CN103045746A - Egfr基因突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片 - Google Patents
Egfr基因突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103045746A CN103045746A CN2012105920684A CN201210592068A CN103045746A CN 103045746 A CN103045746 A CN 103045746A CN 2012105920684 A CN2012105920684 A CN 2012105920684A CN 201210592068 A CN201210592068 A CN 201210592068A CN 103045746 A CN103045746 A CN 103045746A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detection
- phase chip
- exons
- gene mutation
- egfr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 206010071975 EGFR gene mutation Diseases 0.000 title abstract description 5
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 23
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 claims description 22
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 claims description 22
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 14
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 102220045950 rs587782511 Human genes 0.000 claims description 5
- 102200087330 rs74315344 Human genes 0.000 claims description 5
- 102200067134 rs79777494 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 claims description 4
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 102100024342 Contactin-2 Human genes 0.000 claims description 2
- 101000690440 Solanum lycopersicum Floral homeotic protein AGAMOUS Proteins 0.000 claims description 2
- 102220040198 rs587778227 Human genes 0.000 claims 2
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 abstract description 16
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 abstract description 16
- 150000004917 tyrosine kinase inhibitor derivatives Chemical class 0.000 abstract description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 7
- 101150039808 Egfr gene Proteins 0.000 abstract description 5
- 108700021358 erbB-1 Genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 abstract 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 23
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 6
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 229940121647 egfr inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 3
- 102200048928 rs121434568 Human genes 0.000 description 3
- 102220082093 rs376335216 Human genes 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005411 L01XE02 - Gefitinib Substances 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N gefitinib Chemical compound C=12C=C(OCCCN3CCOCC3)C(OC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=C(F)C(Cl)=C1 XGALLCVXEZPNRQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002584 gefitinib Drugs 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 239000011806 microball Substances 0.000 description 2
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N phenanthrene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 YNPNZTXNASCQKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 102200048955 rs121434569 Human genes 0.000 description 2
- 102200048796 rs28929495 Human genes 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- -1 2 μ l Substances 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035578 autophosphorylation Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011095 buffer preparation Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229960000935 dehydrated alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 238000011242 molecular targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 1
- 108010074858 plaferon Proteins 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 102200048929 rs121913444 Human genes 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于医学体外诊断技术，具体涉及EGFR基因上与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物疗效相关突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片。所述EGFR基因突变检测的液相芯片包括：PCR扩增引物、LDR连接探针和Anti-TAG序列包被的微球。所述扩增引物包括针对18、19、20和21号外显子的4对引物。所述连接探针包括针对与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物疗效相关的8个主要突变位点的8对连接探针。本发明提供的液相芯片可对8种EGFR基因突变进行联合检测，单次反应就能对8个突变位点同时进行准确分析，具有低价格并适用于大量样本平行检测的特点。
Description
技术领域
本发明属于医学体外诊断技术，具体涉及EGFR基因上与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物疗效相关突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片。
背景技术
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是细胞表面受体酪氨酸激酶HER/ErbB家族成员，它可以与配体特异性结合，通过同源或异源二聚体的形式使自身磷酸化，进而调控细胞的生长或存活。
以EGFR为靶点的分子靶向治疗目前在NSCLC的治疗中日渐突出，其中以EGFR酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI），如吉非替尼和俄罗替尼，最为重要。NSCLC的前期临床试验表明，在含铂类药物联合化疗失败后，吉非替尼仍有12％~18％的客观有效率，疾病控制率>40％左右，中位生存期约为7个月左右，且受试者的症状改善且安全性良好。然而，并非所有NSCLC患者都对EGFR-TKI敏感，其中EGFR突变人群反应率可达到75%-90%，中位生存期提高至12-23个月。因此，EGFR基因突变可以作为接受靶向治疗的NSCLC患者预后良好的分子标志，通过合理检测EGFR基因突变筛选EGFR-TKIs受益人群以优化EGFR-TKIs药物靶向治疗，对NSCLC患者意义重大。
与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物疗效相关的突变主要位于EGFR基因的18、19、20和21号外显子区域上，其中，19号外显子的缺失突变（747-750位点）和21号外显子的亮氨酸突变为精氨酸（L858R）占EGFR致敏突变的90%。
针对EGFR基因突变的检测方法多种多样，主要有DNA测序法、酶切法、富集突变的PCR法、实时荧光定量PCR法、高效液相色谱法和毛细管电泳法等。DNA测序法通过正反双向测序进行比较，是目前检测EGFR基因突变的金标准，但是该法需对测序样品进行扩增、纯化、序列分析，步骤多，反应耗时长，可能增加错误的概率。此外，DNA测序法还存在着操作繁琐，结果判读复杂，对环境和操作者要求较高等诸多缺点，因而仅适合少数技术装备精良的实验室开展，各级医院很少能独立开展。实时荧光定量PCR法虽然能在较短时间内实现对较多样本的检测，但是每次反应往往只能对一个或少数突变进行检测，无法实现高通量，此外也存在着假阴性的可能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是高通量高灵敏度检测EGFR基因突变体的方法，对预测患者使用吉菲替尼后的疗效进行评估，为了克服现有检测技术的不足，提供了一种EGFR基因突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片，该液相芯片可用于检测与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物疗效相关的八种常见突变，具体情况如表一所示。
表一
| 命名 | 突变 | 外显子 | 碱基变化 |
| 18M | G719C | 18 | 2155G>T |
| 19M1(1) | E746-A750del(1) | 19 | 2235_2249del15 |
| 19M1(2) | E746-A750del(2) | 19 | 2235_2250del15 |
| 19M2 | L747_T751＞S | 19 | 2240_2251del12 |
| 19M3 | L747_P753＞S | 19 | 2240_2257del18 |
| 20M | T790M | 20 | 2369C>T |
| 21M1 | L858R | 21 | 2573T>G |
| 21M2 | L8100Q | 21 | 2582T>A |
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：所述EGFR基因突变检测的液相芯片包括：
A)PCR扩增引物：用于扩增出具有18M、19M1(1)、19M1(2)、19M2、19M3、20M、21M1和/或21M2位点的扩增引物；
B)LDR连接探针：针对A)中扩增的位点分别设计的上游检测探针和下游连接探针，所述上游检测探针包括5’端的TAG序列和3’端的上游特异序列，所述下游连接探针为5’端进行磷酸化标记，3’端经荧光素标记的下游特异序列；
C)Anti-TAG序列包被的微球：分别包被有特异的Anti-TAG序列的，具有不同颜色编码的微球，所述Anti-TAG序列与B)中所选的TAG序列互补配对。
进一步，所述PCR扩增引物包括针对18外显子的P18U和P18L、针对19外显子的P19U和P19L、针对20外显子的P20U和P20L以及针对21外显子的P21U和P21L。
进一步，所述上游特异序列是针对18M的L18U、针对19M1(1)的L191(1)U、针对19M1(2)的L191(2)U、针对19M2的L192U、针对19M3的L193、针对20M的L790U、针对21M1的L211U和/或针对21M2的L212U。
进一步，所述下游特异序列是针对18M的L18L、针对19M1(1)的L191(1)L、针对19M1(2)的L191(2)L、针对19M2的L192L、针对19M3的L193L、针对20M的L790L、针对21M1的L211L和/或针对21M2的L212L。
进一步，所述TAG序列选自TAG1~TAG8。
进一步，所述荧光素为藻红蛋白。
本发明还提供了EGFR基因突变检测的PCR扩增引物，其包括针对18外显子的P18U和P18L、针对19外显子的P19U和P19L、针对20外显子的P20U和P20L以及针对21外显子的P21U和P21L。
上述4对引物对8个突变位点通过多聚酶链式反应（PCR）进行同时扩增，具体涉及突变位点的上下游共1500bp的区域。
本发明还提供了EGFR基因突变检测的LDR连接探针，所述LDR连接探针包括针对18M的L18U和L18L、针对19M1(1)的L191(1)U和L191(1)L、针对19M1(2)的L191(2)U和L191(2)L、针对19M2的L192U和L192L、针对19M3的L193U和L193L、针对20M的L790U和L790L、针对21M1的L211U和L211L和/或针对21M2的L212U和L212L。
本发明采用多重PCR扩增EGFR基因18、19、20、21号外显子中包含8种高频突变位点的特异片段，并以多重LDR对扩增片段中的突变进行特异性的探针连接，连接产物5’端上带有特异的标签（TAG）序列。基于液相芯片技术将连接产物和微球杂交液进行混合，其中，微球杂交液中包含多种荧光编码微球，每种荧光编码微球的表面都共价交联有寡核苷酸探针，杂交过程中探针特异性识别并结合连接产物上的标签（TAG）序列，与荧光素反应后形成微球-探针-连接产物-荧光素的复合物。经液相芯片分析仪监测时，可获取该复合物的微球编码及荧光信号，微球编码代表突变的种类，荧光信号代表突变的多少，最后由分析软件对检测结果进行判定。
本发明提供的液相芯片可对8种EGFR基因突变进行联合检测，单次反应就能对8个突变位点同时进行准确分析，具有低价格并适用于大量样本平行检测的特点，弥补荧光PCR技术样本检测通量低和测序技术检测灵敏度低的缺点。
具体实施方式
所用仪器及试剂
Lysis Buffer配制：100mM NaCl、10mM Tris pH7.5、25mM EDTA pH8.0、0.5%SDS溴乙淀、糖原、50%甘油、氯化钠、0.5%SDS、3N NaOH均为本实验室配制LB培养基：
胰蛋白胨5.0g酵母粉2.5g,氯化钠5.0g，加水至体积500ml，120℃湿热灭菌15分钟
TE配制：
Tris-HCl(1Mtris-HCl pH8.0)5ml，EDTA(0.5M EDTA pH8.0)1ml，加ddH2O定容至500ml
PCR扩增引物、LDR连接探针均由上海生工生物工程技术服务有限公司提供Anti-TAG序列包被的微球购于美国Luminex公司
实施例1EGFR基因突变检测的液相芯片，其包括：
一、PCR扩增引物
与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物疗效相关的突变主要位于EGFR基因的18、19、20和21号外显子区域上，针对相关区域设计了目标序列的引物，具体如表二所示：
表二PCR扩增引物序列
| 类型 | 引物序列（5’→3’） |
| 18外显子上游引物 | CCATGCACAACTTCCCTACC(P18U) |
| 18外显子下游引物 | ACAGCTTGCAAGGACTCTGG(P18L) |
| 19外显子上游引物 | CCCCAGCAATATCAGCCTTA(P19U) |
| 19外显子下游引物 | AGTGCTGGGTAGATGCCAGT(P19L) |
| 20外显子上游引物 | CTCTCCCACTGCATCTGTCA(P20U) |
| 20外显子下游引物 | CATATCCCCATGGCAAACTC(P20L) |
| 21外显子上游引物 | CCTCACAGCAGGGTCTTCTC(P21U) |
| 21外显子下游引物 | ATCCTGCAGGGAGAGACTGA(P21L) |
这些PCR扩增引物在设计时即用软件保证了其具有一致的理论退火温度，并且进行引物两两配对分析，挑选合适引物配成多重PCR引物体系，避免了引物间的相互交叉反应生成非特异扩增产物。
二、LDR连接探针:
针对与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）药物疗效相关的八个主要突变位点分别设计的上游检测探针和下游连接探针，所述上游检测探针包括5’端的TAG序列和3’端的上游特异序列，所述下游连接探针为5’端进行磷酸化标记（P），3’端藻红蛋白标记的下游特异序列。TAG序列、上游特异序列、下游特异序列具体如表三所示：
表三
这些LDR连接探针在设计时即用软件保证了其具有一致的理论退火温度，并且避免探针自身和探针间的非特异匹配，挑选合适连接探针配成多重LDR连接体系，避免了连接探针间的相互交叉反应生成非特异连接产物。
三、Anti-TAG序列包被的微球
分别包被有特异的Anti-TAG序列的，具有不同颜色编码的微球，所述Anti-TAG序列与所选的TAG序列互补配对，选择的8种微球编号与微球上相应的Anti-TAG序列如表四所示：
表四
| 突变 | 微球编号 | Anti-TAG序列（5’→3’） |
| 18M | 25# | TGATTTGAGTATTTGAGATTTTGA |
| 19M1(1) | 32# | GATTGATTATTGTGATTTGAATTG |
| 19M1(2) | 42# | TGTATTGAATGAATTGTTGATGTA |
| 19M2 | 43# | GTTAGTTAGATTATTGTTAGTTAG |
| 19M3 | 35# | GTATTTAGATGAGTTTGTTAGATT |
| 20M | 19# | GTTTGTATTTAGATGAATAGAAAG |
| 21M1 | 48# | AAAGTATAGTAAGATGTATAGTAG |
| 21M2 | 36# | TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG |
实施例2运用实施例1所述EGFR基因突变检测的液相芯片对样品的检测
一、样本的DNA提取
1)切下组织并剪成小块，置液氮中冻结，研磨或捣碎。
2)组织块50mg加入500μL含有蛋白酶K的裂解液中，颠倒混匀数次，充分裂解组织。
3)50度水浴消化过夜。
4)加100μL Buffer AP2，旋涡振荡10s，12000×g离心10min。
5)将制备管置于2mL离心管(试剂盒内提供)中，将步骤4中的滤液加入到制备管中，12000×g离心1min。
6)弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加700μL Buffer W1A，室温放置2min12000×g离心30s。
7)弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加800μL已加无水乙醇的BufferW2，12000×g离心1min。
8)将制备管置回到原2mL离心管中，加500μL Buffer W2到制备管中，12000×g离心1min。
9)弃滤液，将制备管置回原2mL离心管，12000×g离心1min。
10)将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管(试剂盒内提供)中，在制备管膜中央加60μL Buffer TE，室温静置1min。12000×g离心1min洗脱基因组DNA。
11)取2μL DNA溶于18μL TE，分光光度计上比色鉴定其浓度和纯度。
二、待测样品的PCR扩增
多重PCR反应体系为20μl，含10×Buffer 2μl，Mg2+（25mmol/L）1.2μl，dNTPs（2.5mmol/L）2μl，HotSarTaq DNA聚合酶1U，5×Q-solution4μl，PCR扩增引物预混液（共4对8条，每条各为1μmol/L）2μl，基因组DNA模版2μl（5~10ng），补ddH2O至20μl。
多重PCR扩增程序为：
第一阶段（酶热启过程）：95℃10分钟，1个循环；
第二阶段（扩增循环过程）：95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，35个循环；
第三阶段（最后延伸过程）：72℃10分钟，1个循环；
第四阶段（聚合酶变性失活过程）：99℃30分钟，1个循环，4℃保存。
三、PCR产物的LDR检测
在20μl PCR反应产物中直接补加20μl LDR反应体系。
LDR反应体系为含10×Ligase Buffer 2μl、LDR连接探针预混液（共8对16条，每条各为1μmol/L）4μl，Taq Ligase连接酶16U，补ddH2O至20μl。LDR反应程序为：
第一阶段（预变性）：95℃5分钟，1个循环；
第二阶段（连接循环过程）：95℃30秒，62℃30秒，30个循环，4℃保存。
LDR反应使配对的上游检测探针和下游连接探针连接起来，使反应产物上游带上标签序列，下游带上荧光素标记
四、PCR-LDR反应产物的杂交反应
杂交体系为微球杂交反应缓冲液22μl和3μl PCR-LDR反应产物组成。微球杂交反应缓冲液包括Anti-TAG序列包被的微球TE悬浮液（共8种微球，每种微球各为浓度均为2000/22ul）、1.5×TMAC/16.7ul和TE。
杂交反应程序为：
PCR扩增仪上，45℃孵育10min，加入75ulSA-PE（4pg/ul），再置于PCR扩增仪上孵育15min，然后上luminex200多功能流式点阵仪读数，获取的微球编码信号代表突变的种类，分析8种突变对应的编码微球的荧光信号，每种编码微球分析100个后取中位数作为其荧光信号的检测结果，荧光信号代表突变的多少。
如果上下游连接探针连接，则PCR-LDR产物和微球上的互补标签探针配对，则微球上相应探针捕获到标有藻红蛋白的产物。如果上下游连接探针未连接，只有上游LDR连接探针才会与互补标签探针配对，则对应微球的荧光信号为背景信号。
实施例3
采用实施例2的样品检测方法进行液相芯片的性能评估
突变型参比品的来源：参考突变基因位点的上下游序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司按基因片段合成的方式合成，并插入工程质粒载体中制备得到。
野生型基因组的来源：利用市售的基因组纯化试剂盒抽提健康人的抗凝血制备而得，并测序验证相关突变位点均无突变发生。
主要性能指标如下：
灵敏度：8种突变型的参比品混合野生型正常人类基因组（突变基因：野生型人基因组=2000:10000（copies））作为检测样品，液相芯片对野生型基因组背景中低至10%-20%的EGFR基因突变DNA能够检出。
灵敏度实验数据见表五（第一列代表参比品的突变的类型，第一行代表微球编码信号代表突变的类型）：
表五
| 18M | 19M1(1) | 19M1(2) | 19M2 | 19M3 | 20M | 21M1 | 21M2 | |
| 18M | 560 | 66 | 47 | 62 | 55 | 75 | 59 | 48 |
| 18M | 639 | 71 | 56 | 60 | 79 | 61 | 58 | 65 |
| 19M1(1) | 122 | 508 | 66 | 56 | 71 | 65 | 56 | 48 |
| 19M1(1) | 123 | 611 | 51 | 70 | 61 | 80 | 74 | 87 |
| 19M1(2) | 106 | 64 | 625 | 60 | 54 | 47 | 54 | 84 |
| 19M1(2) | 108 | 63 | 519 | 60 | 58 | 66 | 77 | 63 |
| 19M2 | 117 | 67 | 73 | 679 | 54 | 92 | 80 | 62 |
| 19M2 | 105 | 65 | 67 | 741 | 47 | 84 | 81 | 77 |
| 19M3 | 130 | 66 | 68 | 59 | 558 | 59 | 58 | 46 |
| 19M3 | 96 | 75 | 61 | 62 | 531 | 79 | 75 | 65 |
| 20M | 90 | 63 | 48 | 59 | 65 | 812 | 74 | 46 |
| 20M | 87 | 73 | 69 | 52 | 60 | 798 | 62 | 59 |
| 21M1 | 96 | 43 | 60 | 44 | 60 | 73 | 640 | 59 |
| 21M1 | 117 | 67 | 65 | 53 | 73 | 67 | 580 | 67 |
| 21M2 | 89 | 58 | 67 | 73 | 70 | 120 | 47 | 512 |
| 21M2 | 108 | 70 | 65 | 69 | 53 | 68 | 65 | 376 |
特异性：1.阳性参照品符合率：8种突变型的参比品混合野生型正常人类基因组(突变基因：野生型人基因组=10000:10000（copies）)作为检测样品，液相芯片对8组检测样品进行3次平行检测，结果均为阳性。2.阴性参照品符合率：液相芯片对正常人类基因组作为检测样品进行3次平行检测，结果均为阴性。
特异性实验数据见表六（第一列代表参比品的突变的类型，第一行代表微球编码信号代表突变的类型）：
表六
| 18M | 19M1(1) | 19M1(2) | 19M2 | 19M3 | 20M | 21M1 | 21M2 | |
| 18M | 1745 | 51 | 50.5 | 57 | 51 | 67 | 54 | 40.5 |
| 18M | 1844 | 53.5 | 46.5 | 39 | 56 | 50 | 45 | 27 |
| 18M | 1968.5 | 62 | 47 | 53 | 43 | 43.5 | 50 | 61.5 |
| 19M1(1) | 89.5 | 1674 | 36 | 52 | 50 | 62 | 50 | 37.5 |
| 19M1(1) | 84 | 1720.5 | 59 | 42 | 64.5 | 58.5 | 55.5 | 44 |
| 19M1(1) | 89 | 1694 | 52 | 57 | 44 | 34 | 56 | 51 |
| 19M1(2) | 73.5 | 53 | 1850 | 57 | 54 | 46.5 | 57 | 36 |
| 19M1(2) | 65 | 50 | 1828.5 | 70 | 47 | 75 | 52 | 51.5 |
| 19M1(2) | 84 | 63 | 1732.5 | 54 | 41.5 | 58 | 58 | 29 |
| 19M2 | 77.5 | 53.5 | 41 | 1779.5 | 55 | 46 | 42 | 40 |
| 19M2 | 81 | 53 | 68 | 1714 | 44 | 62.5 | 61 | 45 |
| 19M2 | 83 | 47 | 57 | 1761.5 | 36 | 65 | 35 | 46 |
| 19M3 | 87 | 54 | 47 | 73 | 1442 | 57.5 | 45 | 54 |
| 19M3 | 79 | 54.5 | 54.5 | 42 | 1566.5 | 54 | 65 | 65 |
| 19M3 | 94 | 28.5 | 45.5 | 52 | 1539 | 53 | 63.5 | 37.5 |
| 20M | 80.5 | 55 | 46 | 43.5 | 41.5 | 2013 | 52 | 57 |
| 20M | 57 | 49 | 43 | 38 | 24 | 1863 | 42 | 57 |
| 20M | 78.5 | 53 | 50 | 53.5 | 45 | 2077 | 34 | 51 |
| 21M1 | 79.5 | 32 | 37.5 | 64 | 55 | 47 | 1765 | 52.5 |
| 21M1 | 89.5 | 32 | 48 | 67 | 43.5 | 46.5 | 1866 | 38 |
| 21M1 | 72 | 60 | 41 | 27 | 27 | 44 | 1589.5 | 49 |
| 21M2 | 104 | 39.5 | 67 | 47 | 38 | 62 | 39 | 1495 |
| 21M2 | 106 | 46.5 | 32 | 46.5 | 44.5 | 54 | 37 | 1282 |
| 21M2 | 99.5 | 47 | 34.5 | 66 | 47 | 55 | 52 | 1236 |
重复性：8种突变型参比品混合野生型正常人类基因组(突变基因：野生型人基因组=10000:10000（copies）)作为检测样品，液相芯片分别对8组样品进行10次检测，结果一致且准确。
重复性实验数据见表七（第一列代表参比品的突变的类型，第一行代表微球编码信号代表突变的类型）：
表七
| 18M | 19M1(1) | 19M1(2) | 19M2 | 19M3 | 20M | 21M1 | 21M2 | |
| 18M | 1564 | 43 | 57.5 | 59 | 51 | 45 | 75.5 | 38.5 |
| 18M | 1860 | 58 | 63 | 55 | 61 | 61 | 57.5 | 33 |
| 18M | 1906 | 60 | 37 | 45 | 54 | 43.5 | 56 | 44 |
| 18M | 1745 | 51 | 50.5 | 57 | 51 | 67 | 54 | 40.5 |
| 18M | 1844 | 53.5 | 46.5 | 39 | 56 | 50 | 45 | 27 |
| 18M | 1968.5 | 62 | 47 | 53 | 43 | 43.5 | 50 | 61.5 |
| 18M | 1946 | 55 | 47 | 66 | 38 | 59.5 | 56 | 42 |
| 18M | 1868.5 | 48 | 51 | 48 | 30 | 67 | 54 | 31 |
| 18M | 1820 | 71.5 | 47.5 | 57 | 48 | 57.5 | 50 | 47.5 |
| 18M | 1904.5 | 42 | 38 | 40.5 | 43.5 | 45 | 65 | 33 |
| 19M1(1) | 97.5 | 1668.5 | 51.5 | 45.5 | 29 | 61 | 51 | 47 |
| 19M1(1) | 75 | 1610 | 65 | 32.5 | 42.5 | 57 | 38 | 46 |
| 19M1(1) | 62.5 | 1710.5 | 63 | 60.5 | 56 | 47.5 | 47 | 62 |
| 19M1(1) | 89.5 | 1674 | 36 | 52 | 50 | 62 | 50 | 37.5 |
| 19M1(1) | 84 | 1720.5 | 59 | 42 | 64.5 | 58.5 | 55.5 | 44 |
| 19M1(1) | 89 | 1694 | 52 | 57 | 44 | 34 | 56 | 51 |
| 19M1(1) | 85.5 | 1608 | 39 | 22 | 43 | 43 | 40 | 62 |
| 19M1(1) | 69 | 1756 | 37 | 57.5 | 37.5 | 61 | 54.5 | 62 |
| 19M1(1) | 81 | 1697 | 57 | 71.5 | 44 | 43 | 66.5 | 49 |
| 19M1(1) | 70 | 1649.5 | 64.5 | 58 | 32 | 42 | 39.5 | 37 |
| 19M1(2) | 64 | 59 | 1683 | 46 | 48 | 48 | 48 | 38.5 |
| 19M1(2) | 88 | 46 | 1841.5 | 59 | 48 | 41 | 51 | 33 |
| 19M1(2) | 76 | 64 | 1815.5 | 64 | 53 | 56 | 63.5 | 50 |
| 19M1(2) | 73.5 | 53 | 1850 | 57 | 54 | 46.5 | 57 | 36 |
| 19M1(2) | 65 | 50 | 1828.5 | 70 | 47 | 75 | 52 | 51.5 |
| 19M1(2) | 84 | 63 | 1732.5 | 54 | 41.5 | 58 | 58 | 29 |
| 19M1(2) | 62 | 59 | 1726 | 62 | 525 | 60.5 | 47 | 52.5 |
| 19M1(2) | 88 | 36 | 1702 | 60 | 48.5 | 61 | 52 | 39 |
| 19M1(2) | 83 | 67 | 1740 | 29 | 53 | 55 | 40 | 34.5 |
| 19M1(2) | 79.5 | 65.5 | 1836.5 | 49.5 | 53 | 54 | 45 | 61 |
| 19M2 | 103 | 43 | 70 | 1958.5 | 36.5 | 57.5 | 56.5 | 61 |
| 19M2 | 85 | 49 | 68 | 1909 | 42 | 76.5 | 49 | 44 |
| 19M2 | 72 | 48 | 39.5 | 1752 | 71 | 56.5 | 53 | 52 |
| 19M2 | 77.5 | 53.5 | 41 | 1779.5 | 55 | 46 | 42 | 40 |
| 19M2 | 81 | 53 | 68 | 1714 | 44 | 62.5 | 61 | 45 |
| 19M2 | 83 | 47 | 57 | 1761.5 | 36 | 65 | 35 | 46 |
| 19M2 | 83 | 29 | 64.5 | 1729.5 | 43.5 | 54 | 64.5 | 51 |
| 19M2 | 69 | 60 | 45 | 1753 | 41 | 46 | 53.5 | 45.5 |
| 19M2 | 83 | 53 | 50 | 1870.5 | 30 | 60 | 43.5 | 30 |
| 19M2 | 80 | 42 | 42 | 1955 | 59 | 31 | 33 | 41 |
| 19M3 | 85 | 11 | 37 | 59 | 1521 | 55.5 | 32.5 | 34.5 |
| 19M3 | 66 | 45.5 | 51.5 | 56 | 1446 | 48 | 44 | 15 |
| 19M3 | 93 | 56 | 48.5 | 38 | 1496 | 48.5 | 38 | 46.5 |
| 19M3 | 87 | 54 | 47 | 73 | 1442 | 57.5 | 45 | 54 |
| 19M3 | 79 | 54.5 | 54.5 | 42 | 1566.5 | 54 | 65 | 65 |
| 19M3 | 94 | 28.5 | 45.5 | 52 | 1539 | 53 | 63.5 | 37.5 |
| 19M3 | 80 | 50 | 36 | 51 | 1547 | 56 | 50 | 50 |
| 19M3 | 66 | 40 | 53 | 40 | 1668 | 52 | 47 | 34 |
| 19M3 | 76 | 31 | 41 | 42.5 | 1621 | 25 | 57.5 | 30 |
| 19M3 | 83 | 58.5 | 42 | 44 | 1678 | 50 | 36.5 | 46 |
| 20M | 89.5 | 65 | 39 | 36.5 | 68.5 | 1995 | 47 | 50 |
| 20M | 81 | 37 | 43 | 49.5 | 71 | 1953 | 24 | 55.5 |
| 20M | 65.5 | 49.5 | 54 | 37 | 63 | 1985 | 50 | 47 |
| 20M | 80.5 | 55 | 46 | 43.5 | 41.5 | 2013 | 52 | 57 |
| 20M | 57 | 49 | 43 | 38 | 24 | 1863 | 42 | 57 |
| 20M | 78.5 | 53 | 50 | 53.5 | 45 | 2077 | 34 | 51 |
| 20M | 82 | 59.5 | 35.5 | 33.5 | 66 | 2310 | 43 | 26 |
| 20M | 86 | 47 | 46.5 | 69 | 40 | 2209 | 24.5 | 31 |
| 20M | 92 | 52.5 | 56 | 42 | 54 | 2082.5 | 38.5 | 53 |
| 20M | 91 | 44 | 48 | 44 | 67 | 1995 | 46.5 | 48 |
| 21M1 | 69 | 81 | 66 | 47.5 | 27 | 43 | 1578 | 35 |
| 21M1 | 108 | 56 | 51.5 | 40 | 49 | 61 | 1547 | 28 |
| 21M1 | 79.5 | 53 | 62 | 44.5 | 47 | 57 | 1655.5 | 51.5 |
| 21M1 | 79.5 | 32 | 37.5 | 64 | 55 | 47 | 1765 | 52.5 |
| 21M1 | 89.5 | 32 | 48 | 67 | 43.5 | 46.5 | 1866 | 38 |
| 21M1 | 72 | 60 | 41 | 27 | 27 | 44 | 1589.5 | 49 |
| 21M1 | 96 | 45 | 52 | 50 | 54 | 62.5 | 1654 | 41 |
| 21M1 | 92 | 48 | 34 | 49 | 25 | 65 | 1543.5 | 51.5 |
| 21M1 | 98 | 47.5 | 58.5 | 38 | 32 | 53.5 | 1472 | 51 |
| 21M1 | 109 | 58.5 | 43 | 59 | 41 | 79.5 | 1629.5 | 46 |
| 21M2 | 92.5 | 48 | 38 | 30.5 | 50 | 54 | 66 | 1360 |
| 21M2 | 114 | 47 | 50 | 44 | 57 | 29 | 50 | 1421 |
| 21M2 | 89.5 | 26 | 53.5 | 33 | 53.5 | 42 | 53.5 | 1427 |
| 21M2 | 104 | 39.5 | 67 | 47 | 38 | 62 | 39 | 1495 |
| 21M2 | 106 | 46.5 | 32 | 46.5 | 44.5 | 54 | 37 | 1282 |
| 21M2 | 99.5 | 47 | 34.5 | 66 | 47 | 55 | 52 | 1236 |
| 21M2 | 121 | 41 | 36.5 | 51.5 | 54 | 49 | 47 | 1257 |
| 21M2 | 100 | 65 | 41 | 41 | 45 | 50.5 | 33 | 1218.5 |
| 21M2 | 114 | 40 | 32 | 54.5 | 33 | 40.5 | 26 | 1274 |
| 21M2 | 106 | 35.5 | 56 | 49 | 42 | 46 | 52 | 1369 |
稳定性：将液相芯片组份置37℃三天，上述性能未改变。
Claims (7)
1.一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，包括：
A)PCR扩增引物：用于扩增出具有18M、19M1(1)、19M1(2)、19M2、19M3、20M、21M1和/或21M2位点的扩增引物；
B)LDR连接探针：针对A)中扩增的位点分别设计的上游检测探针和下游连接探针，所述上游检测探针包括5’端的TAG序列和3’端的上游特异序列，所述下游连接探针为5’端进行磷酸化标记，3’端经荧光素标记的下游特异序列；
C)Anti-TAG序列包被的微球：分别包被有特异的Anti-TAG序列的，具有不同颜色编码的微球，所述Anti-TAG序列与B)中所选的TAG序列互补配对。
2.根据权利要求1所述一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，所述PCR扩增引物包括针对18外显子的P18U和P18L、针对19外显子的P19U和P19L、针对20外显子的P20U和P20L以及针对21外显子的P21U和P21L。
3.根据权利要求1所述一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，所述上游特异序列是针对18M的L18U、针对19M1(1)的L191(1)U、针对19M1(2)的L191(2)U、针对19M2的L192U、针对19M3的L193、针对20M的L790U、针对21M1的L211U和/或针对21M2的L212U，所述下游特异序列是针对18M的L18L、针对19M1(1)的L191(1)L、针对19M1(2)的L191(2)L、针对19M2的L192L、针对19M3的L193L、针对20M的L790L、针对21M1的L211L和/或针对21M2的L212L。
4.根据权利要求1所述一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，所述TAG序列选自TAG1~TAG8。
5.根据权利要求1所述一种EGFR基因突变检测的液相芯片，其特征在于，所述荧光素为藻红蛋白。
6.一种EGFR基因突变检测的PCR扩增引物，其特征在于，包括针对18外显子的P18U和P18L、针对19外显子的P19U和P19L、针对20外显子的P20U和P20L以及针对21外显子的P21U和P21L。
7.一种EGFR基因突变检测的LDR连接探针，其特征在于，包括针对18M的L18U和L18L、针对19M1(1)的L191(1)U和L191(1)L、针对19M1(2)的L191(2)U和L191(2)L、针对19M2的L192U和L192L、针对19M3的L193U和L193L、针对20M的L790U和L790L、针对21M1的L211U和L211L和/或针对21M2的L212U和L212L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012105920684A CN103045746A (zh) | 2012-12-31 | 2012-12-31 | Egfr基因突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2012105920684A CN103045746A (zh) | 2012-12-31 | 2012-12-31 | Egfr基因突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103045746A true CN103045746A (zh) | 2013-04-17 |
Family
ID=48058606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2012105920684A Pending CN103045746A (zh) | 2012-12-31 | 2012-12-31 | Egfr基因突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103045746A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109097470A (zh) * | 2018-08-17 | 2018-12-28 | 上海迈景纳米科技有限公司 | 一种基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005085473A2 (en) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | University Of Chicago | Polymorphisms in the epidermal growth factor receptor gene promoter |
| CN101041850A (zh) * | 2006-03-20 | 2007-09-26 | 吕成伟 | 一种人类表皮生长因子受体（egfr）基因外显子20的t790m突变快速检测方法和试剂盒 |
| CN101445829A (zh) * | 2008-04-23 | 2009-06-03 | 广州益善生物技术有限公司 | Egfr基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法 |
| CN102181536A (zh) * | 2011-03-22 | 2011-09-14 | 宁波基内生物技术有限公司 | 用于检测人类egfr基因19号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法 |
-
2012
- 2012-12-31 CN CN2012105920684A patent/CN103045746A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005085473A2 (en) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | University Of Chicago | Polymorphisms in the epidermal growth factor receptor gene promoter |
| CN101041850A (zh) * | 2006-03-20 | 2007-09-26 | 吕成伟 | 一种人类表皮生长因子受体（egfr）基因外显子20的t790m突变快速检测方法和试剂盒 |
| CN101445829A (zh) * | 2008-04-23 | 2009-06-03 | 广州益善生物技术有限公司 | Egfr基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法 |
| CN102181536A (zh) * | 2011-03-22 | 2011-09-14 | 宁波基内生物技术有限公司 | 用于检测人类egfr基因19号外显子突变的引物组合物、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 娄加陶等: "基于悬浮点阵技术的新型EGFR基因突变检测方法的建立和应用", 《上海交通大学学报(医学版)》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109097470A (zh) * | 2018-08-17 | 2018-12-28 | 上海迈景纳米科技有限公司 | 一种基于荧光编码微球的egfr突变基因检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101781684B (zh) | Cyp19a1基因snp检测液相芯片及检测方法 | |
| CN101381779B (zh) | kRas基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 | |
| CN101445832B (zh) | Pik3ca基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 | |
| KR20080080525A (ko) | 유전자 전사에 대한 ｆｇｆｒ３의 억제제의 효과 | |
| CN110904225A (zh) | 用于肝癌检测的组合标志物及其应用 | |
| CN101984070A (zh) | 一种c-KIT基因突变检测液相芯片 | |
| CN110117653A (zh) | 肺癌突变位点的突变率的检测方法及试剂盒 | |
| CN104561250A (zh) | 伊马替尼靶向用药基因的检测方法及其引物 | |
| CA2624613A1 (en) | Method to predict or monitor the response of a patient to an erbb receptor drug | |
| CN102220413B (zh) | 检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变和外显子21点突变的方法 | |
| CN106755450A (zh) | 应用数字pcr检测结直肠癌患者尿液中egfr基因突变的方法 | |
| CN102776286A (zh) | 用于检测ros1基因融合突变的引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN101445829B (zh) | Egfr基因突变位点的检测探针、液相芯片及其检测方法 | |
| CN102443626A (zh) | 肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒 | |
| CN101984072B (zh) | 一种pdgfra基因突变检测液相芯片 | |
| CN109182529A (zh) | 检测egfr基因t790m、c797s及l798i位点的特异性探针及试剂盒 | |
| CN102021228B (zh) | 用于组织或全血egfr基因突变检测的特异性引物 | |
| CN113122629B (zh) | 用于基因突变检测的发夹式扩增阻断法的引物和探针及其应用 | |
| CN103045746A (zh) | Egfr基因突变检测的扩增引物、检测探针和液相芯片 | |
| CN101586153A (zh) | 预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒 | |
| CN102994617A (zh) | 一种hras基因突变检测特异性引物和液相芯片 | |
| CN102021240B (zh) | 一种gstm1、gstt1和gstp1基因突变检测液相芯片 | |
| CN104498616A (zh) | 一种人egfr基因突变荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN101463390B (zh) | Egfr基因外显子20突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 | |
| CN101586154A (zh) | 预测表皮生长因子受体抑制剂疗效的试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130417 |