗转移活性。

在一个实施方案中，该制剂或组合物特异性结合或抑制以下项的一个或多个的活性：VEGF、FGF、SDF-1-α、HB-EGF、肝素酶、SCF、音猬因子、骨桥蛋白、osteopontegerin或P-选择素。

在一个实施方案中，该制剂或组合物具有小于30％、25％、20％、15％、10％的钠含量。在一个实施方案中，该制剂或组合物包含：小于20ppm、15ppm、10ppm、5ppm的碘；小于30％、25％、20％、15％、10％的硫；小于50、40、30、20、15ppm的硼。

在一个实施方案中，在此所述的任何制剂或组合物是使用如美国食品与药品管理局(21CFR第110部分)所规定的优良药品制造规范(GMP)来制造的。

在另一个方面，本发明的特征是制备一种制剂的方法。这些方法包括：将UFH与亚硝酸(HONO)相组合来产生一种多糖制剂；并且，在亚硝酸处理之后，进行反应以便在该制剂中产生糖醛酸残基的至少一部分的乙二醇裂解。

在另一个方面，制备一种制剂的方法包括：使一种UFH解聚(例如通过化学水解或酶促解聚)，并且在解聚之后，进行反应，以便在该制剂中产生糖醛酸残基的至少一部分的乙二醇裂解。

在一个实施方案中，在制剂中产生一种乙二醇裂解的糖醛酸残基的至少一部分的反应包括用高碘酸盐氧化该多糖制剂；并且用硼氢化钠还原这一被氧化的多糖制剂。例如，这些方法包括将该多糖制剂用高碘酸盐在约0℃至10℃的温度下氧化约10至20小时；并且在氧化作用之后，将该样品用硼氢化钠在约5.0至8.0的pH值下在约0℃至10℃的温度下还原约1小时。

在另一个方面，本发明的特征是制造一种制剂的方法。这些方法包括：(1)使一种未分级肝素(UFH)解聚(例如，通过亚硝酸解聚作用、水解解聚作用、或酶促解聚作用)以得到一种多糖制剂；(2)用高碘酸盐氧化该多糖制剂；(3)用硼氢化钠还原这一被氧化的多糖制剂；并且(4)将该多糖制剂分离(例如，通过用一种盐以及一种极性的有机溶剂进行沉淀、或通过经受一种色谱法分离或纯化)，以便由此制备一种制剂。

在一个实施方案中，该解聚步骤包括将该UFH用约0.01至0.05M(例如，约0.02至0.04M)的亚硝酸在约2至4的pH值下在约10℃至30℃的温度下处理约1至5小时。

在一个实施方案中，该氧化步骤包括将该多糖制剂用约0.05至0.2M的高碘酸盐在约0℃至10℃的温度下处理约10至20小时。

在一个实施方案中，该还原步骤包括将这一被氧化的多糖制剂用约0.5％至2.0％(重量/体积)的硼氢化钠在约6.0至7.0的pH值下并且在约0℃至10℃的温度下处理约0.5至3小时。

在一个实施方案中，制备或制造一种多糖制剂的方法包括降低该制剂中硼的量。

在一个实施方案中，使用如美国食品与药品管理局(21CFR第110部分)所规定的优良药品制造规范(GMP)来进行所述制造方法的步骤。

在一个实施方案中，对该制剂评价了一种生物学活性，例如抗转移活性；与VEGF、FGF、SDF-1α、HB-EGF、肝素酶以及P-选择素中任一个结合；或抑制VEGF、FGF、SDF-1α以及P-选择素中任一个的活性。

如在此所使用的，脱硫酸化程度被定义为当与未分级肝素相比时，每摩尔二糖单元中硫酸根的摩尔数的降低百分数。

如在此所使用的，硫酸化作用的程度被定义为每摩尔二糖单元中硫酸根的平均摩尔数。

在另一个方面，本发明的特征是通过在此所述的一种方法而制备的一种多糖制剂。

在另一个方面，本发明包括来自用于制备或分析在此所述的一种多糖制剂的方法中任何一种的中间体或反应混合物。

在另一个方面，本发明的特征是一种药物组合物，该组合物包括在此所述的一种多糖制剂。

在一个实施方案中，该药物组合物进一步包括一种药学上可以接受的载体。

在另一个方面，本发明的特征是治疗一位受试者的方法，该方法包括将一个治疗有效量的在此披露的一种多糖制剂给予该受试者。术语“治疗”(“treating”、“treatment“以及类似术语)意味将制剂给予一位受试者或受试者的细胞或组织，以便获得所希望的药理学、生理学或临床作用。用在此所述的一种多糖制剂进行的治疗可以减少、降低、缓解、改善、延缓、或预防一种现存的不想要的病况或它的发作或一种症状。“治疗有效量”是指在某些剂量下并且维持必要的时间段在受试者中取得所希望的药理学、生理学或临床作用的有效量。

本发明包括用于治疗一位受试者的方法，该受试者患有、或有危险患有一种转移性病症(例如，一种癌症，例如一种癌瘤或其他实体以及血液学的癌症)。在这些受试者中，治疗可以包括但并不局限于：抑制肿瘤生长、肿瘤质量的降低、转移病变的大小或数目的降低、抑制新的转移性病变的发展、延长生存期、延长无病情进展的生存期、延长病情进展的时间、和/或提高生活质量。在另一实施方案中，该受试者可以患有选自由以下各项组成的组的病症或病况：一种炎性疾病、一种自身免疫性疾病、一种纤维化或纤维增生症，或一种特应性病症。炎性疾病的实例包括但并不局限于：慢性阻塞性肺病、囊肿性纤维化、哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、多发性硬化症、牛皮癣、局部缺血再灌注损伤、败血症性休克、年龄相关的黄斑变性(例如湿性年龄相关的黄斑变性)、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、心血管疾病、血管炎、I型和II型糖尿病、代谢综合症、糖尿病性视网膜病、再狭窄。自身免疫性疾病的实例包括但并不局限于：哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、修格连氏综合症、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合症、自身免疫性肝炎、重症肌无力。纤维化疾病的实例包括但并不局限于：硬皮病、慢性阻塞性肺病、糖尿病性肾病、肉样瘤病、特发性肺纤维化、肝纤维化、胰纤维化、肝硬化、囊肿性纤维化、神经纤维瘤、子宫内膜组织异位、术后纤维瘤、再狭窄。特应性疾病的实例包括但并不局限于特应性皮炎、特应性哮喘、以及过敏性鼻炎。将本发明的组合物以对于治疗该病症或病况而言的一个有效量给予一位受试者，该受试者患有、或有危险发展这些疾病中的一种或多种。

在一个优选的实施方案中，该受试者患有、或有危险患有一种癌症或转移性病症(例如，一种癌瘤)。例如，该受试者患有一种原发性肿瘤并且具有、或有危险具有该原发性肿瘤的转移。

在一个实施方案中，静脉内或皮下给予或吸入该多糖制剂。

在一个实施方案中，将该多糖制剂与另一种治疗(例如，另一种治疗剂，例如，一种细胞毒性或细胞抑制剂，以及它们的组合)进行联合给予。

在一个实施方案中，该多糖制剂被长期给予，例如在一个特定时间段中至少两次，例如在一个6个月的期间至少两次。在一个实施方案中，一种多糖制剂在一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、六个月、一年、或甚至更长时间的一个期间被给予两次。该多糖制剂可以每日给予(例如每日一次、两次或三次或四次)、每两天给予一次、每周给予(例如一周一次、两次或三次)、每两周给予一次、每三周给予一次、每月给予或按任何其他长期的给予时程表给予。

在一个(on)方面，本发明包括治疗或预防涉及或由骨髓源性祖细胞动员引起的一种病症的方法。该方法包括将在此所述的一种多糖制剂，例如缺少实质性抗凝活性的一种多糖制剂给予一位受试者，该受试者患有或有患有该病症或病况的危险。

在一个实施方案中，该病症或病况涉及或由以下各项中的一个或多个的动员引起：内皮祖细胞(EPC)、造血祖细胞(HPC)、未成熟髓样细胞(iMC，包括髓源性抑制细胞(MDSC))以及间充质祖细胞(MPC)。在一个优选的实施方案中，该受试者患有、或有危险患有一种癌症或转移性病症(例如，一种癌瘤)。例如，该受试者患有一种原发性肿瘤并且具有、或有具有该原发性肿瘤的转移的危险。在一个实施方案中，该受试者已或将用一种化疗剂治疗，该化疗剂与增加的骨髓源性祖细胞动员、例如增加的EPC、HPC、iMC和/或间充质祖细胞动员相关联。化疗剂可以是例如一种紫杉烷(例如紫杉醇、多西他赛、拉洛他赛、卡巴他塞)；一种嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶)；一种埃坡霉素(例如伊沙匹隆、埃坡霉素B、埃坡霉素D、dehydelone、沙戈匹隆)；一种血管阻断剂(例如AVE8062、Oxi 4503、vadimezan、ZD6126、康普立停A-4磷酸二钠盐(CA4P)、DMXAA(ASA404)、NPI-2358)；一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)；一种抗血管生成剂或一种酪氨酸激酶抑制剂。在一个实施方案中，该抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂是选自下组，该组由以下各项组成：一种表皮生长因子(EGF)途径抑制剂(例如一种表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)、一种血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂(例如一种血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如一种VEGFR-1抑制剂、一种VEGFR-2抑制剂、一种VEGFR-3抑制剂))、一种血小板衍生生长因子(PDGF)途径抑制剂(例如一种血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如一种PDGFR-β抑制剂))、一种RAF-1抑制剂以及一种RET抑制剂。在一些实施方案中，该受试者已或将用选自下组的一种抗血管生成剂或一种酪氨酸激酶抑制剂治疗，该组由以下各项组成：贝伐单抗

伊马替尼

西妥昔单抗

舒尼替尼

索拉非尼

tivozanib(AV-951)、西地尼布(AZD2171)、达沙替尼尼洛替尼(AMN-107)、CP-547632、埃罗替尼

帕尼单抗

帕唑帕尼

阿昔替尼和吉非替尼

兰尼单抗

在一个实施方案中，该受试者已或将用一种化疗剂以与增加的骨髓源性祖细胞动员相关联的某一剂量和/或给药时程表进行治疗。例如，化疗剂是一种紫杉烷(例如紫杉醇、多西他赛、拉洛他赛、卡巴他塞)，并且该紫杉烷是以与增加的骨髓源性祖细胞(例如EPC)动员相关联的某一量和/或某一给药时程表(例如，在此所述的一个剂量和/或给药时程表)来给予。在另一个实施方案中，该化疗剂是一种抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂(例如在此所述的一种抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂，例如舒尼替尼)，并且该抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂是以与增加的骨髓源性祖细胞(例如EPC)动员相关联的某一量和/或某一给药时程表(例如，在此所述的一个剂量和/或给药时程表)来给予。在另一个实施方案中，该化疗剂是一种嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶)，并且该嘧啶类似物是以与增加的骨髓源性祖细胞(例如EPC)动员相关联的某一量和/或某一给药时程表(例如，在此所述的一个剂量和/或给药时程表)来给予。在另一个实施方案中，该化疗剂是一种蒽环类药物(例如多柔比星)，并且该蒽环类药物是以与增加的骨髓源性祖细胞(例如MDSC)动员相关联的某一量和/或某一给药时程表(例如，在此所述的一个剂量和/或给药时程表)来给予。

在一个实施方案中，该受试者患有癌症并且已或将被联合一种化疗剂给予血细胞的一种生长因子。示例性生长因子包括粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及红细胞生成素。在一个实施方案中，在给予该生长因子之后给予该多糖制剂。

在另一个实施方案中，该受试者患有癌症并且已或将被给予一种CXCR4拮抗剂，例如联合一种化疗剂。

在一个实施方案中，该癌症是在此所述的癌症。例如，癌症可以为卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤、胃癌、胰腺癌、头颈癌、结肠直肠癌、食管鳞状细胞癌、卡波氏肉瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、甲状腺肿瘤。

在另一实施方案中，该受试者可以患有选自下组的病症或病况，该组由以下各项组成：一种炎症、一种自身免疫疾病、一种纤维化或纤维增生症、一种血管病症。炎症的实例包括但并不局限于：慢性阻塞性肺病、哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、多发性硬化症、牛皮癣、缺血再灌注损伤、败血性休克、年龄相关的黄斑变性(例如湿性年龄相关的黄斑变性)、动脉硬化、阿尔茨海默病、心血管疾患、血管炎、I型和II型糖尿病、代谢性综合症、糖尿病性视网膜病、再狭窄以及嗜酸细胞性食管炎。自身免疫性疾病的实例包括但并不局限于：哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、修格连氏综合症、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合症、自身免疫性肝炎、重症肌无力。纤维化疾病的实例包括但并不局限于：硬皮病、慢性阻塞性肺病、糖尿病肾病、肉样瘤病、特发性肺纤维化、肝硬化、囊性纤维化、神经纤维瘤、子宫内膜组织异位、术后纤维瘤、肺纤维化、子宫肌瘤、再狭窄。血管病症的实例是血管瘤。将本发明的组合物以对于治疗该病症或病况而言的一个有效量给予一位受试者，该受试者患有、或有危险发展这些疾病中的一种或多种。

在另一个方面，本发明的特征是用于在此所述的一种治疗方法的在此所述的一种多糖制剂，例如在此所述的缺少实质性抗凝活性的一种多糖制剂(polysaccharide preparation the lacks substantial anticoagulation activity)。在一个实施方案中，该多糖制剂可以被用于在此所述用于治疗或预防涉及或由骨髓源性祖细胞动员引起的病症的任一种方法中。

在另一个方面，本发明的特征是在此所述的一种多糖制剂(例如，如在此所述的缺少实质性抗凝活性的一种多糖制剂)的用途，用于制造用于治疗或预防在此所述的一种病症(例如用于治疗或预防涉及或由如在此所述的骨髓源性祖细胞动员引起的一种病症)的一种药剂。

在另一个方面，本发明的特征是一种化疗剂用于制造用于治疗或预防涉及或由如在此所述的骨髓源性祖细胞动员引起的病症的一种药剂的用途，其中该药剂联合在此所述的一种多糖制剂，例如一种如在此所述的缺少实质性抗凝活性的多糖制剂而给予。

在另一个方面，本发明的特征是针对用一种化疗剂治疗的一个过程，为患有癌症(例如在此所述的一种癌症)的一位受试者(例如人类受试者)选择一个支付类别的一种方法，该化疗剂与骨髓源性祖细胞动员相关联，该方法包括：

确定该患者是否或将要接受与骨髓源性祖细胞动员相关联的一种化疗剂；并且

如果该患者正接受与骨髓源性祖细胞动员相关联的一种化疗剂，将该受试者分配到多个支付类别之一，其中：

第一支付类别批准支付该化疗剂联合在此所述的一种多糖制剂来治疗受试者；以及

第二支付类别批准支付该化疗剂而无在此所述的一种多糖制剂来治疗受试者。

在一些实施方案中，将该受试者分配到第一类别，并且该分配批准支付一种治疗过程(例如，该化疗剂和/或在此所述的一种多糖制剂)。

在一些实施方案中，将该受试者分配到第二类别，并且该分配批准支付一种不同的治疗过程(例如，一种化疗剂，而缺失在此所述的一种多糖制剂)。

在一些实施方案中，该方法进一步包括确定该受试者是否已经历来自该化疗剂的副作用。

在一些实施方案中，该化疗剂可以是例如一种紫杉烷(例如紫杉醇、多西他赛、拉洛他赛、卡巴他塞)；一种嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶)；一种埃坡霉素(例如伊沙匹隆、埃坡霉素B、埃坡霉素D、dehydelone、沙戈匹隆)；一种血管阻断剂(例如AVE8062、Oxi 4503、vadimezan、ZD6126、康普立停A-4磷酸二钠盐(CA4P)、DMXAA(ASA404)、NPI-2358)；一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)；一种抗血管生成剂或一种酪氨酸激酶抑制剂，例如在此所述的一种抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂。

对于在此所述的范围中的任何范围(例如，对于一种给定的结构或活性)，这些范围可以是所披露的那些范围连同其他范围。例如，从(例如，对于一个给定的结构单元或活性)一个范围的一个较低端点所构建的一个范围可以与(例如，对于该给定的结构单元或活性)另一个范围的较高端点相结合以给出一个范围。

“分离”或“纯化”的多糖制剂基本上不含细胞材料或来自产生多糖的细胞或组织源的其他污染蛋白，或在基本上不含化学合成时的化学前体或其他化学物。“基本上不含”意味一种制剂是至少50％纯的(重量/重量)。在一个优选的实施方案中，该制剂具有小于约30％、20％、10％并且更优选地5％(按干重计算)的例如来于制造的非肝素衍生的多糖、蛋白质或化学前体或其他化学物。这些在此也被称作“污染物”。在此所提供的一种多糖制剂中可以存在的污染物的实例包括但并不局限于：钠、硫、硼、酶(例如，一种肝素酶)、甲醇、乙醇、碘、以及氯化物。

如在此使用的“联合使用”或“联合”意味同时或在一定时间间隔内给予单独药剂，使得与它们以其他方式给予时相比，联合药剂的使用提供一种增加的收益(例如，增加的功效或降低的副作用)。在一个实施方案中，在一定间隔内给予这些单独药剂，使得这些药剂对受试者的生理学作用重叠。

如在此使用的术语“支付类别”是指与一种治疗方案相关的支付计划。该支付计划可以是例如支付一种治疗、某一水平的支付一种治疗、偿付一种治疗、某一水平的偿付一种治疗、拒绝支付一种治疗、拒绝偿付一种治疗或拒绝承保一种治疗。

本发明的其他特征和优点从以下详细的说明、并且从权利要求中应当是清楚的。

附图简要说明

图1是一个条形图，示出在此所述的一种多糖制剂在鼠黑色素瘤实验转移(B16F10，i.v.(静脉注射))模型中的作用。确定雌性C57BL/6小鼠(9-10周龄)的肺肿瘤负荷(肺重-正常肺重)，这些小鼠用静脉注射2x10⁵个B16F10细胞激发，并且就在注射前用单一剂量(10mg/kg)的MONC402(批次R-1-5)、达肝素

或MONC 202(阴性对照：N-脱硫酸化的多糖)预处理。“正常”指代未受激发并且未处理的小鼠。

图2是一个条形图，示出在此所述的一种多糖制剂在乳腺癌转移至肺的一个4T1治疗模型中的作用。在第32天确定雌性BALB/c小鼠(8周龄)的肺肿瘤负荷(肺重-正常肺重)，这些小鼠用乳房内脂肪垫注射8x10⁴个4T1细胞来激发，并且如所指示般在第4天开始被处理。

图3描绘MONC402对G-CSF或多西他塞诱导的EPC动员的作用。

图4描绘MONC402对G-CSF或多西他塞诱导的EPC动员的作用。

图5描绘MONC402在荷瘤小鼠中对多西他塞诱导的EPC动员的作用。

图6描绘G-CSF对MSDC动员的作用。

图7描绘舒尼替尼

对EPC动员的作用。

图8是描绘MONC402对舒尼替尼

诱导的加速的肿瘤再生长和转移的作用的图。

详细说明

聚阴离子/多糖

在此所述的方法涉及联合治疗，这些联合治疗包括一种聚阴离子，例如一种多糖、糖胺聚糖(GAG)、肝素、低分子量肝素、化学或酶促修饰的肝素或硫酸肝素、硫酸肝素类似物(例如PI-88)、化学或酶促合成的多糖，例如K5多糖。在一个实施方案中，该聚阴离子、多糖、GAG、肝素、低分子量肝素、化学或酶促修饰的肝素或硫酸肝素、硫酸肝素类似物或化学或酶促合成的多糖缺少实质性抗凝剂活性，即显示小于50IU/mg的抗-IIa活性和小于50IU/mg的抗-Xa活性。在一个实施方案中，该聚阴离子、多糖、GAG、肝素、低分子量肝素、化学或酶促修饰的肝素或硫酸肝素、硫酸肝素类似物或化学或酶促合成的多糖显示残余抗凝剂活性，例如显示至少0.1IU/mg的抗-IIa活性和至少0.1IU/mg的抗-IIa活性，或至少0.2IU/mg的抗-IIa活性和至少0.2IU/mg的抗-IIa活性，或至少0.5IU/mg的抗-IIa活性和至少0.5IU/mg的抗-IIa活性，或至少1IU/mg的抗-IIa活性和至少1IU/mg的抗-IIa活性。在一些实施方案中，该聚阴离子、多糖、GAG、肝素、低分子量肝素、化学或酶促修饰的肝素或硫酸肝素、硫酸肝素类似物或化学或酶促合成的多糖显示2IU/mg、3IU/mg、4IU/mg、5IU/mg、6IU/mg、7IU/mg、8IU/mg、9IU/mg、10IU/mg、12IU/mg、15IU/mg、18IU/mg、20IU/mg、22IU/mg、25IU/mg、28IU/mg、30IU/mg的抗-IIa活性。在一些实施方案中，该聚阴离子、多糖、GAG、肝素、低分子量肝素、化学或酶促修饰的肝素或硫酸肝素、硫酸肝素类似物或化学或酶促合成的多糖显示2IU/mg、3IU/mg、4IU/mg、5IU/mg、6IU/mg、7IU/mg、8IU/mg、9IU/mg、10IU/mg、12IU/mg、15IU/mg、18IU/mg、20IU/mg、22IU/mg、25IU/mg、28IU/mg、30IU/mg的抗-Xa活性。

肝素制剂

在一些方面，在此所述的方法和试剂盒包括一种肝素制剂。如在此使用，肝素制剂是含有肝素的一种制剂或由它衍生的一种制剂。肝素制剂包括未分级肝素制剂、低分子量肝素(LMWH)制剂、超低分子量肝素(ULMWH)制剂以及类似物。

如在此使用，术语“未分级肝素(UFH)”是自猪肠粘膜纯化的肝素。UFH在形成一种LMWH或一种ULMWH的过程中可以用作例如一种起始材料。UFH从若干供应商可商购，这些供应商包括Abbott、Organon、Riker、Invenex、Baxter、Calbiochem、Sigma或Upjohn。

LMWH制剂的实例包括但并不局限于一种依诺肝素制剂(Lovenox^TM或Clexane^TM)；一种达肝素制剂(Fragmin^TM)；一种舍托肝素制剂(Sandoparin^TM或Embollex)；一种阿地肝素制剂(Normiflo^TM)；一种那屈肝素制剂(Fraxiparin^TM)；一种帕肝素制剂(Fluxum^TM)；一种瑞肝素制剂(Clivarin^TM)；一种亭扎肝素制剂(Innohep^TM或Logiparin^TM)；一种磺达肝素制剂(Arixtra^TM)；或一种M118-REH制剂。在一些实施方案中，LMWH是除以下各物以外的一种LMWH：一种依诺肝素制剂(Lovenox^TM或Clexane^TM)；一种达肝素制剂(Fragmin^TM)；一种舍托肝素制剂(Sandoparin^TM或Embollex)；一种阿地肝素制剂(Normiflo^TM)；一种那屈肝素制剂(Fraxiparin^TM)；一种帕肝素制剂(Fluxum^TM)；一种瑞肝素制剂(Clivarin^TM)；一种亭扎肝素制剂(Innohep^TM或Logiparin^TM)；一种磺达肝素制剂(Arixtra^TM)；或一种M118-REH制剂。

缺少实质性抗凝活性的多糖制剂

在许多临床环境中，作为抗凝剂，可商购的LMWH制剂优于UFH制剂，因为LMWH具有更加可以预测的药物代谢动力学并且可以皮下给予。然而，由于因它们的抗凝剂作用所致的潜在出血并发症，当前可用的LMWH制剂更不适合治疗非凝结介导的病症，且/或更不适合可能要求更高剂量或长期给药方案的病症。本发明的特征是被设计成缺少实质性抗凝剂活性同时保留着临床上有利特性的多糖制剂。这些多糖制剂的特性包括例如缺少实质性抗凝剂活性，例如抗-IIa活性小于50IU/mg，抗-Xa活性小于50IU/mg，并且具有抗转移、抗血管生成、抗纤维化和/或抗炎活性。

此类多糖制剂的实例包括多条链，这些链包括以下：

[U_w-H_x，y，z]_m～[U_G-H_x，y，z]_n

其中，U表示一个糖醛酸残基，而H表示一个己糖胺残基，其中m和n是整数，以使m＝6至18，并且n＝1至4，w＝-2OS或-2OH、x＝-NS或-NAc、y＝-3OS或-3OH、z＝-6OS或-6OH、

并且

其中符号～表示m和n标记的单元是沿着该多糖链分布的并且并非必须按照顺序。例如，本实施方案涵盖以下多糖链：

[U_G-H_x，y，z]-[U_w-H_x，y，z]-[U_G-H_x，y，z]-[U_w-H_x，y，z]-[U_w-H_x，y，z]-[U_w-H_x，y，z]

此外，对于[U_w-H_x，y，z]的各次出现，w、x、y以及z各自可以相同或不同，并且对于[U_G-H_x，y，z]的各次出现，x、y以及z各自可以相同或不同。U在各次出现时可以独立地为一种艾杜糖醛酸(I)或一种葡糖醛酸(G)。

该多糖制剂可以具有的抗-Xa活性和抗-IIa活性各自小于50IU/mg(例如抗-Xa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、3IU/mg、2IU/mg或1IU/mg；或从约0至50IU/mg、约0至40IU/mg、约0至30IU/mg、约0至25IU/mg、约0至20IU/mg、约0至10IU/mg、约0至5IU/mg、约5至10IU/mg、约5至15IU/mg或约5至20IU/mg；和抗-IIa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、3IU/mg、2IU/mg or 1IU/mg；或从约0至50IU/mg、约0至40IU/mg、约0至30IU/mg、约0至25IU/mg、约0至20IU/mg、约0至10IU/mg、约0至5IU/mg、约5至10IU/mg、约5至15IU/mg，或约5至20IU/mg)；以及

[U_w-H_x，y，z]_m-[U_G-H_x，y，z]_n-[U_w-H_x，y，z]_o-[U_G-H_x，y，z]_p-[U_w-H_x，y，z]_q

其中U表示一个糖醛酸残基，而H表示一个己糖胺残基，其中m-r是整数，使得m＝0-10，n＝0-3，o＝0-10，p＝0-3，q＝0-10，w＝-2OS或-2OH，x＝-NS或-Nac，y＝-3OS或-3OH，z＝-6OS或-6OH，

并且

其中w、x、y以及z在m、n、o、p或q标记的各单元上各自是相同或不同的。在一些实施方案中，n+p的和小于或等于4(例如小于或等于3、2、1或0)。在一些实施方案中，n与p的和为4、3、2或1。在一些实施方案中，m、o与q的和在4与18之间，例如4-8、4-9、4-10、4-11、4-12、4-13、4-14、4-15、4-16或4-17之间。

此外，对于[U_w-H_x，y，z]的各次出现，w、x、y以及z各自可以相同或不同，并且对于[U_G-H_x，y，z]的各次出现，x、y以及z各自可以相同或不同。U在各次出现时可以独立地为一种艾杜糖醛酸(I)或一种葡糖醛酸(G)。

该多糖制剂可以具有的抗-Xa活性和抗-IIa活性各自小于50IU/mg(例如抗-Xa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、3IU/mg、2IU/mg或1IU/mg，或从约0至50IU/mg、约0至40IU/mg、约0至30IU/mg、约0至25IU/mg、约0至20IU/mg、约0至10IU/mg、约0至5IU/mg、约5至10IU/mg、约5至15IU/mg或约5至20IU/mg；和抗-IIa活性小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、3IU/mg、2IU/mg or 1IU/mg，或从约0至50IU/mg、约0至40IU/mg、约0至30IU/mg、约0至25IU/mg、约0至20IU/mg、约0至10IU/mg、约0至5IU/mg、约5至10IU/mg、约5至15IU/mg，或约5至20IU/mg)。在一些实施方案中，该制剂具有一个重均链分子量在3,500与8,000Da之间，例如在4,300与7000Da、4,500与7,000Da、4,700与7,000Da以及5,000与7,000Da之间。

抗-IIa活性

在此披露多糖制剂，这些多糖制剂提供实质性降低的抗-IIa活性，例如(e.g.，，e.g.)抗-IIa活性小于约50IU/mg、小于约40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、3IU/mg、2IU/mg或1IU/mg；从约0至50IU/mg、约0至40IU/mg、约0至30IU/mg、约0至25IU/mg、约0至20IU/mg、约0至10IU/mg、约0至5IU/mg、约5至10IU/mg、约5至15IU/mg或约5至20IU/mg。使用针对平行线测定的统计方法，以每毫克的抗IIa活性的国际单位来计算抗IIa活性。使用以下原理来测量在此所述的抗IIa活性水平。

多糖(PS)+ATIII→[PS·ATIII]

IIa

PS·ATIII→[PS·ATIII·IIa]+IIa(过量)

IIa(过量)+底物→肽+pNA(通过分光光度计测量)

在抑制凝血酶中通过样品对抗凝血酶(ATIII)的增强的作用来确定抗因子IIa的活性。凝血酶过量可以间接地通过分光光度计进行测量。可以例如在Diagnostica Stago分析仪上或在ACL Futura3 Coagulation系统上使用来自Chromogenix的试剂(S-2238底物，凝血酶(53纳催量/小瓶)，以及抗凝血酶)、或在任何等效的系统上测量抗因子IIa的活性。使用针对低分子量肝素的第二国际标准来校正分析仪的应答。

抗-Xa活性

优选地，在此提供的一种多糖制剂具有的抗-Xa活性为约0至50IU/mg，例如50IU/mg、40IU/mg、30IU/mg、20IU/mg、15IU/mg、10IU/mg、5IU/mg、4IU/mg、3IU/mg、2IU/mg或1IU/mg；或从约0至50IU/mg、约0至40IU/mg、约0至30IU/mg、约0至25IU/mg、约0至20IU/mg、约0至10IU/mg、约0至5IU/mg、约5至10IU/mg、约5至15IU/mg或约5至20IU/mg。使用针对平行线测定的统计方法，以每毫克抗因子Xa活性的国际单位来计算一种制剂的抗Xa活性。使用以下原理来测量在此所述的制剂的抗因子Xa的活性。

PS+ATIII→[PS·ATIII]

FXa

PS·ATIII→[PS·ATIII·FXa]+Fxa(过量)

Fxa(过量)+底物→肽+pNA(通过分光光度计测量)

在抑制活化的因子Xa(FXa)中，通过样品对抗凝血酶(ATIII)的增强的作用来确定抗因子Xa的活性。因子Xa过量可以间接地通过分光光度计进行测量。可以例如在Diagnostica Stago分析仪上用

肝素检测试剂盒、在ACL Futura3 Coagulation系统上用来自Chromogenix的肝素试剂盒、或在任何等效的系统上测量抗因子Xa的活性。可以使用针对低分子量肝素的NIBSC国际标准来校正分析仪的应答。

分子量和链长度

当确定一种制剂的重均分子量时，约3500至8000Da、约3500至7000Da、优选地约4000至7000Da、约4200至6000、或约4500至6000Da的一个重均分子量，表明在该多糖制剂中显著数目的链是具有足够的链长度的。

如在此使用的“重均分子量”是指糖醛酸/己糖胺二糖重复体的链的以道尔顿计的重均值。非糖醛酸和/或非己糖胺结构单元的存在不包括在确定该重均分子量之中。因此，在该制剂中的一条链或多条链中非糖醛酸和非己糖胺结构单元的分子量不应该包括在确定该重均分子量之中。由以下等式计算重均分子量(M_w)：M_w＝∑(c_im_i)/∑c_i。变量c_i是聚合物在片层冲的浓度，而m_i是聚合物在片层冲的分子量。在含有多个数据片层的色谱峰上取总和。一个片层的数据可以在色谱峰对比时间的图上被绘成一条垂直的线。因此，该洗脱峰可以被分成多个片层。重均分子量的计算是依赖于所有片层的浓度和分子量的总和的平均值。例如使用Wyatt Astra软件或任何适当的软件可以测量重均分子量。通过具有两个串联的柱(例如，一个TSK G3000 SWXL和一个G2000 SWXL)的高效液相色谱法，与串联的一个UV或多角度光散射(MALS)检测器和一个折射率检测器相连接来确定在此所述的重均分子量。所使用的洗脱剂是0.2M硫酸钠，pH 5.0，并且流速是0.5mL/min。

可以例如通过确定在该制剂中这些链的平均链长度和/或通过确定在该制剂内多条链的重均分子量来进行一种多糖制剂是否包括多条足够链长度的链的一个确定。当确定平均链长度时，约5至22个(例如，约7至18个，典型地约7至14个、或8至13个)二糖重复体的一个平均链长度表明在该制剂中显著数目的链是具有足够的链长度的。

如在此使用的，“平均链长度”是指在一条链中发生的糖醛酸/己糖胺二糖重复体的平均链长度。非糖醛酸和/或非己糖胺结构单元(例如，附连的PEG部分)的存在不包括在确定该平均链长度之中。通过将数均分子量(Mn)除以对于一种二糖(500Da)而言的数均分子量确定了平均链长度。

乙二醇裂解的糖醛酸

在此所述的一种多糖制剂可以包括一个开口的糖苷环，常规地被称为还原-氧化作用(RO)衍生物。在这些制剂中，具有邻二醇(vicinyl diol)的一个或多个糖苷环例如在C2-C3之间的键通过一个氧化作用、随后通过一个还原作用而被打开。这些化合物在此也被称为“乙二醇裂解”的衍生物。

在此所述的本发明的另一个实施方案中，这些乙二醇裂解的残基使它们自己进行随后的官能化作用。因此，这些化合物在衍生自乙二醇裂解的伯羟基基团处还可以带有相等或不同的基团，例如，醛基团、甲氧基基团、或寡糖或肽基团，其范围是从一个单一的糖或氨基酸到超过一个单元的长度，例如2个或3个单元。

在一些实施方案中，小于50％的糖醛酸残基是乙二醇裂解的糖醛酸残基(例如，小于40％、30％、25％、或20％的糖醛酸残基是乙二醇裂解的糖醛酸残基)。

还原端的结构

在一些例子中，在此所述的一种多糖试剂中至少有约50％的链具有一个被修饰的还原端结构，如一个2，5-脱水甘露糖残基或被还原生形成一种醇的一个2，5-脱水甘露糖。在一些实施方案中，在该制剂中至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％的链具有一个被修饰的还原端结构，使得该还原端包括一个2，5-脱水甘露糖残基或被还原形成一种醇的一个2，5-脱水甘露糖。

多分散性

在此提供的多糖制剂的多分散性是约2或更小，例如1.7或更小，例如约1.7或1.6至1.2，约1.4-1.5和中间的多个数值。

术语“多分散的”或“多分散性”是指一种组合物的重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)。由以下等式计算数均分子量(Mn)：Mn＝∑ci/(∑ci/mi)。变量ci是多糖在片层冲的浓度，而mi是多糖在片层冲的分子量。在含有多个数据片层的色谱峰上取总和。一个片层的数据可以在色谱峰对比时间的图上被绘成一条垂直的线。因此，该洗脱峰可以被分成多个片层。数均分子量是依赖于在每个片层数据的分子量和浓度的一种计算。以上描述了确定重均分子量的方法，并且还将这些方法用于确定多分散性。

制备多糖制剂的方法

还考虑了制备多糖制剂(例如，在此所述的制剂)的不同方法。一种方法包括提供一种前体肝素制剂，该制剂具有大于7000Da的重均分子量或超过7至18个二糖的一个链长度，并且处理该前体肝素制剂(例如，通过酶促或化学解聚作用，例如通过亚硝酸解聚作用)来获得一种多糖制剂，该制剂具有约3000至8000Da的重均分子量或约7至18个二糖的一个平均链长度。例如，该前体肝素制剂可以是未分级肝素。

可以通过一种方法来处理前体肝素制剂，该方法包括解聚作用(例如，通过亚硝酸处理、水解、或酶促解聚作用)之后跟随一个乙二醇裂解的反应。亚硝酸解聚作用可以例如通过以下完成：将该前体肝素制剂(例如UFH)用亚硝酸(例如约0.02至0.04M亚硝酸)在约2至4的pH值下、在约10℃至30℃的温度下处理一个特定时间段(例如约1至5小时)。乙二醇裂解的反应涉及使用高碘酸盐(例如约0.05M至0.2M高碘酸钠)在约0℃至10℃的温度下进行高碘酸盐氧化约10至20小时。在一些实施方案中，残余杂质，例如盐类或二乙二醇(DEG)，可以随后通过一种色谱法，例如凝胶过滤色谱法移除。任选地，这一氧化的制剂然后通过用一种还原剂(例如，约0.5％至2.0％(重量/体积)硼氢化钠)在约6.0至7.0的pH值下并且在约0℃至10℃的温度下处理约0.5至3小时而被还原。

可以使用酶促消化、化学消化或它们的组合来处理一种前体肝素制剂。化学消化的实例包括氧化解聚作用(例如，使用H₂O₂或Cu⁺和H₂O₂)、脱氨基裂解(例如使用亚硝酸异戊酯或亚硝酸)、β-消除裂解(例如使用苄基酯和/或通过碱处理)。酶促消化可以包括使用一种或多种降解肝素的酶类。例如，这一种或多种肝素降解酶可以是例如一种或多种肝素酶，肝素裂解酶，硫酸肝素糖胺聚糖(HSGAG)裂解酶(被描述成一种糖胺聚糖(GAG)裂解酶的一种裂解酶，它也可以降解肝素)。优选地，该酶在未硫酸化的糖醛酸的一个或多个糖苷键上进行裂解。

生物学活性

在此所述的制剂具有抗转移活性，如在一个转移的动物模型中所测定，其中注射到C57BL/6小鼠尾静脉中的B16F10黑色素瘤细胞在肺中俘获并且作为离散的肺部病灶而增殖。该测定大体上描述于Gabri(加布里)等人.，2006，临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)，12：7092-98中。一种制剂可以在其他的实验性转移模型中额外地具有活性，这些模型包括C170HM2测定，其中将C170HM2人结肠直肠癌系细胞注射到腹膜腔中，其中转移的主要部位是到肝脏。在此所述的制剂还可以在自发性的转移模型中展示出抗转移活性，这些模型如AP5LV模型(其中AP5LV人结肠直肠癌细胞被植入到腹膜壁中并且显示自发转移到肺部)、或4T1模型(其中植入到乳房脂肪垫中的4T1鼠乳房癌瘤细胞显示出自发性转移到肺和其他器官)。

在此所述的制剂可以结合至VEGF、FGF、SDF-1α、HB-EGH、类肝素酶和P-选择素，和/或调节(例如抑制)它们中一个或多个的活性。在一些实施方案中，可以例如体外例如使用本领域已知的方法来测定制剂与(例如结合至)一种标靶蛋白(例如VEGF、FGF、SDF-1α或P-选择素)的相互作用。用来检测结合或活性的调节作用(例如抑制)的多种方法和技术是已知的，例如标准受体竞争测定、荧光能量转移(FET)、荧光共振能量转移(FRET)(见例如美国专利号5,631,169；美国专利号4,868,103)以及荧光偏振(FP)。在一些实施方案中，评估一种多糖制剂与一种标靶蛋白的结合可以包括例如使用生物分子相互作用分析(BIA)对于结合相互作用进行一种实时监测(参见例如Sjolander(舍兰德)&Urbaniczky(俄班尼奇)(1991)分析化学(Anal.Chem.)，63：2338-2345和Szabo(萨博)等人.(1995)结构生物学新见(Curr.Opin.Struct.Biol.)，5：699-705)。表面等离子体共振或“BIA”实时地检测了生物特异性相互作用，而并没有标记这些相互作用物的任何一个(例如，BIAcore)。

在体外和体内VEGF、FGF和P-选择素对细胞的活性在本领域中是熟知的。可以体外或在一个细胞基测定中或在一个有机体中体内测定一种多糖制剂调节(例如抑制)VEGF、FGF和P-选择素的活性。例如，可以测定一种多糖制剂对VEGF、FGF、或P-选择素的活性进行调节(例如，抑制)以便调节(例如，刺激)内皮细胞(例如，人脐静脉上皮细胞)增殖。确定对FGF活性的调节作用的示例性方法可以发现于美国专利号5,733,893。细胞基测定可以使用单一的细胞或一批至少两种或更多种细胞进行。该细胞可以是一种酵母细胞(例如，酿酒酵母)或一种哺乳动物细胞，例如一个细胞系。

确定一种化疗剂是否引起骨髓源性祖细胞动员的测定可以由在本领域中已知的方法确定，参见例如Shaked(沙克德)等人.(2008)癌细胞(Cancer Cell)14：263-273，通过引用将其结合在此，并且描述于实例中。

药物组合物

提供了与一种药学上可以接受的载体一起配制的组合物(例如，药学上可以接受的组合物)，这些组合物包括在此所述的一种制剂。

如在此使用的“药学上可以接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、等张和吸收延迟剂以及类似载体，它们在生理学上与胃肠外给药相容。该载体可以适合于任何胃肠外给药，例如静脉内、肌内、皮下、眼内、腹膜内、直肠、吸入或脊髓给药(例如，通过注射或输注)。

本发明的组合物可以呈多种形式。这些形式包括例如液体、半固体以及固体剂型，如液体溶液(例如，可以注射和可以输注的溶液)、分散体或悬浮液、以及脂质体。优选的形式取决于预期的给药和治疗应用的模式。典型的优选的组合物是呈可以注射或可以输注溶液的形式。优选的给药方式是肠胃外给药(例如，静脉内、皮下、眼内、腹膜内、肌内)。在一个优选的实施方案中，该制剂是通过静脉输注或注射给予。在另一个优选的实施方案中，该制剂是通过肌内或皮下注射给予。

如在此使用的短语“胃肠外给药”和“胃肠外给予”意味除了肠内和局部给药之外的给药方式，通常通过注射，并且包括不限于：静脉内、肌内、皮下、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、玻璃体内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、吸入、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬脑膜外以及胸骨内注射和输注。

治疗性组合物典型地应该是无菌的并且在制造和储存的条件下是稳定的。可以将该组合物配制成一种溶液、微乳液、分散体、脂质体、或其他适合于高浓度的有序结构。无菌的可以注射的溶液可以按照要求通过将这种活性化合物(即，多糖制剂)以一个要求的量与以上列举的一个组分或多个成分的一个组合结合在一种适当的溶剂中，之后过滤杀菌来进行制备。大体上，通过将这种活性化合物结合在一种无菌载体中来制备分散体，这种无菌载体含有一种碱性分散介质和所要求的、来自以上列举的那些的其他成分。在用于制备无菌的、可以注射溶液的无菌粉末的情况下，这些优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，以便得到该活性成分加上来自它的一种之前无菌过滤的溶液的任何额外的所希望成分的粉末。一种溶液的合适流动性可以例如通过使用一种涂料(如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所要求的颗粒大小、并且通过使用表面活性剂来维持。通过在该组合物中包括一种延迟吸收的试剂(例如，不同的聚合物，单硬脂酸盐类以及明胶)可以带来可以注射组合物的延长吸收。

对于多种治疗性应用，优选的给药途径/方式是静脉注射或输注。正如本领域技术人员所应理解的，给药途径和/或方式将根据所希望的结果而变化。

用于注射的制剂可以按照单位剂型来呈现在例如安瓿、注射器、注射器型笔(syringe pen)、或者在多剂量的容器中，它们例如具有一种添加的防腐剂。这些组合物可以采用如处于油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制用试剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

对于通过吸入进行给药，该制剂可以方便地以一种气溶胶喷雾的给送方式的形式从加压的包装或一种喷雾器中进行递送，其中连同使用了一种适合的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。在一种加压的气溶胶的情况下，通过提供一个阀门递送一个计量的量值可以确定剂量单位。在一个吸入器或吹入器中使用的(例如，明胶)的胶囊和药筒可以被配制成含有该化合物与一种适合的粉末基质(如乳糖或淀粉)的一种粉末混合物。此外，用于吸入治疗的干粉制剂在本发明的范围之内。此类干粉制剂可以如所披露(例如，在WO 02/32406中)般进行制备。

除了以上所述的组合物之外，这些化合物还可以配制成储存制剂。这类长效制剂可以用适合的聚合性或疏水性材料(例如，作为处于一种可以接受的油剂中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成略微可溶的衍生物类，例如一种略微可溶的盐。

这些药物组合物还可以包括适合的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些组合物可以与用于给药的说明一起包括在一个容器、包装、或分配器中。

该制剂还可以用短期或长期植入设备(例如，一个支架)进行给药。该制剂可以进行皮下植入，可以被植入到多个组织或器官中(例如，冠状动脉、颈动脉、肾动脉以及其他的外周动脉、静脉、肾脏、心角膜、玻璃质、大脑、等)，或者可以在多个组织和器官(例如，肾包膜、心包膜、胸或腹膜间隙)周围的生理空间中植入。

该制剂还可以用来涂覆不同的医疗装置。例如，该制剂可以用来涂覆一个支架或体外回路。这些制剂的此类制剂可以包括使用例如控制释放的珠子、凝胶或微球连同不同的聚合物，如PLGA、纤维素、海藻酸盐或其他多糖。

对剂量方案进行调整以提供最佳的希望的响应(例如，一种治疗性响应)。例如，可以给予一个快速注射剂，可以随着时间给予几个分开的剂量、或可以按照由治疗情况的紧急事件所表明的按比例减少或增加该剂量。尤其有利的是为了给药的方便以及剂量的均匀性而将胃肠外组合物配置成剂量单位形式。如在此使用的剂量单位形式是指物理上离散的、适合作为单位剂量的单位，用于有待治疗的受试者；每个单位含有一个预先确定量的活性化合物，该量值被计算以产生与所要求的药学载体相关联联的所希望的治疗效果。本发明的这些剂量单位形式的说明通过以下各项表示并且直接取决于以下各项：(a)这种活性化合物的独特特点和有待实现的特定的治疗效果，和(b)在将这种用来治疗多个个体中的敏感性的活性化合物进行混配的领域中所固有的限制。

应当指出，剂量值可以随着有待缓解的病况的类型和严重性而变化。应当进一步理解，对于任何特定的受试者，应当根据该个体的需要以及给予或监督这些组合物的给药的人士的专业判断随时间来调整特定的剂量方案。

本发明的药物组合物可以包括一种制剂的一个治疗有效量。该剂量的一个治疗有效量可以根据以下因素而变化，如该个体的疾病状态、年龄、性别、以及体重，并且可以包括超过一个单位剂量。一个治疗有效量还是一个量值，其中该制剂的任何毒性或有害的作用被这些治疗上有益的作用超过。一个治疗有效量可以抑制一个可以测量的参数，例如VEGF活性、FGF活性、P-选择素活性、类肝素酶活性或转移性病变的大小或生长的速率，例如相对于未治疗的受试者达到至少约20％、更优选地达到至少约25％、30％、40％，甚至更优选地达到至少约50％、60％，并且又更优选地达到至少约70％、80％。可以在一个动物模型系统中或在人体内(例如，在一个临床前模型或一个临床试验中)评估一种化合物对一个可以测量的参数(例如，转移或血管生成)进行抑制的能力。可替代地，可以通过在一个体外测定中检查一种化合物的活性来评估该组合物的一个特性。用于静脉内或皮下给予多糖制剂的示例性剂量是约0.03mg/kg至0.45mg/kg，例如0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.22mg/kg、0.25mg/kg、0.27mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.37mg/kg、0.4mg/kg、0.44mg/kg，优选地约0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.35mg/kg、0.4mg/kg、0.44mg/kg、0.47mg/kg、0.5mg/kg、0.55mg/kg、0.60mg/kg、0.7mg/kg，优选地约0.30至0.50mg/kg，例如0.30mg/kg、0.35mg/kg、0.40mg/kg、0.42mg/kg、0.44mg/kg、0.47mg/kg或0.50mg/kg。在一些实施方案中，该多糖制剂可以每天0.5至80mg/kg、0.5至40mg/kg、0.5至30mg/kg，例如5-50mg/kg之间的剂量给予。

试剂盒

也在本发明的范围内的是一种试剂盒，该试剂盒包含在此所述的一种多糖制剂，例如缺少实质性抗凝活性的在此所述的一种多糖制剂，和与骨髓源性祖细胞动员相关联的一种化疗剂；一种试剂盒，该试剂盒包含在此所述的一种多糖制剂，例如缺少实质性抗凝活性的一种多糖制剂，和将该多糖制剂给予受试者的说明，该受试者患有癌症，已或将用与骨髓源性祖细胞动员相关联的一种化疗剂进行治疗；一种试剂盒，该试剂盒包含在此所述的一种多糖制剂，例如缺少实质性抗凝活性的一种多糖制剂，和将该多糖制剂给予受试者的说明，该受试者患有癌症，已或将用一种化疗剂以与骨髓源性祖细胞动员相关联的剂量和/或给药时程表(例如在此所述的一个剂量和/或给药时程表)进行治疗；一种试剂盒，该试剂盒包含与骨髓源性祖细胞动员相关联的一种化疗剂，和将该化疗剂联合在此所述的一种多糖制剂(例如缺少实质性抗凝活性的在此所述的一种多糖制剂)给予受试者的说明；或一种试剂盒，该试剂盒包含一种化疗剂，和将该化疗剂以与骨髓祖细胞动员相关联的剂量和/或相关给药时程表给予受试者的说明，和将该化疗剂联合在此所述的一种多糖制剂(例如缺少实质性抗凝活性的在此所述的一种多糖制剂)给药的说明。

该试剂盒可以包括一种或多种其他要件，这些要件包括：其他试剂(例如，一种治疗剂)；用于制备该多糖制剂来进行给药的装置或其他材料；药学上可以接受的载体；以及用于给予一位受试者的装置或其他材料。这些说明可以包括针对治疗性应用的说明，包括建议的剂量和/或给药方式，例如在患有一种病症(例如，在此所述的一种病症)的患者体内。该试剂盒可以在一种或多种分开的药物制剂中进一步含有至少一种其他的试剂，如一种诊断性或治疗性药剂(例如，如在此所述的一种诊断性或治疗性药剂)，适当时进行了配制。

用途

这些多糖制剂可以用于治疗一位受试者。如在此使用的，一位受试者是一种哺乳动物，例如一种非人类的实验性哺乳动物、一种兽医的哺乳动物、或人。非人类的哺乳动物包括一种灵长动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫、或啮齿动物。

在此提供的制剂可以用来例如治疗或预防一种转移性病症(例如，一种癌症，例如一种癌瘤或其他实体或血液癌)。如在此使用的术语“癌症”意欲包括所有类型的癌性生长或致癌性过程、转移性组织或恶性转型的细胞、组织或器官，而不考虑组织病理学类型或侵袭的阶段。在此披露的方法和组合物对于治疗、或降低与癌症相关联的转移性病变的大小、数目、或生长速率是特别有用的。

癌症的实例包括但并不局限于：实体瘤、软组织肿瘤、造血系统肿瘤(hematopoietic tumor)以及转移性病变。实体肿瘤的实例包括恶性肿瘤，例如，不同器官系统的肉瘤、腺癌、以及癌瘤，如影响以下各项的那些肿瘤：头和颈(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞的肺癌)、乳房、淋巴、胃肠(例如，口、食管、胃、肝脏、胰脏、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器以及生殖泌尿道(例如，肾脏、尿路上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)，CNS(中枢神经系统)(例如，神经细胞或神经胶质细胞，例如神经母细胞瘤或神经胶质瘤)、皮肤(例如，黑色素瘤)。可以治疗的造血系统癌症的实例包括血管瘤、多发性骨髓瘤、淋巴瘤以及白血病以及骨髓增生异常。在此披露的方法和组合物对于治疗(例如，减轻或延迟)与以上提及的癌症相关联的转移性病变是特别有用的。在一些实施方案中，患者将经历一次或多次手术切除一个组织、化疗、或其他抗癌治疗，并且主要的或唯一的标靶将是转移性病变，例如在骨或淋巴结或肺或肝脏或腹膜腔或CNS或其他器官中的转移。

本发明的方法(例如，治疗的方法)可以进一步包括以下步骤：监测该受试者的例如以下各项中的一个或多个的变化(例如，一种增加或减少)：肿瘤大小；对于患有癌症的患者而言，一种癌症标志物的水平；新病变的大小或出现的速率，例如在一次扫描中；新的疾病相关症状的出现；软组织块的大小，例如一种减小或稳定；通过成像技术测量的血液流动的变化；生存期；无进展生存期；生活质量，例如与疼痛(例如骨痛)相关联的疾病量；或涉及临床结果的任何其他参数。在一个实施方案中，可以监测该受试者的骨髓源性祖细胞动员(例如EPC、HPC、iMC(MDSC)和/或MPC动员)。可以在以下时期中的一个或多个中监测该受试者：在开始治疗之前；在治疗过程中；或在已经给予了该治疗的一个或多个要件之后。可以使用监测来评估对于使用这种相同制剂的进一步治疗或使用其他药剂的额外治疗的需要。大体上，在以上所述的一个或多个参数的一种减少表示该受试者的改善的病况。

可以将在此所述的制剂以单一剂量或多个剂量给予一位受试者来治疗或预防一种转移性或癌性病症，例如在此所述的一种癌性病症。

在此所述的制剂还可以用于治疗炎症、自身免疫、纤维化、纤维增生、特应性、或血管生成性病症。炎症的实例包括但并不局限于：慢性阻塞性肺病、哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、多发性硬化症、牛皮癣、局部缺血再灌注损伤、败血症性休克、年龄相关的黄斑变性(例如湿性年龄相关的黄斑变性)、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、心血管疾病、血管炎、I型和II型糖尿病、代谢综合症、糖尿病性视网膜病、再狭窄。自身免疫性疾病的实例包括但并不局限于：哮喘、类风湿性关节炎、炎症性肠病、多发性硬化症、牛皮癣、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、修格连氏综合症、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合症、自身免疫性肝炎、重症肌无力。纤维化疾病的实例包括但并不局限于：硬皮病、肝纤维化、胰纤维化、慢性阻塞性肺病、糖尿病性肾病、肉样瘤病、特发性肺纤维化、肝硬化、囊肿性纤维化、神经纤维瘤、子宫内膜组织异位、术后纤维瘤、再狭窄。特应性疾病的实例包括但并不局限于特应性皮炎、特应性哮喘、以及过敏性鼻炎。

纤维增生性病症的实例包括全身性和局部的硬皮病、瘢痕瘤和肥大性瘢、动脉硬化、再狭窄、纤维肉瘤、神经纤维瘤、以及类风湿性关节炎。与外伤相关联的疤痕化的实例包括由于手术、化疗诱导的纤维化、辐射诱导的纤维化所致的疤痕化、与损伤或烧伤相关联的疤痕化。

在一个实施方案中，这些多糖制剂用于抑制血管生成，例如治疗血管生成性病症。在此所用的血管生成是不适当地形成新血管。血管生成性病症包括但并不局限于：肿瘤、眼部的新生血管性病症、子宫内膜组织异位、黄斑变性、骨质疏松症、牛皮癣、关节炎、癌症、血管瘤以及心血管病症。应当理解，一些病症将属于超过一个种类的在此所述的疾病之中。

在此所述的制剂还可以用于治疗或预防感染性病症，如疟疾。

联合治疗

本发明的方法和组合物可以与其他治疗模式联合使用。如在此使用的“联合”给药意味着在该受试者罹患该病症的过程中将两种(或多种)不同的治疗递送至该受试者，使得这些治疗对该受试者的作用在一个时间点上重叠。在一些实施方案中，一种治疗的递送在第二治疗的递送开始时仍然发生，这样就给药而言存在着重叠。在此有时这被称为“同时递送”(“simultaneous”or“concurrent delivery”)。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的一些实施方案中，这种治疗由于联合给药变得更加有效。例如，该第二治疗是更加有效的，例如使用较少的该第二治疗可以见一种等效作用，或者与在该第一治疗的缺失下给予该第二治疗相比该第二治疗将多种症状降低了一个更大的程度，或者使用该第一治疗可以见类似的情况。在一些实施方案中，递送是使得一种症状的降低、或者与该病症相关的其他参数大于使用在另一个缺失的情况下所递送的一种治疗将观察到的参数。这两种治疗的作用可以是部分地相加的，全部相加的、或大于相加的。这种递送可以是使得所递送的第一治疗的作用在递送该第二治疗时仍然是可以检测的。

在一个实施方案中，本发明的方法包括将在此所述的一种制剂联合一种或多种其他治疗(例如手术、辐射治疗或给予另一种治疗性制剂)来给予受试者。在一个实施方案中，其他治疗可以包括化疗，例如一种细胞毒性剂。在一个实施方案中，其他疗法可以包括一种靶向治疗，例如一种酪氨酸激酶抑制剂、一种蛋白酶体抑制剂、一种蛋白酶抑制剂。在一个实施方案中，其他疗法可以包括一种抗炎、抗血管生成、抗纤维化或抗增生性化合物，例如一种类固醇、一种生物免疫调节剂、一种单克隆抗体、一种抗体片段、一种适体、一种siRNA、一种反义分子、一种融合蛋白、一种细胞因子、一种细胞因子受体、一种支气管扩张药(bronchodialator)、一种抑制素、一种抗炎剂(例如氨甲蝶呤)以及一种NSAID(非甾体抗炎药)。在另一个实施方案中，额外的治疗可以包括不同类别的联合治疗。该多糖制剂和该其他治疗可以同时或顺序给予。

可以联合该多糖制剂给药的示例性细胞毒性剂包括抗微管剂类、拓扑异构酶抑制剂类、抗代谢药类、蛋白质的合成和降解抑制剂类、有丝分裂抑制剂类、烷基化剂类、铂化剂类、核酸合成的抑制剂类、组蛋白脱乙酰基酶和DNA甲基转移酶抑制剂类、氮芥类、亚硝基脲类、乙撑亚胺类、磺酸烷基酯类、三氮烯类、叶酸类似物类、核苷类似物类、核糖核苷酸(ribnucleotide)还原酶抑制剂类、长春花生物碱类、紫杉烷类、埃坡霉素类、嵌入剂类，能够干扰信号转导路径的药剂类，促进凋亡的药剂类和辐射、结合表面蛋白以递送一种毒性剂的抗体结合物类。在一个实施方案中，可以与在此所述的一种制剂一起给药的细胞毒性剂是一种铂基药剂(诸如顺铂)、环磷酰胺、氮烯唑胺、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、羟基脲、托泊特坎、伊立替康、氮杂胞苷、伏立诺他、伊沙匹隆、硼替佐米、紫杉烷类(紫杉醇、多西他赛)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、秋水仙碱、蒽环类药物(多柔比星、表柔比星、柔红霉素)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、阿霉素、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、蓖麻毒素以及美登素衍生物类。

联合治疗还可以包括共同配制和/或共同给予的本发明的一种组合物与一种或多种额外的治疗剂，这些治疗剂例如一种或多种抗癌剂、细胞毒性或细胞抑制剂、激素治疗、受体酪氨酸激酶和其他酪氨酸激酶(包括HER-2、EGFR、VEGFR、BCR-ABL、c-KIT)的小分子抑制剂(如吉非替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、索拉非尼、舒尼替尼、伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼)或mTOR(如，替西罗莫司、依维莫司、拉珀霉素)，或细胞因子类或趋化因子类、疫苗类、针对细胞膜受体途径(包括EGF-EGFR、VEGF-VEGFR、CD19、CD20、CD3、CTLA-4)的抗体类(如曲妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗)和/或其他免疫治疗。

抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂类

在此所述的多糖制剂可以联合一种抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂给药，以便治疗患有癌症，例如原发性肿瘤，或具有或有危险具有一种原发性肿瘤转移的一位受试者。如在此所论述，将抗血管生成剂和酪氨酸激酶抑制剂给予一位患有癌症的受试者是与骨髓源性祖细胞(例如内皮祖细胞)的动员相关联的。

在一个实施方案中，抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂是以与(例如引起或导致)骨髓源性祖细胞动员相关联的某一量和/或给药时程表给药。例如，抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂是以与(例如引起或导致)内皮祖细胞动员相关联的某一量和/或给药时程表给药。该剂量和/或给药时程表可以为在此所述的一个剂量和/或给药时程表。

在一个实施方案中，该抗血管生成剂或酪氨酸激酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成：一种表皮生长因子(EGF)途径抑制剂(例如一种表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)、一种血管内皮生长因子(VEGF)途径抑制剂(例如一种血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如一种VEGFR-1抑制剂、一种VEGFR-2抑制剂、一种VEGFR-3抑制剂))、一种血小板衍生生长因子(PDGF)途径抑制剂(例如一种血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如一种PDGFR-β抑制剂))、一种TGF途径抑制剂、一种KIT途径抑制剂、一种RAF-1抑制剂以及一种RET抑制剂。在一些实施方案中，该受试者已或将用选自下组的一种抗血管生成剂或一种酪氨酸激酶抑制剂治疗，该组由以下各项组成：贝伐单抗

兰尼单抗

伊马替尼西妥昔单抗

舒尼替尼索拉非尼

tivozanib(AV-951)、西地尼布(AZD2171)、达沙替尼

尼洛替尼(AMN-107)、CP-547632、埃罗替尼

帕尼单抗

帕唑帕尼阿昔替尼以及吉非替尼

一种PDGF途径抑制剂包括但并不局限于酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1296、酪氨酸磷酸化抑制剂9、1，3-丁二烯-1，1，3-三甲腈、2-氨基-4-(1H-吲哚-5-基)-(9Cl)、伊马替尼

以及吉非替尼

以及欧洲专利号0564409和PCT申请号WO 99/03854中总体并且特定披露的那些化合物。

一种VEGF途径抑制剂包括但并不局限于抗-VEGF抗体类，例如贝伐单抗和小分子类，例如舒尼替尼索拉非尼

ZD6474(又称为凡德他尼)(Zactima^TM)、SU6668、CP-547632以及AZD2171(又称为西地尼布)(Recentin^TM)。

一种EGF途径抑制剂包括但并不局限于抗-EGFR抗体类，例如西妥昔单抗

帕尼单抗以及吉非替尼

和小分子类，例如酪氨酸磷酸化抑制剂46、EKB-569、埃罗替尼

吉非替尼

拉帕替尼

以及WO 97/02266、EP 0564409、WO99/03854、EP 0520722、EP 0566226、EP 0787722、EP 0837063、US5,747,498、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983以及WO 96/33980中总体并且特定披露的那些化合物。

在一个实施方案中，癌症是胃肠癌。胃肠癌可以是一种化疗难治性的、一种化疗抗性的和/或一种复发的癌症，例如胃肠癌是甲磺酸伊马替尼难治的、对甲磺酸伊马替尼具有抗性的或在用甲磺酸伊马替尼治疗后复发的。

在一个实施方案中，癌症是肾细胞癌，例如晚期或转移性肾细胞癌瘤，例如一种化疗难治性的、一种化疗抗性的和/或一种复发的癌瘤，例如肾细胞癌瘤是一种细胞因子(例如白细胞介素-2或干扰素)难治的、对一种细胞因子(例如白细胞介素-2或干扰素)具有抗性的或在用一种细胞因子(例如白细胞介素-2或干扰素)治疗后复发的。在一些实施方案中，一种肾细胞癌是根据在此所述的方法，每日用帕唑帕尼

(例如以800mg或更小(例如600mg、400mg、200mg)的剂量)或索拉非尼联合在此所述的一种多糖制剂进行治疗的。在一些实施方案中，在此所述的一种多糖可以联合舒尼替尼进行给药。在一些实施方案中，舒尼替尼是以每日一次口服20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg舒尼替尼的剂量，根据某一时程表进行口服给药的。在一个实施方案中，该时程表是每天给予舒尼替尼持续三、四或五周，接着是一、二或三周的无给药期，或者继续而无‘停药期’。

在一个实施方案中，癌症是结肠直肠癌，例如转移性结肠直肠癌，例如一种化疗难治的、一种化疗抗性的和/或一种复发的癌症。在一些实施方案中，一种结肠直肠癌是用在此所述的一种多糖制剂联合贝伐单抗

(例如以每12、13、14、15、16天5至10mg/kg的剂量)，例如进一步联合以下各物中的一种或多种进行治疗的：一种拓扑异构酶抑制剂(例如托泊特坎、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、层状素D、喜树碱)、一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)、一种抗代谢药(例如5FU)以及甲酰四氢叶酸。

在一个实施方案中，癌症是肺癌，例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌，例如一种化疗难治的、一种化疗抗性的和/或一种复发的癌症。在一些实施方案中，肺细胞癌是用在此所述的一种多糖制剂联合贝伐单抗

(例如以每12、13、14、15、16天5至10mg/kg的剂量)，例如进一步联合以下各物中的一种或多种进行治疗的：一种拓扑异构酶抑制剂(例如托泊特坎、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、层状素D、喜树碱)、一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)、一种抗代谢药(例如5FU)以及甲酰四氢叶酸。

在一个实施方案中，癌症是乳腺癌，例如转移性乳腺癌，例如一种化疗难治的、一种化疗抗性的和/或一种复发的癌症。乳腺癌可以是雌激素受体阳性乳腺癌；雌激素受体阴性乳腺癌；HER-2阳性乳腺癌；HER-2阴性乳腺癌；黄体酮受体阳性乳腺癌；黄体酮受体阴性乳腺癌；雌激素受体阴性、HER-2阴性以及黄体酮受体阴性乳腺癌(即三重阴性乳腺癌)。在一些实施方案中，乳腺癌是用在此所述的一种多糖制剂联合贝伐单抗

(例如以每12、13、14、15、16天5至10mg/kg的剂量)，例如进一步联合一种紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、卡巴他塞(cabizitaxel))进行治疗的。还例如联合蒽环类药物(柔红霉素

多柔比星

)，例如联合铂(例如顺铂)，例如联合雌激素抑制剂(例如，芳香酶抑制剂类、他莫昔芬

依西美坦阿那曲唑以及来曲唑

)，例如联合EGF/HER2抑制剂(例如拉帕替尼

曲妥珠单抗

)。

在一个实施方案中，癌症是一恶性胶质瘤，例如一种化疗难治的、一种化疗抗性的和/或一种复发的恶性胶质瘤。在某些实施方案中，该恶性胶质瘤是用在此所述的一种多糖制剂联合贝伐单抗

(例如以每12、13、14、15、16天5至10mg/kg的剂量)进行治疗的。

在一个实施方案中，癌症是胃肠癌，并且在此所述的一种多糖是联合舒尼替尼进行给药的。在一些实施方案中，舒尼替尼是以每日一次20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg的剂量，根据某一时程表进行口服给药的。在一个实施方案中，该时程表是每天给予舒尼替尼持续三、四或五周，接着是一、二或三周的无给药期，或者继续而无‘停药期’。

在一个实施方案中，癌症是一种白血病(例如慢性髓细胞性白血病或急性淋巴性白血病，例如，费城染色体阳性慢性髓细胞性白血病或急性淋巴性白血病)，例如一种化疗难治的，一种化疗抗性的和/或一种复发的白血病，例如，伊马替尼难治的、对伊马替尼具有抗性的和/或伊马替尼复发的。在一些实施方案中，白血病是用在此所述的一种多糖制剂联合达沙替尼(例如，以120mg/天，130mg/天，140mg/天，150mg/天的剂量，例如每天给药两次)进行治疗的。

在一个实施方案中，癌症是一种胰腺癌(例如，晚期胰腺癌)。在一些实施方案中，该胰腺癌是用在此所述的一种多糖制剂联合吉西他滨、埃罗替尼、注射用紫杉醇(白蛋白结合型)(一种紫杉酚结合物)、一种mTOR抑制剂、一种VEGF抑制剂(例如在此所述的一种VEGF抑制剂)、一种音猬因子抑制剂进行治疗的。

血管阻断剂

在此所述的多糖制剂可以联合一种血管阻断剂进行给药，以便治疗患有癌症、例如原发性肿瘤，或具有或有危险具有一种原发性肿瘤转移的一位受试者。血管阻断剂的给药是与患有癌症的受试者的骨髓源性祖细胞如内皮祖细胞的动员相关联的。

在一个实施方案中，该血管阻断剂是以与(例如引起或导致)骨髓源性祖细胞动员相关联的某一量和/或给药时程表给药。例如，该血管阻断剂是以与(例如引起或导致)内皮祖细胞动员相关联的某一量和/或给药时程表给药。该剂量和/或给药时程表可以为在此所述的一个剂量和/或给药时程表。

示例性血管阻断剂包括但并不局限于AVE8062、vadimezan、ZD6126、康普立停A-4磷酸二钠盐(CA4P)或Oxi4503、DMXAA(ASA404)、NPI-2358。

在一个实施方案中，癌症是肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)。该肺癌可以是对于用一种化疗剂，例如一种VEGF途径抑制剂(例如贝伐单抗)或一种EGF途径抑制剂治疗具有抗性，复发或难治。该肺癌可以是局部晚期或转移性肺癌。在另一实施方案中，癌症是尿路上皮癌(例如，膀胱癌、尿道癌、输尿管癌、肾盂癌)，例如局部晚期或转移性尿路上皮癌。该尿路上皮癌可以是对于另一种化疗剂，例如一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)或一种嘧啶类似物(例如吉西他滨)具有抗性、复发或难治。在此所述的一种多糖可以联合ASA404(例如，ASA404剂量为1,600mg/m²、1,700mg/m²、1,800mg/m²、1,900mg/m²、2,000mg/m²，根据某一时程表)进行给药。在一个实施方案中，该时程表是每18、19、20、21、22、23或24天给予ASA404，持续例如4、5、6、7个周期。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂，例如一种紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、卡巴他塞(cabizitaxel))或一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)。在一些实施方案中，肺癌是用在此所述的一种多糖制剂联合NPI-2358(例如以20、30、40mg/m²的剂量)进行治疗的。

在一个实施方案中，癌症是一种头颈癌(例如，甲状腺的未分化癌瘤)，例如局部晚期或转移性头颈癌。在另一个实施方案中，癌症是一种神经胶质瘤。仍在另一个实施方案中，癌症是肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)，例如局部晚期或转移性肺癌。该癌症可以是化疗难治的、一种化疗抗性的和/或一种复发的。在某些实施方案中，该癌症是用在此所述的一种多糖制剂联合CA4P(例如剂量为50mg/m²、60mg/m²、70mg/m²，根据某一时程表)进行治疗的。给药时程表可以是例如每周给予CA4P，持续三周，然后是一周的无给药期。

在一个实施方案中，癌症是一种肉瘤(例如，一种软组织肉瘤)，例如局部晚期或转移性肉瘤。该癌症可以是化疗难治的、一种化疗抗性的和/或一种对于另一种化疗剂(例如一种蒽环类药物或一种烷基化剂(例如异环磷酰胺))复发的。在某些实施方案中，该癌症是用在此所述的一种多糖制剂联合AVE8026(例如剂量为15mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²，根据某一时程表)进行治疗的。该给药时程表可以是例如每三周给予AVE8026。在一些实施方案中，该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂，例如一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)或一种紫杉烷(例如多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、卡巴他塞(cabizitaxel))。

紫杉烷

在此所述的多糖制剂可以联合一种紫杉烷进行给药，以便治疗患有癌症、例如原发性肿瘤，或具有或有危险具有一种原发性肿瘤转移的一位受试者。如在此所论述，将一种紫杉烷给予一位患有癌症的受试者是与骨髓源性祖细胞如内皮祖细胞的动员相关联的。

在一个实施方案中，该紫杉烷是以与(例如引起或导致)骨髓源性祖细胞动员相关联的某一量和/或给药时程表进行给药。例如，该紫杉烷是以与(例如引起或导致)内皮祖细胞动员相关联的某一量和/或给药时程表给药。该剂量和/或给药时程表可以为在此所述的一个剂量和/或给药时程表。

在一个实施方案中，癌症是乳腺癌(例如局部晚期或转移性乳腺癌)。乳腺癌可以是雌激素受体阳性乳腺癌；雌激素受体阴性乳腺癌；HER-2阳性乳腺癌；HER-2阴性乳腺癌；黄体酮受体阳性乳腺癌；黄体酮受体阴性乳腺癌；雌激素受体阴性、HER-2阴性以及黄体酮受体阴性乳腺癌(即三重阴性乳腺癌)。乳腺癌可以是对于用一种化疗剂，例如一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)或一种蒽环类药物(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、戊柔比星以及伊达比星)治疗具有抗性，复发或难治。在一些实施方案中，在此所述的一种多糖可以联合多西他赛(例如多西他赛剂量为60mg/m²，70mg/m²、75mg/m²、80mg/m²、90mg/m²、100mg/m²、105mg/m²、110mg/m²、115mg/m²，根据某一时程表)进行给药。在一个实施方案中，该时程表是每三周给予多西他赛。在另一个实施方案中，在此所述的一种多糖可以是联合紫杉醇(例如紫杉醇的剂量为125mg/m²、135mg/m²、145mg/m²，例如经约2、3或4小时输注，或为165mg/m²、175mg/m²、185mg/m²、195mg/m²，例如经约22、23、24或25小时输注，根据某一时程表)进行给药的。在一个实施方案中，该时程表是每三周给予紫杉醇。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂，例如一种长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)或一种蒽环类药物(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、戊柔比星以及伊达比星)或一种铂基药剂(例如，顺铂)。

在另一个实施方案中，癌症是肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)，例如局部晚期或转移性肺癌。该肺癌可以是对于一种化疗剂，例如一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)具有抗性、复发或难治。在此所述的一种多糖可以联合多西他赛(例如多西他赛的剂量为60mg/m²，70mg/m²、75mg/m²、80mg/m²、90mg/m²、100mg/m²、105mg/m²、110mg/m²、115mg/m²，根据某一时程表)进行给药。在一个实施方案中，该时程表是每三周给予多西他赛。在另一个实施方案中，在此所述的一种多糖可以是联合紫杉醇(例如紫杉醇的剂量为125mg/m²、135mg/m²、145mg/m²，例如经约2、3或4小时输注，或为165mg/m²、175mg/m²、185mg/m²、195mg/m²，例如经约22、23、24或25小时输注，根据某一时程表)进行给药的。在一个实施方案中，该时程表是每三周给予紫杉醇。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂，例如一种长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)或一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)。

在一个实施方案中，癌症是前列腺癌(例如局部晚期或转移性前列腺癌)。前列腺癌可以是对于用一种化疗剂治疗具有抗性、复发或难治。在此所述的一种多糖可以联合多西他赛(例如多西他赛的剂量为60mg/m²，70mg/m²、75mg/m²、80mg/m²、90mg/m²、100mg/m²、105mg/m²、110mg/m²、115mg/m²，根据某一时程表)进行给药。在一个实施方案中，该时程表是每三周给予多西他赛。在另一个实施方案中，在此所述的一种多糖可以联合多西他赛(例如，多西他赛的剂量为20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、35mg/m²、40mg/m²，根据某一时程表)进行给药。在一个实施方案中，该时程表是每周给予多西他赛。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂。

在一个实施方案中，癌症是卵巢癌(例如局部晚期或转移性卵巢癌)。该卵巢癌可以是对于用一种化疗剂，例如一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)治疗具有抗性、复发或难治。在此所述的一种多糖可以是联合紫杉醇(例如紫杉醇的剂量为125mg/m²、135mg/m²、145mg/m²，例如经约2、3或4小时输注，或为165mg/m²、175mg/m²、185mg/m²、195mg/m²，例如经约22、23、24或25小时输注，根据某一时程表)进行给药的。在一个实施方案中，该时程表是每三周给予紫杉醇。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂。

在一个实施方案中，癌症是一种肉瘤(例如，AIDS(艾滋病)-相关的卡波氏肉瘤)，例如局部晚期或转移性肉瘤。该肉瘤可以是对于用一种化疗剂，例如一种蒽环类药物(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、戊柔比星以及伊达比星)治疗具有抗性、复发或难治。在此所述的一种多糖可以是联合紫杉醇(例如紫杉醇的剂量为125mg/m²、135mg/m²、145mg/m²，例如经约2、3或4小时输注，或为155mg/m²、165mg/m²、175mg/m²、185mg/m²、195mg/m²，例如经约22、23、24或25小时输注，根据某一时程表)进行给药的。在一个实施方案中，该时程表是每三周给予紫杉醇。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂。

嘧啶类似物

在此所述的多糖制剂可以联合一种嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶)进行给药，以便治疗患有癌症，例如原发性肿瘤，或具有或有危险具有一种原发性肿瘤转移的一位受试者。嘧啶类似物，例如氟尿嘧啶的给药是与患有癌症的受试者的骨髓源性祖细胞如内皮祖细胞的动员相关联的。

在一个实施方案中，该嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶)是以与(例如引起或导致)骨髓源性祖细胞动员相关联的某一量和/或给药时程表进行给药。例如，该血管阻断剂是以与(例如引起或导致)内皮祖细胞动员相关联的某一量和/或给药时程表给药。该剂量和/或给药时程表可以为在此所述的一个剂量和/或给药时程表。

在一个实施方案中，癌症是乳腺癌(例如局部晚期或转移性乳腺癌)。乳腺癌可以是雌激素受体阳性乳腺癌，雌激素受体阴性乳腺癌，HER-2阳性乳腺癌，HER-2阴性乳腺癌，黄体酮受体阳性乳腺癌，黄体酮受体阴性乳腺癌，雌激素受体阴性、HER-2阴性以及黄体酮受体阴性乳腺癌(即三重阴性乳腺癌)。乳腺癌可以是对于用一种化疗剂，例如一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、一种蒽环类药物(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、戊柔比星以及伊达比星)、一种紫杉烷(例如多西他赛或紫杉醇)或一种铂基药剂(例如顺铂)治疗具有抗性，复发或难治。在一些实施方案中，在此所述的一种多糖可以联合氟尿嘧啶(例如，氟尿嘧啶的剂量为8mg/m²、10mg/m²、12mg/m²、14mg/m²、16mg/m²，根据某一时程表)进行给药。在一个实施方案中，该时程表是每日一次给予氟尿嘧啶，持续四天，然后是例如在第6天、第8天、第10天以及第12天以一个降低的剂量给予。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂，例如一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)或一种蒽环类药物(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、戊柔比星以及伊达比星)或一种紫杉烷(例如，多西他赛或紫杉醇)。该治疗可以进一步包括给予甲酰四氢叶酸。

在一个实施方案中，癌症是结肠直肠癌(例如局部晚期或转移性结肠直肠癌)。该结肠直肠癌可以是对于用一种化疗剂治疗具有抗性、复发或难治。在一些实施方案中，在此所述的一种多糖可以联合氟尿嘧啶(例如，氟尿嘧啶的剂量为8mg/m²、10mg/m²、12mg/m²、14mg/m²、16mg/m²，根据某一时程表)进行给药。在一个实施方案中，该时程表是每日一次给予氟尿嘧啶，持续四天，然后是例如在第6天、第8天、第10天以及第12天以一个降低的剂量给予。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂，例如一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)、一种蒽环类药物(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、戊柔比星以及伊达比星)或一种紫杉烷(例如，多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、卡巴他塞(cabizitaxel))。该治疗可以进一步包括给予甲酰四氢叶酸。

在一个实施方案中，癌症是胃癌(例如局部晚期或转移性胃癌)。该胃癌可以是对于用一种化疗剂治疗具有抗性、复发或难治。在一些实施方案中，在此所述的一种多糖可以联合氟尿嘧啶(例如，氟尿嘧啶的剂量为8mg/m²、10mg/m²、12mg/m²、14mg/m²、16mg/m²，根据某一时程表)进行给药。在一个实施方案中，该时程表是每日一次给予氟尿嘧啶，持续四天，然后是例如在第6天、第8天、第10天以及第12天以一个降低的剂量给予。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂，例如一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)、一种紫杉烷(多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛、卡巴他塞(cabizitaxel))或一种蒽环类药物(例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、戊柔比星以及伊达比星)。该治疗可以进一步包括给予甲酰四氢叶酸。

在一个实施方案中，癌症是胰腺癌(例如局部晚期或转移性胰腺癌)。该胰腺癌可以是对于用一种化疗剂治疗具有抗性、复发或难治。在一些实施方案中，在此所述的一种多糖可以联合氟尿嘧啶(例如，氟尿嘧啶的剂量为8mg/m²、10mg/m²、12mg/m²、14mg/m²、16mg/m²，根据某一时程表)进行给药。在一个实施方案中，该时程表是每日一次给予氟尿嘧啶，持续四天，然后是例如在第6天、第8天、第10天以及第12天以一个降低的剂量给予。该治疗可以进一步包括给予一种或多种额外的化疗剂。该治疗可以进一步包括给予甲酰四氢叶酸。

血细胞的生长因子

在此所述的多糖制剂可以联合一种化疗剂进行给药，该化疗剂是联合血细胞(例如髓样细胞，粒细胞以及红细胞)的生长因子进行给药，以便治疗患有癌症，例如原发性肿瘤，或具有或有危险具有一种原发性肿瘤转移的一位受试者。要求共同给予血细胞(例如髓样细胞和红细胞)的一种生长因子(例如以便抵消该化疗剂的一种或多种副作用)的一种化疗剂的给药可以是与患有癌症的受试者的骨髓源性祖细胞如内皮祖细胞的动员相关联的。

在一个实施方案中，该方法包括将该化疗剂联合一种生长因子进行给药，然后是接着给予在此所述的一种多糖制剂。例如，该多糖制剂可以是在给予该生长因子一、二、三、五、十、十五、二十小时或1、2、3、4天之后给予。

示例性生长因子包括但并不局限于集落刺激因子(例如粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及红细胞生成素)

在一个实施方案中，该受试者患有以下癌症之一：肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、尿路上皮癌、一种非骨髓恶性肿瘤、乳腺癌、卵巢癌以及一种成神经细胞瘤。

在一个实施方案中，该受试者患有肺癌(例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌)，并且该方法包括给予一种蒽环类药物(例如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星)、一种拓扑异构酶抑制剂(例如托泊特坎、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、层状素D、SN-38、喜树碱)和/或一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)联合一种生长因子(例如，一种集落刺激因子，例如GCSF、GM-CSF)，然后接着给予在此所述的一种多糖制剂。

在一个实施方案中，该受试者患有尿路上皮癌，并且该方法包括例如同时或连续给予一种蒽环类药物(例如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星)、一种拓扑异构酶抑制剂(例如托泊特坎、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、层状素D、SN-38、喜树碱)和/或一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)联合一种生长因子(例如，一种集落刺激因子，例如GCSF、GM-CSF)，联合在此所述的一种多糖制剂。

在一个实施方案中，该受试者患有一种非骨髓癌，并且该方法包括同时或连续给予一种蒽环类药物(例如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星)、一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)、一种长春花生物碱(例如，长春花碱、长春新碱、长春地辛以及长春瑞滨)和/或一种抗代谢药(例如氨甲蝶呤)联合一种生长因子(例如，一种集落刺激因子，例如GCSF、GM-CSF)，联合在此所述的一种多糖制剂。

在一个实施方案中，该受试者患有乳腺癌或卵巢癌，并且该方法包括例如同时或连续给予一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)、一种拓扑异构酶抑制剂(例如托泊特坎、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷、层状素D、SN-38、喜树碱)和/或一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)联合一种生长因子(例如，一种集落刺激因子，例如GCSF、GM-CSF)，联合在此所述的一种多糖制剂。乳腺癌可以是雌激素受体阳性乳腺癌，雌激素受体阴性乳腺癌，HER-2阳性乳腺癌，HER-2阴性乳腺癌，黄体酮受体阳性乳腺癌，黄体酮受体阴性乳腺癌，雌激素受体阴性、HER-2阴性以及黄体酮受体阴性乳腺癌(即三重阴性乳腺癌)。

在一个实施方案中，该受试者患有一种成神经细胞瘤，并且该方法包括给予一种蒽环类药物(例如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星)、一种铂基药剂(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)和/或一种烷基化剂(例如环磷酰胺、氮烯唑胺、美发仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)联合一种生长因子(例如，一种集落刺激因子，例如GCSF、GM-CSF)，然后接着给予在此所述的一种多糖制剂。

辐射和手术

在此所述的多糖制剂可以联合辐射治疗或手术进行给药，以便治疗患有癌症、例如原发性肿瘤，或具有或有危险具有一种原发性肿瘤转移的一位受试者。如在此所论述，将手术和/或辐射给予一位患有癌症的受试者是与骨髓源性祖细胞(例如EPC)的动员相关联的。

其他实施方案

本发明通过以下实例进一步进行说明，这些实例不应解释为是限制性的。在本申请全文中引用的所有参考文献、专利、以及已公开的专利申请的内容都通过引用结合在此。

实例

实例1：一种多糖制剂的制备

这个实例描述了在此所述的一种多糖制剂的产生。

概述：通过受控制的亚硝酸解聚，之后氧化性乙二醇裂解，并且接着还原成一种醇，来由未分级的肝素(UFH)产生乙二醇裂解的低分子量肝素醇(GS-LMWH-CH₂-OH)。在第一步骤中，UFH被解聚以便获得在多糖的还原端具有一个无水甘露糖部分的解聚的肝素(DPH-CHO)。这之后是步骤II：用高碘酸钠氧化性裂解在解聚的肝素中存在的2，3-二醇，以便沿着肝素链(GS-DPH-CHO)产生开环的乙二醇裂解的残基。步骤III涉及一个还原步骤，其中使用硼氢化钠将该醛部分转化成醇，以便产生乙二醇裂解的低分子量肝素醇。

方法概述

以下段落描述在此所述的一种多糖制剂的制备和特性。

1.解聚：

将未分级肝素(10g)溶于在室温下平衡的100mL去离子水中。随后，使此溶液的pH值下降至pH 3.1，之后添加亚硝酸钠(0.03M)。此反应溶液被允许搅拌3小时，之后在添加氯化钠(10g)前中和pH值。在盐完全溶解之后，添加甲醇(200mL)至此溶液，伴随持续搅拌。获得的沉淀物然后在6℃下老化2小时。然后过滤并干燥此沉淀物以获得DPH，该DPH的产率是80％-85％并且具有以下特点：

Mw：5300-6100

Mw分布：(i)＜3000道尔顿：23％-30％

(ii)3000-8000道尔顿：50％-55％

(iii)＞8000道尔顿：15％-22％

抗-Xa活性：80-120IU/mg

抗-IIa活性：40-70IU/mg

2.高碘酸盐氧化

将步骤I获得的醛(5g)溶于在5℃下平衡的50mL水中。向此溶液添加冷却的NaIO₄溶液(0.1M，50mL)，并且反应混合物被允许在无光条件下搅拌16小时。完成时，通过添加二乙二醇(10mL)淬灭反应，之后使温度回升至室温。然后，添加五克氯化钠至此溶液，之后添加150mL甲醇，以沉淀肝素。沉淀物在过滤并干燥前被允许在6℃下老化2小时，以得到具有以下特点的一种乙二醇裂解的多糖(产率95％-98％)：

Mw：5000-5800

Mw分布：(i)＜3000道尔顿：25％-30％

(ii)3000-8000道尔顿：55％-60％

(iii)＞8000道尔顿：15％-20％

3.还原

将以上在步骤II中获得的乙二醇裂解的多糖(4g)溶于维持在5℃下的40mL水中。向此溶液添加硼氢化钠(0.4g)，并且反应混合物随后被搅拌1小时。1小时后，反应混合物被带到室温，之后添加氯化钠(4g)。在盐溶解之后，添加甲醇(80mL)至此溶液，伴随持续搅拌。因此获得的沉淀物在过滤并干燥前被允许在6℃下老化2小时，以得到希望的产物。因此，获得具有以下特点的多糖制剂(产率55％至60％)：

Mw：5500-6200

Mw分布：(i)＜3000道尔顿：17％-23％

(ii)3000-8000道尔顿：56％-62％

(iii)＞8000道尔顿：17％-22％

抗-Xa活性：1-20IU/mg

抗-IIa活性：1-10IU/mg

实例2：一种多糖制剂的制备

解聚

将未分级肝素溶于在室温下平衡的10倍体积的去离子水中。此溶液的pH值被调整至pH 3.1，并添加亚硝酸钠(0.03M)。此反应溶液被允许搅拌若干小时，之后在添加氯化钠(与起始UFH材料的量相同)前中和pH值，。在盐完全溶解之后，添加至少2体积的甲醇至此溶液，伴随持续搅拌。所获得的沉淀物在约室温下被老化约1小时。此沉淀然后被过滤并干燥，以获得典型产率为80％-85％的DPH。

高碘酸盐氧化

将步骤I中获得的醛溶于在5℃下平衡的约10体积的水中。向此溶液添加等体积的冷却的NaIO₄溶液(0.1M)，并且反应混合物被允许搅拌16小时。完成时，通过添加一种醇淬灭反应，之后使温度回升至室温。然后添加氯化钠(起始醛材料的量的两倍)至此溶液，之后添加至少3体积的甲醇，以便沉淀肝素。沉淀物被允许在过滤并干燥前在室温下老化2小时，以得到一种乙二醇裂解的多糖(典型地，产率为约95％-98％)。

还原

将步骤II中获得的乙二醇裂解的多糖溶于维持在5℃下的10体积的水中。向此溶液添加硼氢化钠(GS多糖的起始量的十分之一)，并且反应混合物随后被搅拌1小时。然后，反应混合物被带至室温，之后添加氯化钠(与GS多糖的起始量相同的量)。在盐溶解之后，添加2体积的甲醇至此溶液，伴随持续搅拌。因此获得的沉淀物被允许在过滤并干燥前在室温下老化，以得到希望的产物。因此获得具有以下特点的一种MONC402 LMWH-钠制剂(产率约为55％-60％)：

Mw：5000-7800道尔顿

Mw分布：(i)＜3000道尔顿：15％-25％

(ii)3000-8000道尔顿：55％-65％

(iii)＞8000道尔顿：15％-25％

抗-Xa活性：1-20IU/mg

抗-IIa活性：1-20IU/mg

实例3：多糖制剂的抗转移特性

此实例展示多糖制剂在多个转移模型中具有抗癌和抗转移活性。

模型A：鼠黑色素瘤实验转移(B16F10iv)模型

如实例1中所述产生的一种多糖制剂(在此称作“MONC402”)在一个鼠黑色素瘤实验转移模型中展示抗转移活性。

雌性C57BL/6小鼠(9至10周龄)，就在静脉注射2x10⁵个B16F10细胞前用一个单一剂量(10mg/kg)的MONC402、达肝素/

(已被报导可以降低转移的一种LMWH)或MONC 202(阴性对照：N-脱硫酸化的多糖)处理一次。小鼠在第21天被处死，并且肿瘤负荷被计算为肺重-正常肺重。如图1中所示出，相对于一个收集(未处理)的对照，MONC402显著抑制了肺的B16F10的集群。

模型B：结肠癌转移至肝脏

MONC402在一个原位肝脏转移模型中展示了预防性抗转移活性。

通过腹膜内注射C170HM2人类结肠直肠肿瘤细胞至雄性MF1裸(nu/nu)无胸腺小鼠中，启始肝脏转移。5FU/甲酰四氢叶酸被用作一个阳性对照。

在37℃，5％CO₂，以及增湿条件下，体外维持C170HM2细胞在RPMI培养基(Sigma公司)中，该培养基含有10％(体积/体积)热灭活的胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺。用0.025％EDTA收集来自次融汇的单层的细胞、在培养基中洗涤，并且再次悬浮于无菌磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4(PBS)中，用于体内给予。1ml体积中的1.5×10⁶个细胞被腹膜内注射到65只小鼠中，并且这些小鼠被如下分配到多个处理组中。

组1：n＝10载体对照

组2：n＝1025mg/kg 5FU/甲酰四氢叶酸，静脉注射，在第1天、第3天、第5天、第7天循环

组3：n＝10 5mg/kg化合物1(达肝素)，s.c(皮下注射)，每日一次

组4：n＝10 5mg/kg化合物2(MONC402)，皮下注射，每日一次

组5：n＝10 15mg/kg化合物2，皮下注射，每日一次

组6：n＝10 30mg/kg化合物2，皮下注射，每日一次

组7：n＝5未处理

治疗在第一天细胞注射之后启始，并且继续到第35天或直至动物的临床病况要求终止。组5和6在第5天错过一剂。在荷瘤小鼠中未观察到测试化合物的不利影响。

该研究在第35天终止，并且肝脏中的肿瘤被切除并称重。还计数了肺结节的数目。平均肝脏肿瘤重量和横截面积被概述于表1中。

表1：C170HM2模型：平均肝脏肿瘤重量的总结和统计分析

NS＝不显著

15mg/kg与30mg/kg MONC402这二者均显著降低了肝脏肿瘤尺寸，分别达到90％(p＝0.007)和97％(p＝0.004)，并且还比5FU/甲酰四氢叶酸显著更有效(分别为p＝0.041和p＝0.011)。当与载体对照组相比时，达肝素(组3)降低了肿瘤重量，达到约81％(p＝0.017)。类似地，用达肝素(p＝0.027)和15与30mg/kg MONC402(分别为p＝0.016和p＝0.004)，肿瘤的横截面积也显示显著降低。

在研究持续期间，监测小鼠的体重。贯穿整个研究，对于所有组来说，各组小鼠的体重保持在一个可接受范围内。

模型C：乳腺癌转移至肺

MONC402在乳腺癌转移(4T1)的一个同系原位模型中也展示出抗转移活性。

用8x10⁴个4T1细胞在乳房脂肪垫内注射8周龄(WOA)的雌性BALB/c小鼠。用盐水或MONC402每日处理，伴随或不伴随在第5天开始的使用顺铂的每周处理。原发性肿瘤在第9天被去除并且称重。

如表2所示出，如通过肺重量和肿瘤结节计数所确定，与盐水对照组相比，顺铂联合MONC402(10、20、30mg/kg)展示肺转移的一个统计学显著的降低(p＜0.05，单因数ANOVA)。在终止实验之前的最后3天之内，联合治疗组(顺铂+MONC40210/20/30mg/kg)还具有更低的乳房肿瘤再生长的、胸腔肿瘤转移的、以及重量减轻(＞2g)的发生率。手术过后那一周，联合治疗组具有更高的暂时重量减轻(＞2g)发生率，但一周内恢复。

表2.4T1模型：宏观肿瘤转移计数

在一个第二4T1实验中，用8x10⁴个4T1细胞在乳房脂肪垫内注射8WOA的雌性BALB/c小鼠。连续渗透泵递送盐水或MONC 402，伴随在第4天开始每周用盐水或顺铂处理。原发性肿瘤在第9天被去除。各组间的原发性肿瘤重量无显著差异。然而，免疫组织学分析展示来自用顺铂与M-ONC 402联合处理的小鼠的肿瘤中的微血管密度显著降低。该实验在第32天终止，并且取得了不同样品。6只小鼠被发现死亡亦或由于恶化的整体病况而早早终止。

通过肺重量、肺肿瘤结节定量(包括结节数、大小)，以及计算的肿瘤体积连同组织学定量确定4T1肺转移。结果示于图2中。MONC 402(20毫克/千克/天)单一治疗组未显著抑制4T1肺转移。顺铂(1.25mg/kg)单一治疗展示显著的抗肿瘤功效(p＜0.05)。顺铂(1.25mg/kg)与MONC402(20mg/kg/天)联合显示了降低肺转移(p＜0.0005)和降低微血管密度的功效。重要地，当与顺铂单一治疗组相比较时，通过肺重量(p＜0.02)、肿瘤结节数、通过组织学的肺肿瘤覆盖、以及肺肿瘤微血管密度(p＜0.05，t检验)确定，联合治疗组还展示出更好的抗肿瘤功效，证明MONC402增强了顺铂的抗肿瘤功效。

模型D：人类前列腺癌瘤PC-3M模型：联合治疗

用5x10⁵个PC-3M-萤光素酶前列腺癌瘤细胞在前列腺内注射8WOA的雄性SCID/Beige小鼠。用盐水或MONC402每日处理，伴随有或不伴随在第3天开始的顺铂的每周处理。小鼠每周用Xenogen成像系统监测。实验在第32天终止。不同的器官被分离并且通过重量和Xenogen成像评价肿瘤转移。

MONC402(30mg/kg)单一治疗抑制腹膜中的PC-3M转移。与盐水和MONC402单一治疗组相比，如通过体内成像所确定，顺铂联合MONC402(30mg/kg)降低了肿瘤生长。在特定实验条件下，联合治疗(顺铂+MONC40230mg/kg)与顺铂单一治疗之间的原发性肿瘤重量和转移无显著差异。

实例4：更多联合研究和MONC402对来自骨髓的细胞的动员的作用

A.MONC402对内皮祖细胞的动员的作用

某些化疗剂诱导内皮祖细胞(EPC)的动员。这类药剂的治疗优点可以能由于诱导促进快速肿瘤再生长的EPC动员而受损(见例如Shaked(沙克德)等人，2008癌细胞(Cancer Cell)，14：263-273)。评价了MONC402与引起此现象的这些药剂联合给予的作用。

在一个实验中，用G-CSF(皮下注射连续3天)、多西他赛或顺铂(一个i.p.(腹膜内注射)剂量)处理正常小鼠，其中伴随有或不伴随同时的MONC402处理(一个皮下注射剂量)。24h后监测EPC动员。小鼠(8只小鼠/组)被皮下注射给予盐水或MONC402(40mg/kg)(或40mg/kg的DC101，与多西他赛一起用作对照)。约30min之后，小鼠被给予多西他赛(腹膜内注射，40mg/kg)、顺铂(腹膜内注射，6mg/kg)、或盐水对照。作为一个阳性对照，2组小鼠也被腹膜内注射给予G-CSF(200μg/kg)，持续3天，单独亦或在最后一天联合一个单一剂量的MONC402(皮下注射，40mg/kg)。24h后，小鼠安乐死，并且通过心脏穿刺取0.5-0.8mL血液。

约300μL全血被直接转移到14mL细胞溶解缓冲液中，用于EPC的流式细胞测量。处理剩下300-600μL，为了血清(SDF-1α)。对于流式细胞测量，洗涤并且阻断溶解的细胞，然后用CD13-FITC、CD117-PE、7-AAD、VEGFR2-APC以及CD45-PE/Cy7染色。在PBMNC门中，每个样品总计获得50,000个细胞。

与盐水对照相比，G-CSF和多西他赛诱导了EPC的一个显著增加，而顺铂处理并未展示此作用。如图3中可见，多西他赛诱导的EPC动员被DC101(抗VEGFR2Ab)和MONC402显著抑制。MONC402并未影响盐水或顺铂处理的小鼠中的EPC动员。MONC402对于用G-CSF进行的EPC动员的作用更小。这说明MONC402联合一种紫杉烷和联合GCSF的协同作用。

在一个第二实验中，测试了每日给予MONC402持续5天是否将对通过用一种紫杉烷处理引起的EPC动员产生一个更强的抑制作用。

小鼠(10只小鼠/组)被皮下注射给予盐水或MONC402(40mg/kg)或DC101(40mg/kg，与多西他赛一起作为阳性抑制对照)。约30分钟之后，小鼠被给予多西他赛(腹膜内注射，40mg/kg)或盐水对照。作为一个阳性对照，2组小鼠还被皮下注射给予G-CSF(200μg/kg)±每日MONC402，持续连续5天。24小时后，小鼠安乐死，并且通过心脏穿刺取500-800μL血液。将150μL转移到5mL的细胞溶解缓冲液中，用于EPC的流式细胞分析。处理剩下350-500μL，为了血清(SDF-1α)。对于流式细胞测量，洗涤并且阻断细胞，然后用CD13-FITC、CD117-PE、7-AAD、VEGFR2-APC以及CD45-PE/Cy7染色。在PBMNC门中，每个样品总计获得50,000个细胞。

如图4中所示，G-CSF和多西他赛诱导了EPC动员的一个显著增加，并且二者均可以由MONC402抑制。MONC402在抑制多西他赛诱导的EPC动员方面等效于DC101(抗VEGFR2Ab)。MONC402并未影响盐水处理的小鼠中的EPC动员，表明MONC402并不抑制正常EPC产生或释放，但可以干扰多西他赛所诱导的机制。这也再次展示了MONC402联合诱导EPC动员的药剂的协同作用。

进行一个第三实验，以评估MONC402对荷4T1瘤的小鼠中的响应于用多西他赛处理的EPC动员的作用。该研究还评估了EPC动员是否能够被经由渗透泵给予的MONC402抑制。

在第0天，以1x10⁵个细胞/小鼠将4T1肿瘤植入到第4个乳房脂肪垫中。具有盐水或MONC402的泵在第0天肿瘤细胞注射后被立即植入。小鼠被随机分到以下组：

1.盐水对照，n＝8

2.多西他赛，40mg/kg，第6天，n＝8

3.M402，泵，40mg/kg/天，第0天，n＝8

4.多西他赛40mg/kg，第6天+M402，泵，40mg/kg/天，第0天，n＝8

多西他赛或盐水在第6天上午被腹膜内注射给予。四h后，小鼠通过下颌下脉丛被放血，用于EPC分析和可以溶性因子分析。原发性肿瘤在第9天被去除，用于组织学分析。血液还被收集用于可以溶性因子分析(多西他赛给药后72小时)。使用一个19-丛Luminex试剂盒分析血清样品。此外，还通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测试了样品的SDF-1a水平。选择SDF-1a是因为它是一种肝素结合蛋白；出版物展示了当用多西他赛治疗时这种趋化因子的一个增加，并且SDF-1a涉及募集骨髓干细胞到新的部位中。MONC402和MONC402与多西他赛的组合对肿瘤重量具有一个小的不显著的影响。

如在先前研究中所观察到，多西他赛在40mg/kg的剂量下在截至4h时，诱导了血液中EPC的一个显著增加。经由渗透泵以40mg/kg/天递送的MONC402单一治疗并未诱导动员的EPC的显著变化；然而，观察到了朝向降低的EPC水平的一个趋势。如图5所示，MONC402通过连续渗透泵的共同给药显著抑制了多西他赛所致的血液EPC动员，并且将8只小鼠中的7只的水平降低至盐水对照的水平。这些结果证实了先前研究的观察结果，这次在荷瘤小鼠中进行并且通过经由渗透泵给予MONC402。总之，这些数据表明一个单一多西他赛剂量将EPC动员到了血液中，这可以用同时以40mg/kg/天的MONC402治疗来抑制。

B.MONC402对G-CSF诱导的MDSC动员的动员的作用

评价了MONC402对来自骨髓的其他细胞的动员的作用。

用皮下注射盐水或0.5mg/kg的G-CSF的4个每日剂量联合皮下注射MONC402(20mg/kg)处理BALB/c小鼠。动物在第5天被处死，通过心脏穿刺保存血液样品。用VetScan HM2进行血液学分析。通过大小和粒度确定粒细胞(GRA)，并且当通过流式细胞测量分析时，＞90％的是CD11b⁺GR-1⁺。如图6所示，MONC402抑制了G-CSF诱导的MDSC动员。

C.联合酪氨酸激酶抑制剂的作用

此实例测试了MONC402在两个不同时间点联合在癌症治疗中使用的一种酪氨酸激酶抑制剂：舒尼替尼

的作用。选择90mg/kg的舒尼替尼的一个剂量，因为它在此小鼠模型中可以有效地动员EPC，而不引起毒性。

短期舒尼替尼治疗后加速的肿瘤侵袭和转移被报道在文献中(Ebos(埃博斯)等人.2009.癌细胞(Cancer Cell)15：232-239)。令人惊讶的是，如以下所述，添加MONC402至舒尼替尼治疗显著抑制了EPC动员，并且降低了荷瘤小鼠中的攻击性再生长表型。不希望受理论约束，骨髓中的EPC分析表明MONC402可以防止骨髓祖细胞进入循环。

在一个实验中，36只Balb/c雌性小鼠被每日用载体或90mg/kg苏尼替尼(每组8只小鼠)处理。舒尼替尼作为处于载体中的悬浮液(0.5％羧甲基纤维素，0.4％吐温80，1.8％NaCl)被口服给予。MONC402(20mg/kg，用于一只20g小鼠)每日皮下注射给予2次。

在第7天，各组中的4只小鼠在最后一剂舒尼替尼和MONC402 2小时后被处死。收集全血，连同各小鼠的血清和来自一个股骨的骨髓，用于EPC分离。进行EPC的分离和FACS分析。分离血清并且储存在-80℃下，直到Luminex分析或SDF-1a或SCF ELISA。

在第8天，各组中的4只小鼠在最后一剂舒尼替尼和MONC402 24小时后被处死。收集全血，连同各小鼠的血清和来自一个股骨的骨髓，用于EPC分离。进行EPC的分离和FACS分析。分离血清并且储存在-80℃下，直到Luminex分析或SDF-1a或干细胞因子(SCF)ELISA。

截至2小时时，舒尼替尼诱导了血液中EPC的一个显著增加。此增加是暂时的，并且在此研究中截至24小时时消退。20mg/kg每日两次的MONC402单一治疗在2小时或24小时时并未诱导血液EPC显著变化。在2h时，添加MONC402至舒尼替尼治疗显著抑制了血液EPC动员，并且将4只小鼠中的2只的水平降低至盐水对照的水平。舒尼替尼和舒尼替尼联合MONC402这二者在2h时诱导了骨髓中EPC产生的一个显著增加，这在接受舒尼替尼和MONC402的小鼠中显著更高。截至24h时，接受舒尼替尼的组中的骨髓中EPC的百分比被标准化，并且接近接受舒尼替尼和MONC402的组中的盐水对照。用MONC402单独处理的小鼠在2h或24h时，未观察到骨髓中EPC的产生有增加。

总之，数据表明舒尼替尼治疗7天将EPC动员到了血液中，这可以用同时以每日两次20mg/kg的MONC402治疗来抑制。不希望受理论约束，MONC402可以经由将所诱导的EPC捕集在骨髓中起作用。

进行一个第二实验以证明MONC402对荷瘤小鼠中舒尼替尼

诱导的EPC动员的作用。

荧光素酶转染的MB-231-3P细胞在第0天被以7x10⁵个细胞/60μL/只小鼠的浓度植入到20笼8-9周龄的雌性Fox-Chase SCID小鼠中。原发性肿瘤体积被监测直到第21天。肿瘤在第25天被切除并且称重。小鼠被随机分到4组中：

载体对照

苏尼替尼(60mg/kg，每日一次，维持7天，po(口服))

MONC402(20mg/kg，每日两次，维持7天，皮下注射)

联合治疗(舒尼替尼和MONC402)

在此实验中不使用原发性肿瘤已附着至或渗透腹肌或腹肌在手术期间受损的动物。在第26天原发性肿瘤切除后一天开始治疗。每天早晨，舒尼替尼或载体经由口服强饲法给予所有动物。然后，经由皮下注射给予MONC402或盐水。下午稍后时候，动物被再次给予MONC402或盐水。舒尼替尼每日通过将一(1)个50mg的胶囊的内容物悬浮在8.3mL载体中被新鲜制备。在强饲各动物之前，通过涡旋使舒尼替尼再悬浮。湿食物每日被提供给所有动物。肿瘤在第25天被切除，并且治疗在第26天开始。

在最后一个舒尼替尼剂量后，小鼠经由下颌下脉丛被放血，并且一滴血液被收集到RBC细胞溶解缓冲液中。细胞用FACS缓冲液洗涤2次，并且在2℃-8℃下用抗-CD13-FITC、抗-CD117-PE、7-AAD、抗-VEGFR-2-APC和抗-CD45-PE/Cy7染色20min。细胞被再次洗涤并且固定在2％甲醛中。第二天在FACS Canto上分析样品。

舒尼替尼单一治疗在给药24小时后展示循环EPC的一个适度但显著增加。该增加并非如同在正常小鼠中更高(120mg/kg)舒尼替尼剂量所观察到的一般显著，并且主要由具有更高百分比的4只小鼠推动。与盐水对照相比较，MONC402治疗并未增加循环EPC的百分比。MONC402与舒尼替尼的组合导致类似于舒尼替尼单独组的循环EPC水平，它再次由具有更高百分比的4只小鼠推动。见图7。

在一个第三实验中，萤光素酶转染的MB-231-3P细胞在第0天被以1x10⁶个细胞/50μL/小鼠的浓度植入21笼10-11周龄的雌性Fox-Chase SCID小鼠中。评估了MONC402对索坦诱导的加速的肿瘤再生长和转移的作用。原发性肿瘤体积被监测直到第21天。肿瘤在植入后第24天被切除，此时肿瘤为316.9±11.1mm³。具有更低体重(≤17-18g)的小鼠被从研究中排除。动物随后被随机分到以下4个组中的1个内：(1)载体对照；(2)索坦(0mg/kg每日一次x7，口服)；(3)M402(20mg/kg每日两次x7，皮下注射)；(4)联合治疗(索坦每日一次+M402每日两次)。在第26天，原发性肿瘤切除后2天开始治疗，并且治疗被给予连续7天。此后，小鼠未接受进一步治疗，并且通过生物发光成像监测它们的肿瘤进展，并且监测存活。图8描绘随时间变化的全身生物发光(平均值±SEM(平均值标准误差)，n＝16)。当与盐水对照组相比较时，索坦处理的动物显示显著加速的肿瘤进展(原发性肿瘤再生长和转移)(P＜0.05，单因素ANOVA，带有纽曼-科伊尔斯(Newman-Keuls)多重比较检验)。当与盐水对照相比较时，M402处理的动物未展示出肿瘤进展有显著变化。最重要地，当M402连同索坦一起给药时，当与索坦单一治疗组相比较时，它显著延迟肿瘤进展(P＜0.05，单因素ANOVA，带有纽曼-科伊尔斯(Newman-Keuls)多重比较检验)。

已描述本发明的许多实施方案。尽管如此，应理解的是，可以做出不同的改变而不偏离本发明的精神和范围。因此，其他实施方案是在以下权利要求书的范围内。

Claims (36)

1.一种具有以下特点的多糖制剂：

(a)重均链分子量在3,500与7,000Da之间；

(b)抗-Xa活性和抗-IIa活性各自小于50IU/mg；以及

(c)大于5％并且小于50％的乙二醇裂解的糖醛酸残基。

2.如权利要求1所述的制剂，其中该制剂具有小于30％的乙二醇裂解的糖醛酸残基。

3.如权利要求1所述的制剂，其中该制剂具有10％与30％之间的乙二醇裂解的糖醛酸残基。

4.一种具有以下特点的多糖制剂：

(a)重均链分子量在3,500与7,000Da之间；

(b)抗-Xa活性和抗-IIa活性各自小于50IU/mg；

(c)一条多糖链，该多糖链具有乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G)；以及

(d)多条多糖链，这些多糖链各自具有不大于3个的乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G)。

5.如权利要求4所述的制剂，其中各多糖链具有不大于2个的乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G)。

6.一种具有以下特点的多糖制剂：

(a)重均链分子量在3,500与7,000Da之间；

(b)抗-Xa活性和抗-IIa活性各自小于50IU/mg；以及

(c)多条多糖链，所述多糖链具有每条多糖链平均0.2与3个之间的乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G)。

7.如权利要求6所述的制剂，具有每条多糖链平均不大于1个的乙二醇裂解的糖醛酸残基(U_G)。

8.一种组合物，包含具有以下特点的多糖制剂：

(a)重均链分子量在3,500与7,000Da之间；

(b)抗-Xa活性和抗-IIa活性各自小于50IU/mg；以及

(c)多条多糖链，这些多糖链具有大于40％的U_2SH_NS，6S二糖残基。

9.如权利要求8所述的组合物，具有大于70％的U_2SH_NS，6S二糖残基。

10.如权利要求8所述的组合物，具有小于40％的脱硫酸化程度。

11.如权利要求8所述的组合物，具有小于30％的脱硫酸化程度。

12.如权利要求8所述的组合物，具有小于10％的脱硫酸化程度。

13.一种组合物，包含缺少实质性抗凝剂活性的多糖制剂，其中该制剂主要由包括式I的多种多糖组成：

[U_w-H_x，y，z]_m～[U_G-H_x，y，z]_n

其中U表示糖醛酸残基，并且H表示己糖胺残基；

其中m和n是整数，使得

m＝4-16，并且

n＝1-4；

w＝-2OS或-2OH；

x＝-NS或-NAc；

y＝-3OS或-3OH；

z＝-6OS或-6OH；

并且

其中符号～表示m和n标记的单元是沿着该多糖链分布的并且并非必须按照顺序，其中w、x、y、以及z在每个m标记的单元上各自是相同或不同的，并且其中x、y、以及z在每个n标记的单元上各自是相同的或不同的。

14.一种组合物，包含具有的重均链分子量在3,500与7,000Da之间并且具有降低的抗凝剂活性的多糖制剂，其中该制剂包含多重多糖，这些多糖包括式I：

[U_w-H_x，y，z]_m～[U_G-H_x，y，z]_n

其中U表示糖醛酸残基，并且H表示己糖胺残基；

其中m和n是整数，使得

m＝4-16，并且

n＝1-4；

w＝-2OS或-2OH；

x＝-NS或-NAc；

y＝-3OS或-3OH；

z＝-6OS或-6OH；

并且

其中符号～表示m和n标记的单元是沿着该多糖链分布的并且并非必须按照顺序，其中w、x、y、以及z在每个m标记的单元上各自是相同或不同的，并且其中x、y、以及z在每个n标记的单元上各自是相同的或不同的。

15.一种多种多糖和它们的药学上可以接受的盐的制剂，该组合物缺少实质性抗凝剂活性，具有抗转移活性，并且主要由包括式II的多种多糖组成：

[U_w-H_x，y，z]_m-[U_G-H_x，y，z]_n-[U_w-H_x，y，z]_o-[U_G-H_x，y，z]_p-[U_w-H_x，y，z]_q

其中U表示糖醛酸残基，并且H表示己糖胺残基；

其中m至r是整数，以使：

m＝0-10；

n＝0-3；

o＝0-10；

P＝0-3；

q＝0-10；

w＝-2OS或-2OH；

x＝-NS或-NAc；

y＝-3OS或-3OH；

z＝-6OS或-6OH；

并且

其中w、x、y以及z在每个m、n、o、p、或q标记的单元上各自是相同的或不同的。

16.如权利要求15所述的制剂，其中n+p的和小于或等于3。

17.如权利要求15所述的制剂，其中该制剂具有的重均链分子量在3,500与7,000Da之间。

18.如以上权利要求的任一项所述的组合物或制剂，其中在该组合物中的多糖链的非还原端糖醛酸具有一个4，5-不饱和结构。

19.如权利要求18所述的组合物或制剂，其中在该组合物中约30％的非还原糖醛酸具有一个4，5-不饱和结构。

20.如权利要求18所述的组合物或制剂，其中该4，5-不饱和结构是肝素酶消化或苄基酯化，接着β消除的结果。

21.如权利要求1至17的任一项所述的组合物或制剂，其中该还原端进一步包括2，5-脱水甘露醇残基。

22.如权利要求21所述的组合物或制剂，其中约50％的还原端包括2，5-脱水甘露醇残基。

23.如权利要求1至22的任一项所述的组合物或制剂，其中该组合物是药物组合物。

24.如以上权利要求的任一项所述的组合物或制剂，其中该制剂的10％-50％的寡糖具有＜3000Da的分子量；40％-65％的寡糖具有在3000-8000Da之间的分子量，并且5％-30％的寡糖具有＞8000Da的分子量。

25.如以上权利要求的任一项所述的组合物或制剂，其中该多糖是由包括以下步骤的方法产生：

使UFH解聚，以产生解聚的肝素；并且

在解聚之后，对这一解聚的肝素进行乙二醇裂解反应。

26.如权利要求25所述的组合物或制剂，其中该乙二醇裂解步骤包括：

用高碘酸盐氧化这一解聚的肝素；并且

用硼氢化钠还原这一被氧化的解聚的肝素。

27.一种治疗受试者的以下疾病的方法：转移性疾病，VEGF、FGF-、SDF-Iα和/或选择素介导的疾病，炎性疾病，传染病，自身免疫疾病，纤维化，或涉及血管生成的疾病，包括将如权利要求1-42任一项所述的组合物或制剂给予该受试者。

28.如权利要求27所述的方法，其中该组合物或制剂被长期给予。

29.如权利要求27所述的方法，其中该疾病是癌症。

30.如权利要求29所述的方法，其中该癌症是胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、脑癌、肺癌、黑色素瘤、或前列腺癌。

31.如权利要求29所述的方法，其中该组合物或制剂是联合手术、放射性治疗、化疗剂、抗体或酪氨酸激酶抑制剂来给予的。

32.如权利要求29所述的方法，其中该组合物或制剂是以5-50mg/kg的剂量给予该受试者。

33.一种制造制剂的方法，该方法包括：

(1)用亚硝酸(HONO)使未分级的肝素(UFH)解聚，以得到多糖制剂；

(2)用高碘酸盐氧化该多糖制剂；

(3)用硼氢化钠还原这一被氧化的多糖制剂；以及

(4)分离该多糖制剂，从而制作LMWH组合物。

34.如权利要求33所述的方法，其中该解聚步骤包括用约0.02至0.04M亚硝酸，在约2至4的pH值下，在约10℃至30℃的温度下处理该UFH约1至5小时。

35.如权利要求33所述的方法，其中该氧化步骤包括用约0.05M至0.2M的高碘酸盐，在约0℃至10℃的温度下，处理该多糖制剂约10至20小时。

36.如权利要求33所述的方法，其中该还原步骤包括用约0.5％至2.0％(w/v)的硼氢化钠，在约6.0至7.0的pH下，并且在约0℃至10℃的温度下，处理这一氧化的多糖制剂约0.5至1.5小时。

Images