CN103048451A - 检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条及检测方法，该胶体金免疫试纸条：A、从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA；B、用RT-PCR的方法克隆李痘病毒的外壳蛋白基因，然后将其连接到原核表达载体pET29(a)上，得到pET29a-PPV重组载体，以序列测定最终验证阅读框架正确的重组质粒，用以李痘病毒外壳蛋白基因的诱导表达；将pET29a-PPV重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)；C、用亲和柱法回收特异性表达蛋白，再免疫家兔，获得李痘病毒抗血清；D、采用上述抗血清制备出检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条。本发明目的提供一种使用方便，能快速检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条和采用该试纸条检测李痘病毒的方法。

Description

检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条及检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，本发明还涉及一种采用该胶体金免疫试纸条检测李痘病毒的方法。

背景技术

李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)是我国颁布的最新检疫性病原物，属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)中的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，它是核果类果树危险性最大的病毒之一(Dunez，Sutic，1988；Nemeth，1994)，其自然寄主主要是李属的木本植物，如杏(PrunusarmeniacaL.)、桃(P.persicaL.)和欧洲及日本的李子(P.domesticaL.和P.salicinaLindl.)以及甜樱桃(P.aviumL.)和酸樱1桃(P.cerasusL.)等。果树一旦受其侵染，则叶片扭曲褪绿，叶脉黄化，特别是果实变形变小，出现花斑，造成品质下降，未成熟果实大量脱落，使产量严重降低，而且其传播速度快，在短时间内即可能给果树业的发展带来灾难性损失。

广东地处我国的南方开放地区，地理环境优越，每年经过广东辖区口岸的进出境种子，花卉，苗木等容易携带病毒的材料约占我国总数量的一半，由于进出境批次多，数量庞大，急需研究出即能保证一定的检测数量，又能够检测速度快，而且灵敏度要高，成本也不太昂贵的检测方法。虽然目前在口岸对果树病毒病检测仍然以酶联免疫吸附法(ELISA)为主，但是ELISA需要专门的仪器设备，而且需要有专业人员才可以进行检测判定，操作繁琐，所需时间也比较长，急需更为简单快速灵敏的检测方法才能更加适合口岸快检快放的要求。

目前国外国内，植物病毒的检测方法主要有如下5种：一是传统的生物学方法，其特点是周期长，准确度低，检测病毒数量少，劳动强度大，；二是电子显微镜方法，但它只能观察病毒粒体形态，不能鉴定病毒种类，而且操作复杂，价格十分昂贵；三是酶联免疫吸附分析法，是目前应用最广的病毒检测方法，但其检测时间长，操作步骤多，而且需要专用仪器和购买昂贵的特异性抗血清；四是PCR方法虽然灵敏度非常高且快速，但更需要专用仪器和专业人员，而且检测通量有限；五是基因芯片检测技术，它是目前最有发展前途和潜力的检测方法，但其检测结果的稳定性和重复性还有必要进一步完善，而且仪器价格也是十分昂贵，操作复杂，检测时间也长。

因此，非常有必要在上述5种方法之外再研究新的检测方法，以便充分满足一线口岸植物种苗病毒快速检测的需要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种使用方便，能快速检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条。

本发明另一个目的是提供一种采用该胶体金免疫试纸条检测李痘病毒的方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于按以下步骤制备：

A、从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA；

B、用RT-PCR的方法克隆李痘病毒的外壳蛋白基因，然后将其连接到原核表达载体pET29(a)上，得到pET29a-PPV重组载体，以序列测定最终验证阅读框架正确的重组质粒，用以李痘病毒外壳蛋白基因的诱导表达；将pET29a-PPV重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)；

C、用亲和柱法回收特异性表达蛋白，再免疫家兔，获得李痘病毒抗血清；

D、采用上述抗血清制备出检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条。

如上所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤A中从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA具体包括以下步骤：

(1)李痘病毒感病材料的幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成＜100mg小份至预冷E.P.管，100mg样品加入1mLTriZOL抽提；

(2)12000rpm，2-8℃离心10min；

(3)吸取上清液，转移至新的1.5mLE.P.管中，15-30℃放置5min；

(4)加0.2mL氯仿，充分抽提8min，15-30℃放置2-3min；

(5)12000rpm、2-8℃离心15min；

(6)吸取上清液，转移至新的1.5mLE.P.管中，加0.5mL异丙醇，15-30℃放置10min；

(7)12000rpm、2-8℃离心10min；

(8)弃去上清液，得胶体状RNA，加1-1.5mL75％乙醇，涡旋混匀；

(9)7500rpm、2-8℃离心5min，弃去上清，留下胶体状RNA；

(10)干燥5-10min；

(11)溶于RNase.free水中，枪头打匀，55-60℃温浴10min；

(12)5％Agarose胶检测，测定浓度并调至2-3μg/μL，-70℃储存备用。

如上所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤B的具体方法包括：

a、RT-PCR扩增目的基因：

(1)引物

上游序列：PPV-F1：5’-CAGGATCCGCTGACGAAAGAGAAGAC-3’，其中GGATCC为BamHI酶切位点；

下游序列：PPV-R1：5’-TGAAGCTTCACTCCCCTCACACCGAG-3’，其中AAGCTT为HindIII酶切位点；

(2)扩增参数体系：模板RNA1μL，5μmol/L上游引物1μL，5μmol/L下游引物1μL，扩增酶混合液1μL，2×buffer12.5μL，RNase-freeddH₂O至总体积25μL；

(3)扩增过程：

50℃30min，94℃3min，94℃1min，58℃30s，72℃1min，72℃10min，4℃；其中94℃1min，58℃30s，72℃1min，72℃10min循环35次；

b、基因克隆及序列测序：

(1)PCR产物的回收

取扩增产物在1％TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收；

(2)重组质粒的构建

采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒；具体步骤为：电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4μL回收产物，1μLpGEM18-T载体，5μL连接液，补充ddH₂O至总体积10μL；16℃下反应过夜；

(3)感受态细胞制备

于LB培养基平板上活化DH5α菌株，并挑取单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃下摇动培养过夜，形成种子菌液；取此5mL菌液，于100mLLB液体培养基，37℃摇动培养2～2.5hr，至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，冰浴5min，4℃下4000g离心10min，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂重悬浮菌体，冰浴30min，4℃下4000g离心10min，收集沉淀，加入100μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4℃冰箱中放置12～24hr备用；或加入70μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂和30μL50％甘油于-70℃保存备用；

(4)重组质粒的转化及筛选

从-70℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10μL连接产物于100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42℃水浴中热激90sec，迅速将离心管冰浴3～5min；每管中加入800μLLB液体培养基，37℃下摇动培养90min；

采用抗生素和α-互补法筛选重组质粒：取100mLLB固体培养基加热融化，待冷却至60℃以下时，加入100μLAmp，混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4μLIPTG及40μLX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200μl转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37℃下倒置培养16～24hr；挑取直径约为1～2mm大小的白色菌落于5mLLB液体培养基中37℃下摇动培养12～16hr，标记后取0.7mL与0.3mL50％(v/v)的灭菌甘油混匀后，置-80℃下保存备用，其余菌液用于重组质粒抽提及鉴定；

(5)重组质粒的抽提

经抗生素及α-互补法筛选得到的待检菌落培养物于4℃冰箱内预冷5～10min，采用碱裂解法抽提质粒DNA；具体步骤如下：离心管标号，取含重组质粒的菌体液1.5mL至离心管中，4℃、12000g、离心1min，弃上清，重复加菌体液一次，离心后将管倒置于吸水纸上，待流尽余液后加入150μL溶液I，剧烈振荡，使菌体悬浮，室温放置5～10min，加入250μL溶液II，颠倒离心管数次，温和混匀，室温放置5min，加入180μL溶液III，盖紧离心管，温和颠倒离心管数次，使沉淀混匀，冰浴6～7min，4℃、12000g离心10min，上清液移入干净的离心管中，分别加入1/2体积的氯仿/异戊醇、Tris饱和苯酚，混匀，4℃、12000g离心5min，取上清，氯仿/异戊醇再抽提一次；上清水相移入干净离心管中，加入1/10体积NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，-20℃冰箱中20min或过夜，4℃、12000g离心10min，弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上，吸干余液，70％、100％乙醇各洗一次，室温下风干，加入20μLTE，-20℃冰箱中备用。

(6)重组质粒的鉴定

①、特异引物PCR鉴定

利用特异引物对待检重组质粒进行PCR扩增。反应体系程序参数同上，PCR产物在1％TBE琼脂糖凝胶上电泳鉴定；凡含有目的扩增片段的克隆，进一步进行酶切鉴定；

②、重组质粒酶切鉴定

经PCR鉴定阳性的重组质粒，以下列体系进行双酶切：10×HBuffer1.5μL，BamH10.5μL，HindIII0.5μL，待检质粒4μL，加ddH₂O至总体积15μL，37℃下反应过夜，取10μL反应液电泳检测酶切结果；

③、重组质粒序列测定

经上述PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，扩繁菌体，抽提并纯化质粒后，利用通用测序引物对重组质粒进行序列测定；

c、PPVCP基因原核表达载体的构建：

以BamH1和HindIII分别双酶切PPVCP/

-T重组载体和表达质粒pET29(a)，将经双酶切的产物都以1％的琼脂糖凝胶进行电泳，并切胶回收纯化，纯化产物与双酶切载体进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α；用PCR和质粒酶切鉴定方法筛选出的阳性重组子后，再进行DNA测序，以验证阅读框的正确性；

d、CP基因诱导表达及SDS-PAGE分析：

将阅读框正确的重组子质粒pET29a-PPV转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于3mlLB的液体培养基中，37℃摇床中活化培养过夜后，按1∶100稀释到新鲜的LB培养基中，37℃，200rpm振动培养至OD600达到0.5-1.0，加入IPTG至终浓度1mM，继续于37℃培养；分别于不同的时间段取样，离心收集菌体，加适量TE溶液pH8.0，震荡悬浮，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸3min，13.5％的SDS-PAGE电泳分析PPVCP基因的蛋白表达情况；电泳结束后的聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝R-250染色1h，室温摇床脱色3h；

e、表达产物的纯化：

根据预表达结果，选取高效表达菌株，以IPTG诱导大量表达，并离心收集菌体；菌体可于-20℃保存；称取适量菌体，以20mM磷酸缓冲液pH8.0悬浮，加入蛋白酶抑制剂CocktailsetIII和溶菌酶，冰上置30min，再加等体积的8M尿素磷酸缓冲液pH8.0，震荡混匀2min；于4℃，10000rpm离心10min，上清液以0.45μm过滤器抽滤后，上样Ni-NTA预装柱，然后进行纯化；

经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，将含有洗脱纯化蛋白的收集液以含尿素浓度梯度递减的50mMTris缓冲液透析去除尿素，并以紫外分光光度计测定法测定回收蛋白的含量。

如上所述的一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤C的具体方法：

以从Ni-NTA亲和柱纯化得到的高纯度CP蛋白和从凝胶上切胶回收的蛋白条带分别免疫大白兔；切胶条带用生理盐水适当稀释后，加入等体积福氏不完全佐剂乳化；蛋白液体1mg/mL直接与福氏不完全佐剂进行乳化；免疫大白兔采用肌肉注射结合皮下注射的方式，第一次免疫之后，分别于第21天、第35天和第49天加强免疫3次；最后一次注射免疫后7天开始少量静脉采血测定效价，根据效价情况分次大量取血；制备的抗血清加入0.02％的叠氮化钠，-20℃保存。

如上所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤D的具体方法：

(1)20～30nm胶体金颗粒的制备

取1％氯金酸0·6ml，加30ml超纯水加热煮沸；加1％柠檬酸钠0·9ml，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3～5min，补水至原体积。冷却后，用0·2mol/L碳酸钾调pH至7.2～7.5；用0·22μm滤膜无菌注射器压滤；

(2)胶体金-抗体结合物的制备

取1mg纯化的PPV病毒的抗体，边搅拌边注入到50ml胶体金溶液中，室温下搅拌1h；加10％牛血清白蛋白2ml，室温下搅拌5min；加10％聚乙二醇1ml，室温下搅拌5min；12000～15000r/min离心50min，沉淀溶于5ml保存液中；用0·45μm滤膜过滤，4℃冰箱保存；

(3)胶体金-抗体结合物玻璃纤维素膜的制备

取3ml胶体金-抗体结合物，加3ml稀释液混匀；放入玻璃纤维素膜浸泡10min，取出置37℃烤箱中烤干，热合封口，置4℃冰箱备用；

(4)抗体固相硝酸纤维素膜的制备

取PPV病毒的抗体用固相溶液稀释成3mg/ml；取羊抗兔抗体用固相溶液稀释成1mg/ml；取PPV抗体1μl，点样在硝酸纤维素膜上；将固相抗体硝酸纤维素膜置封闭液中，37℃水浴锅中孵育1h；取出固相抗体硝酸纤维素膜浸泡在洗涤液中洗2次，室温下风干，置4～8℃保存备用；

(5)试纸条的组装

在双面胶白色塑料板25mm端内侧粘附抗体固相硝酸纤维素膜；在双面胶白色塑料板25mm端中间粘附金标抗体结合物-玻璃纤维素膜条带，并在其上面覆盖1条25mm宽的玻璃纤维素条与抗体固相NC膜重叠2mm，再粘附1层黄色胶带；在双面胶白色塑料板50mm端粘附32mm宽的吸水纸与抗体固相硝酸纤维素膜重叠2mm，并粘附1层胶带；用裁纸刀切成5mm宽的条带。

本发明采用如上所述任一种胶体金免疫试纸条检测李痘病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1).制样：取0.1g样品加入PBST缓冲液pH7.4，1ml研磨1∶10；

2).取样：低速离心后取300～400μl放入0.5ml离心管中；

3).测试：取出胶体金免疫试纸条恢复至室温，将有胶体金复合物端插入300～400μl离心后的检测样品液中，10min判断结果。

本发明中所采用的材料、试剂、仪器等：

1.1材料

PPV感病材料由西班牙国家生物技术中心分子生物学实验室提供，于-80℃超低温冰箱中保存。

1.2主要试剂

柠檬酸三钠、在硝酸纤维素膜、氯金酸、Trizol试剂、Taq酶、M-MLV反转录酶，T4连接酶等均购自广州普博生物技术公司；羊抗兔抗体、碱性磷酸酶标记抗体购自军事医学科学院，限制性内切酶BamHI和HindIII购自大连宝生物公司；IPTG购自Sigma公司；Ni-NTA以及纯化用柱体购自Invitrogen公司；原核表达载体和大肠杆菌菌株DH5α和BL21(DE3)由本实验室提供；dNTPs、RNase、PCR产物回收试剂盒以及Amp、Cam、Kan、DEPC、EB、Tris碱、琼脂糖、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异硫氰酸胍、无水乙醇、柠檬酸钠、琼脂粉、SDS、NaCl、KCl、EDTA、Trizol试剂、Taq酶、M-MLV反转录酶，T4连接酶等购自广州普博生物技术公司；连接试剂盒、限制性内切酶、X-gal、IPTG、DL2000Marker、DL15000Marker、LoadingBuffer和PrimeScript^TMOne-StepVer.2.0试剂盒等购自大连宝生物生物工程公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自广州捷倍思生物技术有限公司；液氮购自广州气体厂。

1.3主要仪器

BIOTEK酶联检测仪、日本梯度PCR仪、Labofuge400R型冷冻高速离心，高速台式离心机、DYY-7型转移电泳仪，PharmaciaEPS601型电泳仪；法国UVP凝胶成像系统；日本Shimadzu公司UV--120-02型可见-紫外分光光度计；HARRIS超低温冰三洋牌、法国吉尔森牌移液器；单人型超净工作台；人工气候箱LRH-250-GS，隔水式电热恒温培养箱PYX-DHS，HZQ-C空气浴振荡器，电热恒温水浴锅DK-S22、三维喷点平台(XYZ3050)、微定量喷头(BJQ3000XY)、以及切展机(6008-A007)等设备等。

1.4主要溶液的配制

(1)PBS缓冲液：每1000mL中，含2.2gNa₂HP0₄.12H₂O、0.2gKH₂P0₄、8.0gNaCl、0.2gKCl、0.2gNaN₃，调节pH至7.3；(2)PBST：每1000mLPBS中加0.5mLTween-20。(3)摩擦接种缓冲液：PBS中加入1％的铜试剂。(4)0.1％DEPC水溶液：1000mL水中加入1mLDEPC后，37℃下处理24hr，高压灭菌，封闭保存。(5)RNA提取缓冲液：4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，0.5％十二烷基肌氨酸纳(w/v)，0.1mol/L巯基乙醇，2mol/LNaAc，水饱和酚(pH3.5)。(6)10×MOPS：0.2mol/LMOPS(pH7.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)，80mmol/LNaAc。(7)LB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母浸出液(YeastExtract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，pH7.0～7.2，固体培养基加1.5％(w/v)琼脂粉。(8)质粒抽提缓冲液：溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)，分装后高压灭菌，于4℃下保存；溶液II：0.2mol/LNaOH，1％SDS(w/v)，用4mol/LNaOH和20％(w/v)SDS贮存液现配现用；溶液III：在60mL5mol/L的乙酸钾溶液中加入11.5mL冰乙酸和28.5mL水，配成浓度为3mol/L(pH5.3)，乙酸钾浓度为5mol/L的溶液。(9)10％(w/v)SDS溶液(100mL)：SDS10g，加入ddH₂O至终体积100mL。室温保存(使用前确保SDS没有沉淀)。(10)酶联免疫吸附试验(ELISA)的相关试剂：A.抗原包被缓冲液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液)：每1000mL中含1.59gNa₂CO₃，2.93gNaHCO₃，0.2gNaN₃，调节pH值至9.6；B.洗涤缓冲液(0.02mol/LpH7.3PBST缓冲液)：取8.0gNaCl，0.2gKCl，2.9gNa₂HPO₄，0.2gKH₂P0₄，0.5mL吐温-20(Tween-20)，蒸馏水定容至1000mL，调节pH至7.3；C.IgG稀释缓冲液(0.02mol/LPBST牛血清白蛋白缓冲液)：0.1g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗涤液中；D.磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)：0.2mol/LNa₂HPO₄25.7mL，0.1mol/L柠檬酸液24.3mL，加蒸馏水定容至100mL；E.底物溶液(OPD-H₂O₂)：该溶液现用现配，取磷酸盐-柠檬酸缓冲液100mL，加40mg(随温度升高可调整至16mg)邻苯二胺(OPD)，避光充分溶解后，加入0.15mL(随温度升高可调整至0.07mL)30％的H₂O₂；F.终止液：2mol/LH₂SO₄。(11)氨苄青霉素(Amp)：用双蒸水溶解，稀释至贮存浓度100mg/mL，过滤除菌后置-20℃备用；(12)氯仿∶异戊醇(24∶1)：取氯仿48mL、异戊醇2mL，充分混匀后，棕色瓶中保存。(13)TE：含10mmol/LTris-Cl，1mmol/LEDTA，调pH值至8.0；(14)EB母液(10mg/mL)：称取10mgEB溶解于1mL蒸馏水中，避光保存，工作浓度为0.5μg/mL。(15)5×TBE母液：称取54gTrisbase，27.5g硼酸，0.5mol/LEDTA(PH8.0)20mL，双蒸水定容至1000mL。稀释10倍为0.5×TBE工作液。

综上所述，本发明的有益效果：

采用本发明胶体金免疫试纸条检测李痘病毒，不但灵敏度比较高，而且非常快速，一般只需要10分钟既可以判断检测结果。胶体金免疫试纸条特异性强、灵敏度较高，可对新鲜的或冻干的病叶材料进行检测。可满足常规检测的需要，不需要酶联那样精密的仪器，也不需要酶促反应的底物，操作只需一步，十分简便。

附图说明

图1为PPVCP序列的测试图；

图2和图3为原核表达载体重组子的筛选和鉴定的测试图；

图4为PPVCP蛋白原核表达产物SDS-PAGE分析图；

图5为Ni-NTA亲和柱纯化回收PPVCP蛋白的SDS-PAGE分析图；

图6为胶体金试纸条特异性测试图

图7为胶体金试纸条灵敏度测试图。

其中图2和图3中A.菌落PCR筛选M.100bpladder，1至4为所挑取的4个不同转化子。B.重组质粒pET29a-PPVCP的BamH1和HindIII双酶切鉴定。图4中1至4分别为A号克隆在IPTG诱导0min，30min，60min和90min时的CP蛋白表达分析；1’至4’分别为B号克隆在相同诱导表达条件下的PPVCP蛋白。图5中M：蛋白质分子量对照(150kDa，100kDa，75kDa，50kDa，35kDa，25kDa，15kDa)；E1-E8：表达蛋白洗脱产物。图6中1.烟草花叶病毒；2-5.不同稀释度的PPV感病汁液；6.黄瓜花叶病毒；7.李坏死环斑病毒；8.马铃薯Y病毒。图7中1.PPV感病汁液稀释10倍；2.PPV感病汁液稀释10²倍；3.PPV感病汁液稀释10³倍；4.PPV感病汁液稀释10⁴倍。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：

实施例1

本发明检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条由以下步骤制备：

1、病毒样品的鉴定及保存

鉴定：采集的样品先采用血清学方法，主要是ELISA进行检测，根据血清学检测结果，再用现代分子生物学方法如PCR检测法进行确证。保存：主要采用二种方法，一是选取症状典型叶片标本速冻干燥后，保存于-80℃冰箱中；二是抽提病株总DNA和RNA并保存于-80℃冰箱中。

1.1PPV的血清学检测方法，采用间接ELISA方法进行，步骤如下：

(1)取待测样品0.1g，用研杵捣碎，加入1mL的抗原包被缓冲液，转入1.5mL离心管中，2700g离心，取上清液体；(2)加入200μL上清液体到酶联板样品孔中以包被抗原，37℃下，孵育2hr；(3)倒掉包被液，用PBST洗板3次，每次3min；(4)加入PPV特异性IgG，每孔150uL，37℃，温育2hr；(5)倒掉此溶液，洗板同前；(6)加入酶标羊抗兔IgG，每孔100μL(工作浓度1∶3000)，37℃下温育2hr；(7)倒掉此溶液，洗板同前；(8)加入底物溶液TMB，每孔100μl，室温30min后，每孔加50μL2mol/L的H₂SO₄终止反应；(9)酶标仪测定OD450，观测记录显色情况，重复三次。注：做ELISA检测时，每个样品至少重复2次，并需要设置阳性对照、阴性对照以及空白对照；而且显色时间不可过长。

2、总RNA提取方法：

(1)幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成＜100mg小份至预冷E.P.管，100mg样品加入1mLTriZOL抽提几分钟(颠倒混匀)；

(2)12000rpm，2-8℃离心10min；

(3)吸取上清(含RNA)，转移至新的1.5mLE.P.管中，15-30℃放置5min(此前可于-70℃放置1月再抽提)；

(4)加0.2mL(1/5×VOl.TriZOL)氯仿，充分抽提8min，15-30℃放置2-3min；

(5)12000rpm、2-8℃离心15min(形成上层无色水相、中间相和下层有机相、中间相和有机相可用于DNA和蛋白质抽提)；

(6)吸取上清，转移至新的1.5mLE.P.管中，加0.5mL(1/2×VOl.TriZOL)异丙醇，15-30℃放置10min；

(7)12000rpm、2-8℃离心10min；

(8)小心弃去上清，得胶体状RNA，加1-1.5mL(＞＝1×VOl.TriZOL)75％乙醇，涡旋混匀(在75％乙醇中，RNA沉淀可于2-8℃放置二周、-70℃放置1年)；

(9)7500rpm、2-8℃离心5min，小心弃去上清，留下胶体状RNA；

(10)干燥5-10min(过干会使RNA难以溶解)；

(11)溶于RNase.free水中，枪头打匀，55-60℃温浴10min；

(12)5％Agarose胶检测，测定浓度并调至2-3μg/μL。-70℃储存备用。

3、RT-PCR扩增目的基因：

(1)引物设计合成

根据已测定的PPVCP基因保守序列设计，上游序列：

PPV-F1：5’-CAGGATCCGCTGACGAAAGAGAAGAC-3’，其中GGATCC为BamHI酶切位点；

下游序列：PPV-R1：5’-TGAAGCTTCACTCCCCTCACACCGAG-3’，其中AAGCTT为HindIII酶切位点；上游序列和下游序列均由北京奥科生物公司合成。

(2)扩增参数体系

采用大连宝生物公司的试剂盒PrimeScript^TMOne-StepVer.2.0进行一步法RT-PCR扩增。PCR产物4℃保存，取5μL在1％的琼脂糖凝胶上电泳，检查PCR结果。

RT-PCR扩增体系为：模板RNA1μL，5μmol/L上游引物1μL，5μmol/L下游引物1μL，扩增酶混合液1μL，2×buffer12.5μL，RNase-freeddH₂O至总体积25μL。

(3)扩增过程：

50℃30min，94℃3min，94℃1min，58℃30s，72℃1min，72℃10min，4℃；其中94℃1min，58℃30s，72℃1min，72℃10min循环35次；

4、基因克隆及序列测序：

(1)PCR产物的回收

取扩增产物在1％TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收。具体步骤参照试剂盒说明：取一1.5mL离心管在电子天平上称重，切下体积尽可能小的凝胶块至离心管中，称重，按每100mg胶加入300μLBufferDE-A，悬浮混匀后于75℃水浴加热，每隔2～3min混合一次，直至凝胶块完全融化，按BufferDE-A体积的50％加入BufferDE-B，混合均匀，DNA-prep柱置于2mL离心管中，并将上述混合液移入DNA-prep柱中，3600g离心1min，弃滤液，将DNA-prep柱置回到原2mL离心管中，加入500μLBufferW1，3600g离心1min，弃滤液，将DNA-prep柱置回到原2mL离心管中，加入700μL已加无水乙醇的BufferW2，3600g离心1min，以同样的方法再用700μLBufferW2洗涤一次，将DNA-prep柱置于1.5mL离心管中，12000g离心1min，将DNA-prep柱置于另一干净1.5mL离心管中，在silica膜中央加入25～30μL65℃预热的Eluent或去离子水，室温静置1min，12000g离心1min，洗脱DNA，-20℃保存备用。

(2)重组质粒的构建

采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒。连接反应方法按生产商推荐的方法进行，具体步骤为：电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4μL回收产物，1μLpGEM18-T载体，5μL连接液，补充ddH₂O至总体积10μL；16℃下反应过夜。

(3)感受态细胞制备

感受态大肠杆菌的制备参考Sambrook等(1989)的氯化钙法。

具体步骤为：于LB培养基平板上活化DH5α菌株，并挑取单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃下摇动培养过夜(约12～16hr)，形成种子菌液。取此5mL菌液，于100mLLB液体培养基，37℃摇动培养2～2.5hr，至OD₆₀₀＝0.6～0.8左右时，吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，冰浴5min，4℃下4000g离心10min，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂重悬浮菌体，冰浴30min，4℃下4000g离心10min，收集沉淀，加入100μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4℃冰箱中放置12～24hr备用；或加入70μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂和30μL50％甘油于-70℃保存备用。

(4)重组质粒的转化及筛选

从-70℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10μL连接产物于100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42℃水浴中热激90sec，迅速将离心管冰浴3～5min。每管中加入800μLLB液体培养基(不含抗生素)，37℃下摇动培养90min，以利于细菌的复苏和质粒编码抗性基因的表达。

采用抗生素和α-互补法(Sambrook，etal.，1989)筛选重组质粒。取100mLLB固体培养基加热融化，待冷却至60℃以下时，加入100μLAmp，混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4μLIPTG(200mg/mL水溶液过滤除菌)及40μLX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200μl转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37℃下倒置培养16～24hr。挑取直径约为1～2mm大小的白色菌落于5mLLB液体培养基中(含100μg/mLAmp)37℃下摇动培养12～16hr，标记后取0.7mL与0.3mL50％(v/v)的灭菌甘油混匀后，置-80℃下保存备用，其余菌液用于重组质粒抽提及鉴定。

(5)重组质粒的抽提

经抗生素及α-互补法筛选得到的待检菌落培养物于4℃冰箱内预冷5～10min，采用碱裂解法抽提质粒DNA(Sambrook，etal.，1989)。具体步骤如下：离心管标号，取含重组质粒的菌体液1.5mL至离心管中，4℃、12000g、离心1min，弃上清，重复加菌体液一次，离心后将管倒置于吸水纸上，待流尽余液后加入150μL溶液I，剧烈振荡，使菌体悬浮，室温放置5～10min，加入250μL溶液II，颠倒离心管数次，温和混匀，室温放置5min，加入180μL溶液III，盖紧离心管，温和颠倒离心管数次，使沉淀混匀，冰浴6～7min，4℃、12000g离心10min，上清夜移入干净的离心管中，分别加入1/2体积的氯仿/异戊醇、Tris饱和苯酚，混匀，4℃、12000g离心5min，取上清，氯仿/异戊醇再抽提一次。上清水相移入干净离心管中，加入1/10体积NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，-20℃冰箱中20min或过夜，4℃、12000g离心10min，弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上，吸干余液，70％、100％乙醇各洗一次，室温下风干，加入20μLTE，-20℃冰箱中备用。

(6)重组质粒的鉴定

A、特异引物PCR鉴定

利用特异引物对待检重组质粒进行PCR扩增。反应体系程序参数同上，PCR产物在1％TBE琼脂糖凝胶上电泳鉴定。凡含有目的扩增片段的克隆，进一步进行酶切鉴定。

B、重组质粒酶切鉴定

经PCR鉴定阳性的重组质粒，以下列体系进行双酶切：10×HBuffer1.5μL，BamH10.5μL(14U/μL)，HindIII0.5μL(14U/μL)，待检质粒4μL(约400ng)，加ddH₂O至总体积15μL，37℃下反应过夜，取10μL反应液电泳检测酶切结果。

C、重组质粒序列测定

经上述PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，扩繁菌体，抽提并纯化质粒后，利用通用测序引物对重组质粒进行序列测定，由宝生物工程(大连)有限公司进行DNA序列测定。

5、PPVCP基因原核表达载体的构建：

以BamH1和HindIII分别双酶切

重组载体和表达质粒pET29(a)，将经双酶切的产物都以1％的琼脂糖凝胶进行电泳，并切胶回收纯化，纯化产物与双酶切载体进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α。用PCR和质粒酶切鉴定方法筛选出的阳性重组子后，再送到宝生物工程(大连)有限公司进行DNA测序，以验证阅读框的正确性。

6、CP基因诱导表达及SDS-PAGE分析：

将阅读框正确的重组子质粒pET29a-PPV转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于3mlLB的液体培养基中(含卡那霉素40μg/ml)，37℃摇床中活化培养过夜后，按1∶100稀释到新鲜的LB培养基中(含卡那霉素40μg/ml)，37℃，200rpm振动培养至OD600达到0.5-1.0，加入IPTG至终浓度1mM，继续于37℃培养。分别于不同的时间段取样，离心收集菌体，加适量TE溶液(pH8.0)，震荡悬浮，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸3min，13.5％的SDS-PAGE电泳分析PPVCP基因的蛋白表达情况。电泳结束后的聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝R-250染色1h，室温摇床脱色3h。

7、表达产物的纯化：

根据预表达结果，选取高效表达菌株，以IPTG诱导大量表达，并离心收集菌体。菌体可于-20℃保存。称取适量菌体，以20mM磷酸缓冲液(pH8.0)悬浮，加入蛋白酶抑制剂CocktailsetIII和溶菌酶(10mg/ml，至终浓度1mg/ml)，冰上置30min，再加等体积的8M尿素磷酸缓冲液(pH8.0)，震荡混匀2min；于4℃，10,000rpm离心10min，上清液以0.45μm过滤器抽滤后，上样Ni-NTA预装柱，参考INVITROGEN公司提供的蛋白质纯化方法进行纯化。

经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，将含有洗脱纯化蛋白的收集液以含尿素浓度梯度递减的50mMTris(pH7.4)缓冲液透析去除尿素，并以紫外分光光度计测定法测定回收蛋白的含量。

8、抗血清制备：

本实验以从Ni-NTA亲和柱纯化得到的高纯度CP蛋白和从凝胶上切胶回收的蛋白条带分别免疫大白兔。切胶条带用生理盐水适当稀释后，加入等体积福氏不完全佐剂乳化；蛋白液体(1mg/mL)直接与福氏不完全佐剂进行乳化。免疫大白兔采用肌肉注射结合皮下注射的方式，第一次免疫之后，分别于第21天、第35天和第49天加强免疫3次。最后一次注射免疫后7天开始少量静脉采血测定效价，根据效价情况分次大量取血。制备的抗血清加入0.02％的叠氮化钠，-20℃保存。

9、抗血清效价及特异性测定：

将抗血清进行一系列稀释后，用间接ELISA方法测定抗血清的效价和特异性。

(1).用包被液将抗原稀释成2ug/mL，100ul/孔加到96孔可拆酶标板中，4℃过夜。(2).PBS-T洗三次于吸水纸上拍干，加200ul/孔1％BSA，37℃恒温箱2小时。(3).取抗血清按照1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000，1∶32000，1∶64000，1∶128000作梯度稀释，每个样品不小于200ul。(4).取出37℃恒温箱里的抗原板，PBS-T洗三次于吸水纸上拍干，加步骤3中稀释好的抗血清样品100ul/孔，每个稀释度加并排两个孔。(5).取阴性血清1∶1000稀释按顺序加到抗血清最小浓度样品后作为阴性对照。置37℃恒温箱1小时。(也要重复2次)(6).PBS-T洗三次于吸水纸上拍干，羊抗兔酶标(辣根过氧化物酶)二抗按照使用说明稀释好，100ul/孔加到酶标板中，置37℃恒温箱1小时。(7).PBS-T洗五次于吸水纸上拍干，TMB显色液100ul/孔加到酶标板中，置37℃恒温箱10分钟。酶标仪450nm测OD值并打印结果。(8).通常将2.5倍阴性对照OD值看作阳性，根据结果判断样品滴度。(9).选择最适合的工作浓度，分别与TMV、PVX、PVY等病毒进行免疫反应，以测试该血清的特异性。

10、胶体金试纸条的制备

1)20～30nm胶体金颗粒的制备

取1％氯金酸0·6ml，加30ml超纯水加热煮沸。加1％柠檬酸钠0·9ml(37℃预温)，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3～5min，补水至原体积。冷却后，用0·2mol/L碳酸钾调pH至7·2～7·5。用0·22μm滤膜无菌注射器压滤。

2)胶体金-抗体结合物的制备

取1mg纯化的PPV病毒的抗体，边搅拌边注入到50ml胶体金溶液中，室温下搅拌1h。加10％牛血清白蛋白(BSA)2ml(终浓度为0·4％)，室温下搅拌5min。加10％聚乙二醇(PEG2000)1ml(终浓度为0·2％)，室温下搅拌5min。12000～15000r/min离心50min，沉淀溶于5ml保存液中。用0·45μm滤膜过滤。4℃冰箱保存。

3)胶体金-抗体结合物玻璃纤维素膜的制备

取3ml胶体金-抗体结合物，加3ml稀释液混匀。放入玻璃纤维素膜浸泡10min，取出置37℃烤箱中烤干，热合封口，置4℃冰箱备用。

4)抗体固相硝酸纤维素膜(NC)的制备

取PPV病毒的抗体用固相溶液稀释成3mg/ml。取羊抗兔抗体用固相溶液稀释成1mg/ml。取PPV抗体1μl，点样在硝酸纤维素膜上。将固相抗体硝酸纤维素膜置封闭液中，37℃水浴锅中孵育1h。取出固相抗体硝酸纤维素膜浸泡在洗涤液中洗2次，室温下风干，置4～8℃保存备用。

5)试纸条的组装

在双面胶白色塑料板25mm端内侧粘附抗体固相硝酸纤维素膜。在双面胶白色塑料板25mm端中间粘附金标抗体结合物-玻璃纤维素膜条带，并在其上面覆盖1条25mm宽的玻璃纤维素条与抗体固相NC膜重叠2mm，再粘附1层黄色胶带。在双面胶白色塑料板50mm端粘附32mm宽的吸水纸与抗体固相硝酸纤维素膜重叠2mm，并粘附1层胶带。用裁纸刀切成5mm宽的条带。

本发明中采用胶体金试纸条检测李痘病毒的方法：

1).制样：取0.1g样品加入PBST缓冲液(pH7.4)1ml研磨(1∶10)；

2).取样：低速离心后取300～400μl放入0.5ml离心管中；

3).测试：取出试纸条恢复至室温，将有胶体金复合物端插入300～400μl离心后的检测样品液中，10min左右判断结果。

4).结果判定：若试纸条仅质控点C(加羊抗兔抗体)出现粉红色点而测试点未显色，结果为阴性；若试纸条上质控点和检测点T(加PPV病毒抗体)均出现粉红色点，结果为阳性；若试纸条质控点和检测点都没有显色，则说明此试纸条已经失效，结果无效。

结果与分析

1、提取植物总RNA以及含CP基因片段的克隆：

以带病叶片总RNA为模板，经RT-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，得到长度约1000bp的DNA目的片段。扩增产物经纯化后克隆到

-T载体上，经蓝白斑筛选和酶切鉴定，对所获得的阳性克隆进行序列测定，确定了扩增产物的核苷酸序列，其中包含996bp的PPVCP序列，与GenBank报道的CP序列一致(NC 001445)。测序结果如下图1所示。

2、含CP基因原核表达载体的构建与测序验证：

应用特异性引物PPV-F1和PPV-R1所获得的CP基因PCR产物经双酶切后，连接到同样用BamH1和HindIII双酶切的表达质粒pET29a载体上，组建成表达重组载体pET29a-PPVCP。经ColonyPCR扩增，阳性克隆可以得到1000bp大小的条带，抽提质粒经BamH1和HindIII双酶切证明筛选出的阳性重组子正确(图2和图3)。再以序列测定最终验证阅读框架正确的重组质粒用以PPVCP基因的诱导表达。

3、CP基因的诱导表达产物SDS-PAGE分析：

将pET29a-PPVCP转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并进行IPTG诱导表达，SDS-PAGE后，考马斯亮蓝染色结果表明：转化pET29a-PPVCP的菌株经IPTG诱导，特异性的产生一分子量约为39kDa的蛋白条带，与预期大小相符。所挑取的4个独立菌落培养液经IPTG诱导后，都能产生PPVCP蛋白的特异性表达；在诱导30分钟后即有明显的诱导表达条带出现，60-90分钟后达到很高的水平(见图4)。4个独立菌落之间的蛋白表达水平略有差别，但在60分钟诱导后都达到很高的水平。

4、表达产物的纯化：

大量诱导的菌液经离心回收后，在变性条件用Ni-NTA纯化柱回收表达产物。变性条件下可以保证包涵体中的PPVCP蛋白得到最大限度的回收。洗脱收集液经SDS-PAGE分析，结果表明大多数的特异性表达CP蛋白得到纯化，而且纯度较高(图5)。将含CP蛋白纯度较高的洗脱液合并，并以尿素浓度梯度递减的50mMTris缓冲液(pH7.4)透析去除尿素，最终的PPVCP蛋白浓缩液用于直接免疫大白兔。作为对照，诱导菌液经SDS-PAGE电泳染色后，切下39kDa的表达蛋白条带作为直接免疫源。

5、抗血清的制备和效价及特异性测定：

将纯化得到的高纯度CP蛋白液以及切胶回收得到的CP蛋白分别免疫大白兔，获得了PPV的特异性抗血清。其中用纯化的CP蛋白制备的抗血清效价为3.2×10⁴，而用切胶方式回收的CP蛋白制备的抗血清效价为4×10³，经ELISA检测验证，该二种抗血清均与李坏死环斑病毒及健康的桃树、李树和樱桃叶片等李树植物没有血清学反应。根据目前市场价格，制备出的50mL抗血清经济价值超过一亿元，可检测样品1000多万份，不仅能够完全满足对中山市该病毒的检测的需求，也完全能够充分满足全国其他地区对该病毒检测的需求。本研究利用基因克隆的方法来制备PPV抗血清，完全避免了该病毒的扩散蔓延的风险，为口岸对该病毒检疫提供了一个物质保障。

6、胶体金试纸条的测试结果

6.1特异性测试

通过对烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯Y病毒、李坏死环斑病毒等的测定。仅质控点出现粉红色条带，结果呈阴性，没有出现交叉反应；而用李痘病毒测试时，质控点和测试点均出现粉红色条带，结果呈阳性反应；健康对照和缓冲液对照仅质控点出现粉红色条带，测试点未出现粉红色条带。说明这种检测方法特异性强，见图6。

3.6.2灵敏度检测

酶联检测粗提纯的PPV灵敏度为100ng/ml，检测病汁液可稀释1000倍；试纸条检测粗提纯的PPV灵敏度为1000ng/ml，检测病汁液可稀释100倍，见表1、图7。试纸条检测灵敏度没有酶联高，检测灵敏度低于ELISA一个数量级，但基本可满足常规初筛定性检测的需要。

表1.胶体金试纸条与酶联测试结果对比

3.6.3稳定性测试

试纸条在4℃冰箱干燥密封保存一个月后重新测试，结果同前。

Claims (6)

1.一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于按以下步骤制备：

A、从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA；

B、用RT-PCR的方法克隆李痘病毒的外壳蛋白基因，然后将其连接到原核表达载体pET29(a)上，得到pET29a-PPV重组载体，以序列测定最终验证阅读框架正确的重组质粒，用以李痘病毒外壳蛋白基因的诱导表达；将pET29a-PPV重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)；

C、用亲和柱法回收特异性表达蛋白，再免疫家兔，获得李痘病毒抗血清；

D、采用上述抗血清制备出检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条。

2.根据权利要求1所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤A中从李痘病毒感病材料中提取李痘病毒的RNA具体包括以下步骤：

(1)李痘病毒感病材料的幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成＜100mg小份至预冷E.P.管，100mg样品加入1mLTriZOL抽提；

(2)12000rpm，2-8℃离心10min；

(3)吸取上清液，转移至新的1.5mLE.P.管中，15-30℃放置5min；

(4)加0.2mL氯仿，充分抽提8min，15-30℃放置2-3min；

(5)12000rpm、2-8℃离心15min；

(6)吸取上清液，转移至新的1.5mLE.P.管中，加0.5mL异丙醇，15-30℃放置10min；

(7)12000rpm、2-8℃离心10min；

(8)弃去上清液，得胶体状RNA，加1-1.5mL75％乙醇，涡旋混匀；

(9)7500rpm、2-8℃离心5min，弃去上清，留下胶体状RNA；

(10)干燥5-10min；

(11)溶于RNase.free水中，枪头打匀，55-60℃温浴10min；

(12)5％Agarose胶检测，测定浓度并调至2-3μg/μL，-70℃储存备用。

3.根据权利要求1所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤B的具体方法包括：

a、RT-PCR扩增目的基因：

(1)引物

上游序列：PPV-F1：5’-CAGGATCCGCTGACGAAAGAGAAGAC-3’，其中GGATCC为BamHI酶切位点；

下游序列：PPV-R1：5’-TGAAGCTTCACTCCCCTCACACCGAG-3’，其中AAGCTT为HindIII酶切位点；

(2)扩增参数体系

模板RNA1μL

5μmol/L上游引物1μL

5μmol/L下游引物1μL

扩增酶混合液1μL

2×buffer12.5μL

RNase-freeddH₂O至总体积25μL

(3)扩增过程：

50℃30min，94℃3min，94℃1min，58℃30s，72℃1min，72℃10min，4℃；其中94℃1min，58℃30s，72℃1min，72℃10min循环35次；

b、基因克隆及序列测序：

(1)PCR产物的回收

取扩增产物在1％TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收；

(2)重组质粒的构建

采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒；具体步骤为：电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4μL回收产物，1μLpGEM18-T载体，5μL连接液，补充ddH₂O至总体积10μL；16℃下反应过夜；

(3)感受态细胞制备

于LB培养基平板上活化DH5α菌株，并挑取单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃下摇动培养过夜，形成种子菌液；取此5mL菌液，于100mLLB液体培养基，37℃摇动培养2～2.5hr，至OD₆₀₀＝0.6～0.8时，吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，冰浴5min，4℃下4000g离心10min，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂重悬浮菌体，冰浴30min，4℃下4000g离心10min，收集沉淀，加入100μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4℃冰箱中放置12～24hr备用；或加入70μL冰预冷的100mmol/LCaCl₂和30μL50％甘油于-70℃保存备用；

(4)重组质粒的转化及筛选

从-70℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10μL连接产物于100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42℃水浴中热激90sec，迅速将离心管冰浴3～5min；每管中加入800μLLB液体培养基，37℃下摇动培养90min；

采用抗生素和α-互补法筛选重组质粒：取100mLLB固体培养基加热融化，待冷却至60℃以下时，加入100μLAmp，混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4μLIPTG及40μLX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200μl转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37℃下倒置培养16～24hr；挑取直径约为1～2mm大小的白色菌落于5mLLB液体培养基中37℃下摇动培养12～16hr，标记后取0.7mL与0.3mL50％(v/v)的灭菌甘油混匀后，置-80℃下保存备用，其余菌液用于重组质粒抽提及鉴定；

(5)重组质粒的抽提

经抗生素及α-互补法筛选得到的待检菌落培养物于4℃冰箱内预冷5～10min，采用碱裂解法抽提质粒DNA；具体步骤如下：离心管标号，取含重组质粒的菌体液1.5mL至离心管中，4℃、12000g、离心1min，弃上清，重复加菌体液一次，离心后将管倒置于吸水纸上，待流尽余液后加入150μL溶液I，剧烈振荡，使菌体悬浮，室温放置5～10min，加入250μL溶液II，颠倒离心管数次，温和混匀，室温放置5min，加入180μL溶液III，盖紧离心管，温和颠倒离心管数次，使沉淀混匀，冰浴6～7min，4℃、12000g离心10min，上清液移入干净的离心管中，分别加入1/2体积的氯仿/异戊醇、Tris饱和苯酚，混匀，4℃、12000g离心5min，取上清，氯仿/异戊醇再抽提一次；上清水相移入干净离心管中，加入1/10体积NaAc，2倍体积无水乙醇，混匀后，-20℃冰箱中20min或过夜，4℃、12000g离心10min，弃上清，将管口打开倒置于吸水纸上，吸干余液，70％、100％乙醇各洗一次，室温下风干，加入20μLTE，-20℃冰箱中备用。

(6)重组质粒的鉴定

①、特异引物PCR鉴定

利用特异引物对待检重组质粒进行PCR扩增。反应体系程序参数同上，PCR产物在1％TBE琼脂糖凝胶上电泳鉴定；凡含有目的扩增片段的克隆，进一步进行酶切鉴定；

②、重组质粒酶切鉴定

经PCR鉴定阳性的重组质粒，以下列体系进行双酶切：10×HBuffer1.5μL，BamH10.5μL，HindIII0.5μL，待检质粒4μL，加ddH₂O至总体积15μL，37℃下反应过夜，取10μL反应液电泳检测酶切结果；

③、重组质粒序列测定

经上述PCR及酶切鉴定为阳性的克隆，扩繁菌体，抽提并纯化质粒后，利用通用测序引物对重组质粒进行序列测定；

c、PPVCP基因原核表达载体的构建：

以BamH1和HindIII分别双酶切PPVCP/

-T重组载体和表达质粒pET29(a)，将经双酶切的产物都以1％的琼脂糖凝胶进行电泳，并切胶回收纯化，纯化产物与双酶切载体进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α；用PCR和质粒酶切鉴定方法筛选出的阳性重组子后，再进行DNA测序，以验证阅读框的正确性；

d、CP基因诱导表达及SDS-PAGE分析：

将阅读框正确的重组子质粒pET29a-PPV转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接种于3mlLB的液体培养基中，37℃摇床中活化培养过夜后，按1∶100稀释到新鲜的LB培养基中，37℃，200rpm振动培养至OD600达到0.5-1.0，加入IPTG至终浓度1mM，继续于37℃培养；分别于不同的时间段取样，离心收集菌体，加适量TE溶液pH8.0，震荡悬浮，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸3min，13.5％的SDS-PAGE电泳分析PPVCP基因的蛋白表达情况；电泳结束后的聚丙烯酰胺凝胶用考马斯亮蓝R-250染色1h，室温摇床脱色3h；

e、表达产物的纯化：

根据预表达结果，选取高效表达菌株，以IPTG诱导大量表达，并离心收集菌体；菌体可于-20℃保存；称取适量菌体，以20mM磷酸缓冲液pH8.0悬浮，加入蛋白酶抑制剂CocktailsetIII和溶菌酶，冰上置30min，再加等体积的8M尿素磷酸缓冲液pH8.0，震荡混匀2min；于4℃，10000rpm离心10min，上清液以0.45μm过滤器抽滤后，上样Ni-NTA预装柱，然后进行纯化；

经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析，将含有洗脱纯化蛋白的收集液以含尿素浓度梯度递减的50mMTris缓冲液透析去除尿素，并以紫外分光光度计测定法测定回收蛋白的含量。

4.根据权利要求3所述的一种检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤C的具体方法：

以从Ni-NTA亲和柱纯化得到的高纯度CP蛋白和从凝胶上切胶回收的蛋白条带分别免疫大白兔；切胶条带用生理盐水适当稀释后，加入等体积福氏不完全佐剂乳化；蛋白液体1mg/mL直接与福氏不完全佐剂进行乳化；免疫大白兔采用肌肉注射结合皮下注射的方式，第一次免疫之后，分别于第21天、第35天和第49天加强免疫3次；最后一次注射免疫后7天开始少量静脉采血测定效价，根据效价情况分次大量取血；制备的抗血清加入0.02％的叠氮化钠，-20℃保存。

5.根据权利要求1所述的检测李痘病毒的胶体金免疫试纸条，其特征在于步骤D的具体方法：

(1)20～30nm胶体金颗粒的制备

取1％氯金酸0·6ml，加30ml超纯水加热煮沸；加1％柠檬酸钠0·9ml，快速一次加入，溶液由蓝逐渐变为紫红色，煮沸3～5min，补水至原体积。冷却后，用0·2mol/L碳酸钾调pH至7.2～7.5；用0·22μm滤膜无菌注射器压滤；

(2)胶体金-抗体结合物的制备

取1mg纯化的PPV病毒的抗体，边搅拌边注入到50ml胶体金溶液中，室温下搅拌1h；加10％牛血清白蛋白2ml，室温下搅拌5min；加10％聚乙二醇1ml，室温下搅拌5min；12000～15000r/min离心50min，沉淀溶于5ml保存液中；用0·45μm滤膜过滤，4℃冰箱保存；

(3)胶体金-抗体结合物玻璃纤维素膜的制备

取3ml胶体金-抗体结合物，加3ml稀释液混匀；放入玻璃纤维素膜浸泡10min，取出置37℃烤箱中烤干，热合封口，置4℃冰箱备用；

(4)抗体固相硝酸纤维素膜的制备

取PPV病毒的抗体用固相溶液稀释成3mg/ml；取羊抗兔抗体用固相溶液稀释成1mg/ml；取PPV抗体1μl，点样在硝酸纤维素膜上；将固相抗体硝酸纤维素膜置封闭液中，37℃水浴锅中孵育1h；取出固相抗体硝酸纤维素膜浸泡在洗涤液中洗2次，室温下风干，置4～8℃保存备用；

(5)试纸条的组装

在双面胶白色塑料板25mm端内侧粘附抗体固相硝酸纤维素膜；在双面胶白色塑料板25mm端中间粘附金标抗体结合物-玻璃纤维素膜条带，并在其上面覆盖1条25mm宽的玻璃纤维素条与抗体固相NC膜重叠2mm，再粘附1层黄色胶带；在双面胶白色塑料板50mm端粘附32mm宽的吸水纸与抗体固相硝酸纤维素膜重叠2mm，并粘附1层胶带；用裁纸刀切成5mm宽的条带。

6.采用权利要求1至5任一种胶体金免疫试纸条检测李痘病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1).制样：取0.1g样品加入PBST缓冲液pH7.4，1ml研磨1∶10；

2).取样：低速离心后取300～400μl放入0.5ml离心管中；

3).测试：取出胶体金免疫试纸条恢复至室温，将有胶体金复合物端插入300～400μl离心后的检测样品液中，10min判断结果。

Images