CN103063662B - 一种生牛乳体细胞检测试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生牛乳体细胞检测试纸及其制备方法。该制备方法包括以下步骤：第一次浸泡：将滤纸在表面活性剂溶液中浸泡1-10min，然后在缓冲液中浸泡1-10min；第一次烘干；第二次浸泡：将第一次烘干后的滤纸在第二次浸泡液中浸泡1-5min；第二次烘干，得到所述生牛乳体细胞检测试纸。本发明的生牛乳体细胞检测试纸在使用时操作简便，能够经济、准确地用于奶牛乳房炎的日常监测，以及生牛乳体细胞指标日常检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种生牛乳体细胞检测试纸及其制备方法，属于食品检测技术领域。
背景技术
牛乳中的体细胞数(Somatic Cell Count，SCC)是指每毫升牛乳中的细胞总数。体细胞中大多数是白细胞(即巨噬细胞、嗜中性白细胞和淋巴细胞)，约占体细胞数的95％以上，其余为脱落的上皮细胞。产自健康乳房牛乳SCC通常小于10万/mL，包括1-7％的上皮细胞和30-74％的巨噬细胞。
影响牛乳SCC的因素很多。一般来说，微生物是诱发乳房炎、引起SCC增加的主要原因，95％的乳房炎是由金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠埃希氏杆菌等引起的。其次，当乳房因外伤或发生疾病出现炎症时，也可引起SCC大量增加。因此，牛乳中SCC是奶牛乳房健康状况和牛乳质量及防治乳房炎的重要指标。
SCC的增多会引起牛乳产量的下降，鲜奶品质下降，炎乳废弃，严重时乳区化脓坏疽，使奶牛失去泌乳能力。每头患隐性乳房炎母牛平均日产奶量降低4％-10％。全世界约有2.2亿头奶牛，其中约有1/3的奶牛患有各种类型的乳房炎，每年因乳房炎造成的损失高达350亿美元。在我国奶牛饲养条件更为粗糙，乳房炎的发病率更高，确切经济损失无法统计。我国的收购标准一般认为SCC小于50万/mL的牛乳为合格乳；超过50万/mL母牛患乳房炎危险性很大。而在欧美国家收购标准是，高质量的牛乳SCC应少于20万/mL，超过这个范围牛乳的品质就会下降；合格乳SCC一般在20-50万/mL之间；乳房炎乳SCC达到60-120万/mL。新两兰和澳大利亚的标准是SCC少于40万/mL。
牛乳SCC的检测方法可分为直接检测和间接检测两种。直接检测法包括显微镜检测(标准显微镜法和荧光显微镜法)、荧光流式细胞计数法、电阻式粒度分析方法等。间接检测法包括加利福尼亚细胞数测定法(CMT)、威斯康辛乳腺炎试验(WMT)、4％NaOH凝乳法以及pH检验法等。
现有方法存在的问题是：仪器设备昂贵，运行成本高；检测精度差；检测耗时长；或操作繁琐，需要专业的技术人员进行操作。目前还没有一种既经济、快速准确，又操作简便的方法。因为检测技术及成本的限制，我国乳品行业与奶牛饲养业极少对牛乳的SCC进行检测，只有少数集约化管理的牧场应用丹麦FOSS公司产的体细胞检测仪进行月检，但是检测费用昂贵。
随着乳品业的不断发展，体细胞的检测工作将逐渐变成一项日常工作，而现有的检测原料乳体细胞数的方法存在耗时长、操作繁琐、且需要专业的技术人员进行操作、成本高、及不够准确的问题。因此，研发出一种新的生牛乳体细胞检测方法或仪器仍是本领域亟待解决的问题之一。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种生牛乳体细胞检测试纸及其制备方法。该试纸在使用时操作简便，能够经济、准确地用于奶牛乳房炎的日常监测，以及生牛乳体细胞指标日常检测。
为达上述目的，本发明提供一种生牛乳体细胞检测试纸的制备方法，其包括以下步骤：
第一次浸泡：将滤纸在表面活性剂溶液中浸泡1-10min，然后在缓冲液中浸泡1-10min；
第一次烘干；
第二次浸泡：将第一次烘干后的滤纸在第二次浸泡液中浸泡1-5min；
第二次烘干，得到所述生牛乳体细胞检测试纸。
在上述制备方法中，第一次浸泡所采用的表面活性剂溶液和缓冲液的用量，以及第二次浸泡所采用的第二次浸泡液的用量为使滤纸全部浸泡在其中即可。
在上述制备方法中，优选地，所述表面活性剂溶液包括Tween-20溶液、Tween-80溶液、Triton X-100溶液和EDTA溶液中的一种或几种的组合。上述的表面活性剂溶液均为本领域常规使用的表面活性剂溶液，其溶剂可以均为PBS，其浓度可以为常规使用的浓度。将滤纸浸泡于表面活性剂溶液中，表面活性剂起到增溶、增敏的作用，能够使第二次浸泡液的有效成分在滤纸中均匀分布。更优选地，所述表面活性剂溶液为EDTA溶液；最优选地，所述EDTA溶液的浓度为0.05-0.2重量％。
在上述制备方法中，优选地，所述缓冲液包括Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液和巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或几种的组合。由于第二次浸泡液与生牛乳反应的pH条件为pH＝7.0-8.5，将滤纸浸泡于缓冲液中，起到调节滤纸pH的作用。更优选地，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液；最优选地，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.05-0.2mol/L。
在上述制备方法中，优选地，所述第二次浸泡液是通过以下步骤制备的：
将1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶于水并搅拌为糊状，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液，然后冷却至2-7℃，向所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液中加入CuSO4饱和溶液，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液；
将亚硝酸钠溶于水中，形成亚硝酸钠溶液；
以亚硝酸钠溶液∶1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液＝1∶4-1∶11的质量比，在3-5℃搅拌条件下，将所述亚硝酸钠溶液滴加到所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液中，5-10min后滴加完毕，之后在3-5℃搅拌20-60min，形成第二次浸泡液的粗产物，经过滤后，得到所述第二次浸泡液。
在上述制备方法中，优选地，将所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液与过量浓盐酸混合，然后以亚硝酸钠溶液∶1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液＝1∶4-1∶11的质量比，在3-5℃搅拌条件下，将亚硝酸钠溶液滴加到1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液与浓盐酸中，5-10min后滴加完毕，之后在3-5℃搅拌20-60min，形成第二次浸泡液的粗产物，进行过滤(可以采用滤纸)，滤掉沉淀后，用稀盐酸对滤液进行洗涤，得到所述第二次浸泡液。其中，浓盐酸的作用是使反应在无机酸存在的条件下进行，并且起到溶解反应生成的亚硝酸的作用，使亚硝酸为新生态的亚硝酸，而非游离态的亚硝酸(不稳定)。此外，在形成第二次浸泡液的粗产物后继续在浓盐酸中进行搅拌反应，并且过滤后用稀盐酸进行洗涤，能够使反应更加充分。本领域技术人员能够根据实际情况，对上述浓盐酸及稀盐酸的使用量进行调控。优选地，浓盐酸∶1-氨基-2-萘酚-4-磺酸的摩尔比＝2.5-4∶1；稀盐酸∶过滤后的第二次浸泡液的粗产物滤液的体积比＝1∶4-1∶20。
在上述制备方法中，优选地，以重量比计，所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸∶水＝1-3∶6-18。
在上述制备方法中，优选地，以所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液的总重量计，所述CuSO4饱和溶液的添加量为1％-3％。
在上述制备方法中，优选地，以重量比计，所述亚硝酸钠∶水＝3-10∶6-18。
在上述制备方法中，优选地，所述制备方法还包括以下步骤：将滤纸在硫酸铜干燥皿中放置20-40min进行预处理。在滤纸进行第一次浸泡前，将其进行干燥预处理，去除滤纸中的水分，能够保证第一次及第二次浸泡后的试纸中浸泡液的浓度一致。
在上述制备方法中，优选地，所述第一次烘干在50-90℃下进行；所述第二次烘干在50-70℃下进行。
在本发明的制备方法中，可以根据具体的情况和需求，将制备得到的试纸剪切为任意尺寸；优选地，将其剪裁为尺寸20×100mm的试纸条，以便检测。
本发明还提供一种生牛乳体细胞检测试纸，其是由上述的生牛乳体细胞检测试纸的制备方法所制备得到的。本发明的试纸的使用方法为：将适量生牛乳样品滴加于试纸上，静置5分钟观察试纸颜色变化，然后通过与比色卡进行对比，进行生牛乳体细胞指标的评价。
在上述的检测方法中，所述比色卡为本发明自制的比色卡，其制备方法如下所述：
选取分娩30天内的奶牛的体细胞数较高的生牛乳，以生牛乳∶UHT乳＝1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶14、1∶19的质量比，将该生牛乳用UHT乳进行稀释后，混合均匀，制备得到样品。分别取0.5-1mL样品滴在本发明的试纸上，分别于静置1min、5min、10min之后记录颜色变化。同时，采用显微镜直接计数法(NY/T800-2004)分别检测样品的体细胞数。本发明的试纸检测结果与显微镜直接计数法的检测结果如表1所示。
表1
由表1的检测结果可以看出：本发明的试纸的检测限为≥18万/mL。采用观察时间为5min，当检测结果为淡黄或橙色时，则样品体细胞数≤40万/mL；当检测结果为褐色时，则样品体细胞数为40-120万/mL；当检测结果为(深褐色)紫红时，则样品体细胞数≥120万/mL。以该实验结果为依据制作比色卡，并将3个颜色变化范围(观察时间为5min)分别设定为定为“-”阴性(淡黄或橙色)、“+”弱阳性(褐色)、“++”阳性((深褐色)紫红)，即可实现对生牛乳体细胞指标进行半定量分析。
本发明的生牛乳体细胞检测试纸具有以下优点：其一、检测速度快，最快2-3分钟即可对生牛乳的体细胞指标进行判断，与医疗的常规试纸检验方法不同，本发明的试纸颜色变化明显，无需应用颜色采集仪器，只需通过与比色卡进行对比，就可以对生牛乳体细胞指标进行评价；其二、检测费用低，检测成本不超过0.2元/次，可实现对奶牛乳房炎的日常监测；其三、操作简便，无需专业人员操作。因此，本发明的生牛乳体细胞检测试纸能够经济、准确地用于奶牛乳房炎的日常监测，以及生牛乳体细胞指标日常检测。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供一种生牛乳体细胞检测试纸，其是通过以下方法制备的：
1、预处理：将滤纸在硫酸铜干燥皿中放置20-40min；我在实际实验中的滤纸大小是10cm2
2、第一次浸泡：将预处理后的滤纸浸泡于浓度为0.09-0.12wt％的EDTA溶液2分钟，然后将滤纸浸泡于0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液中2分钟，使第一次浸泡后的滤纸的pH值为7.0-8.0；
3、第一次烘干：将第一次浸泡后的滤纸放入热风干燥箱中、在50-90℃下烘干；
4、第二次浸泡：将第一次烘干后的滤纸在第二次浸泡液中浸泡1-5min；
其中，所述第二次浸泡液是通过以下方法制备的：
将1重量份的1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶于6重量份的水中，并搅拌为糊状，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液，然后冷却至5℃，向所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液中加入CuSO4饱和溶液(以所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液的总重量计，所述CuSO4饱和溶液的添加量为1％-3％)，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液；
将3重量份的亚硝酸钠溶于6重量份的水中，形成亚硝酸钠溶液；
将所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液与浓盐酸以浓盐酸∶1-氨基-2-萘酚-4-磺酸＝2.5∶1的摩尔比混合，然后以亚硝酸钠溶液∶1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液＝1∶4的质量比，在3-5℃搅拌条件下，将亚硝酸钠溶液滴加到1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液与浓盐酸中，5-10min后滴加完毕，之后在3-5℃搅拌20-60min，形成第二次浸泡液的粗产物，采用滤纸进行过滤，滤掉沉淀后，用所述滤液的体积1/10的稀盐酸对滤液进行洗涤，得到所述第二次浸泡液；
5、第二次烘干：将第二次浸泡后的滤纸放入热风干燥箱中、在50-70℃下烘干，得到所述的生牛乳体细胞检测试纸；
6、成品：将制备得到的试纸剪裁为尺寸20×100mm的试纸条。
实施例2
本实施例提供一种生牛乳体细胞检测试纸，其是通过以下方法制备的：
1、预处理：将滤纸在硫酸铜干燥皿中放置20-40min；
2、第一次浸泡：将预处理后的滤纸浸泡于浓度为0.05-0.15wt％的EDTA溶液2分钟，然后将滤纸浸泡于0.5mol/L Tris-盐酸缓冲液中2分钟，使第一次浸泡后的滤纸的pH值为7.0-8.0；
3、第一次烘干：将第一次浸泡后的滤纸放入热风干燥箱中、在50-90℃下烘干；
4、第二次浸泡：将第一次烘干后的滤纸在第二次浸泡液中浸泡1-5min；
其中，所述第二次浸泡液是通过以下方法制备的：
将3重量份的1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶于18重量份的水中，并搅拌为糊状，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液，然后冷却至5℃，向所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液中加入CuSO4饱和溶液(以所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液的总重量计，所述CuSO4饱和溶液的添加量为1％-3％)，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液；
将10重量份的亚硝酸钠溶于6-18重量份的水中，形成亚硝酸钠溶液；
将所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液与浓盐酸以浓盐酸∶1-氨基-2-萘酚-4-磺酸＝2.5∶1的摩尔比混合，然后以亚硝酸钠溶液∶1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液＝1∶8的质量比，在3-5℃搅拌条件下，将亚硝酸钠溶液滴加到1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液与浓盐酸中，5-10min后滴加完毕，之后在3-5℃搅拌20-60min，形成第二次浸泡液的粗产物，采用滤纸进行过滤，滤掉沉淀后，用所述滤液的体积1/10的稀盐酸对滤液进行洗涤，得到所述第二次浸泡液；
5、第二次烘干：将第二次浸泡后的滤纸放入热风干燥箱中、在50-70℃下烘干，得到所述的生牛乳体细胞检测试纸；
6、成品：将制备得到的试纸剪裁为尺寸20×100mm的试纸条。
检测对比试验：
分别采用实施例1的试纸、显微镜直接计数法以及CMT检测法对29个不同的生牛乳样品进行生牛乳体细胞指标的评价。
显微镜直接计数法
显微镜直接计数法(NY/T800-2004)是一种色素还原试验，体细胞的细胞核可被亚甲基蓝清晰染色。该方法主要包括以下步骤：将装在试管中的待测样品混动摇匀，如果样品脂肪高则需要预热至40℃后再进行检测；用微量移液器或微量注射器吸取一定体积待测的样品(标准为0.01mL)，涂抹在载玻片一定面积上形成均匀样膜，水平放置于40-45℃恒温箱中5min，放入染色液中染色10min，取出后晾干，之后用蒸馏水洗去剩余的染色液；在油浸高倍显微镜下对染成蓝色的体细胞计数。
在上述检测方法中，对于牛乳而言，IDF推荐的染色液为亚甲蓝染色剂(Methyleneblue，MB)，FDA推荐的亚甲蓝染色剂的制备方法为Newman-lampert stain的修正方法。该亚甲蓝染色剂的配置方法可以包括以下步骤：在通风橱中将50mL的95％乙醇和40mL二甲苯混匀后，加入0.5g亚甲基蓝，然后在冰箱中于4.4-7.2℃放置12-24h，过滤后加入4mL冰醋酸混匀，装入棕色试剂瓶，常温贮存。采用Newman-lampert stain的修正方法进行亚甲蓝染色剂的配置时用四氯乙烷代替二甲苯。
在上述检测方法中，所采用的载玻片的面积标准为100mm2，可采用直径为11.28mm的圆形载玻片或5mm×20mm的长方形载玻片。
对于圆形载玻片而言，选择几个视野计数，然后取平均值，计算体细胞数，计算公式为：
X＝N×4×104/πd2
对于长方形载玻片而言，逐行计数，然后取平均值，计算体细胞数，计算公式为：
X＝N×2×103/d
式中：X为样品中体细胞数(mL-1)；N为显微镜计数的体细胞数(个)；d为显微镜视野直径(mm)。
在计数时，只计直径大于8um的细胞，直径小于4um的细胞不计；如有碎片，应计显示一半以上形体的细胞；成簇的体细胞计为1个，如可区分细胞核则分开计数；当视野上下方均有只见一半的体细胞，只计上方或下方，确保边缘无漏掉的细胞；如对于某个细胞存在疑虑则忽略不计。
显微镜直接计数法是牛乳中体细胞数检测的基准方法，所需仪器设备少，但所用的试剂(四氯乙烷)具有强毒性，而且耗时较长，长时间的操作会引起操作者眼睛疲劳，现在乳品生产企业普遍不采用该方法。
CMT法
CMT法的操作步骤如下所述：将3.0g十二烷基磺酸钠溶于100mL蒸馏水中，用2M的氢氧化钠调节pH值至6.4，然后加入溴甲酚紫0.1g，即制备得到CMT检测液；取诊断盘1个，滴加待检测样品2mL，CMT检测液2mL，作同心圆状摆动，观察混合物反应状态，进行实验结果判断。实验结果的判定标准如表2所示。
表2
对比实验及结果
分别采用实施例1的试纸、显微镜直接计数法以及CMT法对29个不同的生牛乳样品进行生牛乳体细胞的检测。采用实施例1的试纸进行检测的检测方法为：将适量生牛乳样品滴加于试纸上，静置5分钟观察试纸颜色变化，然后通过与上述标准建立中制备得到的比色卡进行对比，得出实验结果。上述三种方法的实验结果如表3所示。
表3
| 样品号 | 实施例1的试纸 | CMT法 | 显微镜直接计数法(SCC万/mL) |
| 1 | 淡黄(-) | - | 5.9±1.1 |
| 2 | 淡黄(-) | ± | 11.5±1.6 |
| 3 | 淡黄(-) | + | 3.7±1.3 |
| 4 | 淡黄(-) | - | 10.4±1.0 |
| 5 | 淡黄(-) | - | 16.3±2.0 |
| 6 | 淡黄(-) | - | 26.4±4.3 |
| 7 | 淡黄(-) | - | 14.7±3.8 |
| 8 | 橙色(-) | ± | 26.4±4.6 |
| 9 | 橙色(-) | ± | 24.2±3.1 |
| 10 | 橙色(-) | + | 32.0±2.0 |
| 11 | 橙色(-) | + | 24.8±2.4 |
| 12 | 橙色(-) | - | 22.5±1.0 |
| 13 | 橙色(-) | + | 30.8±2.1 |
| 14 | 橙色(-) | + | 25.8±1.6 |
| 15 | 橙色(-) | + | 38.2±2.9 |
| 16 | 橙色(-) | - | 35.5±3.4 |
| 17 | 褐色(+) | + | 72.2±7.2 |
| 18 | 褐色(+) | + | 75.2±4.8 |
| 19 | 褐色(+) | + | 78.4±4.3 |
| 20 | 褐色(+) | + | 79.8±9.8 |
| 21 | 褐色(+) | ++ | 78.6±7.6 |
| 22 | 褐色(++) | ± | 98.1±10.4 |
| 23 | 褐色(++) | ± | 98.4±6.9 |
| 24 | 橙色(-) | + | 52.1±3.2 |
| 25 | (深褐色)紫红(+++) | ++ | 146.8±6.8 |
| 26 | (深褐色)紫红(++) | ++ | 112.4±10.2 |
| 27 | (深褐色)紫红(++) | ++ | 156.4±10.2 |
| 28 | (深褐色)紫红(+++) | +++ | 450.7±16.4 |
| 29 | (深褐色)紫红(+++) | +++ | 1023.7±22.4 |
由表3可知，本发明的生牛乳体细胞检测试纸的检测结果与显微镜直接计数法以及CMT法的检测结果呈现良好的对应关系，证明本发明的试纸具有良好的准确性。而且本发明的试纸检测法较CMT法而言，其检测结果更为客观、准确；较显微镜直接计数法而言，其操作更为简便、快捷。
Claims (5)
1.一种生牛乳体细胞检测试纸的制备方法，其包括以下步骤：
第一次浸泡：将滤纸在表面活性剂溶液中浸泡1-10min，然后在缓冲液中浸泡1-10min；
第一次烘干；
第二次浸泡：将第一次烘干后的滤纸在第二次浸泡液中浸泡1-5min；
第二次烘干，得到所述生牛乳体细胞检测试纸；
其中，所述表面活性剂溶液包括Tween-20溶液、Tween-80溶液、Triton X-100溶液和EDTA溶液中的一种或几种的组合；
所述缓冲液包括Tris-盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液和巴比妥钠-盐酸缓冲液中的一种或几种的组合；
所述第二次浸泡液是通过以下步骤制备的：
将1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶于水并搅拌为糊状，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液，然后冷却至2-7℃，向所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液中加入CuSO4饱和溶液，形成1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液；
将亚硝酸钠溶于水中，形成亚硝酸钠溶液；
以亚硝酸钠溶液：1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液＝1:4-1:11的质量比，在3-5℃搅拌条件下，将所述亚硝酸钠溶液滴加到所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸混合溶液中，5-10min后滴加完毕，之后在3-5℃搅拌20-60min，形成第二次浸泡液的粗产物，经过滤后，得到所述第二次浸泡液；
以重量比计，所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸：水＝1-3：6-18；
以所述1-氨基-2-萘酚-4-磺酸糊状液的总重量计，所述CuSO4饱和溶液的添加量为1％-3％；
以重量比计，所述亚硝酸钠：水＝3-10：6-18；
所述第一次烘干在50-90℃下进行；所述第二次烘干在50-70℃下进行。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述表面活性剂溶液为EDTA溶液，所述EDTA溶液的浓度为0.05-0.2重量％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液，所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.05-0.2mol/L。
4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其中，所述制备方法还包括以下步骤：将滤纸在硫酸铜干燥皿中放置20-40min进行预处理。
5.一种生牛乳体细胞检测试纸，其是由权利要求1-4任一项所述的生牛乳体细胞检测试纸的制备方法所制备得到的。
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2012
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