CN103025328A - 用于皮肤应用的至少一种维生素e成分和酪氨酸酶抑制剂协同相互作用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及通过以药学有效量的组合物对患者给药治疗皮肤疾病或预防皮肤疾病发生，或改变皮肤色素沉着的方法，所述组合物包含至少一种维生素E成分和至少一种与所述维生素E成分不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分。本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含至少一种所述维生素E成分和至少一种与所述维生素E成分不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分。

Description

用于皮肤应用的至少一种维生素E成分和酪氨酸酶抑制剂协同相互作用

相关申请的交叉引用

本申请要求于2010年4月16日递交的美国临时申请61/325,011号的优先权权益，其内容为所有目的通过引用全部合并于此。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物化学领域，具体地，与皮肤疾病相关的生物化学和分子生物学领域。

背景技术

皮肤色素沉着是抗有害的紫外辐射的重要的保护机制。例如，在疾病或损伤的情况下，人的皮肤可改变颜色，造成更深的皮肤色调或颜色（色素沉着）。多数形式的色素沉着由体内过量产生的黑色素而引起，这个物质是颜色（色素）的原因。在体内，色素黑色素的形成发生在皮肤黑素细胞的黑素体内（Mason,H.S.,1949,J Biol Chem,181,803-12;Fitzpatrick,T.B.等,1950,Science,112,223-5）。这个过程由增色酶，例如酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白1/2(TRP1/2)调节(Chen,& Chavin,W.1966,Nature,210,35-7)。具体地，这些酶促进了限制黑色素生物合成中两步反应的速率：L-酪氨酸羟基化为3,4-二羟基苯丙氨酸(DOPA)及其后来氧化成多巴醌(Korner,A.& Pawelek,J.,1982,Science,217,1163-5)。因此酪氨酸酶活性的调节代表皮肤色素沉着的关键步骤(Kornerand Pawelek,1982)。此外，由于皮肤色素沉着（黑素生成过程）是黑色素瘤病的标志，酪氨酸酶活性的控制可提供治疗患有这种类型癌症的患者的基础。

例如与色素沉着相关的皮肤疾病难于治疗，尤其在深肤色的个体或其它皮肤相关疾病中。尽管有很多可用的有效的治疗方法，但是有与目前可用的药物相关的潜在的显著的副作用。用于治疗皮肤疾病的常用药物包含对苯二酚、羟基酚类化学品，它们抑制酶酪氨酸酶，因而减少DOPA向黑色素的转化。在这方面，其它一些可能的作用机制可包含黑素细胞的破坏、黑素体的降解，及DNA和RNA合成的抑制。目前正在研究和开发其它酚类制剂，例如N-乙酰基-4-胱氨基苯酚(Nacetyl-4-cystaminylphenol)(NCAP)。还使用包括维甲酸、阿达帕林、局部用皮质甾类、壬二酸、熊果苷、曲酸和甘草提取物的非酚类制剂治疗皮肤疾病。

多数已知的治疗皮肤疾病的方法对患者具有严重的副作用。因此，本发明的目的为进一步探索治疗皮肤疾病的方法。

发明内容

一个方面，本发明提供了一种治疗皮肤疾病或预防皮肤疾病发生或改变皮肤色素沉着的方法。所述方法包括以药学有效量的组合物对患者给药，所述组合物包含至少一种维生素E成分和至少一种与所述维生素E成分不同的另外的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的成分。

另一方面，本发明提供了一种药物组合物，包含至少一种维生素E成分和至少一种与所述维生素E成分不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分。所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分选自由抗氧化剂、酪氨酸酶抑制剂、多酚、维生素、抗酪氨酸酶RNA干扰剂、抗酪氨酸酶肽或它们的混合物组成的组中。

再一方面，本发明提供了一种包含上面限定的药物组合物的药膏或乳脂。

另一方面，本发明提供了一种产品，包含酰化3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-11-三癸烯基)-2H-1-苯并吡喃-6-醇，或由酰化3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-11-三癸烯基)-2H-1-苯并吡喃-6-醇组成。

附图说明

在与非限制的实施例和附图结合的同时参考的详细说明考虑，本发明更易于理解，其中：

图1说明了显示β-生育三烯酚(贝塔T3)、γ-生育三烯酚(γT3)、δ-生育三烯酚(δT3)、曲酸和α熊果苷对B16黑素瘤细胞的处理分别在高浓度下抑制B16黑素瘤细胞活性的实验结果。在处理后24小时用MTT细胞活性分析确定在B16黑素瘤细胞中，A)分别的α生育三烯酚(αT3)和β-生育三烯酚(βT3)，B)分别的γ-生育三烯酚(γT3)和δ-生育三烯酚(δT3)，C)分别的曲酸和乳酸钠和D)α熊果苷的抗增殖作用。

图2说明在分别用A)δ-生育三烯酚(δT3)和γ-生育三烯酚(γΤ3)，B)β-生育三烯酚(βT3)、曲酸和α熊果苷处理的B16黑素瘤细胞中细胞凋亡分子的免疫印迹结果。注意分别用β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、曲酸和α熊果苷对B16黑素瘤细胞的处理以随剂量变化的方式诱导临界的细胞凋亡分子（裂解的半胱天冬酶3和PARP）。

图3说明了显示在分别用α-生育酚(αTP)、α-生育三烯酚(αT3)、β-生育三烯酚(βT3)、δ-生育三烯酚(δΤ3)、γ-生育三烯酚(γΤ3)、乳酸钠和曲酸处理的B16黑素瘤细胞中的酪氨酸酶活性的实验结果。A)在分别用δ-生育三烯酚和γ-生育三烯酚、乳酸钠、曲酸、α-生育酚(αTP)对B16黑素瘤细胞的处理后没有观察到酪氨酸酶mRNA的变化。B)分别用α-生育酚(αTP)、α-生育三烯酚(αT3)、β-生育三烯酚(βT3))、γ-生育三烯酚(γΤ3)和δ-生育三烯酚(δΤ3)处理的B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的免疫印迹结果。用20μΜ的γΤ3和δΤ3处理B16黑素瘤细胞抑制了酪氨酸酶蛋白表达。注意δΤ3是最有效的酪氨酸酶蛋白的抑制剂。

图4说明了显示在分别用棕榈富含生育三烯酚的部分（棕榈TRF）、棕榈TRF乙酸酯、曲酸和乳酸钠、γ-生育三烯酚(γΤ3)、δ-生育三烯酚(δΤ3)、γ-生育三烯酚乙酸酯（γΤ3乙酸酯）和δ-生育三烯酚乙酸酯（δΤ3乙酸酯）处理的B16黑素瘤细胞中的酪氨酸酶活性的免疫印迹结果。A)分别用20μΜ的棕榈TRF和棕榈TRF乙酸酯处理B16细胞抑制了酪氨酸酶的蛋白表达。B)分别用20μΜ的曲酸和乳酸钠处理B16黑素瘤细胞没有抑制酪氨酸酶的蛋白表达。只有在分别用高很多的浓度的曲酸和乳酸钠处理时观察到酪氨酸酶的抑制。C)分别用20μΜ的γΤ3乙酸酯和δT3乙酸酯处理B16黑素瘤细胞抑制了酪氨酸酶蛋白表达。

图5说明了显示用各种浓度的曲酸、乳酸钠、α-熊果苷和γ-生育三烯酚琥珀酸酯(γΤ3琥珀酸酯)处理的B16黑素瘤细胞中的酪氨酸酶活性的免疫印迹结果。A)用多达100μΜ的曲酸和乳酸钠分别处理B16细胞未抑制酪氨酸酶蛋白的表达。B)用多达60μΜ的熊果苷和γΤ3琥珀酸酯分别处理B16细胞未抑制酪氨酸酶蛋白的表达。C)只有在高很多的浓度（1mM）处理时观察到α熊果苷对酪氨酸酶的抑制。

图6说明了显示分别用δ-生育三烯酚(δΤ3)、γ-生育三烯酚(γΤ3)、乳酸钠、曲酸、α-生育酚(αTP)和棕榈富含生育三烯酚的部分（棕榈TRF）处理超过24小时和48小时的B16黑素瘤细胞中的酪氨酸活性的免疫印迹结果。在48小时的培养周期后，在B16细胞中γΤ3和δΤ3对酪氨酸酶的抑制增强。相反地，在48小时后，乳酸钠和曲酸的抗酪氨酸酶活性减小。值得注意的是，与γΤ3和δΤ3相比，20μΜ的棕榈TRF具有更低的抗酪氨酸酶活性，而αTP对酪氨酸酶的抑制没有影响。

图7A说明了分别用20μΜ的棕榈富含生育三烯酚的部分（棕榈TRF）、20μΜ的γ-生育三烯酚(γ-T3)和20μΜ的δ-生育三烯酚(δ-T3)处理后，在第4天和第15天测量的B16黑素瘤细胞的随时间变化的酪氨酸酶活性。柱形图，3次检验测量的平均值；条，标准方差。

图7B说明了分别用20μΜ的γ-生育三烯酚(γT3)、20μΜ的δ-生育三烯酚(δ-T3)、20μΜ的a-生育酚(αTP)、3.5mM的曲酸和4.5mM的乳酸钠处理后，在第5天和第9天测量的B16黑素瘤细胞的随时间变化的酪氨酸酶活性。注意γT3在第9天显著地抑制了酪氨酸酶的活性。

图7C说明了分别用20μΜ的γ-生育三烯酚(γT3)、20μΜ的δ-生育三烯酚(δ-T3)、20μΜ的a-生育酚(αTP)、3.5mM的曲酸和4.5mM的乳酸钠处理后，在第5天和第9天测量的B16黑素瘤细胞的随时间变化的黑色素合成的抑制。注意直到第9天γT3显著地抑制了黑色素含量。

图8A说明了分别用20μΜ的γ-生育三烯酚(γT3)、20μΜ的δ-生育三烯酚(δ-T3)、20μΜ的富含生育酚部分92%(T92)、3.5mM的曲酸和4.5mM的乳酸钠和1mM熊果苷处理后，在第5天测量的B16黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性。

图8B说明了分别用20μΜ的γ-生育三烯酚(γT3)、20μΜ的δ-生育三烯酚(δ-T3)、20μΜ的富含生育酚部分92%(T92)、3.5mM的曲酸和4.5mM的乳酸钠和1mM熊果苷处理后，在第5天测量的B16黑素瘤细胞的黑色素含量。

图9说明了分别用γ-生育三烯酚(γT3)、δ-生育三烯酚(δ-T3)、α-生育三烯酚(α-T3)、富含生育酚部分92%(T92)、曲酸和乳酸钠处理后，B16黑素瘤细胞中抗色素沉着的效力。继代培养B16细胞，用γT3和δT3、αTP、富含生育三烯酚部分92%、曲酸和乳酸钠处理，然后收获。给细胞颗粒照相。应注意到，用20μΜ的γT3和δT3、T92，和3.5mM的曲酸处理B16细胞导致更少的细胞色素沉着。相反地，20μΜ的αTP、曲酸和乳酸钠产生具有与对照相当的色素沉着水平的细胞颗粒。

图10说明了分别用α-生育酚(αTP)、γ-生育三烯酚(γT3)、δ-生育三烯酚(δ-T3)、富含生育酚部分92%(T92)和熊果苷处理后，B16黑素瘤细胞中抗色素沉着的效力。继代培养B16细胞，用γT3和δT3、αTP、富含生育三烯酚部分92%（T92）和α熊果苷处理，然后收获。给细胞颗粒照相。注意到，用20μΜ的γT3和δT3、T92和1mM的α熊果苷处理B16细胞导致更少的细胞色素沉着。相反地，20μΜ的αTP、α熊果苷产生具有与对照相当的色素沉着水平的细胞颗粒。

图11说明了在裸鼠中抗色素沉着效力和肿瘤的缩小，其中将预处理的B16黑素瘤细胞异体移植到裸鼠的侧腹。将用20μΜ的γ-生育三烯酚(γΤ3)预处理1周的5×l0⁵的B16细胞异体移植到裸鼠的侧腹。然后，以50mg/kg/天的剂量补充γΤ3两周。在两周的处理结束时拍摄实体瘤的照片。

图12说明了在裸鼠中抗色素沉着效力和肿瘤的缩小，其中将预处理的B16黑素瘤细胞异体移植到裸鼠的侧腹。将分别用20μΜ的δ-生育三烯酚(δΤ3)和棕榈富含生育三烯酚部分92%(T92)预处理1周的5×l0⁵的B16细胞移植到裸鼠的侧腹。然后，以50mg/kg/天的剂量分别补充δΤ3和T92两周。在两周的处理结束时拍摄实体瘤的照片。

图13说明分别用γ-生育三烯酚(γT3)、δ-生育三烯酚(δT3)和棕榈富含生育三烯酚部分（棕榈TRF）处理的裸鼠的肿瘤大小。在实验的开始和结束时测量肿瘤大小。

图14说明了在人体试验中检验的棕榈富含生育三烯酚部分(TRF)的降低色素沉着的性质。用含2%的棕榈TRF的Kose Prime乳脂处理受试者1个月的前后，拍摄受试者脸上老人斑。对照受试者未显示老人斑的改善(n=13)。

图15A说明了在用棕榈富含生育三烯酚部分92%(T92)、γ-生育三烯酚(γΤ3)、δ-生育三烯酚(δΤ3)和T92乙酸酯(T92Ac)预处理，然后暴露于UV 10分钟（短波和长波UV）的B16黑素瘤细胞中，UV对B16黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性的影响。柱形图，3次检验测量的平均值；条，标准方差。

图15B说明了在用棕榈富含生育三烯酚部分92%(T92)、γ-生育三烯酚(γΤ3)、δ-生育三烯酚(δΤ3)和T92乙酸酯(T92Ac)预处理，然后暴露于UV 10分钟（短波和长波UV）的B16黑素瘤细胞中，UV对黑色素含量的影响。柱形图，3次检验测的平均值；条，标准方差。注意到，γΤ3、δΤ3和T92显著地抑制黑色素的含量。柱形图，3次检验测的平均值；条，标准方差。

图16A说明了显示在不同的时间段内B16黑素瘤细胞活性的实验结果。暴露于UV超过60分钟诱导B16细胞的凋亡。

图16B说明了在暴露于UV 10分钟、60分钟和12小时后在B16黑素瘤细胞中细胞凋亡分子的免疫印迹结果。注意到，B16黑素瘤细胞暴露于UV 12小时诱导临界的细胞凋亡分子（裂解的半胱天冬酶3和PARP）。

图16C至E说明了用γ-生育三烯酚(γT3)、δ-生育三烯酚(δΤ3)、棕榈富含生育三烯酚部分92%（棕榈TRF）和棕榈富含生育三烯酚部分乙酸酯（棕榈TRF乙酸酯）处理的B16细胞暴露于UV 1分钟、10分钟、30分钟和60分钟后酪氨酸酶蛋白表达的效果。γΤ3、δT3和棕榈TRF显著地抑制了暴露于UV的B16细胞中的酪氨酸酶蛋白表达。

图17A说明了与单独使用一种制剂相比，用棕榈富含生育三烯酚部分92%（棕榈TRF）和曲酸处理的B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶活性和黑色素含量的协同效应。用20μΜ的棕榈富含生育三烯酚部分92%（棕榈TRF），及0.05%的乳酸钠(4.5mM)或曲酸(3.5mM)中的一种处理B16细胞24小时。共处理后对酪氨酸酶活性和黑色素含量的抑制显著大于单独用任一种处理的细胞。

图17B说明了与单独使用一种制剂相比，显示用γ-生育三烯酚(γΤ3)，及曲酸或乳酸钠处理的B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的协同效应的免疫印迹结果。根据这个结果，5μΜ的γΤ3与1mM的乳酸钠或曲酸的共处理对酪氨酸酶蛋白抑制的增强。

图17C说明了与单独使用一种制剂相比，显示用δ-生育三烯酚(δΤ3)，及曲酸或乳酸钠处理的B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的协同效应的免疫印迹结果。根据这个结果，5μΜ的δΤ3与1mM的乳酸钠或曲酸的共处理导致对酪氨酸酶蛋白抑制的增强。

图18A至18C说明了显示了与单独使用任一个制剂相比，当用γ-生育三烯酚(γΤ3)(10μΜ)和α熊果苷(50μΜ)（图18A）共处理，或用对苯二酚(20μΜ)处理（图18B）处理，或用L-谷胱甘肽(10μΜ)（图18C）处理时，B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的协同效应的免疫印迹结果。

图18D说明了显示与未转染的B16细胞相比，用mi434-5P microRNA转染并用γ-生育三烯酚(γΤ3)处理的B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶蛋白表达的免疫印迹结果。

图18E说明了显示与单独用任一种制剂相比，当用γ-生育三烯酚(γT3)(10μΜ)和维甲酸(2nM)共处理时，B16黑素瘤细胞中酪氨酸酶表达的免疫印迹结果。

具体实施方式

本发明的第一个方面涉及一种通过以药学有效量的组合物对患者给药，治疗皮肤疾病或预防皮肤疾病发生或改变皮肤色素沉着的方法，包所述组合物包含至少一种维生素E成分和至少一种与维生素E不同具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分。

已经证明包含至少一种维生素成分，如γ-生育三烯酚(γΤ3)、δ-生育三烯酚(δΤ3)或富含生育三烯酚部分(TRF)的组合物，例如，通过防止酪氨酸酶蛋白的持续活化抑制了诸如B16黑素瘤细胞的细胞中持续的黑色素合成。还已经证明本发明涉及的维生素E成分，例如γ-生育三烯酚(γΤ3)或δ-生育三烯酚(δΤ3)，与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分具有协同效应，所述附加成分例如但不限于：乳酸钠、曲酸或维甲酸。这些发现得到了从这里提及的实验结果观测到的体外与体内数据的支持。本发明该方面的普遍原理可在图17和图18中证明，图17和图18是基于这样的实施例，其中与只使用一种成分相比，包含至少一种维生素E成分，例如γ-生育三烯酚(γΤ3)、δ-生育三烯酚(δΤ3)，和与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分，例如乳酸钠、曲酸、α熊果苷、对苯二酚、L-谷胱甘肽或mi434-5P microRNA分子，的组合物呈现出显著的酪氨酸酶蛋白抑制。

这里使用的术语“治疗”或“处理”旨在涉及提供药学有效量的组合物，所述组合物包括至少一种维生素E成分和至少一种与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分，所述组合物能充分起到防止虚弱和/或不健康状态的发展的预防作用；和/或提供充足量的所述组合物或其药物给受试者或患者，以减轻或消除疾病状态/紊乱，和/或疾病状态/紊乱的症状，和虚弱和/或不健康状态。

“预防皮肤疾病发生”是指预防或阻碍皮肤疾病发生的作用。在目前情况下，给药此处提到的组合物具有使皮肤疾病不能在患者或动物体内发展的效力。预防不同于“治疗”在于：此处提到的组合物将用于治疗在患者或动物体内已经存在的皮肤疾病，或换句话说，治疗已经患皮肤疾病的患者或动物身体。

通常，认为“皮肤疾病”是指任何症状、紊乱或疾病，例如癌和与皮肤、皮毛、毛发、指甲、口和生殖膜和腺相关的表面和老化疾病。皮肤病症可表现为可见的损伤的形式、发生前损伤、疼痛、接触敏感、发炎、炎症等形式。皮肤病症包括但不限于皮肤和毛囊皮脂腺单位或角质生成过程的疾病。例如，皮肤病症可为上皮或真皮，或位于表皮、真皮、皮下层的毛囊皮脂腺单位内部或周围，或它们组合的疾病。皮肤病症的实例包含但不限于痤疮、秃头症、牛皮癣、皮脂溢、向内生毛和须部假性毛囊炎、色素沉着的皮肤、皮肤感染、扁平苔癣、小棘状苔藓及脱发性毛囊炎、口周黑子炎症、红斑痤疮、化脓性汗腺炎、蜂窝组织炎、系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮等。

一些实施方式中，可用这里说明的组合物预防或治疗的皮肤病症的类型例如可包括表皮疾病。表皮疾病可例如包括由增加的黑色素引起的皮肤暗沉、皮肤色素沉着过度、皮肤炎症、皮肤普通痤疮、伤口愈合、皮肤光老化、皮肤皱纹、吸烟者的黑变病、黑斑病、黑棘皮病、库兴氏病、爱迪生氏病、黑线、汞中毒，仅举几例。

“改变皮肤的色素沉着”是指皮肤天然颜色（色素）的变化。可指皮肤的色素沉着水平或量的下降。在一些实施方式中，给药这里提到的组合物可减少黑色的实际皮肤损伤，或例如可预防或阻止皮肤暗区的扩大。实际的皮肤损伤可为，例如由年龄、过量的太阳暴露或引起皮肤暗区的疾病或紊乱。这些疾病可包括，例如这里提及的皮肤疾病的任一种。在其它实施方式中，给药这里提到的组合物可减小察觉到的黑色的皮肤损伤。这意味着皮肤损伤可被个人感知，因此他的或他的皮肤阴影是深色的，其不易定具有实际的皮肤损伤而只是（为了美容）期望减轻皮肤阴影。

如此处所述，为了治疗皮肤疾病或防止皮肤疾病发生或改变皮肤色素沉着的治疗，使用包含至少一种维生素E成分和至少一种与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分的组合物。维生素E由两种主要成分组成-生育酚(T)和生育三烯酚(T3)。生育三烯酚(T3)主要发现于棕榈油中。与生育酚一起，他们为所有活细胞提供抗氧化活性的重要来源。这个普通的抗氧化属性反应了生育三烯酚和生育酚的化学结构的相似性，生育三烯酚和生育酚仅区别于它们结构的侧链（生育三烯酚包含法呢基(farnesyl)或生育酚包含饱和的植基侧链）。来自色原烷醇环上羟基的普通氢原子起到清除链增长过氧化自由基的作用。基于甲基在其色原烷醇环上的位置，生育酚和生育三烯酚可分成4种同分异构形式：阿尔法(α)、贝塔(β)、伽玛(γ)和德尔塔(δ)。

存在不同的生育酚的生育三烯酚同型异构体（参考通式I和通式II）。生育酚由分别源自尿黑酸(HGA)和植基二磷酸的色原烷醇环和15碳链组成。另一方面，生育三烯酚与生育酚在结构上的区别在于在碳链中存在3个反式双键。通式I和通式II和下面的说明提供了关于已知的生育酚(T)和生育三烯酚(T3)异构体的概述。

通式I

通式II

通式I(A)中：R¹=R²=R³=Me(CH₃)，已知为α(阿尔法)-生育酚，指定为α生育酚或5,7,8-三甲基生育酚；R¹=R³=Me，R²=H，已知为β(贝塔)-生育酚，指定为β-生育酚或5,8-二甲基生育酚；R¹=H；R²=R³=Me，已知为γ(伽玛)-生育酚，指定为γ-生育酚或7,8-二甲基生育酚；R¹=R²=H；R³=Me，已知为δ(德尔塔)-生育酚，指定为δ-生育酚或8-甲基生育酚。通式II(B)中：R¹=R²=R³=H，2-甲基-2-(4,8,12-三甲基三癸-3,7,ll-三烯基)色原烷-6-醇，指定为生育三烯酚；R¹=R²=R³=Me，以前已知为ζ1或ζ2-生育酚，指定为5,7,8-三甲基生育三烯酚或α(阿尔法)-生育三烯酚。也使用名称生育色原烷醇-3（tocochromanol-3）；R¹=R³=Me；R2=H，以前已知为ε-生育酚指定为5,8-二甲基生育三烯酚或β(贝塔)-生育三烯酚；R¹=H；R²=R³=Me，以前已知为γ-生育酚，指定为7,8-二甲基生育三烯酚或(伽玛)γ-生育三烯酚。也使用名称质体色原烷醇-3（plastochromanol-3）；R¹=R²=H；R³=Me指定为8-甲基生育三烯酚或δ(德尔塔)-生育三烯酚。

另一个维生素E成分为α-生育单烯酚，其以不同的异构体形式存在，以及δ-生育单烯酚。α-生育单烯酚的一个异构体形式，即3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-11-三癸烯基)-2H-l-苯并吡喃-6-醇可从，例如从棕榈油树，例如油棕（Elaeis guineensisjacq.）中分离。α-生育单烯酚的另一个异构体形式，即3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-12-三癸烯基)-2H-l-苯并吡喃-6-醇可从，例如从大鳞大麻哈鱼（pacific salmon）（大马哈鱼（Oncorhynchus keta)）（Yamamoto Y.等，J.Nat.Prod.1999，62，1685-1687）中分离。δ-生育单烯酚可从猕猴桃(Actinidia chinensis)(kiwi)果实中分离(Fiorentino等，Food Chemistry，2009,115,187-192)。δ-生育单烯酚的结构也可被形容为2,8-二甲基-2-(4,8,12-三甲基三癸-11-烯基)色原烷-6-醇。

在一些实施方式中，维生素E成分这里是指维生素E成分。所述酰化维生素E成分可为乙酰化的维生素E成分。乙酰化通常是指添加酰基到化合物的过程。在一些实施方式中，可用酰化剂，例如酸酐或氯化酰进行酰化反应。例如，维生素E成分的酰化使例如生育酚、生育三烯酚或生育单烯酚包含的酚羟基的酯化，导致产生酰化生育酚、酰化生育三烯或酰化生育单烯酚。在一些实施方式中，酰化生育酚、生育三烯酚或生育单烯酚可为乙酰化的生育酚、生育三烯酚或生育单烯酚。

这里所指的任何酰化剂中的酰基可来自脂肪族羧酸，例如直链或支链烷酸，例如C1至C₇烷酸，例如乙酸、丙酸、丁酸和新戊酸，或来自具有直至20个碳原子的更高级烷酸（脂肪酸），例如棕榈酸，或来自芳香羧酸，例如苯甲酸。在这个实施方式的上下文中，所述羧酸酐可为选自乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、马来酸酐、氯乙酸酐、琥珀酸酐、邻苯二甲酸酐和柠康酸酐等中的一种。

酰氯的实例可包括但不限于直链或支链烷酰基氯化物，例如乙酰氯、丙酰氯和丁酰氯；和芳香氯化物，例如苯甲酰氟。

这里所指的至少一种维生素E成分的酰化可在催化剂的存在下进行，例如，酸性催化剂或碱性催化剂。只要催化剂在酰化反应中完成其期望的功能，用于维生素E成分的酰基化的酸性催化剂和碱性催化剂可分别指任何刘易斯碱或酸催化剂。碱性催化剂可为下面化合物的任何一个：氧化态3的N、P、As、Sb和Bi，氧化态2的化合物O、S、Se和Te，例如醚、酮或亚砜，或一氧化碳。在这方面，刘易斯碱催化剂可为选自吡啶、三乙胺、二甲基氨基吡啶(DMAP)、N-甲基咪唑、3-(l-甲基-2-吡咯烷基)吡啶或4-吡咯烷基吡啶(PPY)等中的一种。酸催化剂包含但不限于NH₃、B₂H₆、BF₃、A1₂C1₆、A1F₃、SiF₄、PC1₅、SF₄、金属离子形成溶剂化物，例如[Mg(H₂O)₆]²⁺或[A1(H₂O)₆]³⁺、(l-H-3-甲基-咪唑硫酸氢盐)、l-己基-3-甲基-咪唑硫酸氢盐([hmim][HSO₄])、l-丁基-3-甲基咪唑二氢磷酸盐([bmim][H₂PO₄])、l-[2-(2-羟基-乙羟基)乙基]-3-甲基-咪唑硫酸氢盐([heemim][HSO₄])、l-丁基-3-甲基-咪唑氯铝酸盐([bmim]Cl2A1C1₃)和l-丁基-3-甲基-咪唑硫酸氢盐([bmim][HSO₄])。

在一个实施方式中，与生育三烯酚和/或生育酚相比，酰化反应中，所述酰化剂可过量使用（例如为维生素E成分的3至10摩尔比）。

在一个实施方式中，这里所指的至少一种维生素E成分的酰化可例如，在超过大气压力的压力下包括进行催化的生育三烯酚的酰化反应。在这方面，所述压力可在至少2bar或至少5bar，或在约2bar至约12bar之间，或约5bar至约10bar之间的范围内。在一些实施方式中，酰化反应可在惰性气氛下进行。在这个实施方式的这个方面，所述惰性气氛可为氮气或卤化物，例如氩。

在一个实施方式中，至少一种维生素E成分的酰化可包含在室温进行例如生育三烯酚成分的维生素E的催化酰化反应。通常室温理解为在约15℃至约35℃范围内的温度。在一个实施方式中，室温为约20℃至约30℃，或约25℃至约30℃之间的温度。

在一些实施方式中，这里所指的维生素E成分的酰化反应可进行约10分钟至约60分钟，或约10分钟至约180分钟。在一个实施方式中，所述酰化反应可进行约15分钟至约30分钟。

这里所指的维生素E成分的酰化的其它方法在本领域普通技术人员的知识范围内，并在美国专利7,169,973号、美国专利6,239,294号、美国专利7,135,580号和美国专利5,523,420号。作为非限制实施例，维生素E成分，例如富含生育三烯酚部分(TRF)可与羧酸酐，例如乙酸酐，在催化剂例如吡啶的存在下，在N2下室温下搅拌预订的时间例如约2小时（也可参考O'Byrne,D.等，自由基生物学和医学，2002，29，834-45）。通过本领域中已知的例如包括真空蒸馏的蒸馏工艺去除多余的酸酐及其相应的酸和催化剂。可通过本领域中已知的分离方法，例如包含柱层析，蒸馏等，进一步纯化剩余的TRF乙酸酯。

这里所指的用在所述组合物中的至少一种维生素E成分可包含，或主要由生育酚、生育三烯酚、生育单烯酚、酰化生育酚、酰化生育三烯酚和酰化生育单烯酚的至少一种组成。所述维生素E成分还包括或主要由生育酚、生育三烯酚、生育单烯酚、酰化生育酚、酰化生育三烯酚和酰化生育单烯酚的混合物组成。在一些实施方式中，这里使用的所述至少一种维生素E成分可为至少一种生育酚和至少一种生育三烯酚的混合物，或至少一种酰化生育酚和至少一种酰化生育三烯酚的混合物。所述至少一种维生素E成分可为富含生育三烯酚部分(TRF)或酰化TRF，例如TRF乙酸酯。这里所指的富含生育三烯酚部分通常是指生育三烯酚和生育酚的不同异构体的混合物，例如a-生育酚、α生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚。所述富含生育三烯酚部分可进一步包括其它成分，例如植物甾醇、类胡罗卜素和鲨烯等。例如，富含生育三烯酚部分可由棕榈油、米糠或葡萄种子获得。

在另一个实施方式中，这里所指的组合物中使用的所述至少一种维生素E成分可包括γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、富含生育三烯酚部分(TRF)、酰化γ-生育三烯酚、酰化δ-生育三烯酚、酰化TRF或它们的混合物。

只要所述成分具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性，所述与所述维生素E成分不同的附加成分可涉及任何成分。例如，附加成分可为抗氧化剂、酪氨酸酶抑制剂、多酚、维生素、抗酪氨酸酶RNA干扰剂、抗酪氨酸酶肽，或任一组合物的混合物等。

“抗黑素生成活性”通常指具有在细胞预防和抑制黑色素合成的能力的化合物。例如，附加成分可为调节或抑制或干扰黑素生成的制剂。在上下文中，这里所指的所述与维生素E成分不同的附加成分可具有抗黑素生成活性，但不必要地具有抗酪氨酸酶活性。不希望结合任何理论，该具有抗黑素生成活性的附加成分可例如涉及不同于酪氨酸酶活性机制的其它机制。例如，这样的机制可包括防止黑色素由黑素细胞转移到角化细胞，或减小黑色素相关的代谢物到无色形式等。所述与所述维生素E成分不同的附加成分还可同时具有抗酪氨酸酶活性和抗黑素生成活性。

抗酪氨酸酶肽还可包含前蛋白或后蛋白或成熟蛋白，通常包括例如由于信号序列能够被定向到内质网(ER)、分泌小泡、细胞腔隙或胞外空间的的多肽或蛋白，然而，也涵盖不易定具有信号序列的被释放到胞外空间的蛋白。通常，多肽经历例如信号序列的切除、修改、折叠等加工形成成熟形式。如果抗酪氨酸酶多肽被释放到胞外空间，其可经胞外加工以产生“成熟”蛋白。可通过许多机制，包括，例如胞外分泌和蛋白酶切，释放到胞外空间。

抗酪氨酸酶肽还可被“改变”导致“变化”，并可包含产生沉默变化和导致功能等效蛋白的氨基酸残基的删除、插入或替代。只要保留抗酪氨酸酶多肽的生物和免疫活性，可基于在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性，做出有意的氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸，并且带正电荷氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸。具有相似亲水值的不带电极性侧链的氨基酸可包括：天冬酰胺和谷氨酰胺；和丝氨酸和苏氨酸。具有相似亲水值的不带电侧链的氨基酸可包括：亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；和苯基丙氨酸和酪氨酸。

可用本领域中已知的任何方式制备抗酪氨酸酶肽。例如，天然产生的抗酪氨酸酶肽可被分离、重组生成、合成生产或由这些方法的任何组合产生。例如，包括分泌的多肽的抗酪氨酸酶肽的重组制备的版本可用这里说明的技术或其它本领域中已知的方法纯化。参考Martin FH,等，Primary structure and functional expression of rat and humanstem cell factor DNAs，Cell 63:203，1990。抗酪氨酸酶肽还可从天然、合成或重组来源或其它本领域中已知方法，例如用抗酪氨酸酶肽或融合到抗酪氨酸酶肽的肽序列的抗体。参考，例如美国专利6,759,215或6,207,417。作为非限制实施例，所述抗酪氨酸酶肽可包含谷胱甘肽、L-谷胱甘肽、包括本领域中已知的它们的衍生物。

酪氨酸酶抑制剂可通过自然或合成来源获得。酪氨酸酶为催化黑色素合成反应的含铜酶。不期望结合任何理论，酪氨酸酶抑制剂主要通过干扰黑色素的合成而起作用，而不考虑是否有任何直接的抑制剂/酶相互作用。除了普通的酪氨酸酶抑制剂，例如曲酸，酪氨酸酶抑制剂通常可分成5个主要的类别，包含a)多酚，b)苯甲醛和苯甲酸酯衍生物，c)长链脂质和类固醇，d)其它天然和合成抑制剂，e)基于化学结构或抑制机制的不可逆灭活剂。

多酚表示不同组的包含多个酚官能团并在自然界广泛分布的化合物。多酚的实例包括对苯二酚。多酚的另一个实例包括类黄酮，类黄酮为由酚和芘环组成的苯并-γ-吡喃酮衍生物。类黄酮可分成七个主要的组，包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮、黄烷醇、异类黄酮、查耳酮和儿茶酸。类黄酮的不同类别的区别在于另外的氧杂环、B环的位置差异，及羟基、甲基、类异戊二烯和甲氧基在环上不同模式的分布。不期望结合任何理论，类黄酮的结构与酪氨酸酶的底物和（推测竞争性）抑制剂的功能相容。除了类黄酮，其它可用作酪氨酸酶抑制剂的多酚包含二苯乙烯类和香豆素衍生物。多酚的衍生物也可用作这里所指的酪氨酸酶抑制剂。这样的多酚衍生物可包括(酚)苷，例如，对苯二酚苷。对苯二酚苷的非限制实例包含α熊果苷。

在一些实施方式中，这里所指的所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分可为选自由维生素A、维生素A衍生物、维生素B、维生素B衍生物、维生素C、维生素C衍生物、醌、对苯二酚、乳酸盐、曲酸、曲酸衍生物、α-羟基酸、熊果苷、羟基乙酸、对苯二酚、谷胱甘肽、L-谷胱甘肽、壬二酸、糖皮质激素、桑椹提取物、粗糙帽果提取物、黄瓜提取物、甘草提取物、石榴提取物、熊果叶（熊果）提取物、六亚甲基二乙酰胺、丁酸钠、二甲亚砜、合成的羟基取代的苯基萘和衍生物、例如2,6-二-叔丁基-4-甲酚、2,6-二-叔丁基-4-乙酚等的一元酚、和例如4,4'-亚甲基双(2,6-二-叔丁基酚)、2,2'-亚甲基双(4-乙基-6-叔丁基酚)的二元酚、维甲酸、衣霉素、N-乙酰葡糖胺、透明质酸、凝血酸、胎盘提取物、鞣花酸、EDTA、植酸、芦荟素、硫辛酸、蛋白酶激活受体(PAR2)和大豆胰岛素抑制剂等。在上下文中，期望时，只要其具有抗酪氨酸酶活性，可将任何乳酸酯或乳酸盐用作与所述维生素E成分不同的附加成分。乳酸酯或乳酸盐可包括但不限于乳酸钾、乳酸钠、乳酸镁、乳酸铵和乳酸钙。

在其它实施方式中，这里所指的所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分可例如，包括乳酸钠、对苯二酚、L-谷胱甘肽、曲酸、熊果苷、维甲酸，包含它们的衍生物等的一种。在上下文中，可使用本领域中普通技术人员已知的合适的曲酸衍生物。这样曲酸衍生物的实例包含但不限于二棕榈酸曲酸酯（美国专利号5,824,327）、曲酸酯（美国专利号4,278656）、曲酸和环糊精（美国专利号4,847,074）。

在一些实施方式中，所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分可包括皮肤美白剂。这里使用的“皮肤美白剂”指只要所述制剂具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性，具有改变皮肤色素效果的任何化合物。例如，所述皮肤美白剂可用在这里说明的组合物中，以减小深色的实际皮肤损伤。例如，当期望时，所述皮肤美白剂可用于这里说明的组合物中，以减少个体深色的可察觉的皮肤损伤。这意味着个体不必具有实际的皮肤损伤，但是具有减轻皮肤颜色的愿望。可用在这里说明的组合物中皮肤美白剂的实例可包括但不限于上面提及的示例性附加成分的任一个。

在一些实施方式中，所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分可包含抗酪氨酸酶RNA干扰剂。抗酪氨酸酶RNA干扰剂（例如干扰核苷酸）可指调节编码酪氨酸酶的核苷酸的活性的任何化合物。在上下文中，术语“核酸”、“核苷”、核苷分子”或“寡核苷酸”指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。如可使用于这里说明的实施方式，应理解所述术语的包含单链（例如正义和反义）和双链多核苷酸。除了核糖或脱氧核糖，核苷亚单位的糖基还可为其改性衍生物，例如2'-O-甲基核糖。寡核苷酸的核苷亚单位可通过磷酸二酯键、硫代磷酸键、甲基磷酸键或其它不抑制寡核苷酸杂交的稀少的非天然生成的键结合，此外，寡核苷酸可具有非普通的核苷或非核苷部分。

所述抗酪氨酸酶RNA干扰剂可例如包阔干扰RNA、短折叠RNA和微RNA。这些抗酪氨酸酶RNA干扰剂已经成为“敲除”具体基因的有力的工具。RNAi技术利用通过其在转录后水平发生并包括mRNA降解的RNA干扰(RNAi)的基因沉默或基因抑制。RNA干扰代表了保护基因组的细胞学机制。siRNA和miRNA分子通过siRNA与多酶复合物的结合以形成被称为RNA-诱导的沉默复合物(RISC)，调节它们互补的RNA的降解。siRNA或miRNA变成RISC的部分，并靶向到互补RNA种类，然后互补RNA种类被裂解。siRNA为对相应的互补链的完全碱基对，而miRNA双层结构不完全配对。RISC的活化导致各个基因表达的表达损失。干扰核苷酸可不超过约100nt的长度，并且通常不超过约75nt。干扰核苷酸为两个不同的核苷酸彼此杂交的双层结构，如siRNA，双层结构的长度典型地在约15至30bp，通常约15至29bp。RNAi制剂为在折叠构型中存在的单核苷酸的双层结构，即shRNA，折叠的杂交部分的长度通常与上面提供给siRNA类型制剂的相同或长4至8个核苷。在一些实施方式中，miRNA为mi434-5P miRNA（参考Wu David T.S.等，Clinical,Cosmetic andInvestigational Dermatology，2008,1,19-35）。

所述抗酪氨酸酶RNA干扰剂也可为反义RNA。这里使用的反义RNA是指与信使RNA(mRNA)中的碱基序列互补的单链RNA序列。“互补”意味着两个单链核酸的相似区域的核酸序列，或同一单链核酸的不同区域具有允许单链在稳定的双链氢键区域杂交在一起的核苷碱基组合物。当一个单链区域的核苷邻近序列能够与另一单链区域的相应的核苷序列形成一系列“规范的”氢键碱基对，例如A与U或T配对，并且C与G配对时，核苷序列为“完全”互补。当反义RNA引入细胞中，例如本发明中使用的B16细胞，所述反义RNA可抑制编码酪氨酸酶蛋白的互补mRNA的转译。反义RNA和mRNA序列之间的互补碱基对可阻止转译通路。

短语“核酸杂交”是指两个具有完全或部分互补核苷序列的核酸链在预订的反应条件下结合到一起，以形成稳定的具有特定氢键的双链杂交的过程。任一核酸链可为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，或这些核酸中一个的类似物，因而杂交可包含RNA∶RNA杂交、DNA∶DNA杂交或RNA∶DNA杂交。

当哺乳动物靶细胞为体内时，用在本发明方法中的抗酪氨酸酶RNA干扰剂可使用本领域普通技术人员已知的任何常规的技术，给药给哺乳动物主体。下面的讨论提供了代表的核酸，例如siRNA，和可用的给药方法的综述。可通过任何数目的途径，包含病毒感染、显微注射或囊泡融合，引入核酸到组织和主体细胞中。

喷射注射还可用于肌肉内给药，如在Furth,P.A.,Shamay，A.等(1992)“Gene transferinto somatic tissues by jet injection”，Anal Biochem，205卷，365-368页中说明。所述核酸可涂覆到金微粒，并通过颗粒轰击装置或“基因枪”皮层内传输，如在文献（参考，例如Tang,D.C.,De Vit,M.等，(1992)“Gene immunization is a simple method foreliciting an immune response”，Nature，356卷，152-154）中所述，其中，金微粒涂覆DNA，然后被轰入皮肤细胞。用于传输siRNA的纳米颗粒的使用是另一种合适的细胞特异靶向的方法。例如，这个方法已经在Weissleder,R.,Kelly，K.等(2005)“Cell-specifictargeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules”Nature Biotech卷l.23,1418-1423页中说明。

体内传输抗酪氨酸酶RNA干扰剂，例如siRNA到选择的细胞的一个示例性的实例为其共价结合到重链抗体片段(F_ab)和核酸结合蛋白精朊的融合蛋白（Song,E.,Zhu,P.等，(2005)“Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surfacereceptors”，Nature Biotech，23卷，709-717页）。另一个体内传输siRNA分子到选定的细胞的示例性实例为其封装入脂质体。例如，Morrissey，D.,Lockridge,J.等，“Potentand Persistent In Vivo Anti-HBV Activity of Chemically Modified siRNAs”，NatureBiotech（2005），23卷，1002-1007页）使用稳定的核酸脂质颗粒，其用聚乙二醇-脂质结合涂覆以形成用于静脉内给药的脂质体。

传输RNAi制剂到选定的恶性靶细胞的再一个实例为使用包含各自核酸分子的生物载体，例如细菌或病毒（例如腺病毒）。例如，Xiang,S.、Fruehauf，J.等(2006)“Shorthairpin RNA-expressing bacteria elicit RNA interference in mammals”，Nature Biotech，24卷，697-702页，已经例如通过给药细菌E.coli使用这个方法，所述细菌从质粒及其它转录shRNAh和侵袭素，因而允许进入哺乳动物的细胞，并接着使其中的基因沉默。

表达载体可用于将siRNA引入期望的细胞。此外，寡核苷酸可直接放入、注射入包含靶基因，即酪氨酸酶编码基因的机体。siRNA可直接引入细胞（即细胞内）；或胞外引入到腔、胞间隙、机体的循环系统，口服引入等。口服引入的方法包括直接混合RNA和机体的食物。引入核酸的物理方法包含直接注射到细胞中，或胞外注射RNA溶液到有机体中。所述制剂可以允许每个细胞至少拷贝一个的量引入。高剂量（例如，每个细胞至少5、10、100、500或1000拷贝）的制剂可产生更有效的抑制；低剂量也可对具体的应用有用。

在一个实施方式中，所述至少一种维生素E成分可包含富集制剂。“富集”意味着包含的至少一种维生素E成分的量高于包含其它所有维生素E成分的正常混合物。例如，基于所述油的总重，从例如棕榈油分离的生育三烯酚包含小于10wt%的量的γ-生育三烯酚和σ-生育三烯酚。因此，根据本发明的实施方式，“富集”制剂意味着，基于所述制剂（或组合物）的总重，包含以多于各个维生素E成分的量的0.1%的量的具体的维生素E成分，例如γ-生育三烯酚或σ-生育三烯酚，或γ-生育三烯酚和σ-生育三烯酚的混合物。

在另一个实施方式中，基于所述富集制剂的总重量，所述浓缩制剂可包含具体的维生素E成分含量为约0.1wt%、0.5wt%、1wt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%、10wt%、15wt%、20wt%、25wt%、30wt%、35wt%、40wt%、45wt%、50wt%、55wt%、60wt%、65wt%、70wt%、75wt%、80wt%、85wt%、90wt%、92wt%、94wt%、96wt%、97wt%或98wt%的总维生素E成分含量。

在一个实施方式中，这里所指的组合物可进一步包含UV阻挡剂。在这个实施方式的范围内，UV阻挡剂是指其自身起到阻挡紫外线辐射的作用的任何化合物或物质，例如氧化锌、氧化钛、氧苯酮、偶氮苯和阿伏苯宗（avobenzone）。

只要所述组合物提供旨在期望的效果，并未引起对患者的不利的效果，这里所指的组合物的量可以任何合适的浓度给药给患者。在一些实施方式中，给药给患者的所述组合物的量可在约1mg至约1500mg之间；在约1mg至约1200mg之间；在约1mg至约1000mg；约1mg至约800mg；约1mg至约500mg；约10mg至约1500mg；约25mg至约1500mg；约30mg至约1500mg；约30mg至约1000mg；约40mg至约1000mg；约10mg至约800mg；或约10mg至约500mg之间。在另一个实施方式中，所述组合物以获得患者血液中约0.5μΜ至约50μΜ之间；约0.5μΜ至约50μΜ之间；约1μΜ至30μΜ之间；或约10μΜ至30μΜ之间的血清水平浓度的量给药。在这个实施方式的范围内，在这里所指的组合物中使用的维生素E成分的量可在约0.5μΜ至约80μM之间；约1μΜ至约60μΜ；约2.5μM至约50μΜ；约4μΜ至约80μΜ；约5μΜ至约50μΜ；约5μΜ；约10μΜ；约15μΜ；约20μΜ；约30μΜ或约50μΜ。在这里所指的组合物中使用的异于维生素E成分且具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分的量可在约1μΜ至约5000μΜ之间；约1μΜ至约4500μΜ；约1μΜ至约3500μΜ；约1μΜ至约3000μΜ；约1μΜ至约2000μΜ；约1μΜ至约1000μΜ；约1μΜ至约500μΜ；约1μΜ至约250μΜ；约5μΜ至约5000μΜ；约10μΜ至约5000μΜ；约20μΜ至约5000μΜ；约50μΜ至约5000μΜ；约100μΜ至约5000μΜ；约200μΜ至约5000μΜ；约300μΜ至约5000μΜ；约10μΜ；约20μΜ；约50μΜ；约60μΜ；约1000μΜ；约3500μΜ，或约4500μΜ。在一个实施方式中，所述患者为动物。动物可为，例如哺乳动物，例如但不限于人、猪、马、小鼠、大鼠、牛、狗或猫。

在一个实施方式中，所述组合物可以软胶囊、眼部保湿棒(eyestick)、硬胶囊、药片、凝胶、糖衣丸、缓释制剂、洗液、药膏、凝胶、喷雾、稀液、体喷雾、面膜、血清、固体化妆棒、唇膏、洗发精、液体肥皂、沐浴油、花露水、护发素、乳脂，例如润肤乳脂；洁面乳，可注射制剂，纳米颗粒形态，或纳米颗粒的乳状液或胶囊形态给药。在另一实施方式中，这里所指的组合物可用于可商购的皮肤组合物，并不限于皮肤变白乳脂，保湿霜等。

在一个实施方式中，所述组合物可以水溶形式给药。因此，如果期望，可通过加入具体的组合物，水溶化这里所指的组合物。例如，可通过配制其成固体分散体，获得这里所指的组合物的水溶形式。其它配制水分散或水溶生育三烯酚形式的方法例如在美国专利5,869,704号中公开。

“固体分散体”定义了在固体状态的系统（相对于液体或气体状态），包含至少两种成分，其中，一种成分完全分散在其它一种或多种成分中。例如，所述组合物的成分可分散于由药学可接受水溶性聚合物和药学可接受表面活性剂组成的基质中。

术语“固体分散体”包括具有一个相分散于另一个相的小颗粒的系统。这些颗粒通常尺寸小于400μm，例如小于100μm、10μm或1μm。当所述组分这样分散时，即所述系统全部化学或物理地均匀或同质，或由一个相组成（如在热力学中定义），这样的固体分散体将称为“固溶体”或“玻璃溶液”。“玻璃溶液”为均匀的玻璃系统，其中，溶质溶于玻璃溶剂。

这样的固体分散体可通过不同的途径给药。例如口服给药的固体剂型包括但不限于胶囊、糖衣丸、颗粒、片剂、粉末和药片。用于配制这样的剂型的常用的赋形剂包含胶囊材料或配方添加剂，例如吸收促进剂、抗氧化剂、粘结剂、缓冲剂、涂布剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、混合剂、填料、调味剂、湿润剂、润滑剂、防腐剂、推进剂、释放剂、灭菌剂、甜味剂、增溶剂和它们的混合物。

用于口服给药的固体剂型化合物的赋形剂可包阔但不限于琼脂、褐藻酸、氢氧化铝、苯甲酸苄酯、1,3-丁二醇、蓖麻油、纤维素、乙酸纤维素酯、可可油、玉米淀粉、玉米油、棉籽油、乙醇、乙酸乙酯、碳酸乙酯、乙基纤维素、月桂酸乙酯、油酸乙酯、明胶、胚油、葡萄糖、甘油、落花生油、异丙醇、等渗盐水、乳糖、氢氧化镁、硬脂酸镁、麦芽、橄榄油、花生油、磷酸钾盐、马铃薯淀粉、丙二醇、云母、黄芪胶、水、红花油、芝麻油、芝麻素、芝麻酚、羧甲基纤维素钠、十二醇硫酸钠、磷酸钠盐、大豆油、蔗糖、四氢糠醇和它们的混合物。

在一个实施方式中，剂型可包含在基质中的至少一种维生素E成分和至少一种与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分的固溶体或固态分散体。所述基质可包括至少一种药学可接受水溶性聚合物和至少一种药学可接受表面活性剂。合适的药学可接受水溶性聚合物包含但不限于具有至少50℃、或至少60℃，或约80℃至约180℃的玻璃转化温度(T_g)的水溶性聚合物。

具有上面定义的T_g的水溶性聚合物允许机械稳定和在正常温度范围内的充分的温度稳定性的固溶体或固态分散体的制备，以使所述固溶体或固态分散体可在不需要进一步处理的情况下被用作剂型，或压成具有小量的压片助剂的药片。

包括于这里定义的剂型中的所述水溶性聚合物为当在20℃以2%(w/v)溶于水溶液时，具有在1至5000mPa或1至700mPa或5mPa至100mPa的表观粘度的聚合物。

适用在这里所指的剂型中的水溶性聚合物可包括但不限于N-乙烯基内酰胺的均聚物和共聚物，尤其是N-乙烯基吡咯烷酮的均聚物和共聚物，例如聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)，N-乙烯基吡咯烷酮和乙烯基乙酸酯或乙烯基丙酸酯的共聚物；纤维素酯和纤维素醚，尤其是甲基纤维素酯和乙基纤维素酯，羟烷基纤维素，尤其是羟丙基纤维素，羟烷基烷基纤维素，具体地羟丙基甲基纤维素，纤维素邻苯二甲酸酯或琥珀酸酯，尤其是乙酸纤维素邻苯二甲酸酯和羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯或羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯；高分子聚环氧烷基，例如聚环氧乙烷和聚环氧丙烷，和环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物；聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯，例如，甲基丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物、甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸丁酯/甲基丙烯酸2-二甲基氨乙酯共聚物、聚(丙烯酸羟烷酯)、聚(甲基丙烯酸羟烷酯)；聚丙烯酰胺，乙烯基乙酸酯聚合物，例如乙烯基乙酸酯和巴豆酸共聚物，部分水解的聚乙烯基乙酸酯（也称为部分皂化“聚乙烯醇”）、聚乙烯醇；寡糖和多糖，例如卡拉胶、半乳甘露聚糖和黄原胶，或它们一种或多种的混合物。

这里所指的术语“药学可接受的表面活性剂”是指药学可接受的非离子表面活性剂。这里所指的剂型包括至少一种具有12至18，或13至17，或14至16的亲水亲酯平衡(HLB)值的表面活性剂。HLB系统赋予数值给表面活性剂，亲脂物质得到较低的HLB值，亲水物质得到较高的HLB值。

在一个实施方式中，这里所指的剂型包括一种或多种的药学可接受的表面活性剂，选自聚氧乙烯蓖麻油衍生物，例如聚氧乙烯甘油三蓖麻油酸酯或聚乙二醇35蓖麻油(

EL)或聚氧乙烯甘油氧化硬脂酸酯，例如聚乙二醇40羟基化蓖麻油（

RH 40，又称为聚乙二醇40羟基化蓖麻油或聚乙二醇甘油羟基硬脂酸酯）或聚乙二醇60羟基化蓖麻油(

RH 60)；或聚乙二醇(20)山梨糖醇酐的单脂肪酸酯，例如，聚乙二醇(20)单油酸山梨醇酐酯(

80)，聚乙二醇(20)单硬脂酸山梨醇酐酯(

60)，聚乙二醇(20)单棕榈酸山梨醇酐酯(

40)，或聚乙二醇(20)单月桂酸山梨醇酐酯(

20)。还可使用其它包含具有大于18或小于12的HLB的那些表面活性剂，例如，环氧乙烷和环氧丙烷嵌段共聚物，也称为聚环氧乙烯聚环氧丙烯嵌段共聚物或聚环氧乙烯聚丙二醇，例如

124、

188、

237、

388或407。

当使用两种或更多种表面活性剂时，所述具有12至18的HLB值的表面活性剂占使用的表面活性剂的总重的优选至少50wt%，更优选至少60wt%。

这里所指的剂型还包括另外的赋形剂或添加剂，例如，流量调节剂、润滑剂、填充剂（填料）和分解质。这样的另外的赋形剂可为无限制地占所述总剂型的0wt%至15wt%。

这里所指的剂型可以由几个层组成的剂型提供，例如层压或多层的药片。它们可为敞开或封闭的形式。“封闭的剂型”为其中一层被至少一种其它层完全包围的那些。多层形式具有两种彼此互相不相容的活性成分可被加工，或活性成分的释放特性可被控制的优点。例如，有可能通过在外层的一个中包含活性成分提供初始剂量，并通过在内层中包含活性成分提供维持剂量。可通过压紧两层或多层颗粒生产多层药片类型。

此外，在药片上的膜包衣可有助于药片易于被吞咽。膜包衣还可改善口感，并提供好的外观。如果期望，所述膜包衣可为肠溶包衣。所述膜包衣通常包含形成聚合膜的材料，例如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、和丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯共聚物。除了形成膜聚合物，所述膜包衣可进一步包括塑化剂，例如聚乙二醇，表面活性剂，例如

类型，并且可选择地颜料，例如，氧化钛或氧化铁。所述膜包衣还可包含作为抗粘合剂的云母。所述膜包衣通常占小于5wt%的所述剂型。

配置这里所指的组合物的其它具体形态包括但不限于生育三烯酚的天然油液体，例如可用于软凝胶制造的棕榈油、可用于软饮料制造的水溶乳状液形态、可用于软胶囊和药片制造的冷水可分散粉末、或可用于硬胶囊制造的微粒。

对这里所指的水溶乳液形态的所述组合物的制造，生育三烯酚液体用作起始材料，加入甘油和乳状剂混合。然后，混合物均匀化成乳状剂。

可用于水溶乳化液的剂型的乳化剂的实例包含但不限于甘油脂肪酸酯、单甘油乙酸酯、单甘油乳酸酯、单甘油柠檬酸酯、单甘油琥珀酸酯、双乙酰酒石酸单甘油酯、聚甘油脂肪酸酯、聚甘油聚蓖麻油酸酯、脂肪酸脱水山梨糖醇酯、脂肪酸丙二酯、淀粉衍生物、表面活性剂、脂肪酸蔗糖酯、硬脂酰二乳酸钙、卵磷脂、或酶消化的卵磷脂/酶处理的卵磷脂。

这里所指的所述组合物的冷水可分散粉末可通过提供生育三烯酚油液体作为起始材料而制造。将乳化剂，例如改性玉米淀粉、麦芽糖糊精、环糊精或玉米淀粉，加入生育三烯酚油中。然后，所述混合物可喷雾干燥成干燥的粉末。

包括这里所指的组合物的微粒可通过提供生育三烯酚油液体作为起始材料而制造。然后，在一个实施方式中，将明胶、玉米淀粉、蔗糖和抗坏血酸棕榈酸酯加入生育三烯酚油中。所述混合物可喷雾干燥成干燥的微粒。

可注射制剂允许上述上面的组合物以精确计算的剂量通过皮下、肌肉或腹膜内(i.p.)注射引入和传输到动物体的循环系统。丙二醇是常用于这样的制剂的溶剂。在另一个实施方式中，所述组合物以油包水的制剂配制。

只要能获得想达到的治疗或化妆效果，这里所指的组合物可以任何合适的方式给药给患者。在一些实施方式中，例如，可通过局部、眼内或全身或口服，或直肠或黏膜，或肠内或肌肉，或皮下，或骨髓，或鞘内，或直接心室内，或静脉内，或玻璃体内，或腹膜内，或鼻内给药所述组合物给患者。

所述药物组合物进一步包括药物可接受载体或赋形剂。只要所述载体与制剂的其它成分相容，并对患者无害，所述“载体”或“赋形剂”可包括任何药物可接受载体。因此，根据本发明可用的药学组合物可用一种或多种包含赋形剂和助剂的生理可接受载体以常规的方式配制，所述赋形剂和助剂促进活性成分进入可药用的制剂中的过程。合适的制剂由所选的给药途径决定。药物可接受载体或赋形剂可为纤维素、羟甲基纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素酯(CAP)结冷胶、多元醇、聚乙烯醇、透明质酸、聚丙烯酸、羧乙烯聚合物、泊洛沙姆、聚(氧化乙烯)和聚(氧化丙烯)和其嵌段共聚物、聚环氧乙烷、聚卡波非、壳聚糖、环糊精、脂质体、纳米颗粒、包含微球体和纳米球的微颗粒、囊泡、药质体、胶原盾、眼膜（ocular film）或它们的组合中的任一个。

在本发明的再一个方面，提供了一种药物组合物，包含至少一种维生素E成分和至少一种与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分，其中，所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分选自由抗氧化剂、酪氨酸酶抑制剂、多酚、维生素、抗酪氨酸酶RNA干扰剂、抗酪氨酸酶肽或它们的混合物组成的组中。

在本发明的再一个方面，提供一种药膏或乳脂，包含这里说明的药物组合物。

在本发明的另一个方面，提供了由一种产品，包含或由酰化3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-11-三癸烯基)-2H-1-苯并吡喃-6-醇组成。在一个实施方式中，3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-11-三癸烯基)-2H-1-苯并吡喃-6-醇可为乙酰化的。

这里示例性说明的本发明在缺少这里没有具体公开的任何单个或多个元件、单个或多个限制的情况下，可合适地实施。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“包括”等应扩大地理解，且没有限制。此外，这里使用的术语和表述已经用作说明书的术语，并且无限制，没有在使用这样的术语和表述中排除显示和说明的特征或其部分的等价方式的目的，而认为各种改变可能在本发明主张的范围内。因此，应理解虽然本发明已经被优选的实施方式和可选择的特征具体地公开，本领域普通技术人员可采用这里公开的那里包含的本发明的改变和变化，认为这样的改变和变化在本发明的范围内。

这里已经广泛地和遗传地说明了本发明。落在本公开范围内的较窄的种类和亚属分组的每个也形成本发明的部分。无论离体的材料是否在此具体地引用，这包含本发明的一般描述，限制或局限为从属中排除任何主题。

其它实施方式在下面的权利要求和非限制实例的范围内。此外，当本发明的特征和方面根据马库什组说明时，本领域普通技术人员可认识到本发明因此根据马库什组部件的任何单个部件和亚类说明。

实施例

实施例1：材料和方法

B16小鼠黑素瘤细胞购自（美国弗吉尼亚州马纳萨斯的ATCC）。这个细胞系的基础培养基为达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)。为制备完全生长培养基，将胎牛血清（终浓度10%）加到基础培养基中。用分子蒸溜和

装置（法国庞培Novasep）从棕榈脂肪酸蒸馏液(PFAD)中纯化生育三烯酚(T3)和生育酚(TP)异构体和富含棕榈生育三烯酚部分(TRF)。提取设备位于新加坡的Tuas。所述PFAD供给购自Kuala LumpurKepong Berhad（马拉西亚Kuala Lumpur）。通过HPLC和气相色谱法（GC）峰面积的百分比检验所述维生素E异构体的纯度。

实施例2：棕榈维生素E乙酸酯的合成

10g的棕榈VE溶于20至50ml的乙醇或乙醇/水混合物（溶剂）中，冷却至﹣20℃至﹣40℃以去除杂质，例如鲨稀和游离脂肪酸(FFA)。去除溶剂后，纯化的棕榈VE与30至100ml的乙酸酐混合，并加入0.1至0.3g的三甲基胺。在催化剂吡啶的存在下，从50℃至100℃的温度循环，在N₂下搅拌所述混合物1至9个小时（O'Byrne等，Studies of LDL oxidation following alpha-,gamma-,or delta-tocotrienyl acetatesupplementation of hypercholesterolemic humans.Free Radical Biology & Medicine，29，834-45，2000）。通过在60℃至100℃的范围内真空蒸馏，去除剩余的乙酸酐和其相应的酸及催化剂。剩余物溶于20ml的己烷，并用20ml稀释的NaHCO₃水溶液洗，然后用20ml的水洗。获得的有机层在减压下干燥，以提供深黄色油。如在美国专利4517057号中所述，这些剩余的VE乙酸盐进一步在160℃至240℃和小于0.01m bar下通过短程蒸馏（SPD）纯化。获得具有VE乙酸盐成分的清澈的黄色油，并未检测到游离VE。总产率约85%。

实施例3：紫外分光光度法和发射器

用具有光电二极管阵列(PDA)的Agilent 8453紫外可见分光光度计（美国加利福尼亚州圣克拉拉Agilent Technologies）在200至500nm的范围内用1cm试管研究UV光谱。用UVP UVM-57手提UV灯（美国加利福尼亚州Upland，UVP股份有限公司）提供所述用于细胞辐射的UVB源。

实施例4：细胞活力研究和时程实验

为研究细胞活力，在100μl的培养液中重悬浮的5×10³细胞在放入96孔板的每个孔中。然后用不同浓度的维生素E的异构体处理所述细胞24小时。这个处理后，将20μl的MTT溶液（在PBS中1mg/ml，美国密苏里州圣路易斯，Sigma-Aldrich）加到每个孔中，然后在37℃培养细胞2小时。然后将甲瓒（formazan）晶体重悬浮于200μl的DMSO中，并测量在595nm的强度。每个实验在三个的孔中重复三次，生长曲线显示平均值和标准方差。

实施例5：免疫印迹

详细的方法已经在Chu等，A novel anticancer effect of garlic derivatives:inhibitionof cancer cell invasion through restoration of E-cadherin expression，Carcinogenesis，2006，27，2180-9。简要地，通过在裂解缓冲液（50mmol/1 Tris-HCl[pH 8.0]，150mmol/1 NaCl，1%NP40，0.5%脱氧胆酸盐，0.1%SDS，1mg/ml抑肽酶，1μg/ml亮肽酶素和1mmol/1苯甲磺酰氟）中悬浮细胞颗粒制备裂解细胞裂解物。用DC蛋白分析试剂盒（美国加利福尼亚州Hercules，Bio-Rad）测量蛋白浓度。将等量的蛋白(30μg)加到10%SDS的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移到聚偏(二)氟乙烯膜（美国新泽西州Piscataway，Amersham）。然后，所述膜与抗酪氨酸酶和β肌动蛋白的一级抗体Idl（美国加利福尼亚州Santa Cruz，Santa Cruz Biotechnology股份有限公司）室温培养1小时，用合适的二级抗体培养后，用ECL蛋白印迹系统(Amersham)显示信号。评定β肌动蛋白的表达为总细胞裂解物的内标。

实施例6：PCR反转录

根据厂商的说明用Trizol试剂（美国加利福尼亚州Carlsbad，Invitrogen）提取总RNA。用Superscript First Strand Synthesis System（美国加利福尼亚州Carlsbad，Invitrogen）合成cDNA，然后用酪氨酸酶特异引物（正向引物，酪氨酸酶-S，5'-TTCAACCCTTTTCTATGTCC-3'[-2236/-2217]（序列号：1）和反向引物，酪氨酸酶-AS，5'-TCATACAAGATCTGCACCAA-3'[+63/+42])（序列号：2））PCR扩增，用GAPDH特异引物：5'至3'F ATGACATCAAGAAGGTGGTG（序列号：3）；5'至3'RCATACCAGGAAATGAGCTTG（序列号：4）PCR扩增。PCR循环条件如下：在95℃30个循环10分钟，95℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟和72℃10分钟。扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内标。在2%的琼脂糖上凝胶上电泳所述PCR产物，并用凝胶记录系统分析。

实施例7：黑素原测量

在经化合物处理（20μΜγΤ3和δΤ3；分别为0.05%、0.5%和1%的棕榈TRF、乳酸钠和曲酸；和0.05-5ng/ml维甲酸；Sigma-Aldrich）的不同处理周期前，将B16黑素瘤细胞（5×10⁶细胞/孔）在6孔板中培养至少16小时。在不同的时间点，用胰蛋白酶-EDTA收获细胞，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞颗粒一次。将每个化合物处理组的样品量分成两等份。这些细胞颗粒在测量酪氨酸酶活性和黑色素含量前在﹣80℃储存。

实施例8：酪氨酸酶活性

收获的细胞颗粒在具有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液（10mM Tris-HCl[pH 7.5]、1%NP-40、0.1%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、150mM氯化钠和1mM EDTA）中均匀化，并放在冰上30分钟。样品在4℃在15,000g离心样品30分钟后，收集上清液。每100μl的上清液中加入200μl的0.3%L-DOPA(Sigma-Aldrich)。所有样品，包含RIPA缓冲液的空白对照和0.3%L-DOPA，在37℃下培养20分钟。然后，在475nm测量每个样品的多巴色素组成。处理组相对于未处理组的吸光率百分比值根据总蛋白含量的每μg计算，用DC蛋白检验（美国佛罗里达州Hercules，Bio-Rad）确定总蛋白含量。

实施例9：黑色素含量

收获的细胞颗粒在于80℃培养前，溶于1ml的1N氢氧化钠。然后立即在420nm测量黑色素含量。处理组相对于未处理组的吸光率百分比值根据确定的总蛋白含量的每μg计算。

实施例10：B16异种移植模型的建立

实验方法被位于Biopolis（IACUC号080302）的A-STAR生物资源中心(BRC)IACUC委员会批准。雄性BALB/c无胸腺的裸鼠（4至5周大小，18-22g）购自Jackson实验室（美国缅因州，Bar Harbor）。在标准条件（20.8±2℃，55±1%相对湿度，12小时晚上/白天周期）和在无菌环境中提供啮齿动物饮食（美国印第安纳州印第安纳波利斯，Harlan实验室公司）和氯化反渗透水，安置老鼠于生物资源中心（新加波，Biopolis）的1部中。简略地，用20μΜ的γ-Τ3和δ-Τ3，或棕榈TRF预处理B16细胞一周。然后，将在100μl不含血清的DMEM中的5×l0⁵预处理的B16细胞用具有26-计量注射针（美国新泽西州Franklin Lakes，Becton Dickinson）的1ml注射器皮下注入裸鼠的腹侧。然后口服在100mg/kg/天剂量的γ-Τ3和δ-Τ3或棕榈TRF补充品2周。总共有4个实验组：Gl，载剂对照；G2，γΤ3(100mg/kg/d)；G3，δT3(100mg/kg/d)；和G4，全谱棕榈TRF(100mg/kg/d)。每日称重老鼠，并在接种后第5天和第14天，用数字碳纤维尺（美国宾夕法尼亚州Pittsburgh，Fisher Scientific）测量肿瘤。处理14天后，通过CO₂吸入处死老鼠。用26-计量注射针通过心脏出血收集血液样品。血液样品在室温培养30分钟，然后在4℃4400rpm离心30分钟。从血浆分离悬浮的血清，并在﹣80℃储存。收获肿瘤、肝、肾、脾、心和皮肤。

1.1 T3异构体和酪氨酸酶抑制剂的抗增殖效力

以增加的剂量用α生育三烯酚(α-T3)、β-生育三烯酚(β-T3)、γ-生育三烯酚(γ-Τ3)、δ-生育三烯酚(δ-Τ3)和乳酸钠、曲酸和α熊果苷处理B16黑素瘤细胞24小时。已证明β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚以剂量依赖的方式抑制B16黑素瘤细胞的增殖率（图1A和1B）。在研究的酪氨酸酶抑制剂中，曲酸显示具有在＞0.5%浓度的抗增殖效力（图1C）。免疫印迹的进一步研究显示β-Τ3、γ-Τ3和δ-Τ3及曲酸诱导细胞凋亡，如证据来自裂解的半胱天冬酶3和PARP的活化（图2A和2B）。

1.2 T3异构体和酪氨酸酶抑制剂的抗酪氨酸酶效力

用αΤΡ、γ-Τ3和δ-Τ3异构体及2个酪氨酸酶抑制剂（曲酸和乳酸钠）处理B16黑素瘤细胞。RT-PCR结果显示酪氨酸酶基因的mRNA转录没有被所有研究的处理影响（图3A）。然而，免疫印迹结果显示20μΜγ-Τ3和δ-Τ3处理导致B16黑素瘤细胞中显著地酪氨酸酶蛋白表达的抑制。γΤ3对酪氨酸酶蛋白表达的抑制更强（图3B和4B）。相反，20μΜ曲酸和乳酸钠处理未导致可看得见的酪氨酸酶蛋白表达的下调。然而，用更高剂量的曲酸和乳酸钠(≥0.05%)导致对酪氨酸酶酪氨酸酶蛋白表达的显著抑制（图4B）。

为研究所有棕榈TRF成分对酪氨酸酶抑制的剂量相应，用增加剂量的所有棕榈TRF异构体，包括αTP，处理B16黑素瘤细胞。如图3B所示，只有γ-Τ3和δ-Τ3以剂量依赖的方式诱导对酪氨酸酶的显著抑制。此外，用20μΜ的棕榈TRF混合物及其乙酸盐处理B16黑素瘤细胞还导致对酪氨酸酶蛋白表达连续的抑制（图4A）。棕榈TRF的抑制水平与单独使用γ-Τ3和δ-Τ3异构体相似。

为研究γ-Τ3和δ-Τ3、αΤΡ和酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶抑制的时间响应，用单剂量的γ-Τ3和δ-Τ3异构体、aTP、乳酸钠和曲酸处理B16黑素瘤细胞直至48小时。显示通过处理周期由24小时提高至48小时，增强了γ-Τ3和δ-Τ3异构体的酪氨酸酶蛋白表达的抑制（图6）。然而，当乳酸钠和曲酸处理周期由24小时提高至48小时，确定了相反观测，表明两种制剂的抑制可为短暂的。

1.3 T3异构体和酪氨酸酶抑制剂处理的细胞中的酪氨酸酶活性和黑色素含量

测定在对照培养基(DMEM+10%FBS)和处理的培养基中黑色素合成率和总黑色素含量。黑色素合成率由酪氨酸酶活性分析表示。在图7和8提供了代表性实例的结果。当通过用总活性除以细胞数目归一化细胞生长中的酪氨酸酶活性的差异时，用γ-Τ3和δ-Τ3和棕榈TRF处理的B16黑素瘤细胞在对照中具有<45%的酪氨酸酶活性。酪氨酸酶活性活性的抑制保持直到处理后第15天（图7A）。15天后，用γΤ3处理的B16黑素瘤细胞与对照相比具有<15%的酪氨酸酶活性。图7B显示γΤ3处理后第9天酪氨酸酶活性与用0.05%曲酸处理的类似。由于低的γΤ3处理浓度（0.05%曲酸和乳酸钠分别等于3.52mM和4.46mM），γ-Τ3和δ-Τ3对酪氨酸酶活性的抑制比曲酸和乳酸钠强至少150倍。用γ-Τ3和δ-Τ3处理的黑素瘤细胞培养基的黑色素含量在第5天和第9天分别比对照低45%和30%（图7C）。γΤ3处理后B16黑素瘤细胞的黑色素含量比用0.05%的乳酸钠和曲酸处理的样品稍微低（图7C）。

1.4表明γ-Τ3和δ-Τ3抗黑素生成的体内和体外证据

这个研究报道了γ-Τ3和δ-Τ3、棕榈TRF，和酪氨酸抑制剂在B16黑素瘤细胞中抑制诱导黑素生成的能力。检查免疫功能低下老鼠中细胞颗粒和移植实体瘤的色素沉着水平。试验结果示于图9。图9中，通过拍摄用空白（对照）、δΤ3、γΤ3、αΤΡ、棕榈TRF、20μΜ乳酸钠、20μΜ曲酸、0.05%乳酸钠和0.05%曲酸（面板从左至右）处理的细胞颗粒，直接证明色素的量。在用γΤ3、δΤ3、棕榈TRF、0.05%乳酸钠和0.05%曲酸处理的样品中观测到较轻的色素沉着。图11中，14天的T3补充后，实体瘤的色素沉着不仅比对照较轻，γΤ3和δΤ3组的肿瘤的大小也比对照小（图11）。

1.5γ/δΤ3与曲酸和乳酸钠的协同作用

检测γ-Τ3和δ-Τ3单独或与曲酸、乳酸钠和维甲酸结合的效力。如图17所示，在与γ-Τ3和δ-Τ3、曲酸和乳酸钠共处理后，每个细胞的酪氨酸酶活性显著地低于用γ-Τ3和δ-Τ3、曲酸和乳酸钠单独处理。用免疫印迹（图17B至C）证明γ-Τ3和δ-Τ3、曲酸共处理与γ-Τ3或δ-Τ3或曲酸单独处理相比增强了抑制酪氨酸酶蛋白表达。

1.6γ-和δ-Τ3阻碍紫外诱导的黑素生成

还检测了在B16黑素瘤细胞中，T3阻碍UVB诱导黑素生成的能力。为取得合适的UVB辐射剂量，比较了暴露于不同剂量的UVB后，MTT细胞的增值率。如图16A和16B所示，暴露＞12小时的细胞具有减小的细胞的增值率，如证据来自关键细胞凋亡分子（降解的半胱天冬酶3和PARP)的活化。因此，限制细胞暴露于UVB＜12小时以避免细胞凋亡反应的干扰。图16C和图16D显示了随时间变化的UVB诱导的酪氨酸酶蛋白过表达的抑制。虽然在抑制短期（＜10分钟）UVB诱导的酪氨酸酶活化中δT3比γΤ3更有效，它们的长期抑制效果类似。意外地，TRF乙酸酯（图16C和图16D）和αTP（图16E）在所有检测的时间点不能够阻碍UVB诱导的酪氨酸酶活化。

Claims (37)

1.一种治疗皮肤疾病或预防皮肤疾病发生或改变皮肤色素沉着的方法，包含以药学有效量的组合物对患者给药，所述组合物包括至少一种维生素E成分和至少一种与所述维生素E成分不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分选自由抗氧化剂、酪氨酸酶抑制剂、多酚、维生素、抗酪氨酸酶RNA干扰剂、抗酪氨酸酶肽或它们的混合物组成的组中。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分为皮肤美白剂。

4.如权利要求1至3的任一项所述的方法，其中，所述至少一种维生素E成分选自生育酚、生育三烯酚、生育单烯酚、酰化生育酚、酰化生育三烯酚、酰化生育单烯酚和它们的混合物组成的组中。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述至少一种维生素E成分为至少一种生育酚和至少一种生育三烯酚的混合物，或至少一种酰化生育酚和至少一种酰化生育三烯酚混合物。

6.如权利要求4所述的方法，其中，所述酰化生育单烯酚为生育单烯酚乙酸酯。

7.如权利要求4所述的方法，其中，所述至少一种酰化生育酚、生育三烯酚或生育单烯酚成分为乙酰化的生育酚、生育三烯酚或生育单烯酚。

8.如权利要求4至7的任一项所述的方法，其中，所述生育三烯酚选自由α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚和上述生育三烯酚的混合物组成的组中。

9.如权利要求4至7的任一项所述的方法，其中，所述生育三烯酚选自由α生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和上述生育酚的混合物组成的组中。

10.如权利要求4至7的任一项所述的方法，其中，所述生育单烯酚选自由α-生育单烯酚、β-生育单烯酚、γ-生育单烯酚、δ-生育单烯酚和上述生育单烯酚的混合物组成的组中。

11.如权利要求10所述的方法，其中，所述a-生育单烯酚为3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-11-三癸烯基)-2H-l-苯并吡喃-6-醇或3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-12-三癸烯基)-2H-l-苯并吡喃-6-醇。

12.如权利要求1至11的任一项所述的方法，其中，所述至少一种维生素E成分为γ-生育三烯酚，或δ-生育三烯酚，或富含生育三烯酚部分(TRF)，或酰化γ-生育三烯酚，或酰化δ-生育三烯酚，或酰化TRF或它们的混合物。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述酰化γ-生育三烯酚或酰化δ-生育三烯酚或酰化TRF为乙酰化的γ-生育三烯酚或乙酰化的δ-生育三烯酚或乙酰化的TRF。

14.如权利要求1至13的任一项所述的方法，其中，所述皮肤疾病为皮肤病症。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述皮肤病症选自由增加的黑色素引起的皮肤暗沉、皮肤色素沉着过度、皮肤炎症、皮肤普通痤疮、伤口愈合、皮肤光老化、皮肤皱纹、吸烟者的黑变病、黑斑病、黑棘皮病、库兴氏病、爱迪生氏病、黑线、汞中毒组成的组中。

16.如权利要求1至15的任一项所述的方法，其中，所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分选自由维生素A、维生素A衍生物、维生素B、维生素B衍生物、维生素C、维生素C衍生物、醌、对苯二酚、乳酸盐、曲酸、曲酸衍生物、α-羟基酸、熊果苷、羟基乙酸、对苯二酚、谷胱甘肽、L-谷胱甘肽、壬二酸、糖皮质激素、桑椹提取物、粗糙帽果提取物、黄瓜提取物、甘草提取物、石榴提取物、熊果叶（熊果）提取物、六亚甲基二乙酰胺、丁酸钠、二甲亚砜、合成的羟基取代的苯基萘和衍生物；一元酚，例如2,6-二-叔丁基-4-甲酚、2,6-二-叔丁基-4-乙酚等；和二元酚、例如4,4'-亚甲基双(2,6-二-叔丁基酚)、2,2'-亚甲基双(4-乙基-6-叔丁基酚)、维甲酸、衣霉素、N-乙酰葡糖胺、透明质酸、凝血酸、胎盘提取物、鞣花酸、EDTA、植酸、芦荟素、二硫辛酸、蛋白酶激活受体(PAR2)和大豆胰岛素抑制剂。

17.如权利要求16所述的方法，其中，所述乳酸盐选自由乳酸钾、乳酸钠、乳酸镁、乳酸铵和乳酸钙组成的组中。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分选自由乳酸钠、对苯二酚、L-谷胱甘肽、曲酸、熊果苷和维甲酸组成的组中。

19.如权利要求1至18的任一项所述的方法，其中，所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分为选自由miRNA、siRNA和反义RNA组成的组中的抗酪氨酸酶RNA干扰剂。

20.如权利要求19所述的方法，其中，所述miRNA为mi434-5P miRNA。

21.如权利要求1至20的任一项所述的方法，其中，所述组合物以约1mg至约1000mg之间或约10mg至500mg之间的量给药。

22.如权利要求1至20的任一项所述的方法，其中，以获得患者血液中约1μΜ至30μΜ之间或约10μΜ至30μΜ之间血清水平浓度的量给药所述组合物。

23.如权利要求1至22的任一项所述的方法，其中，所述患者为动物。

24.如权利要求23所述的方法，其中，所述动物为哺乳动物。

25.如权利要求24所述的方法，其中，所述哺乳动物选自由人、猪、马、小鼠、大鼠、牛、狗和猫组成的组中。

26.如权利要求1至25的任一项所述的方法，其中，所述组合物以软胶囊、硬胶囊、药片、凝胶、糖衣丸、缓释制剂、药膏、乳脂、润肤乳脂、洁面乳、眼部保湿棒、可注射制剂、纳米颗粒形态或胶囊形态给药。

27.如权利要求1至25的任一项所述的方法，其中，所述组合物以水溶形态给药。

28.如权利要求1至27的任一项所述的方法，其中，所述组合物以口服或局部给药。

29.如权利要求1至28的任一项所述的方法，其中，所述组合物进一步包括药学可接受赋形剂。

30.如权利要求1至29的任一项所述的方法，其中，所述至少一种维生素E成分被包含在富集制剂中，其中，所述富集制剂基于所述富集制剂的总重，包括大于0.1wt%的具体的维生素E成分。

31.如权利要求30所述的方法，其中，基于所述富集制剂的总重，所述富集制剂包括的所述具体维生素E成分的量选自由0.1wt%、0.5wt%、1wt%、2wt%、3wt%、4wt%、5wt%、10wt%、15wt%、20wt%、25wt%、30wt%、35wt%、40wt%、45wt%、50wt%、55wt%、60wt%、65wt%、70wt%、75wt%、80wt%、85wt%、90wt%、92wt%、94wt%、96wt%、97wt%和98wt%的总维生素E成分组成的组中。

32.如权利要求1至31的任一项所述的方法，其中，所述组合物进一步包含UV阻挡剂。

33.如权利要求32所述的方法，其中，所述UV阻挡剂选自由氧化锌、氧化钛、氧苯酮、偶氮苯和阿伏苯宗组成的组中。

34.一种药物组合物，包含至少一种维生素E成分和至少一种与维生素E不同的具有抗酪氨酸酶活性和/或抗黑素生成活性的附加成分，其中，所述至少一种与所述维生素E成分不同的附加成分选自由抗氧化剂、酪氨酸酶抑制剂、多酚、维生素、抗酪氨酸酶RNA干扰剂、抗酪氨酸酶肽或它们的混合物组成的组中。

35.一种药膏或乳脂，包括权利要求34所述的药物组合物。

36.一种产品，包括或由酰化3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-11-三癸烯基)-2H-1-苯并吡喃-6-醇组成。

37.如权利要求36所述的方法，其中，3,4-二氢-2,5,7,8-四甲基-2-(4,8,12-三甲基-11-三癸烯基)-2H-l-苯并吡喃-6-醇是乙酰化的。

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