CN103059289A - 一种聚乙二醇修饰的d-氨基葡萄糖及其合成和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖及其合成和应用，该化合物的合成是采用简单的碳化二亚胺法，将聚乙二醇上的羧基与D-氨基葡萄糖上的氨基相连，采用透析法得到高纯度的聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖。本发明中的新化合物的水溶液注射到荷乳腺癌的裸鼠肿瘤组织内，通过病理组织学检查肿瘤坏死情况，结果表明，该化合物具有抑制肿瘤组织生长的作用。
Description
技术领域
本发明是关于一种聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖的合成及其在治疗肿瘤中的应用。
背景技术
氨基葡萄糖是一种从天然甲壳素中提取的氨基己糖。甲壳素又叫几丁，是一种线型氨基多糖，广泛存在于节肢动物类的翅膀或外壳中，也存在于真菌和藻类的细胞壁中。甲壳素经盐酸水解可得D-氨基葡萄糖盐酸盐（GAH）。氨基葡萄糖几乎分布于人体所有组织，参与构造人体组织和细胞膜，是蛋白多糖大分子合成的中间物质，它可合成黏多糖、糖蛋白和蛋白聚糖，特别是合成那些关节软骨以及滑液分子的中间物，是人体及动物体内关节组织中糖蛋白的天然成分，在动物和人体内由葡萄糖氨基化内源性生物合成。
大量的临床研究表明，氨基葡萄糖具有抗骨关节炎作用和抗肿瘤活性等。其中硫酸氨基葡萄糖片剂和胶囊等目前已经生产上市，临床用于治疗衰退性骨关节炎，而其抗肿瘤活性也正成为学术届的研究热点。氨基葡萄糖对肿瘤细胞具有较好的杀伤作用，而对人体正常细胞毒性很小。研究表明，氨基葡萄糖在体外对SGC-7901胃癌细胞的生长有一定的抑制作用，对LS-174肠癌细胞、HepG-2肝癌细胞抑制作用较弱。
近年来，国内外学者对氨基葡萄糖进行了相关的结构修饰，并对其抗肿瘤活性和相关机制进行了研究。氨基葡萄糖衍生物羧基-D-氨基葡萄糖（COPADG）能够有效诱导人食管癌Eca-109细胞凋亡，同时显著诱导Eca-109细胞内Caspase-3活化；能明显降低Eca-109细胞内bcl-2蛋白表达。在前期的研究中已发现，随着COPADG作用浓度增加，线粒体膜电位呈下降趋势。因此，可推测COPADG可能通过下调bcl-2蛋白表达，进而打破线粒体膜电位的稳定性，引起细胞色素C的释放并最终激活Caspase-3诱导Eca-109细胞凋亡的发生。
本发明将PEG与氨基葡萄糖相连形成新的化合物，实验证明，该新化合物具有抗肿瘤作用。以该化合物为材料，可合成具有长循环和抗肿瘤作用的微球等新型制剂，不仅能避免巨噬细胞的吞噬，还能增加肿瘤特异性，具有广泛的应用前景。
发明内容
技术问题：本发明的目的在于提供一种聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖及其合成和应用，所合成的聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖纯度高，且具有抑制肿瘤组织生长的作用。
技术方案：本发明的的聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖通式为：
R-PEG-CO-NHC6H11O5.
其中R为聚乳酸PLA、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA或氢H。
所述聚乳酸PLA分子量为2000~6000，聚乙二醇PEG分子量为2000~5000，聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA分子量为2000~6000；在PLGA中，乳酸与羟基乙酸的摩尔比例为75：25~50：50。
本发明的聚乙二醇修饰的氨基葡萄糖的合成方法为：将R-PEG-COOH上的羧基与氨基葡萄糖上的氨基结合而得，具体包括以下步骤：
1）将R-PEG-COOH溶于溶剂中，配成1~10mg/mlR-PEG-COOH的工作液；
2）将EDC和NHS用溶剂溶解，分别配制成1mg/mlEDC和1mg/ml NHS的工作液；
3）取R-PEG-COOH的工作液，加入EDC工作液，室温振荡反应10~20min，然后加入NHS工作液，室温振荡反应3h制成最初反应液；
4）用溶剂溶解氨基葡萄糖，配制成1~10mg/ml氨基葡萄糖的工作液；
5）向步骤3）中的最初反应液中加入氨基葡萄糖工作液，室温振荡反应12h获得最终反应液；
6）将上述最终反应液转移到透析袋中，用水透析24h，每8h换液1次，透析完后分装，冻干。
所述的R-PEG-COOH:EDC:NHS：氨基葡萄糖的摩尔比为1：5~10：10~50：100。
所述的溶剂S是二甲基亚砜DMSO、二甲基甲酰胺DMF、4-二甲氨基吡啶DMAP或水；或是水与二甲基亚砜DMSO、二甲基甲酰胺DMF、4-二甲氨基吡啶DMAP中的一种或多种的混合物。
所述的聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖应用在治疗乳腺癌等肿瘤中。
所述的聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖的应用，其特征在于该聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖应用在制备具有抗肿瘤作用的脂质体或微球中。
有益效果：本发明所合成的聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖纯度高，且具有抑制肿瘤组织生长的作用。
具体实施方式
PEG化的氨基葡萄糖（聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖）的制备，具体步骤如下：
（1）将R-PEG-COOH（A）溶于适当的溶剂（以S1表示）中，配成1~10mg/ml的A工作液；将D-氨基葡萄糖（B）用S1溶解，配制成1~10mg/ml的B的工作液；
（2）将EDC和NHS用S1溶解，分别配制成1mg/ml相应工作液；
（3）取一定体积A工作液，加入EDC工作液，室温振荡反应10~20min，然后加入NHS工作液；
（4）向步骤（3）中的最初反应液中加入一定体积的B工作液，室温振荡反应8~12h获得最终反应液；
（6）将上述最终反应液转移到透析袋中，用水透析24h，每6~10h换液1次。
合成产物与R-PEG-COOH的红外光谱图结果显示，合成产物中含有酰胺键：酰胺Ⅰ带：νC=0 1645.9cm-1；酰胺Ⅱ带：δN-H 1548.3cm-1；N-H伸缩振动峰（νN-H）：3296.9cm-1。表明，PEG成功修饰到了氨基葡萄糖上。
D-氨基葡萄糖测定：
(1)标准曲线的制备：采用经典的Elson ＆ Morgan法，配制不同浓度的氨基葡萄糖标准溶液，按照Elson ＆ Morgan法的操作步骤显色后，在524nm波长处测定吸光度，以吸光度对质量进行线性回归，得回归方程为：Y=0.0055X+0.0303，R2=0.9991，线性范围为20～120ug。
（2）合成产物纯度的测定：按（1）中相同的方法处理合成产物，测定524nm波长处的吸光度，代入标准曲线方程，最后计算得产物的纯度为90%。
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于实施例。
实施例1 聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖的制备
（1）将A，B分别溶于DMSO中，分别配成5mg/ml的A工作液和B工作液；将EDC和NHS用0.1M pH7.5的PBS，分别配制成10mg/ml和20mg/ml相应工作液；取一定体积A工作液，加入一定量EDC工作液，使得A与EDC的摩尔比为1：10，室温振荡反应10~20min，然后加入一定量NHS工作液，使得EDC与NHS的摩尔比为1：5，室温振荡反应3h制成最初反应液；向最初反应液中加入一定体积的B工作液，室温振荡反应12h获得最终反应液；将上述最终反应液转移到透析袋中，用水透析36h，每12h换液1次，透析完后取出反应物即制得酰胺。
（2）将A，B分别溶于DMF中，分别配成5mg/ml的A工作液和B工作液；将EDC和NHS用0.1M pH7.5的PBS，分别配制成10mg/ml和20mg/ml相应工作液；取一定体积A工作液，加入一定量EDC工作液，使得A与EDC的摩尔比为1：10，室温振荡反应10~20min，然后加入一定量NHS工作液，使得EDC与NHS的摩尔比为1：5，室温振荡反应3h制成最初反应液；向最初反应液中加入一定体积的B工作液，室温振荡反应12h获得最终反应液；将上述最终反应液转移到透析袋中，用水透析36h，每12h换液1次，透析完后取出反应物即制得酰胺。
实施例2 局部注射聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖对荷瘤裸鼠的肿瘤抑制作用小鼠乳腺癌4T1细胞体外培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37°C，5%CO2培养箱内培养，收集对数生长期细胞悬液，接种于雌性裸鼠右腋下，一周后随机分为聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖组和模型对照组，每组6只。给药后30天剥离肿瘤称质量，结果模型对照组肿瘤质量为3.92±0.81g，聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖组肿瘤质量为1.67±0.39g抑瘤率达57.40%。
Claims (7)
1.一种聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖，其特征在于该氨基葡萄糖通式为：
R-PEG-CO-NHC6H11O5.
其中R为聚乳酸PLA、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA或氢H。
2.如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖，其特征在于，所述聚乳酸PLA分子量为2000~6000，聚乙二醇PEG分子量为2000~5000，聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA分子量为2000~6000；在PLGA中，乳酸与羟基乙酸的摩尔比例为75：25~50：50。
3.一种如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的氨基葡萄糖的合成方法，其特征在于，将R-PEG-COOH上的羧基与氨基葡萄糖上的氨基结合而得，具体包括以下步骤：
1）将R-PEG-COOH溶于溶剂中，配成1~10mg/mlR-PEG-COOH的工作液；
2）将EDC和NHS用溶剂溶解，分别配制成1mg/mlEDC和1mg/ml NHS的工作液；
3）取R-PEG-COOH的工作液，加入EDC工作液，室温振荡反应10~20min，然后加入NHS工作液，室温振荡反应3h制成最初反应液；
4）用溶剂溶解氨基葡萄糖，配制成1~10mg/ml氨基葡萄糖的工作液；
5）向步骤3）中的最初反应液中加入氨基葡萄糖工作液，室温振荡反应12h获得最终反应液；
6）将上述最终反应液转移到透析袋中，用水透析24h，每8h换液1次，透析完后分装，冻干。
4.如权利要求3所述的聚乙二醇修饰的氨基葡萄糖的合成方法，其特征在于R-PEG-COOH:EDC:NHS：氨基葡萄糖的摩尔比为1：5~10：10~50：100。
5.如权利要求3所述的聚乙二醇修饰的氨基葡萄糖的合成方法，其特征在于所述的溶剂S是二甲基亚砜DMSO、二甲基甲酰胺DMF、4-二甲氨基吡啶DMAP或水；或是水与二甲基亚砜DMSO、二甲基甲酰胺DMF、4-二甲氨基吡啶DMAP中的一种或多种的混合物。
6.一种如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖的应用，其特征在于该聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖应用在治疗乳腺癌等肿瘤中。
7.一种如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖的应用，其特征在于该聚乙二醇修饰的D-氨基葡萄糖应用在制备具有抗肿瘤作用的脂质体或微球中。
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