CN101008991A

CN101008991A - 扫描细胞计数方法

Info

Publication number: CN101008991A
Application number: CN 200610023546
Authority: CN
Inventors: 陈奎发
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2006-01-23
Publication date: 2007-08-01

Abstract

本发明提供一种对细胞进行扫描实现细胞计数的方法。溶液中各种细胞对透过光产生的衰减作用不同，对细胞染色可加大这种差异。将细胞染色后固定在平面固体介质上或将细胞溶液制成厚度均匀一致的液膜，用稳定的线光源扫描介质或液膜，反射光或(和)透射光用光电系统转换成数字信息。信息内容包括扫描位置、光颜色和光强度，对这些信息进行统计则可以得到样品中细胞的数量，实现细胞计数。将所有扫描点的信息以像素图显示，还可判断细胞的颜色、形状、大小。

Description

扫描细胞计数方法

技术领域

本发明涉及一种细胞计数的方法，利用该方法可在5分钟内获得溶液中细胞(包括单细胞微生物)的数量。此方法特别适用于食品、饮料、水、空气中微生物污染的快速检测，也可用于细胞培养研究、发酵工业和医疗卫生检测等领域。

背景技术

细胞计数作为一种检测样品中细胞浓度的分析方法广泛应用于科研、生产、环保和卫生领域，以下5种方法最为常见，其特点及其在食品微生物检测中的应用实例如下：

1.显微镜直接观察

特点：仪器投资不大，检测快速(数分钟)，检测成本低；但是劳动强度大。

应用实例：

“NY/T 800-2004生鲜牛乳中体细胞测定方法”中的显微镜观察法

“GB/T 4789.15-2003食品卫生微生物学检验-霉菌和酵母计数”中的霉菌直接镜检法

2.微生物菌落计数：让微生物在平皿培养基上生长形成可见菌落，一个微生物细胞对应一个菌落。

特点：无特殊仪器要求；但是劳动强度大，检测成本较高，检测时间长(至少24小时)。

应用实例：

GB/T 4789.2-2003食品卫生微生物学检验-菌落总数测定

GB/T 4789.3-2003食品卫生微生物学检验-大肠菌群测定

3.电子粒子计数：利用细胞高电阻特性，让细胞流经狭缝，由阻抗增值引起的电压脉冲数记录，读出细胞个数。

特点：操作简单，检测快速(数分钟)，检测成本低；但是仪器投资费用高。

应用实例：“NY/T 800-2004生鲜牛乳中体细胞测定方法”中的电子粒子计数法

4.荧光光电计数：对细胞进行染色，用荧光检测仪计数染色的细胞。

特点：操作简单，检测快速(数分钟)；但是仪器投资费用高，检测成本较高。

应用实例：“NY/T 800-2004生鲜牛乳中体细胞测定方法”中的荧光光电计数法

5.流式细胞仪检测：让细胞逐个通过细管路，用激光照射细胞流经路线，通过接收的散色光或者染色细胞发出的荧光信息，获得流过的细胞数量。

特点：检测快速(数分钟)；但是仪器投资费用高，需要专业人员操作，检测成本高。

应用实例：没有被食品微生物检测的相关标准引用。

在食品卫生检测中，目前最主要的方法是平皿培养菌落计数，但是由于检测时间很长(菌落总数检测需要48小时，酵母和霉菌检测需要5天)，无法满足食品快速生产、流通、消费的需求，特别是那些保质期只有几天的食品。

另外，食品(包括饮料和水)卫生标准中的微生物数较低，如：“GB 19298-2003瓶(桶)装饮用水卫生标准”中，菌落总数不超过50个/ml，霉菌和酵母均不超过10个/ml。以上提到的电子粒子计数和荧光光电计数法一般用于细胞浓度超过1000个/ml的样品(如：鲜牛奶中体细胞标准为500000个/毫升)。因此将其用于一般食品微生物检测时，要进行增菌处理(一般为6小时到24小时)，因此加长了检测时间。

流式细胞仪尽管可以准确检测1个细胞/毫升的样品，但是设备费用太高，一般要几十万，甚至100多万人民币，因此限制了该方法的应用推广。

理论上，显微镜观察可以准确检测到单个细胞，但是由于视野太小，实际操作难度很大。如“GB/T 4789.15-2003食品卫生微生物学检验-霉菌和酵母计数”中采用的显微计数操作，其过程大致如下：将样品用水稀释到一定浓度，将溶液涂布到郝氏计玻片上形成0.1mm厚的液膜，调节显微镜视野到1.382mm，观察连续50个视野，统计有霉菌的视野的个数。如上所述：0.1毫升样品形成0.1mm的液膜面积为1000平方毫米，为计算方便，可认为每个视野的面积为1.382*1.382＝1.910平方毫米，则检查完0.1毫升样品需要看1000÷1.910＝523个视野。按“GB19298-2003瓶(桶)装饮用水卫生标准”中霉菌10个/ml的要求，即0.1毫升样品中只有1个霉菌，则用显微镜观察50个视野根本不能判断出样品中是否有霉菌存在。因此，显微镜检测很难实现低浓度细胞计数，即无法进行一般食品的卫生检测。

随着人们对食品安全的重视，HACCP(危害分析和关键控制点)质量体系的推广，食品生产领域需要快速、灵敏、低成本的种微生物检测方法，它应具有以下特点：检测速度快(几分钟完成)，检测限低，操作简单，设备投资小。

在环境微生物检测、细胞研究、发酵工业中，同样缺乏检测低细胞浓度的方法和仪器。

本文涉及的细胞计数方法可在数分钟内完成检测，检测限度可达到1个细胞/ml溶液。该方法涉及的仪器制造成本接近显微镜系统，比电子计数器、荧光检测仪和流式细胞仪均有明显优势。

发明内容

根据上文所述，只要有仪器系统能快速扫描大面积的液膜(如：1毫升溶液可形成100平方厘米大小0.1毫米厚的液膜)，就能实现低浓度细胞溶液的检测。

目前，广泛应用的生物芯片扫描技术，它利用激光共聚焦扫描或CCD扫描，可快速检测指甲盖大小的芯片，但是它的检测面积也只有几个平方厘米。

在扫描设备中，应用于文稿、胶片扫描的办公扫描仪，可快速扫描A4幅面(长29.7cm，宽21cm)，扫描面积为623.7平方厘米。而且扫描仪的光学分辨率达到9600dpi，即能分辨1/9600英寸或2.65微米的对象。

对于大小在几微米到几十个微米的细胞，我们就可以将细胞液膜当作“文稿”或者“胶片”，进行扫描检测，实现计数。

因此，本文提出一种新的细胞计数方法：扫描细胞计数法。该方法实现过程如下：将细胞配制成溶液，并对细胞进行染色处理，以强化细胞和背景溶剂两者之间的透光性差异，染色后可根据需要进行适当的稀释。将细胞溶液加入一个扁平的盒子中，压成液膜。然后用均匀的线光源扫描液膜平面，将扫描的反射光(视液膜为“文稿”)或透射光(视液膜为“胶片”)经一组反射和透射镜传输到光电转换系统(光电耦合器CCD，接触式图像传感器CIS或LIDE，光电倍增管PMT等)，再将电信号通过模拟/数字转换器转化为数字信号，最后利用计算机系统对数字信息进行分析统计，得到液膜中存在细胞的数量。

上述方法中所说的反射光和透射光是针对扫描系统的工作方式来说的，即“反射式扫描”和“透射式扫描”。在反射式扫描中，系统接收的光包括两部分：一部分由细胞直接反射的光；另一部分是光源透过细胞后由细胞固定器或扫描系统的部件反射，该反射光再次透过细胞，最终被光电系统接收，因此实际上是双重透射光。

本方法所述盒子的底和盖的扫描区域都应该是厚度均匀一致的平板，在加入细胞溶液后，底和盖都能和细胞溶液紧密接触(无气泡隔离)，使细胞溶液形成厚度均匀一致的液膜。当采用透射式扫描时，盒子的底和盖的扫描区域都应该是透光的；当采用反射式扫描时，盒子的底或盖至少有一面是透光的。

方法实施时，液膜的厚度控制在50-100微米，盒子的扫描区域控制在10-200平方厘米。样品检测量和形成液膜大小根据溶液中细胞浓度选择，其原则是液膜中的细胞充分分离，细胞之间的距离应不小于细胞的平均长度或直径的3倍。检测时的实际扫描区域根据细胞浓度的大小选择以保证检测的准确性，扫描区域可以是部分或整个液膜区域。1毫升样品可形成面积为100平方厘米、厚度为0.1毫米的液膜。利用市场上现有的线光源扫描技术完全可以在5分钟内完成100平方厘米的扫描，而且扫描的精度可以达到2.65微米，因此利用本文描述的方法，可以在5分钟内完成1个样品的细胞扫描计数检测，而且该样品的细胞浓度可以在10个/ml以下。

扫描获得的数字化信息包括扫描点位置、反射光或透射光的颜色、光强度(或灰度)。利用软件，可根据不同细胞的颜色、透光性(或灰度值)对扫描点的颜色值和灰度值进行分级统计，并由此计算出特定细胞的数量。计算的方法很多，本文举例一种较为简单的计算方法：若某特定类别细胞的总扫描点数为X，以此值除以此类细胞平均可被扫描的点数N(如：某近球形细胞的平均直径为10微米，其横截面则为π×5×5＝78.5平方微米，若扫描仪的精度为2.65微米，即每个扫描点的面积为7.02平方微米，所以每个细胞可形成N＝11.2个扫描点)，则液膜中此类细胞的总数n＝X/N。

扫描的信息还可以用图像软件以像素图的形式显示，这样就可以通过颜色、灰度、形状分辨出不同种类的细胞，也可以直观地数出特定细胞的数目。利用图像分析软件，可以进行更复杂的信息处理，获得更多信息。

以上所述为将细胞固定在液膜中实现扫描计数的方法，如果将细胞固定在固体平面介质上，则可以实现细胞溶液的浓缩，提高检测的灵敏度。因此本文提出第二种扫描细胞计数法，该方法实现过程如下：将细胞配制成溶液，并对细胞进行染色处理；过滤溶液将细胞截留在滤膜上，并用溶剂洗涤细胞以除去细胞外残留的染色剂；用扫描系统进行反射式扫描或透射式扫描，获取滤膜上的细胞信息用于统计或图像分析。使用滤膜固定的另一个用途在于可对细胞按大小进行分级过滤，进行分类计数。

以上所述的两种扫描细胞计数方法在实施过程中能体现细胞形状、大小、颜色，再加上不同的染色处理，因此可用于判断细胞的种类、活性状态等特性，实现细胞鉴别。如：用碘染色，就可以区分酵母(浅黄色)和淀粉颗粒(蓝色)；用亚甲基蓝就可以区分活性细胞(接近无色)和非活性细胞(浅蓝色)。

根据以上所述，本发明的一个目的是利用高精度快速扫描技术和细胞对透射光产生衰减的特性，提供一种细胞检测计数的方法。

本发明的另一个目的是提供一种对细胞进行定性描述的技术，利用该方法可以描述细胞的大小，颜色，以及细胞的存活状态。

具体实施方式

用市购的办公扫描仪作为光电扫描系统，以市售面包酵母为对象，按以上描述的方法进行试验。试验中所用扫描仪分辨率4800×9600dpi(上海中晶科技有限公司制造，仪器型号ScanMaker s430)，系统采用白色线光源，可进行反射稿件和透射胶片两类扫描，光电转换系统为集成4800个检测点的线性CCD。

试验中，酵母用水配制成溶液，加入等体积2％的碘液染色2分钟，取混合液用两块玻璃片(两玻片之间用胶布隔开)压成0.1毫米厚的液膜，放入扫描仪中进行反射式扫描。扫描的彩色图显示出浅黄色斑点，这些斑点即为酵母细胞，而不是淀粉颗粒。

图1显示的是用9600dpi分辨率扫描1平方厘米液膜获得的灰度像素图，图中大的黑点为多个粘在一起的酵母细胞，小的黑点则为单个细胞，图像显示细胞大小占2-3个像素点。另外，扫描仪的操作软件可以自动统计不同灰度像素点的个数，利用这些数据就可以按前文所述方法计算细胞个数。因每个像素点大小为2.65微米，因此可判定细胞大小为5-8微米，酵母的实际大小为4-5微米。造成偏差的原因是扫描系统分辨率不够高，减少偏差的方法可采用硬件方法或软件方法，硬件方法是采用更高光学分辨率的扫描仪，增加单个细胞的扫描点数；软件方法是对图像进行插值运算，精确计算细胞边缘区域的扫描点，不以简单的“0”或“1”统计，而以小数或几分之一计算。

图2显示的是用液膜固定酵母采用透射式扫描获得的灰度图，采用的分辨率为4800dpi，扫描面积为10平方厘米。由于细胞浓度低，因此利用扫描仪配备软件显示的图像，可直接数出细胞个数。

图3显示的是固定在滤膜上的细胞扫描灰度图。同样用碘液进行染色，取染色的细胞溶液1ml，用0.45微米滤膜过滤，将滤膜放在同一扫描仪上进行反射式扫描。试验所用分辨率为9600dpi，扫描面积为1平方厘米。从图中明显看出细胞密度比液膜中高，这就是用滤膜固定的一个好处，可以大大减少扫描面积，加快检测速度。这一特点在检测低细胞浓度(小于100个/ml)样品时很有用。

试验中使用的扫描仪为市场上低端产品(售价不到2000元)，光学效果较差，因此获得的图像比较模糊。在用软件统计时，标准偏差在20％左右(细胞浓度为100000个/ml)；在低细胞浓度(1000个/ml)且采用目视观察图像计数时，产生的偏差可控制在10％以内。目前市场上已有的高性能专业级扫描仪(每台售价约10000元)具有更高分辨率，系统的光学性能更高，扫描信号噪音低，获得图像更清晰，采用这种高端产品进行扫描和统计可进一步提高结果的准确性。另一方面，电子产品技术升级更新很快，同一性能产品价格也逐年降低，因此本文所述的细胞计数方法的设备系统在性能和成本等方面的优势比其他方法也会越来越大。

Claims

1.对溶液中细胞进行分类计数的方法，其步骤包括：

(1)配制细胞溶液；

(2)加入染色剂对细胞进行染色处理；

(3)将细胞固定在一个扁平区域中；

(4)用线光源逐行扫描固定细胞的区域，用光电器件接收透射光或反射光，并将其转化成数字信息，信息内容包括扫描点的位置、接收光的颜色和强度；

(5)将扫描点信息按颜色、光强度进行分类统计，并以此获得各类细胞的数量。

2.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(2)的染色处理还包括染色后的溶液稀释。

3.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(3)是通过将细胞溶液制作成液膜来实现的。

4.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(3)是通过过滤细胞溶液从而将细胞截留在滤膜上来实现的。

5.根据权利要求3的方法，其中所述液膜的厚度为50-100微米。

6.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(4)还包括同时接收透射光和反射光，用于转换和分析。

7.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(4)的扫描区域为部分或整个固定细胞的区域。

8.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(4)的光电器件包括线性光电耦合器CCD。

9.根据权利要求1的方法，其中所述步骤(5)还包括将扫描点信息用计算机软件以像素图的形式显示，用于观察细胞颜色、形状和大小，并计数细胞。