CN103041401A

CN103041401A - 靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法

Info

Publication number: CN103041401A
Application number: CN2012105505395A
Authority: CN
Inventors: 李云龙; 周红华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2013-04-17

Abstract

本发明公开了一种靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法，其特征是：药物分子中含有白蛋白分子、抗人膀胱癌单克隆抗体（BDI-1）和丝裂霉素(MMC)，其合成方法是用戊二醛为交联固化剂，把丝裂霉素分子与牛血白蛋白分子结合，制成粒径为280～350纳米的白蛋白载丝裂霉素（MMC-NS）纳米微球，然后用异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-3-（2-毗啶基二琉）丙酸酯（SPDP）使白蛋白载丝裂霉素分子连接上吡啶二硫基基团（PDP），得到MMC-NS-PDP分子，最后MMC-NS-PDP与BDI-1-SH分子反应，得到分子中含有抗人膀胱癌抗体、白蛋白分子和丝裂霉素的药物，即靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物，英文缩写为BDI-1-MMC-NS。本发明的药物对膀胱癌有很强的靶向性，对膀胱癌的杀伤力强，而对正常组织细胞作用较小。

Description

靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法，具体说是一种分子中含有抗人膀胱癌单克隆抗体、白蛋白和丝裂霉素的药物及其制备方法。

背景技术

膀胱癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的生命和健康，其中90%以上是尿路上皮癌（移行）细胞癌（transitional cell carcinoma, TCC），其中约10%最终发展为肌层浸润性或转移性膀胱癌，远期疗效不佳，由于其较高的发病率及复发率，膀胱灌注化疗对于非肌层浸润性膀胱是主要治疗方法之一。目前膀胱灌注化疗药物有丝裂霉素（简称MMC）、喜树碱、吡柔吡星、表柔比星及柔红霉素等多种。膀胱癌高复发率原因之一是对抗癌药物耐药性的产生，体外实验证实这些药物对癌细胞有明显杀伤作用，但由于其选择性太差，在杀伤癌细胞的同时也杀伤大量的正常细胞，且其有效剂量与毒性剂量往往很接近，容易出现并发症，影响病人的生活质量，如何实现化疗药物对肿瘤细胞的特异性杀伤成为提高药物治疗效果的可能途径。靶向药物的出现，大大降低了药物的副作用。所谓靶向药物治疗就是使药物瞄准肿瘤部位，在局部保存相对高的浓度，延长药物的时间，提高对肿瘤的杀伤力，而对正常组织细胞作用较小。

丝裂霉素是从头状链霉菌培养液中分离提取的一种广谱抗肿瘤抗生素，对多种癌症有抗癌作用，其作用原理可使细胞的DNA解聚，同时阻碍DNA的复制，从而抑制肿瘤细胞分裂。丝裂霉素为细胞周期非特异性药物，其抗肿瘤谱较广，作用迅速，但治疗指数不高，毒性较大。因此通过对丝裂霉素进行改性，制成靶向药物来降低它的副作用，成为研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法，通过乳化热固化法用戊二醛为交联固化剂，把丝裂霉素分子载在白蛋白分子上，制备成280～350nm白蛋白载丝裂霉素（MMC-NS）纳米微球，然后用异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-3-（2-毗啶基二琉）丙酸酯（SPDP）使白蛋白载丝裂霉素分子连接上吡啶二硫基基团，得到MMC-NS-PDP分子，最后MMC-NS-PDP与BDI-1-SH分子反应，得到具有靶向性和缓释功能的抗膀胱癌药物，本发明的抗膀胱癌药物对膀胱癌有特异靶向性，降低了丝裂霉素的副作用，药物对肿瘤细胞杀伤力强，药效持久，且对正常组织细胞作用小。

本发明的技术方案如下：

靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物及其制备方法，其特征是：药物分子中含有白蛋白分子、抗人膀胱癌单克隆抗体（BDI-1）和丝裂霉素（MMC），合成方法是用戊二醛为交联固化剂，把丝裂霉素分子与牛血白蛋白分子结合，制成粒径为280～350纳米的白蛋白载丝裂霉素（MMC-NS）纳米微球，然后用异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-3-（2-毗啶基二琉）丙酸酯使白蛋白载丝裂霉素分子连接上吡啶二硫基基团，得到MMC-NS-PDP分子，最后MMC-NS-PDP与BDI-1-SH分子反应，得到分子中含有抗人膀胱癌单克隆抗体、白蛋白分子和丝裂霉素的药物，即靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物，英文缩写为BDI-1-MMC-NS。

所述的白蛋白载丝裂霉素（MMC-NS）纳米微球的制备方法为：

（a1）用生理盐水溶解牛血白蛋白，配置成每毫升含0.15～0.25g的牛血白蛋白溶液，用牛血白蛋白溶液溶解丝裂霉素，配置成每毫升含0.06～0.10mgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；

（a2）按照体积比，环己烷：乳化剂：MMC牛血白蛋白溶液为100:3.0～4.0:0.5，把物料放入反应器中，用搅拌器搅拌均匀；用功率为200～400W的超声波乳化15min，加入戊二醛饱和甲苯溶液，加入量按照环己烷的体积计算，环己烷：戊二醛饱和甲苯溶液为100:2，在20～40℃下搅拌反应2h，反应完成后把反应器内的所有物料放入离心机，在2000～4000r/min的转速下离心2min，弃去沉积的大微球，然后在500～800r/min转速下离心 3min，得到所需要的纳米微球，用环己烷洗涤纳米微球，洗涤后的纳米微球加入丙酮和乙醇胺，常温搅拌1h，过滤，所得固体用异丙醇洗涤，再用丙酮洗涤，最后用冻干机冻干，得到MMC-NS冻干粉，粒径为280～350nm。

所述的MMC-NS-PDP的制备方法为：

（b1）用0.01mol/L的无菌PBS缓冲溶液(即磷酸盐缓冲溶液)溶解MMC-NS，使每毫升含MMC-NS 2～3mg，与SPDP无水乙醇溶液混合，常温搅拌反应30min，投料摩尔比为SPDP:MMC-NS=20:1；用离心机离心，得到沉淀；

（b2）用0.01mol/L的无菌PBS缓冲溶液与沉淀混合均匀，用离心机离心，得到沉淀；

（b3）重复步骤（b2）三次，以除去多余的SPDP，得到纯净的MMC-NS-PDP，用0.02 mol／L无菌 PBS缓冲液溶解，配置成2.5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液。

所述的BDI-1-SH为BDI-1与SPDP反应，BDI-1分子引入吡啶二硫基（PDP），得到BDI-1-PDP，然后用二硫苏糖醇（DTT）还原得到巯基，即为BDI-1-SH。

所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物（BDI-1-MMC-NS）的其制备方法，步骤为：用0.02 mol／L无菌 PBS缓冲液溶解BDI-1-SH，配置成每毫升含1mg的BDI-1-SH，等体积加入b3步骤得到的2.5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液，在4～10℃下搅拌16～20h，然后在10000～15000r/min下离心30s～15min，取沉淀用0.02 mol／L无菌PBS离心洗涤3～4次，得到的沉淀物即为BDI-1-MMC-NS。

所述的乳化剂为span40、span60、span80、span83和span85中的一种或它们的组合物。

本发明的优点是：

1.本发明采用乳化热好固化法，同时使用超声乳化技术，得到的白蛋白载丝裂霉素粒径为280～350nm，纳米微球大小均匀，分散性好，表面光滑，对药物的靶向特异性有非常积极的作用。

2.本发明通过丝裂霉素与白蛋白偶联固化，把丝裂霉素载在白蛋白上，使丝裂霉素缓慢释放，使药物的作用时间延长，减少副作用。

3. 本发明用抗人膀胱癌单克隆抗体（BDI-1）与白蛋白载丝裂霉素偶联制成靶向药物，使制成的药物对肿瘤细胞的选择性更强，绝大部分药物只靶向结合膀胱癌细胞，释放出丝裂霉素，杀死癌细胞，而不损害正常的膀胱粘膜细胞。

附图说明

图1为单个MMC-NS药物放大20万倍的扫描电镜图；

图2为形状规则、分散性良好的MMC-NS药物放大15万倍扫描电镜图；

图3为MMC-NS药物的粒径分布图，纳米微球的粒径测试结果：粒径=314.18±31.093nm；

图4为MMC-NS纳米微球与EJ人膀胱癌细胞图，从图中看出，MMC-NS很少与EJ人膀胱癌细胞结合，扫描电镜可见肿瘤细胞表面有丰富的突起和微绒毛；

图5为靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物（BDI-1-MMC-NS）与EJ人膀胱癌细胞结合图，从图中看出，BDI-1-MMC-NS与EJ人膀胱癌细胞结合得很好，BDI-1-MMC-NS把肿瘤细胞大部分覆盖了，扫描电镜可见肿瘤细胞表面突起和微绒毛明显减少，说明BDI-1-MMC-NS对肿瘤细胞有非常好的杀伤力。

具体实施方式

实施例1

本发明的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备包括如下步骤：

a.白蛋白载丝裂霉素（MMC-NS）纳米微球的制备：

（a1）用生理盐水溶解牛血白蛋白，配置成每毫升含0.15g的牛血白蛋白溶液，用牛血白蛋白溶液溶解丝裂霉素，配置成每毫升含0.06mgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；

（a2）100ml环己烷、3.0mlspan40 和0.5mlMMC牛血白蛋白溶液放入三口烧瓶中，用搅拌器搅拌均匀；用功率为200W的超声波乳化15min，加入2ml戊二醛饱和甲苯溶液，20℃下搅拌反应2h，把物料放入离心机，在2000r/min的转速下离心2min，弃去沉积的大微球，然后在500r/min转速下离心 3min，得到所需要的纳米微球，用环己烷洗涤纳米微球，加入丙酮，加入适量乙醇胺，常温搅拌1h，过滤，固体用异丙醇洗涤，再用丙酮洗涤，最后用冻干机冻干，得到MMC-NS冻干粉，粒径为280～350纳米；

b.MMC-NS-PDP的制备：

（b1）用0.01mol/L的无菌PBS缓冲溶液溶解MMC-NS，使每毫升含MMC-NS 2mg，与SPDP无水乙醇溶液混合，常温搅拌反应30min，投料摩尔比为SPDP:MMC-NS=20:1；离心，得到沉淀；

（b3）重复步骤（b2）三次，以除去多余的SPDP，得到纯净的MMC-NS-PDP，用0.02 mol／L无菌 PBS缓冲液溶解，配置成2.5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液；

c.BDI-1-MMC-NS的制备：

用0.02 mol／L无菌 PBS缓冲液溶解BDI-1-SH，配置成每毫升含1mg的BDI-1-SH，等体积加入b3步骤得到的2.5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液，在4℃下搅拌20h，然后在15000r/min下离心30s，取沉淀用0.02 mol／L无菌PBS离心洗涤3-4次，得到的沉淀物即为BDI-1-MMC-NS。

实施例2

步骤与实施例1相同，只是把（a1）步骤的生理盐水配置成的蛋白质浓度为0.20g/ml，配置成每毫升含0.07mgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；（a2）步骤的乳化剂改为3.6ml span80 ，超声波的功率为300W，3000r/min下去大微球，600r/min下得到要求的纳米微球；（b1）步骤每毫升含MMC-NS 2.5mg；c步骤改为6℃下搅拌18h，离心转速为12000r/min，时间为10min，得到大小均匀，分散性好，二联体药物BDI-1-MMC-NS。

实施例3

步骤与实施例1相同，只是把（a1）步骤的生理盐水配置成的蛋白质浓度为0.30g/ml，配置成每毫升含0.08mgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；（a2）步骤的乳化剂改为4.0ml span83 ，超声波的功率为400W，2000r/min下去大微球，600r/min下得到要求的纳米微球；（b1）步骤每毫升含MMC-NS 2.5mg；c步骤改为6℃下搅拌18h，离心转速为10000r/min，时间为15min，得到大小均匀，分散性好，二联体药物BDI-1-MMC-NS。

实施例4

步骤与实施例1相同，只是把（a1）步骤的生理盐水配置成的蛋白质浓度为0.30g/ml，配置成每毫升含0.10mgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；（a2）步骤的乳化剂改为3.8ml span85 ，超声波的功率为400W，4000r/min下去大微球，800r/min下得到要求的纳米微球；（b1）步骤每毫升含MMC-NS 3mg；c步骤改为10℃下搅拌16h，离心转速为14000r/min，时间为60s，得到大小均匀，分散性好，二联体药物BDI-1-MMC-NS。

应用实施例1

本发明的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物治疗裸小鼠皮下EJ人膀胱癌细胞移植瘤的研究，试验方法如下：

1．裸小鼠膀胱癌皮下瘤模型的建立：取已传代3～4代的EJ人膀胱癌细胞以PBS液配置成细胞悬液进行接种，接种细胞浓度为１×10^７/ml每只裸小鼠接种量为0.2ml。接种前以碘伏消毒裸小鼠皮肤，应用１ml注射器抽取细胞悬液，接种于裸小鼠左前腋部皮下，观察接种部位有无溢出、肿瘤生长及荷瘤裸小鼠的一般状况。待2周后可明显触及皮下瘤，无菌操作切下，同上方法在裸小鼠皮下传代两次。成瘤后，再分组治疗。取下皮下瘤，切成厚度0.2cm薄片，再用自制的内直径0.12cm的不锈钢管，统一规格下压切成面积约0.045cm²的肿块，确保每只小鼠接种部位的肿瘤细胞数量一致，用自制套管针传送接种于实验用裸小鼠左侧肩部，连续观察肿瘤的生长情况。待肿瘤平均直径达到0.8cm时，将裸小鼠随机分组，给予化疗药物进行实验。持续观察，称量体重，用游标卡尺测量皮下瘤肿瘤体积大小。SPF级饲养室饲养，裸小鼠饮用的灭菌蒸馏水及辐照饲料均由广西医科大学实验动物中心提供。操作均遵守动物伦理学条例。

2．皮下瘤实验为组：随机将20只4～6周龄，体重相近，雌性裸小鼠分成4组。于左前肩背部皮下种植体积相同大小的瘤块，种植10天后可达到直径8mm皮下瘤，分组实验。其中以含MMC有效剂量2.5mg／kg给予瘤内注射，为了使药液完全渗透肿瘤组织，一半剂量被注入肿瘤中央，另一半则在瘤周。分组如下：①. 空白对照组（5只）：瘤内注射无菌PBS 0.15ml/次；②. MMC组（5只）：瘤内注射0.2mg/ml丝裂霉素0.15ml/次；③. MMC-NS组（5只）：瘤内注射0.2mg/ml丝裂霉素白蛋白微球0.15ml/次；④. BDI-1-MMC-NS组（5只）：瘤内注射0.2mg/ml膀胱癌单克隆抗体与丝裂霉素白蛋白微球的二联体0.15ml/次；以上操作均每3天一次，共治疗30天，实验结束。

3．肿瘤体积测定：每周测量肿瘤直径，计算体积，实验结束时，将裸小鼠用颈椎脱臼法处死，切取瘤体称湿重，统计各组肿瘤体积、重量的差异，计算肿瘤抑制率。绘制裸小鼠皮下移植瘤生长曲线图：分组治疗后每周用游标卡尺检测各组小鼠肿瘤的最长径a值和最短径b值，根据公式计算出小鼠肿瘤体积。第1次用药时间记为0天，以时间（d）为横坐标，每组动物肿瘤体积的均数为纵坐标，绘制肿瘤生长曲线。

v=1/2ab²

（注：V-体积；a-肿瘤长径；b-肿瘤短径; 式中体积为平均体积）

抑瘤率=(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)／对照组肿瘤体积*100％

4．裸小鼠皮下瘤的给药方法及裸小鼠皮下瘤模型的观测：用1ml注射器在皮下瘤的远端正常皮肤进针，在皮下潜行一段后，刺入瘤体，缓慢注射给药。腋下接种1周后裸小鼠皮下出现米粒大小结节，2周后裸小鼠皮下出现绿豆大小的白色结节，质硬，活动度差，即为皮下种植瘤。

5．标本的收集：手术开始时，即对各组小鼠进行精神状态、饮食、大小便、腹部情况等严密观察。于荷瘤裸小鼠皮下瘤模型治疗后一月，颈椎脱臼法处死裸小鼠，切取皮下肿瘤观察其大体形态，浸入等渗盐水漂洗干净，测量各组肿瘤体积。将瘤块浸泡到10%的福尔马林溶液中。

6．统计学处理：计量资料以

±s表示，采用SPSS 13.0统计软件对结果单因素方差分析。检验水准：α=0.05，以P<0.05作为有显著性差异的标准；P<0.01认为差异有非常显著性。

实验结果：

1．皮下瘤组的实验结果

分组治疗后对照组裸小鼠皮下瘤肿瘤生长迅速，BDI-1-MMC-NS组肿瘤生长明显减慢，部分肿瘤停止生长，少数肿瘤缩小，但未出现肿瘤消退。BDI-1-MMC-NS组抑瘤显著，肿瘤体积明显小于其他三组（见表1，图1）。

表1实验期间每周测量皮下瘤计算瘤体积（

±s，n=5）

项目	0w	1w	2w	3w	4w
						空白对照（mm3）	572.273±10.948	801.917±14.279	1330.612±28.991	2375.318±62.694	3351.692±57.876
MMC（mm3）	528.324±11.223	692.974±5.575	1034.398±39.615	1628.714±22.971	2782.527±46.946
						MMC-NS（mm3）	515.415±11.740	627.987±10.595	714.871±12.980	906.662±12.280	1198.368±22.537
BDI-1-MMC-NS（mm3）	503.984±11.247	614.899±8.219	667.100±12.173	756.012±11.767	792.626±92.366

应用实施例2

本发明的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物治疗裸小鼠原位膀胱癌EJ人膀胱癌细胞移植瘤的研究，试验方法如下：

1. 裸小鼠膀胱腔内EJ人膀胱癌细胞种植模型体系的建立：建立原位人膀胱癌动物模型膀胱粘膜损伤内切割器的研制（见本人的国家发明专利：裸小鼠膀胱癌原位模型建立方法和装置；发明专利号：201110325574.2）

2. 膀胱癌的原位移植动物模型分组及膀胱灌注给药方法：随机选取周龄和体重相近的雌性Balb/c裸小鼠30只，使用用造模器械，进行裸小鼠膀胱腔内切割法建立动物模型。于裸小鼠膀胱腔内种植人膀胱癌细胞2周后，进行触诊、彩超检查、MRI检查及手术探查以了解肿瘤生长情况。最终选取原位膀胱肿瘤大小相近的20只裸小鼠，随机分为4组，分组情况如下：①. 空白对照组（5只）：膀胱腔内灌注无菌PBS，0.06 ml/次；②. MMC组（5只）：膀胱灌注0.05mg/ml丝裂霉素，0.06ml/次，每三天膀胱腔内灌注一次，每次保留1小时；③. MMC-NS组（5只）：膀胱腔内灌注0.05mg/ml丝裂霉素白蛋白微球，0.06ml/次；④. BDI-1-MMC-NS组（5只）：膀胱腔内灌注0.05mg/ml膀胱癌单克隆抗体与丝裂霉素白蛋白微球的二联体，0.06ml/次；膀胱灌注给药后，用静脉夹（显微止血夹）夹闭尿道外口。每15分钟改变裸小鼠体位，以利于药物充分与膀胱肿瘤接触，保持1小时。隔两日灌注一次，共治疗28天。

3. 实验结果：①膀胱相对体重的测定：于末次裸小鼠膀胱灌注后24小时，称体重（g），麻醉后，解剖膀胱离断尿道，双输尿管，取出膀胱，去除膀胱外脂肪。于膀胱前壁剖开观察记录膀胱内腔情况后，滤纸吸净液体，称膀胱绝对重量（mg）。②以膀胱绝对重量与体重的比值（膀胱相对重量）作为膀胱肿瘤的生长参数进行统计分析。目前普遍认为，研究膀胱癌动物模型可以对肿瘤发生发展机制有进一步认识，并且能够为新型抗癌药物的研制提供帮助。

4. 统计学处理：计量资料以

±s表示，采用SPSS 16.0统计软件对结果单因素方差分析。检验水准：α=0.05为检验水准，以P<0.05，差别有统计学意义。

5. 标本的大体组织病理学观察：实验结束经断颈处死，所有实验裸小鼠膀胱均有肿瘤生长，局部呈红褐色，不规则球状。膀胱粘膜均发生不同程度粘膜病变，可见向腔内突入的半圆形瘤体，可见粘膜充血水肿，有3例出现瘤体中央不同程度的坏死。将瘤及原位膀胱癌的瘤体作HE染色，并在显微镜下观察。

6. 原位膀胱癌组裸小鼠膀胱重量及抑瘤率：按统一标准切取膀胱，在精密天平上分别测量裸小鼠膀胱绝对重量，并由体重换算出膀胱相对重量，计算抑瘤率。由表2可看出，3组的膀胱绝对重量逐渐下降，抑瘤率逐渐升高。

表2药物对裸小鼠膀胱重量的影响及抑瘤率(%)

注：*表示与空白对照组比较：**P<0.01、* P<0.05、 ^△△ P<0.01、 ^△ P<0.05。

从表1和表2中看出，本发明的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物（BDI-1- MMC-NS）对肿瘤的杀伤力最大，白蛋白载丝裂霉素（MMC-NS）纳米微球对肿瘤的杀伤力次之，丝裂霉素（MMC）对肿瘤的杀伤力最小。这是因为本发明的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物具有靶向性，对肿瘤细胞的选择性最强，能够选择的吸附肿瘤细胞，在局部保持相对高的药物浓度，延长药物作用时间，提高了对肿瘤细胞的杀伤力，而对正常的组织细胞作用较小。因此本发明的二联体药物是一种效果非常好的抗肿瘤药物，特别适用于膀胱癌的治疗。

Claims

1.靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征是：药物分子中含有白蛋白分子、抗人膀胱癌单克隆抗体（BDI-1）和丝裂霉素（MMC），合成方法是用戊二醛为交联固化剂，把丝裂霉素分子与牛血白蛋白分子结合，制成粒径为280～350纳米的白蛋白载丝裂霉素（MMC-NS）纳米微球，然后用异型双功能连接剂N-琥珀酰亚胺基-3-（2-毗啶基二琉）丙酸酯使白蛋白载丝裂霉素分子连接上吡啶二硫基基团，得到MMC-NS-PDP分子，最后MMC-NS-PDP与BDI-1-SH分子反应，得到分子中含有抗人膀胱癌单克隆抗体、白蛋白分子和丝裂霉素的药物，即靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物，英文缩写为BDI-1-MMC-NS。

2.根据权利要求1所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征在：所述的白蛋白载丝裂霉素（MMC-NS）纳米微球的制备方法为：

（1）用生理盐水溶解牛血白蛋白，配置成每毫升含0.15～0.25g的牛血白蛋白溶液，用牛血白蛋白溶液溶解丝裂霉素，配置成每毫升含0.06～0.10mgMMC的MMC牛血白蛋白溶液；

（2）按照体积比，环己烷：乳化剂：MMC牛血白蛋白溶液为100:3.0～4.0:0.5，放入反应器中，用搅拌器搅拌均匀；用功率为200～400W的超声波乳化15min，加入戊二醛饱和甲苯溶液，加入量按环己烷的体积比计算，环己烷：戊二醛饱和甲苯溶液100:2，在20～40℃下搅拌反应2h，反应完成后的所有物料放入离心机，在2000～4000r/min的转速下离心2min，弃去沉积的大微球，然后在500～800r/min转速下离心 3min，得到所需要的纳米微球，用环己烷洗涤纳米微球，洗涤后的纳米微球加入丙酮和乙醇胺，常温搅拌1h，过滤，所得固体用异丙醇洗涤，再用丙酮洗涤，最后用冻干机冻干，得到MMC-NS冻干粉，粒径为280～350nm。

3.根据权利要求1所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征是：所述的MMC-NS-PDP的制备方法为：

（1）用0.01mol/L的无菌PBS缓冲溶液溶解MMC-NS，使每毫升含MMC-NS 2～3mg，与SPDP无水乙醇溶液混合，常温搅拌反应30min，投料摩尔比为SPDP:MMC-NS=20:1；用离心机离心，得到沉淀；

（2）用0.01mol/L的无菌PBS缓冲溶液与沉淀混合均匀，用离心机离心，得到沉淀；

（3）重复步骤（2）三次，以除去多余的SPDP，得到纯净的MMC-NS-PDP，用0.02 mol／L无菌 PBS缓冲液溶解，配置成2.5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液。

4.根据权利要求1所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征在于：所述的BDI-1-SH为BDI-1与SPDP反应，BDI-1分子引入吡啶二硫基（PDP），得到BDI-1-PDP，然后用二硫苏糖醇（DTT）还原得到巯基，即为BDI-1-SH。

5.根据权利要求1所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征是：用0.02 mol／L无菌 PBS缓冲液溶解BDI-1-SH，配置成每毫升含1mg的BDI-1-SH，等体积加入b3步骤得到的2.5mg/ml的MMC-NS-PDP溶液，在4～10℃下搅拌16～20h，然后在10000～15000r/min下离心30s～15min，取沉淀用0.02 mol／L无菌PBS离心洗涤3～4次，得到的沉淀物即为BDI-1-MMC-NS。

6.根据权利要求2所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法，其特征在于：所述的乳化剂为span40、span60、span80、span83和span85中的一种或它们的组合物。

7.权利要求书所述的靶向抗膀胱癌白蛋白载丝裂霉素药物的制备方法得到的产品。