CN102279178B - 一种生乳中体细胞含量的分析测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生乳中体细胞含量的分析测试方法，该方法包括配制反应试剂、反应、标准的建立及待检生乳检测等步骤。除了可以使用溶液试剂进行检测外，本发明还提供用反应试剂制成反应试纸进行检测的方法。本发明的优点在于，检测速度快，最快1分钟即可定量测定生乳的体细胞数，适合在线检测，并且检测费用低，检测结果准确，环境要求低，检测操作简便。
Description
技术领域
本发明涉及生化检测领域，具体涉及一种生乳中体细胞含量的分析测试方法。
背景技术
生乳中的体细胞数是指每毫升生乳中的细胞总数。体细胞数是衡量生乳品质与供应生乳动物乳腺健康的重要指标，需要简便、成本低、准确度高的检测方法。目前国内外乳品行业应用的生乳体细胞数或乳房炎的检测方法很多，通用的方法包括显微镜检测（标准显微镜法和荧光显微镜法）、电子计数仪检测法、加利福尼亚细胞数测定法（CMT）、威斯康辛乳腺炎试验（WMT）；其中标准显微镜法是我国体细胞数检测的基准方法，该法所需仪器设备少，但检测耗时较长、操作繁琐，且需要专业的技术人员操作。电子计数仪检测法设备价格昂贵、运行成本高；加利福尼亚细胞数测定法只能定性，结果不够准确，易出现假阴性结果。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有的生乳体细胞含量的分析测试方法中存在的或耗时长、操作繁琐且需要专业的技术人员进行操作、或成本高、或不够准确的问题，提供一种新的检测生乳体细胞数的方法。
实现上述目的的本发明的技术方案为，一种生乳中体细胞含量的分析测试方法，该方法包括以下步骤：
（1）配制反应试剂：分别配制pH值为7.5～10浓度为0.01～1M的缓冲液、浓度为1～100mM 的酯溶液、浓度为1～100mM的重氮盐溶液，其中缓冲液混合有浓度为0.01-30mM 的反应助剂；
（2）反应：将生乳样品加入反应杯，然后将步骤（1）中配制好的反应试剂依次加入反应杯，即缓冲液、酯溶液、重氮盐溶液，生乳样品所占体积百分比为20～80%，缓冲液、酯溶液、重氮盐溶液的加入体积可依配制溶液的浓度而定，反应体系中最终浓度缓冲液为0.005-0.8M，酯溶液为0.5-8mM，重氮盐溶液为0.5-8mM，反应助剂为0.005-24mM，并使之在37℃条件下反应1～30分钟；
（3）标准的建立：目测或使用仪器采集步骤（2）反应过程中的颜色变化信息，采用标准显微镜法，制作标准比色卡，或建立反应过程中的颜色变化信息与体细胞数之间固定的函数关系，作为检测标准；
（4）检测：按照步骤（2）中生乳样品与反应试剂体积，并在步骤（2）的温度与时间条件下，使待测生乳与反应试剂进行反应,目测或使用仪器采集反应过程中的颜色变化信息，将采集的颜色变化信息与步骤（3）获得的检测标准进行比较，获得所测生乳中的体细胞数。
将滤纸分别在步骤（1）配制的反应试剂中浸泡10～30分钟，完全浸透后在锡纸上加热干燥，制成反应试纸，干燥保存。
所述反应试纸的使用方法是，将生乳样品滴加到试纸上，或将试纸浸入样品中1-3秒，然后将试纸平放，目测或使用仪器采集反应过程中的试纸颜色变化信息，采用标准显微镜法，制作标准比色卡，或建立反应过程中的颜色变化信息与体细胞数之间固定的函数关系，作为检测标准；将待测生乳与试纸进行反应,目测或使用仪器采集反应过程中的颜色变化信息，将采集的颜色变化信息与检测标准进行比较，获得所测生乳中的体细胞数。
使用溶液反应试剂时，所述反应助剂包括EDTA、Triton。
使用试纸时，所述的反应助剂包括EDTA、Triton、聚乙烯吡咯烷酮。
所述酯溶液为吡咯酯类、吲哚酯类或聚乙酸萘酚酯中的一种。
所述重氮盐为1,2-重氮氧基萘-4-磺酸或2,4-二氯苯胺重氮盐。
所述缓冲液为硼酸盐缓冲液、硼酸-氢氧化钠缓冲液、tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液等任何可调节pH在碱性范围的缓冲液。
采集样品颜色信息的仪器为颜色传感器、扫描仪、色差仪或反射式光学密度计等任何可采集样品颜色信息的仪器。
计算生乳颜色变化速度的方法是两点法、终点法或速率法。
本发明具有以下优点：
1、检测速度快，最快1分钟即可定量测定生乳的体细胞数，适合在线检测；
2、检测费用低，检测结果准确，性价比高；
3、环境要求低，检测操作简便，建立好标准后，之后的检测仅使用配制好的试管液或试纸与生乳反应即可，操作人员无需专门培训，易普及。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式生乳中体细胞含量的分析测试方法按照以下步骤进行：
（1）配制反应试剂：分别配制pH值为7.5～10浓度为0.01～1M的缓冲液、浓度为1～100mM 的酯溶液、浓度为1～100mM的重氮盐溶液，其中缓冲液混合有浓度为0.01-30mM 的反应助剂；
（2）反应：将生乳样品加入反应杯，然后将步骤（1）中配制好的反应试剂依次加入反应杯，即缓冲液、酯溶液、重氮盐溶液，生乳样品所占体积百分比为20～80%，缓冲液、酯溶液、重氮盐溶液的加入体积可依配制溶液的浓度而定，反应体系中最终浓度缓冲液为0.005-0.8M，酯溶液为0.5-8mM，重氮盐溶液为0.5-8mM，反应助剂为0.005-24mM，并使之在37℃条件下反应1～30分钟；
（3）标准的建立：目测或使用仪器采集步骤（2）反应过程中的颜色变化信息，采用标准显微镜法或与之等效的方法，制作标准比色卡，或建立反应过程中的颜色变化信息与体细胞数之间固定的函数关系，作为检测标准；
（4）检测：按照步骤（2）中生乳样品与反应试剂体积，并在步骤（2）的温度与时间条件下，使待测生乳与反应试剂进行反应,目测或使用仪器采集反应过程中的颜色变化信息，将采集的颜色变化信息与步骤（3）获得的检测标准进行比较，获得所测生乳中的体细胞数。
本实施方式中步骤（3）建立标准的操作只需要一次，标准建立后，以后的每次检测仅需与标准进行比较即可。
优选实施方式为，所述反应助剂包括EDTA、Triton。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式二：可以将滤纸分别在具体实施方式一步骤（1）配制的反应试剂中浸泡10～30分钟，完全浸透后在锡纸上加热干燥，制成反应试纸，干燥保存。
所述反应试纸的使用方法是，将生乳样品滴加到试纸上，或将试纸浸入样品中1-3秒，然后将试纸平放，目测或使用仪器采集反应过程中的试纸颜色变化信息，采用标准显微镜法或与之等效的方法，目测制作标准比色卡，或机测建立反应过程中的颜色变化信息与体细胞数之间固定的函数关系，作为检测标准；将待测生乳与试纸进行反应,目测或使用仪器采集反应过程中的颜色变化信息，将采集的颜色变化信息与检测标准进行比较，获得所测生乳中的体细胞数。
本实施方式中建立标准的操作只需要一次，标准建立后，以后的每次检测仅需与标准进行比较即可。
优选实施方式为：制作试纸时，反应助剂包括EDTA、Triton、聚乙烯吡咯烷酮。其它步骤及参数与具体实施方式二相同。
优选实施方式为，反应试剂中反应助剂的浓度为0.05～10mM。其它步骤及参数与具体实施方式一或具体实施方式二相同。
优选实施方式：所述酯溶液为吡咯酯、吲哚酚酯或聚乙酸萘酚酯中的一种。其它步骤及参数与具体实施方式一或具体实施方式二相同。
优选实施方式：反应试剂中酯溶液的浓度为10～80mM，其它步骤及参数与具体实施方式一或具体实施方式二相同。
优选实施方式：所述重氮盐为1,2-重氮氧基萘-4-磺酸或2,4-二氯苯胺重氮盐。其它步骤及参数与具体实施方式一或具体实施方式二相同相同。
优选实施方式：反应试剂中重氮盐的浓度为10～80mM ，其它步骤及参数与具体实施方式一或具体实施方式二相同。
优选实施方式：所述缓冲液为：硼酸盐缓冲液、硼酸-氢氧化钠缓冲液、tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液中的一种。其它步骤及参数与具体实施方式一或具体实施方式二相同。
优选实施方式：反应试剂中缓冲液的浓度为0.05～1 M，其它步骤及参数与具体实施方式一或具体实施方式二相同。
优选实施方式：所述采集样品颜色信息的仪器为颜色传感器、扫描仪、色差仪或反射式光学密度计。其它步骤及参数与具体实施方式一或具体实施方式二相同。
优选实施方式：所述计算生乳颜色变化速度的方法可以是两点法、终点法或速率法。其它步骤及参数与具体实施方式一或具体实施方式二相同。
具体实施方式三、本实施方式按照以下步骤进行：
（1）配制反应试剂：分别配制pH值为8.0浓度为0.2M的Tris-HCl缓冲液、浓度为15mM 的吡咯酯溶液、浓度为15mM的1,2-重氮氧基萘-4-磺酸溶液，其中缓冲液混合有浓度为10mM 的反应助剂EDTA；
（2）反应：将生乳样品1.4mL加入反应杯，然后将步骤（1）中配制好的反应试剂依次加入反应杯，即Tris-HCl缓冲液0.4mL、吡咯酯溶液0.1mL、1,2-重氮氧基萘-4-磺酸溶液0.1mL，并使之在37℃条件下反应3分钟；
采集加入反应试剂后的样品颜色信息（RGB），两点法计算3分钟时R值差，代入计算方程进行计算，获得下表数据。计算方程为：y=0.1296x-113.6，y为生乳中的体细胞，x为R值差。
表1 本实施方式方法检测值与标准显微镜计数检测结果对比
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）配制反应试剂：分别配制pH值为7.5～10、浓度为0.01～1M的缓冲液、浓度为1-100mM 的酯溶液、浓度为1-100mM的重氮盐溶液，其中缓冲液混合有浓度为0.01-30mM 的反应助剂；
（2）反应：将生乳样品加入反应杯，然后将步骤（1）中配制好的反应试剂依次加入反应杯，即缓冲液、酯溶液、重氮盐溶液，生乳样品所占体积百分比为20～80%，缓冲液、酯溶液、重氮盐溶液的加入体积可依配制溶液的浓度而定，反应体系中最终浓度缓冲液为0.005-0.8M，酯溶液为0.5-8mM，重氮盐溶液为0.5-8mM，反应助剂为0.005-24mM，并使之在37℃条件下反应1～30分钟；
（3）标准的建立：目测或使用仪器采集步骤（2）反应过程中的颜色变化信息，采用标准显微镜法，制作标准比色卡，或建立反应过程中的颜色变化信息与体细胞数之间固定的函数关系，作为检测标准；
（4）检测：按照步骤（2）中生乳样品与反应试剂的体积，并在步骤（2）的温度与时间条件下，使待测生乳与反应试剂进行反应,目测或使用仪器采集反应过程中的颜色变化信息，将采集的颜色变化信息与步骤（3）获得的检测标准进行比较，获得所测生乳中的体细胞数。
2.根据权利要求1所述的生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，将滤纸分别在步骤（1）配制的反应试剂中浸泡10～30分钟，完全浸透后在锡纸上加热干燥，制成反应试纸，干燥保存。
3.根据权利要求2所述的生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，所述反应试纸的使用方法是，将生乳样品滴加到试纸上，或将试纸浸入样品中1-3秒，然后将试纸平放，目测或使用仪器采集反应过程中的试纸颜色变化信息，采用标准显微镜法，制作标准比色卡，或建立反应过程中的颜色变化信息与体细胞数之间固定的函数关系，作为检测标准；将待测生乳与试纸进行反应,目测或使用仪器采集反应过程中的颜色变化信息，将采集的颜色变化信息与检测标准进行比较，获得所测生乳中的体细胞数。
4.根据权利要求1所述的生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，所述反应助剂包括EDTA、Triton。
5.根据权利要求2或3所述的生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，所述的反应助剂包括EDTA、Triton、聚乙烯吡咯烷酮。
6.根据权利要求1或2所述的生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，所述酯溶液为吡咯酯类、吲哚酯类或聚乙酸萘酚酯中的一种。
7.根据权利要求1或2所述的生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，所述重氮盐为1,2-重氮氧基萘-4-磺酸或2,4-二氯苯胺重氮盐。
8.根据权利要求1或2所述的生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液、硼酸-氢氧化钠缓冲液、tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液等任何可调节pH在碱性范围的缓冲液。
9.根据权利要求1或2所述的生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，采集样品颜色信息的仪器为颜色传感器、扫描仪、色差仪或反射式光学密度计等任何可采集样品颜色信息的仪器。
10.根据权利要求1或2所述的生乳中体细胞含量的分析测试方法，其特征在于，计算生乳颜色变化速度的方法是两点法、终点法或速率法。
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