CN101382481A

CN101382481A - 一种测定原料乳中体细胞数的方法

Info

Publication number: CN101382481A
Application number: CNA2008101373901A
Authority: CN
Inventors: 田波; 霍贵成; 姜瞻梅; 韩翠萍; 陈晓义; 史慧茹
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2008-10-27
Filing date: 2008-10-27
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2028-10-27
Also published as: CN101382481B

Abstract

一种测定原料乳中体细胞数的方法，它涉及了一种测定乳中体细胞数的方法。本发明解决了现有检测原料乳体细胞数的方法存在或耗时长、操作繁琐、且需要专业的技术人员进行操作、或成本高、或不够准确的问题。本发明测定原料乳中体细胞数的方法按如下步骤进行：一、预处理；二、加入反应试剂；三、测定颜色变化；即得到原料乳中体细胞数。本发明的方法具有成本低，节省时间，操作简便，测定结果准确的优点。

Description

一种测定原料乳中体细胞数的方法

技术领域

本发明涉及一种测定乳中体细胞数的方法。

背景技术

原料乳中的体细胞数是指每毫升原料乳中的细胞总数。体细胞中大多数是白细胞，约占总数的95％以上，其余为脱落的上皮细胞。体细胞数是衡量原料乳品质与供应原料乳动物乳腺健康的重要指标，是诊断供应原料乳动物乳房炎的一个国际性指标，而牛乳是最为常见和应用最广的原料乳，需要快速简便、成本低、准确性好的方法来测定牛乳中的体细胞总数。

目前国内外乳品行业应用的牛乳体细胞数或乳房炎的检测方法很多，常用的方法包括显微镜检测(标准显微镜法和荧光显微镜法)、电子计数仪检测法、加利福尼亚细胞数测定法(CMT)、威斯康辛乳腺炎试验(WMT)；其中标准显微镜法是我国体细胞数检测的基准方法，该法所需仪器设备少，但检测耗时较长、操作繁琐、并且需要专业的技术人员进行操作；电子计数仪检测法设备价格昂贵、运行成本高；加利福尼亚细胞数测定法检测方法只能定性，结果不够准确，易出现假阴性结果。

发明内容

本发明是为了解决现有检测原料乳体细胞数的方法存在或耗时长、操作繁琐、且需要专业的技术人员进行操作、或成本高、或不够准确的问题，而提供测定原料乳体细胞数的方法。

本发明测定原料乳体细胞数的方法按如下步骤进行：一、预处理：取待测原料乳两份，分别命名为样品1和样品2，将样品1中的体细胞滤出，得到不含体细胞对照品，分别取等体积样品2和对照品加入透明器皿中，预热至36～38℃；二、反应试剂的加入：分别向样品2和对照品中加入酯溶液、缓冲盐溶液和重氮盐溶液，每1mL的样品2和对照品分别需要加入酯溶液0.01～0.1mL、缓冲盐溶液0.01～0.1mL和重氮盐溶液0.01～0.1mL；三、测定颜色变化：立即用仪器分别采集步骤二加入反应试剂后的样品2和对照品的颜色信息，并记录颜色信息对应的时间，根据颜色变化速度与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数；其中步骤二及步骤三中样品2和对照品温度始终保持36～38℃；步骤二中的酯溶液的浓度为0.02～0.6mol/L；步骤二中的缓冲盐溶液的pH值为7.2～7.6，浓度为0.0025～0.25mol/L；步骤二中的重氮盐溶液的浓度为0.02～0.6mol/L；按照与步骤二完全相同的剂量和浓度向已知体细胞数的原料乳中加入酯溶液、缓冲盐溶液和重氮盐溶液，建立步骤三中的颜色变化速度与体细胞数之间固定的函数关系。

建立颜色变化速度与体细胞数之间固定的函数关系时原料乳中的体细胞数可采用标准显微镜法或电子计数法获得。

本发明的方法根据白细胞酯酶试验原理对原料乳体细胞进行检测，本发明的方法具有以下优点：

1、检测速度快，最快2～3分钟即可定量测定原料乳的体细胞数；单次检测时间比标准显微镜检测法节省20分钟左右，适合在线检测。

2、检测限低，最低限可达到5万体细胞/mL；

3、检测费用低，检测2mL样品的试剂成本不超过0.5元/次，即使中小型乳品企业也有能力应用本方法进行检测；与某些牛奶体细胞计数仪相比仅仪器投资就节省了90％左右，有的牛奶体细胞计数仪售价几十万元。

4、检测结果准确，操作简便，环境要求低，人员无需专门培训，易普及。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式测定原料乳体细胞数的方法按如下步骤进行：一、预处理：取待测原料乳两份，分别命名为样品1和样品2，将样品1中的体细胞滤出，得到不含体细胞对照品，分别取等体积样品2和对照品加入透明器皿中，预热至36～38℃；二、反应试剂的加入：分别向样品2和对照品中加入酯溶液、缓冲盐溶液和重氮盐溶液，每1mL的样品2和对照品分别需要加入酯溶液0.01～0.1mL、缓冲盐溶液0.01～0.1mL和重氮盐溶液0.01～0.1mL；三、测定颜色变化：立即用仪器分别采集步骤二加入反应试剂后的样品2和对照品的颜色信息，并记录颜色信息对应的时间，根据颜色变化速度与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数；其中步骤二及步骤三中样品2和对照品温度始终保持36～38℃；步骤二中的酯溶液的浓度为0.02～0.6mol/L；步骤二中的缓冲盐溶液的pH值为7.2～7.6，浓度为0.0025～0.25mol/L；步骤二中的重氮盐溶液的浓度为0.02～0.6mol/L；按照与步骤二完全相同的剂量和浓度向已知体细胞数的原料乳中加入酯溶液、缓冲盐溶液和重氮盐溶液，建立步骤三中的颜色变化速度与体细胞数之间固定的函数关系。

本实施方式中建立颜色变化速度与体细胞数之间固定的函数关系时原料乳中的体细胞数可采用标准显微镜法或电子计数法获得。

本实施方式中样品2和对照品的体积最好为0.5mL～2mL，不超过5mL。

本实施方式中的原料乳为牛乳、羊乳。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤一中分别将样品2和对照品预热至37℃。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中的酯为氯乙酸萘酚酯、吲哚酚酯或吡咯酯。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中酯溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中酯溶液的浓度为0.3mol/L。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中每1mL的样品2或对照品需要加入0.03～0.07mL的酯溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中每1mL的样品2或对照品需要加入0.05mL的酯溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中缓冲盐溶液的浓度为0.05～0.2mol/L。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中缓冲盐溶液的浓度为0.12mol/L。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中缓冲盐为磷酸盐。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中每1mL的样品2或对照品需要加入0.03～0.08mL的缓冲盐溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中每1mL的样品2或对照品需要加入0.06mL的缓冲盐溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中缓冲盐溶液的pH值为7.3～7.5。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中缓冲盐溶液的pH值为7.4。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二的重氮盐溶液的浓度为0.2～0.4mol/L。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二的重氮盐溶液的浓度为0.3mol/L。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中每1mL的样品2或对照品需要加入0.03～0.08mL的重氮盐溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二中每1mL的样品2或对照品需要加入0.06mL的重氮盐溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤二的重氮盐为1，2-重氮氧基萘-4-磺酸或2，4-二氯苯胺重氮盐。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤三中采集样品颜色信息的仪器为颜色传感器、扫描仪、色差仪或反射式光学密度计；其中颜色传感器为电荷耦合器件(CCD)、电荷注入器件(CID)或光敏二极管阵列(PDA)。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤三中数据的取值和计算的方法为在相隔2～15分钟后再次采集颜色信息，然后用样品2两次的颜色测定差值与对照品两次的颜色测定差值相减，得到体细胞引起颜色变化的差值，根据差值与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

本实施方式中建立颜色差值与体细胞数之间固定的函数关系时体细胞数采用标准显微镜法获得。

具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤三中数据的取值和计算的方法为每隔0.5～30秒再采集一次颜色信息，连续采集至样品2和对照品颜色差值到达某一数值，记录所需要的时间，根据时间与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

本实施方式中建立时间与体细胞数之间固定的函数关系时体细胞数采用标准显微镜法获得。

具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式一的不同点为：步骤三中数据的取值和计算的方法为每隔0.5～30秒再采集一次颜色信息，连续采集几分钟，分析RGB值随时间变化斜率，并计算样品2和对照品斜率差值，根据其与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

本实施方式中建立斜率差值与体细胞数之间固定的函数关系时体细胞数采用标准显微镜法获得。

本实施方式中连续采集颜色的时间为1～10分钟，最好为2～6分钟。

具体实施方式二十一至具体实施方式二十三得到的颜色变化与体细胞数的函数关系一致。

具体实施方式二十四：本实施方式测定原料乳体细胞数的方法按如下步骤进行：一、预处理：取待测原料乳两份，分别命名为样品1和样品2，将样品1中的体细胞滤出，得到不含体细胞对照品，分别取等体积样品2和对照品加入透明器皿中，预热至37℃；二、反应试剂的加入：分别向样品2和对照品中加入酯溶液、缓冲盐溶液和重氮盐溶液，每1mL的样品2和对照品分别需要加入酯溶液0.05mL、缓冲盐溶液0.05mL和重氮盐溶液0.05mL；三、测定颜色变化：立即用仪器分别采集步骤二加入反应试剂后的样品2和对照品的颜色信息，并记录颜色信息对应的时间，根据颜色变化速度与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数；其中步骤二及步骤三中样品2和对照品温度始终保持37℃；步骤二中的酯溶液的浓度为0.066mol/L；步骤二中的缓冲盐溶液的pH值为7.5，浓度为0.016mol/L；步骤二中的重氮盐溶液的浓度为0.066mol/L；按照与步骤二完全相同的剂量和浓度向已知体细胞数的原料乳中加入酯溶液、缓冲盐溶液和重氮盐溶液，建立步骤三中的颜色变化速度与体细胞数之间固定的函数关系。

本实施方式中步骤三中数据的取值和计算的方法为：每隔10秒采集一次加入反应试剂后的样品2和对照品颜色信息(RGB)，连续采集3分钟。分析二者G值斜率，并计算斜率差值，然后代入计算方程进行计算；计算方程为：y＝6.3532x+113.9206，y＝G斜率差值×-1000，x为牛乳中的体细胞数。

用本实施方式的方法反复测定不同牛乳中的体细胞数，并和标准显微镜法做比较，比较结果如表1所示，表1的数据说明本实施方式的方法测定结果准确。

表1 本实施方式方法检测值与标准显微镜计数检测结果对比

Claims

1、一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于测定原料乳体细胞数的方法按如下步骤进行：一、预处理：取待测原料乳两份，分别命名为样品1和样品2，将样品1中的体细胞滤出，得到不含体细胞对照品，分别取等体积样品2和对照品加入透明器皿中，预热至36～38℃；二、反应试剂的加入：分别向样品2和对照品中加入酯溶液、缓冲盐溶液和重氮盐溶液，每1mL的样品2和对照品分别需要加入酯溶液0.01～0.1mL、缓冲盐溶液0.01～0.1mL和重氮盐溶液0.01～0.1mL；三、测定颜色变化：立即用仪器分别采集步骤二加入反应试剂后的样品2和对照品的颜色信息，并记录颜色信息对应的时间，根据颜色变化速度与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数；其中步骤二及步骤三中样品2和对照品温度始终保持36～38℃；步骤二中的酯溶液的浓度为0.02～0.6mol/L；步骤二中的缓冲盐溶液的pH值为7.2～7.6，浓度为0.0025～0.25mol/L；步骤二中的重氮盐溶液的浓度为0.02～0.6mol/L；按照与步骤二完全相同的剂量和浓度向已知体细胞数的原料乳中加入酯溶液、缓冲盐溶液和重氮盐溶液，建立步骤三中的颜色变化速度与体细胞数之间固定的函数关系。

2、根据权利要求1所述的一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于步骤一中分别将样品2和对照品预热至37℃。

3、根据权利要求1所述的一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于步骤二中的酯为氯乙酸萘酚酯、吲哚酚酯或吡咯酯。

4、根据权利要求1所述的一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于步骤二中每1mL的样品2或对照品需要加入0.03～0.07mL的酯溶液。

5、根据权利要求1所述的一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于步骤二中每1mL的样品2或对照品需要加入0.06mL的缓冲盐溶液。

6、根据权利要求1所述的一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于步骤二的重氮盐为1，2-重氮氧基萘-4-磺酸或2，4-二氯苯胺重氮盐。

7、根据权利要求1所述的一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于步骤三中采集样品颜色信息的仪器为颜色传感器、扫描仪、色差仪或反射式光学密度计；其中颜色传感器为电荷耦合器件、电荷注入器件或光敏二极管阵列。

8、根据权利要求1所述的一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于步骤三中数据的取值和计算的方法为在相隔2～15分钟后再次采集颜色信息，然后用样品2两次的颜色测定差值与对照品两次的颜色测定差值相减，得到体细胞引起颜色变化的差值，根据颜色变化的差值与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数。

9、根据权利要求1所述的一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于步骤三中数据的取值和计算的方法为每隔0.5～30秒再采集一次颜色信息，连续采集至样品2和对照品颜色差值到达某一数值，记录所需要的时间，根据时间与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数。

10、根据权利要求1所述的一种测定原料乳中体细胞数的方法，其特征在于步骤三中数据的取值和计算的方法为每隔0.5～30秒再采集一次颜色信息，连续采集几分钟，颜色信息用RGB表示，分析RGB值随时间变化斜率，并计算样品2和对照品斜率差值，根据其与体细胞数的函数方程计算，即得到原料乳中体细胞数。