CN103013737B - Ea风味调味酒的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的EA风味调味酒的生产方法，属于酿酒技术领域。本发明要解决的技术问题是现有的该风味调味酒的生产方法产酯量低，风味质量不高，勾调难度大。本发明解决技术问题的技术方案是EA风味调味酒的生产方法，该方法利用异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002 CGMCC No.5955发酵，蒸馏生产EA风味调味酒。本发明方法发酵周期短，产酯更高。

Description

EA风味调味酒的生产方法

技术领域

本发明涉及EA风味调味酒的生产方法，属于酿酒技术领域。

背景技术

高档次白酒深受消费者欢迎，但质高量少，其价格也逐年上涨。大量高档次以下的白酒需要使用呈香呈味物质含量较高的调味酒来进行勾调，从而达到较高的质量水平，符合相应的质量标准。

白酒调味是在基础酒的基础上进行精加工，是一项细致的工作，调味酒的用量虽小但效果显著。验收后的合格酒，经过勾兑就成为基础酒，已接近产品标准。但仍有不足之处，则可通过调味使产品保持稳定和提高。因此，调味酒在调味过程中的作用就显得尤为重要，要做好调味工作，就需要高质量、多品种的调味酒。

调味酒主要分为以下几类：①双轮底调味酒：主要为浓香型白酒生产中，利用双轮发酵的双轮底酒，即底窖酒。相比正常生产的精华酒，香气好，酯香浓，具有浓香型白酒的典型性香气，口味正，能改善基础酒质量或具有糟香味。②陈酿调味酒：选用窖泥质量好的、生产正常的老窖池，延长发酵期，以促使其充分产酸与酯化作用，生产出特殊香味的调味酒。延长发酵期的调味酒具有良好的糟香味和浓郁的后味，尤其具有陈酿味，即老熟酒的风味。③老酒调味酒：选择贮存期在3年以上的老酒作为调味酒。经过3年以上贮存后，酒质变得纯和、浓郁，成为具有特殊风味的老酒。老酒味目前只有在长期贮存过程中才能生成。老酒能提高基础酒的陈酿味和风格，使调味工作不可缺少的酒种。④酒头调味酒：酒头中含有大量香味物质，总酯含量高。主要是挥发性酯，所以香浓，刺激性强。随着贮存时间的延长，甲醛、乙醛等燥辣成分挥发和被氧化而减少，并生成芳香成分。乙醇和乙醛缩合生成乙缩醛，次香味成分是其它馏分不能替代的，所以作为风格独特的调味酒使用。⑤酒尾调味酒：选用窖底层酒醅或双轮底酒醅蒸馏出来的酒尾调味酒，入坛并贮存1年以上。酒尾调味酒中含有较多的高沸点物质，可提高基础酒的后味，使酒质回味悠长。⑥酯香调味酒：酯香调味酒是采用特殊的工艺酿造而成的。其中，白酒生产中含量最高的三大酯类物质就是乙酸乙酯（EA）、己酸乙酯和乳酸乙酯。传统酯香调味酒根据产物的不同，其生产方法较多。但为得到复合酯香，通常采用浓香操作工艺加堆积工序的方法，室温堆积20～24h，品温升高到50℃左右后，再拌匀入窖发酵45～60天，总酯含量一般可达1.2g/100mL。⑦酱香、曲香、窖香调味酒。酱香调味酒即酱香型白酒，主要用于其它香型的调味，使酒体香味增长和丰满。曲香调味酒选用优质小麦为酒曲，加入双轮底调味酒中，存放一年，取上清液即成，可增加白酒曲香味。窖香调味酒，又称泥香，选好老窖泥，按2～5%添加到双轮底调味酒中，贮存1年取上清液即成。

EA风味调味酒属于酯香调味酒的一种，应用范围广泛，是最重要的调味酒之一。EA风味调味酒的传统生产方法均采用纯粮固态或半固态的自然发酵工艺模式是以酒精生产为主，在此基础上提高香味物质的含量。由于酒精发酵产生大量影响风味成分的副产物，而传统工艺都采用复合型的酒曲进行调味酒生产，因此，调味酒质量不高，调味难度大。这使得传统工艺模式生产的EA风味调味酒不能满足市场的需求。因此，寻找一种生产高质乙酸乙酯风味调味酒的方法就显得尤为重要。

利用纯菌种生产优质食用酒精已成为一项非常成熟的生物技术。在此前提下，如果能利用高产乙酸乙酯的功能菌株，并通过合适的工艺条件生产，便能获得乙酸乙酯含量较高的EA风味调味酒。从国内外相关技术的现状和发展来看，目前还没有发现利用高产乙酸乙酯的功能菌株生产调味酒中的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种EA风味调味酒的生产方法。

本发明解决技术问题的技术方案是EA风味调味酒的生产方法，该方法利用异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002CGMCC No.5955发酵，蒸馏生产EA风味调味酒。

具体的，所述的发酵是指将异常毕赤酵母JNC-EA002的菌悬液接种到糖化液中；其中，菌悬液的细胞浓度为10⁴～10⁶个/mL，菌悬液与糖化液的体积百分比为2~4%。

进一步的，所述的菌悬液与糖化液体积百分比为2.5~3.5%。

具体的，所述的发酵周期为60~72h，发酵温度为28~30℃。

具体的，在发酵完毕后，将发酵液抽入精馏设备中进行蒸馏浓缩，使调味酒中乙酸乙酯的质量浓度为3000mg/100mL～4000mg/100mL，酒度为58～60%voL。

具体的，所述的糖化液为大麦芽糖化液或/和粮食糖化液。

具体的，所述的粮食糖化液以小麦、玉米、糯米、大米或高粱中的至少一种为原料制成。

具体的，所述的粮食糖化液以小麦为原料制成的小麦糖化液。

进一步的，所述的糖化液为大麦芽糖化液和小麦糖化液各50%混合而成。

进一步的，前述糖化液使用前调节糖含量在11～14糖度（白利糖度，符号°Bx）；调节pH为2.8~4.0，于115～121℃灭菌15～20min；添加体积占添加前糖化液体积2.5~4.5%的酒精，酒精中乙醇的质量分数大于95%。

优选的，调节糖化液的糖含量为12～13糖度。

优选的，调节糖化液的pH为3.2~3.6。

优选的，糖化液中添加的酒精体积占添加前糖化液体积的3~4%。

具体的，所述的大麦芽糖化液的制备方法如下：将大麦芽粉碎，粉碎细度为能通过20目筛的细粉含量占大麦芽总量的70～80%；加水混合，大麦芽与水质量比为1︰4~1︰5，于58℃～60℃液化、糖化6~8小时；以糖化液滴加稀典液后不变蓝为液化、糖化的终点，过滤，即可。

具体的，所述的粮食糖化液的制备方法包括如下步骤：将粮食原料粉碎，粉碎细度为能通过20目筛（即筛子20孔/cm³）的细粉含量占粮食总量的70～80%；加水混合，粮食原料与水质量比为1︰4~1︰5，调整pH为5.0～7.0；加入耐高温α-淀粉酶液化；滴加稀典液后不变蓝即结束液化；调整pH为4.0～5.0，加入糖化酶糖化使葡萄糖值达到95%以上，即得糖化液。

具体的，所述的粮食糖化液的制备方法包括如下步骤：将粮食原料粉碎，粉碎细度为能通过20目筛的细粉含量占粮食总量的70～80%；加水混合，粮食原料与水质量比为1︰4~1︰5，调整pH为5.0～7.0；加入质量分数为0.10～0.15%的氯化钙；加入耐高温的α-淀粉酶；搅拌均匀，用泵打入喷射液化器，升温到95～97℃，保温60～70min；进行2次喷射，使温度升高到140～145℃，保温3～5min；经真空闪急冷却系统，将温度降低到95～97℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化25～35min，滴加稀典液后不变蓝即结束液化；将液化液冷却至55～60℃，调整pH为4.0～5.0，加入曲霉糖化酶，糖化16～24h，使葡萄糖值达到95%以上，即得糖化液。

本发明有益效果在于：

采用纯菌种代替传统复合型大曲生产EA（乙酸乙酯）风味调味酒，纯度高，发酵副产物少，杂醇油、醛酮类物质、高级脂肪酸酯和有机酸的总含量较低，有利于减小调味的难度。本发明方法使用产乙酸乙酯能力强的异常毕赤酵母JNC-EA002，发酵液中乙酸乙酯含量最高可达到850～900mg/100mL。本发明方法可使用原料品种多，应用范围广；原料消耗低，发酵周期短，不超过72h。本发明方法生产的EA风味调味酒，清香纯正、乙酸乙酯气味突出，酒体醇和、绵柔，香味协调、尾味净爽等风味特征。同时，将该产品应用于浓香型基础酒中，可使酒体更加柔和，协调性更好，口感更加丰满。

本发明所述的异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002CGMCC No.5955，该菌株于2012年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

附图说明

图1、多株菌株代谢产物中乙酸乙酯的含量，纵坐标为乙酸乙酯的含量（单位g/L）。

图2、出发株和诱变株产酯能力分析，纵坐标为乙酸乙酯的含量（单位g/L）。

图3、不同种类粮食接种JNC-EA002后产乙酸乙酯含量，横坐标为乙酸乙酯的含量（单位g/L）。

图4、大麦芽糖化液和小麦小麦糖化液不同粮配比发酵产乙酸乙酯含量，横坐标为大麦芽糖化液在糖化液中所占比例。

图5、不同pH与乙酸乙酯生成量的关系图。

图6、不同接种量与乙酸乙酯生成量的关系图。

图7、不同酒精添加量与乙酸乙酯生成量的关系图。

图8、不同糖度与乙酸乙酯生成量的关系图。

图9、本发明EA风味调味酒生产流程图。

图10、实施例7中传统EA风味调味酒生产方法的工艺流程图。

具体实施方式

本发明的EA风味调味酒的生产方法，该方法利用异常毕赤酵母Pichia anomalaJNC-EA002CGMCC No.5955发酵，蒸馏生产EA风味调味酒。

具体的，所述的发酵是指将异常毕赤酵母JNC-EA002的菌悬液接种到糖化液中；其中，菌悬液的细胞浓度为10⁴～10⁶个/mL，菌悬液与糖化液的体积百分比为2~4%。

进一步的，所述的菌悬液与糖化液体积百分比为2.5~3.5%。

具体的，所述的发酵周期为60~72h，发酵温度为28~30℃。

具体的，在发酵完毕后，将发酵液抽入精馏设备中进行蒸馏浓缩，使调味酒中乙酸乙酯的质量浓度为3000mg/100mL～4000mg/100mL，酒度为58～60%voL。采用精馏设备能够保证乙酸乙酯高效、稳定的回收。在白酒生产过程中，原酒的酒度一般在70%voL左右，通常将原酒调至50~65%voL的基础酒进行贮存或使用。因此，本发明中蒸馏时控制EA风味调味酒的酒度在58~60%voL，酒度满足基础酒的范围，此情况下可直接使用。

具体的，所述的糖化液为大麦芽糖化液或/和粮食糖化液。

具体的，所述的粮食糖化液以小麦、玉米、糯米、大米或高粱中的至少一种为原料制成。

进一步的，所述的糖化液为大麦芽糖化液和小麦糖化液各50%混合而成。

进一步的，前述糖化液使用前调节糖含量在11～14糖度（白利糖度，符号°Bx）；调节pH为2.8~4.0，于115～121℃灭菌15～20min；添加体积占添加前糖化液体积2.5~4.5%的酒精，酒精中乙醇的质量分数大于95%。

优选的，调节糖化液的糖含量为12～13糖度。

优选的，调节糖化液的pH为3.2~3.6。

优选的，糖化液中添加的酒精体积占添加前糖化液体积的3~4%。

具体的，所述的大麦芽糖化液的制备方法如下：将大麦芽粉碎，粉碎细度为能通过20目筛的细粉含量占大麦芽总量的70～80%；加水混合，大麦芽与水质量比为1︰4~1︰5，于58℃～60℃液化、糖化6~8小时；以糖化液滴加稀典液后不变蓝为液化、糖化的终点，过滤，即可。

具体的，所述的粮食糖化液的制备方法包括如下步骤：将粮食原料粉碎，粉碎细度为能通过20目筛（即筛子20孔/cm³）的细粉含量占粮食总量的70～80%；加水混合，粮食原料与水质量比为1︰4~1︰5，调整pH为5.0～7.0；加入耐高温α-淀粉酶液化；滴加稀典液后不变蓝即结束液化；调整pH为4.0～5.0，加入糖化酶糖化，使葡萄糖值达到95%以上，即得糖化液。

具体的，所述的粮食糖化液的制备方法包括如下步骤：将粮食原料粉碎，粉碎细度为能通过20目筛的细粉含量占粮食总量的70～80%；加水混合，粮食原料与水质量比为1︰4~1︰5，调整pH为5.0～7.0；加入质量分数为0.10～0.15%的氯化钙；加入耐高温的α-淀粉酶；搅拌均匀，用泵打入喷射液化器，升温到95～97℃，保温60～70min；进行2次喷射，使温度升高到140～145℃，保温3～5min；经真空闪急冷却系统，将温度降低到95～97℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化25～35min，以滴加稀典液后不变蓝即结束液化；将液化液冷却至55～60℃，调整pH为4.0～5.0，加入曲霉糖化酶，糖化16～24h，使葡萄糖值达到95%以上，即得糖化液。

本发明的菌株异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002，是从剑南春集团有限责任公司的曲药和糟醅中分离得到，先通过生产性能选育，再经过进一步紫外线（UV）诱变所获得的一株高产乙酸乙酯的菌株。该菌株于2012年4月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.5955。

本发明EA风味调味酒生产流程见图9。具体步骤如下：

1、接种发酵前的准备工作，主要包含种子培养和糖化液的制备，且两个步骤同时进行。

1）种子培养：包含冷冻小管的制备和各级种子培养。

A、冷冻小管的制备：取一支保藏异常毕赤酵母JNC-EA002的冻干管，放入20～24℃的水浴中迅速解冻。将冻干管口在酒精灯火焰上灼烧15～20s，迅速滴上1～2滴冷却至室温的无菌水，使冻干管口炸裂。用镊子轻敲管口，使管口部玻璃掉落。用无菌吸管或移液器迅速吸取1.5mL无菌水到冻干管中，与干酵母混合成菌液。再将菌液用2mL的无菌吸管或移液器吸出，注入到300mL麦芽汁培养基（糖度11～14，pH值2.8~4.0，使用食品级的浓盐酸稀释4倍后调节）中，28～30℃，恒温振荡培养16～24小时（可通过连续检测细胞浓度或使用显微镜进行在线观测来确定该菌株对数生长期）。加入2～3%的甘油，混匀。将上述含培养基的菌液分装成若干冷冻小管，每支2mL的冷冻小管分装1.8mL菌液。将制作好的冷冻小管迅速放入-80℃至-40℃的超低温冰箱中保存备用。

B、各级种子培养：同批次制作大量的冷冻小管，可保证EA风味调味酒生产的稳定性。但应用于大规模生产，还需各级种子培养来扩大生产使用菌种的数量。本发明所述的种子培养过程，均使用麦芽汁培养基（糖度11～14，pH值2.8~4.0）培养。以下为扩培方法：根据生产需要，取一支或多支已制备好的冷冻小管，放入20～24℃的水浴中迅速解冻。将每支冷冻小管中所盛装的1.8mL菌液全部倒入装有100mL麦芽汁琼脂培养基的250mL三角瓶中，28～30℃，恒温震荡好养培养16～24小时，检测细胞浓度，以OD值（在560nm测OD值），确定优选培养时间。最优OD值需根据对数生长期对应的细胞浓度选取。以上将冷冻小管到100mL培养液的培养过程作为一次扩培。将一次扩培后的菌液全部倒入一级种子罐中，扩大40～50倍（即培养基含量为一次扩培的40～50倍），28～30℃，恒温震荡好养培养，以OD值达到二次扩培前菌液浓度为终点。根据实际生产规模，可采用三级或多级种子培养，扩培方式同二级扩培相同。最后用相同的麦芽汁培养基将菌液浓度调整至10⁴～10⁶个/mL范围内，备用。

2）糖化液的制备：

A、原料粉碎：将原料粉碎，粉碎条件为能通过20目筛（即筛子20孔/cm³）的细粉含量占原料总量的70～80%。

B、制备：分为以大麦芽为原料的糖化液制备和其它粮食为原料的糖化液的制备。

a、大麦芽糖化液的制备：按大麦芽︰水的质量比为1︰4~1︰5加水混合，恒温58℃～60℃同时液化、糖化6~8小时。此过程加热根据实际情况，采用水浴加热或直接加热方式均可，加热过程中根据条件进行自动或人工搅拌。自动搅拌对转速无严格要求，缓慢搅拌能使粮水均匀混合，不沉淀即可。人工搅拌每15min搅拌1次，混匀即可。以糖化液滴加稀典液后不变蓝为液化、糖化的终点，过滤，备用。

b、粮食糖化液的制备：本发明采用双酶水解法制糖，主要以白酒生产中常用的五种粮食（小麦、玉米、糯米、大米和高粱）为原料，也适用于其它淀粉含量高的粮食原料。无论是其中某种单一粮食或者任意种类粮食、任意比例混合，以下方法均适用。首先，将粮食原料粉碎，粉碎细度为能通过20目筛（即筛子20孔/cm³）的细粉含量占粮食总量的70～80%。在配料罐内加水混合，按大麦芽︰水的质量比为1︰4～1︰5，调制成淀粉乳。用食用级浓盐酸稀释4倍后调整其pH为5.0～7.0。加入质量分数为0.10～0.15%的氯化钙作为淀粉酶的保护剂和激活剂，再加入耐高温的α-淀粉酶（酶的添加量根据采购产品的用量使用说明确定），所有料液搅拌均匀后用泵打入喷射液化器，在短时间内升温到95～97℃。此后料液进入保温罐恒温60～70min，然后进行2次喷射，使温度迅速升高到140～145℃，并维持罐内温度3～5min，彻底杀死耐高温的α-淀粉酶。然后料液经真空闪急冷却系统进入二次液化罐，将温度降低到95～97℃。在二次液化罐内加入耐高温α-淀粉酶，液化25～35min，用碘呈色试验合格后，结束液化。糖化采用曲霉糖化酶，根据所选酶的品种，选择相关说明书标注的糖化最佳条件。如所用糖化酶无标注，可将液化液冷却至55～60℃，调整pH为4.0～5.0，糖化16～24h，一般DE值（葡萄糖值=还原糖含量/干物质含量）可达到95%以上。

将以上任意方法制得的糖化液加水调节糖含量在11～14糖度之间；食用级浓盐酸稀释4倍调节pH为2.8~4.0，灭菌温度为115～121℃，灭菌时间为15～20min，冷却备用。所述糖化液的调节顺序依次为：先调节糖度，再调节pH，最后灭菌。

2、接种发酵

本发明采用间歇式好氧静止发酵的工艺模式。根据生产能力，选择适当的发酵罐，将前期制备的糖化液注入发酵罐中。菌液浓度以酵母细胞为10⁴~10⁶个/mL计，控制接种量（菌悬液与糖化液体积的百分比）在2%~4%之间。添加体积占糖化液体积2.5~4.5%的酒精，乙醇的质量分数大于95%。混匀，静置发酵。发酵周期为60~72h，发酵温度为28~30℃。本发明中方法中，使用酒精作为发酵添加物和溶剂，使异常毕赤酵母充分发挥产酯作用，不再同酿酒酵母共同作用，即对乙酸乙酯的生产工艺调整不再考虑酒精发酵条件。减少了两种不同工艺条件的相互影响，有利于打破瓶颈，提高产能，同时也降低了发酵副产物的生成量。

3、蒸馏浓缩

本发明方法发酵得到的发酵液经等体积蒸馏后得到的调味酒，已经满足调味酒要求，为了减少贮存容器，方便勾调和运输，可将生产出来的调味酒进行浓缩的。但浓缩程度不能过高，这是由于调味酒的作用是用于调味，用量少，若浓缩程度太高，则不利于调味工作的进行。

利用板式塔精馏塔的蒸馏浓缩效果较好，因此采用板式塔精馏塔将乙酸乙酯和酒精从发酵液中分离出来。

按本发明方法生产的调味酒，发酵液中的乙酸乙酯含量一般能达到400mg/100mL～900mg/100mL。为了便于贮存以及满足调味要求，将发酵液中的乙酸乙酯浓缩到3000mg/100mL～4000mg/100mL。当蒸馏浓缩后调味酒中乙酸乙酯浓度往往高4000mg/100mL，使用58~60%voL酒精进行稀释。

4、质量鉴定

在本发明中，还对生产的调味酒进行质量鉴定，主要包括感官质量鉴定和理化数据分析。

1）感官质量鉴定

调味酒主要用于基础酒的调味，调味酒的感官性能直接决定了勾调产品的风味质量。而感官鉴定是最灵敏、最直接、最便捷和最有效的鉴定方法，因此，调味酒必须经过感官鉴定。具体的方法为：在15～20℃，用58～60%voL的酒精将乙酸乙酯含量为3000mg/100mL～4000mg/100mL的调味酒稀释到100mg/100mL～200mg/100mL。由专职白酒尝评人员分别对色、香、味、风格4项进行感官质量鉴定，标准如下：

①色：无色透明，无沉淀和悬浮物；

②香：清香纯正，香气优雅；

③味：酒体醇和、绵柔，诸味协调、尾味爽净；

④风格：乙酸乙酯典型性突出，且无其它风格特征。

经鉴定，必须同时满足以上所有感官特征的EA风味调味酒，才符合产品的感官质量要求。

2）理化数据分析检测

本发明利用气相色谱对产品中香气成分进行检测，检测样品为经过感官鉴定后的平行样品。

下述实施例中糖化液的制备中所用到的糖化发酵设备（糖化罐、喷射液化器、真空闪急冷却系统等）均由宜宾岷江集团岷江机械厂设计制造。

下述实施例中的气相色谱为安捷伦（Agilent）公司6890GC，色谱柱为HP-INNOWAX，检测器温度280℃,进样口温度260℃，分流比为20︰1，程序升温条件为40℃保持8min，再以5℃/min的速度升至100℃，再以15℃/min的速度升至220℃，保持8min。

下述实施例中的高效液相色谱为安捷伦1260液相色谱仪，安捷伦6120质谱检测器。流动相A：超纯水，流动相B：甲醇，色谱柱：ZORBAX SB-Phenyl 4.6×250mm，5μm。进样量：10μL，总分析时间15min，色谱条件如下表（表9）。

表9色谱条件

时间（min）	流动相B(%)	流速（ml/min）	最大压力（bar）
				0.00	70	1.000	400
5.00	85	1.000	400
				9.00	100	1.000	400
13.00	70	1.000	400
				13.5	70	1.000	400

下述实施例中所使用的培养基均属于购买的合成培养基，麦芽汁培养基和马铃薯培养基均为北京奥博星生物有限公司产品，麦芽汁培养基的货号02-183，马铃薯培养基的货号02-023；酵母膏培养基为北京双旋培养基制造有限公司产品，货号为02-22。

实施例1自然选育

以下菌种均为剑南春集团公司的曲药和糟醅中分离纯化得到的产乙酸乙酯较高的功能性菌种。具体过程如下：

①样品的采集：

曲药样品采集贮存期在3个月的浓香型大曲，选取了10匹的半块曲砖（不同贮存室）经过粉碎、混合，获得曲药综合样。粉碎细度为通过20目筛（即筛子20孔/cm³）的细粉含量占曲药总量的75%。

糟醅选用中上层优质母糟（出窖糟），取五点，即四角和中心部位的糟醅，每点各取200g混匀，作为1个糟醅子样品。随机选取了10口窖池（不同班组）的出窖糟，获得10个糟醅子样品。在每个糟醅子样品中各取200g混匀，即选育所需的糟醅综合样。

②菌株培养：

曲药综合样按20g/瓶的标准装入盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中；糟醅综合样按100g/瓶的标准装入盛有100mL无菌水的250mL三角瓶中。浸泡2个小时，每半小时震荡一次。取各浸泡液的上清液10mL，加入到100mL已灭菌（115℃，20min）的麦芽汁液体培养基中，混匀，30℃恒温、好氧培养24h。然后各取0.5mL培养液涂在马铃薯培养基（PDA）平板上，30℃，培养24h。选取不同菌落形态的酵母菌在麦芽汁琼脂培养基上进行纯化培养。

实施例2生产性能测试

以下所使用的麦芽汁液体培养基参数均为：糖度12（白利糖度，符号：°Bx），将浓盐酸稀释4倍后用于调pH至3.4。

菌悬液的制备：用无菌棉签蘸少许蒸馏水，让棉签浸润。在已纯化的菌落上轻轻转动棉签，让棉头沾满菌种。将沾满菌种的棉签迅速插入盛装20mL无菌水的比浊管中。旋转棉签让菌种分散在无菌水中，由内向外，由慢到快，旋转抽出棉签。将菌悬液放在涡旋振荡器上摇匀后，插入细胞浓度仪中。继续通过此方法或者添加无菌水的方法，分别调整各种菌悬液的菌液浓度为10⁶个/mL。

发酵：吸取2mL菌悬液和3mL无水乙醇，加入到已配制好的100mL麦芽汁培养基中（已灭菌，115℃，20min），30℃恒温，好氧，静置培养72h。培养结束后，把所有发酵液倒入2000mL圆底蒸馏烧瓶中，并加入60mL质量分数为99%的酒精和340mL纯水。将圆底烧瓶放入2000mL电热套中，通过实验室蒸馏（蒸馏电压220V），进行等体积蒸馏，将发酵液中乙酸乙酯全部蒸馏出来，得馏出液100mL，做气相色谱分析，了解每株菌株的产酯能力，挑选出生产性能高的优势菌株。分析结果见表1和图1。

表1分离纯化所得产酯能力较强菌株的主要代谢产物

注：表中符号“-”表示未检出。

从表1数据中可以看出，各菌株的代谢产物中以乙酸乙酯的含量最高，同时也含有一定量的醛类物质、杂醇油等副产物。其中，菌株AD11和AD22的代谢产物中乙缩醛和杂醇油的含量高于其它菌株。由图1可知，菌株AD22和X2的代谢产物中乙酸乙酯的含量最少；菌株AD11和S1的代谢产物中乙酸乙酯的含量稍高，菌株JNC1的代谢产物中乙酸乙酯的含量最高。由此可见，菌株JNC1具有产酯能力强、发酵副产物少的优势，被选为诱变育种的出发菌株。

实施例3紫外线（UV）诱变试验

发明人将实施例2得到的菌株JNC1作为出发菌株，使用紫外线（UV）诱变的育种方式进行选育。

1）诱变前培养

诱变处理前，制备经实施例2选取的JNC1菌株的菌悬液（制备方法与实施例2同），吸取10mL菌悬液加入100mL酵母膏液体培养基中，好氧震荡培养30min备用，振幅为130r/min。继续培养，每隔1h取一次培养液，至于4℃冰箱中，每次取2mL，一共取样10次。全部培养结束后，用分光光度计于波长560nm处测各管菌液的吸光值，以酵母膏液体培养基为空白对照，根据数据绘制出菌种的生产曲线，确定其对数生长期约为8~12小时。

2）突变率和致死率测定

将对数生长期的菌悬液稀释至10⁶个/mL。打开20W紫外灯预热30min，使其功率达到稳定。取7个直径为9cm的培养皿分别吸取4mL稀释菌悬液于培养皿中，液层厚度为2mm，将7个培养皿置于距紫外灯20cm处，每隔30s取走1个培养皿。取1个不经紫外照射的培养皿作对照。将7个诱变后的培养皿和1个未诱变的培养皿中的培养液进行10倍稀释涂平板，平板使用马铃薯（PDA）培养基，平行样为3个，28℃恒温培养48h，并计算其突变率和致死率。

3）紫外诱变

选择致死率为85%的UV照射时间为试验的诱变照射时间，处于对数生长期的出发菌株JNC1经UV照射诱变后涂布于马铃薯（PDA）培养基平板上，避光培养48h。每次用接种针挑取7个菌落并编号，将这7种突变株和出发株分别做生产性能测试（同实施例2），检测其产乙酸乙酯的能力。发明人经过多轮若干样品的筛选，挑选出9株高产菌株，将其分别命名为：JNC-EA001～009，各菌株产酯能力如图2。

由图2可知，该9株菌株产乙酸乙酯的能力均高于出发菌株，其中又以JNC-EA002的产酯能力最强，达到8.75g/L。由于该菌株属生产应用性菌株，随即进行遗传稳定性测试。经鉴定菌株JNC-EA002为异常毕赤酵母Pichia anomala。

随后，又对该异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002遗传稳定测试，结果见表2。

表2菌株JNC-EA002连续传代后主要代谢产物的含量

从表2结果可以看出，经过连续传代九次，代谢终产物乙酸乙酯含量没有明显降低的趋势，且在各传代中，乙酸乙酯含量的变化量（同第1代相比）均不超过第1代时乙酸乙酯含量的4%。同时，其它代谢副产物含量极低且稳定，完全满足生产要求。由此可见，本发明的异常毕赤酵母Pichia anomala JNC-EA002遗传性好，生产性能稳定。

实施例4最适发酵条件的选择

1）生产原料的选择

接种JNC-EA002号酵母后，以各种粮食为生产原料分别发酵。具体实验步骤和工艺条件如下：

A、糖化液的制备：

a、以1kg大麦芽为原料：粉碎细度为能通过20目筛（即筛子20孔/cm³）的细粉含量占大麦芽总量的75%。按粮水质量比1:5的比例加水混合，恒温60℃，同时液化、糖化6小时。以糖化液滴加稀典液后不变蓝为液糖化终点，过滤，备用。

b、以淀粉为主要成分的其它粮食为原料的糖化方法。取1kg白酒生产中常用的五种粮食（小麦、玉米、糯米、大米和高粱）得混合粮，五种粮食均按等质量混合，即各200g，采用双酶水解法制糖。以首先，将粮食原料粉碎，粉碎细度为能通过20目筛（即筛子20孔/cm³）的细粉含量占粮食总量的75%。在配料罐内加水混合，粮水质量比为1:5，调制成淀粉乳。浓盐酸（食用级）稀释4倍后，调整pH值为5.0。加入质量分数0.15%的氯化钙作为淀粉酶的保护剂和激活剂，再加入耐高温的α-淀粉酶液5mL（诺维信中国生物科技有限公司，产品名为利可来耐高温淀粉酶液），升温到95℃，恒温60min。再升高到140℃，并维持该温度5min，彻底杀死耐高温的糖化酶。然后将温度降低到95℃。在二次加入耐高温α-淀粉酶液5mL，液化35min，结束液化。将液化液冷却至60℃，调整pH为4.5，加入曲霉糖化酶（河南莲花酶工程有限公司，每克含有50个酶单位），酶的添加量为2g（100个酶单位）。糖化16h。

加水调整糖化液糖度为12白利糖度；浓盐酸（食用级）稀释4倍后，调节pH为3.4。115℃，灭菌20min。

B、不同原料的生产性能测试：

配制异常毕赤酵母JNC-EA002的菌悬液，调整菌悬液细胞浓度为10⁶个/mL，菌悬液接种体积为糖化液体积的3%。添加占糖化液体积2.5%的无水乙醇。混匀，静置发酵。发酵周期为72h，发酵温度为28℃。

采用实验室蒸馏方法进行等体积蒸馏。将100mL发酵液、340mL蒸馏水和60mL无水乙醇（分析纯），注入2000mL圆底蒸馏烧瓶中，再将圆底烧瓶放置在2000mL电热套内，套上玻璃弯管和蛇形冷凝管。连接循环水冷凝器，冷却温度调整在15℃。将电热套电压调整到220V蒸馏，得馏出液100mL。

将收集到的馏出液进行气相色谱分析。

发酵液的感官特征和理化数据见表3、表4和图3。

表3接种JNC-EA002菌株72h后发酵液感官特征

在发酵过程中，对发酵液的颜色、香气、形态进行观察：使用大麦芽和小麦制成的糖化液，菌株生长速度较快，24h后液面就有菌膜生成，48h后就能闻到较为突出的乙酸乙酯香气，60小时后香气浓郁。使用玉米糖化液在48h后开始产膜，60h后乙酸乙酯香气突出，72h后香气较浓。糯米、高粱和大米在60小时后液面才略微有菌膜形成，72小时后有淡淡的乙酸乙酯香气（表3）。

表4接种JNC-EA002菌株72h后发酵液理化数据

注：上表中“-”表示未检出。

通过色谱数据（表4、图3）可以看出，将异常毕赤酵母JNC-EA002CGMCCNo.5955接种到以上六种糖化液中发酵，均能产生乙酸乙酯，且主要副产物含量都很低。从乙酸乙酯的生产量来看，该菌株在大麦芽糖化液中的乙酸乙酯生成量最高，其次为小麦、玉米、糯米、高粱、大米。

C、不同粮食配比的糖化液对生产的影响

将大麦芽糖化液和小麦糖化液按不同比例混合，以混合液进行发酵。接种JNC-EA002，发酵参数、蒸馏方法与B部分不同原料的生产性能测试中相同。结果见图4。

由图4可知，混合粮使得糖化液的营养结构发生了改变，对菌株的生长代谢产生了影响，且不同粮食配比混合发酵效果不等同于各种单粮发酵效果的叠加。以50%的大麦芽糖化液和50%小麦糖化液混合发酵，所产乙酸乙酯的含量明显高于同等体积100%大麦芽糖化液和100%小麦糖化液单独发酵后平均值。因此，确定不同粮食配比的变化关系是非常重要的。大麦芽糖化液占糖化液（大麦芽糖化液和小麦糖化液混合）的百分比与乙酸乙酯生成量之间的线性关系为：y=－3073x+41299。

2）pH的选择

培养基的制备：制作新鲜麦芽汁培养基，调整培养基糖度为12白利糖度；浓盐酸（食用级）稀释4倍后，分别调节pH为2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8和4.0。再将培养基灭菌，灭菌温度为115℃，灭菌时间为20min，冷却备用。

接种发酵：配制异常毕赤酵母的菌悬液，调整细胞浓度为10⁶个/mL，菌悬液体积占培养基体积的3%。添加培养基体积2.5%的无水乙醇。混匀，静置发酵。发酵周期为72h，发酵温度为28℃。

蒸馏：采用实验室蒸馏方法进行等体积蒸馏。将100mL发酵液、340mL蒸馏水和60mL无水乙醇（分析纯），注入2000mL圆底蒸馏烧瓶中，再将圆底烧瓶放置在2000mL电热套内，套上玻璃弯管和蛇形冷凝管。连接循环水冷凝器，冷却温度调整在15℃。将电热套电压调整到220V蒸馏，得馏出液100mL。

色谱分析：将收集到的馏出液直接进行气相色谱分析，结果见图5。

由图5可知，pH在2.8时，乙酸乙酯的生产量较低，当pH升至低于3.2时，乙酸乙酯生成含量达到最高，在pH为3.2~3.6时趋于稳定，并随着酸性的减弱而缓慢下降。

3）接种量的选择

配制细胞浓度为10⁶个/mL的异常毕赤酵母JNC-EA002的菌悬液，分别接种占培养基体积0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%和4%的菌悬液，做生产性能测试。其它操作与2）pH的选择中相同。结果见图6。

由图6结果可知，在菌悬液浓度为10⁶个/mL时，随着接种量的升高，乙酸乙酯的生产量也逐渐升高；当接种量控制在2.5~3.5%时，乙酸乙酯的生成量达到最高，且相对稳定；接种量超过3.5%，乙酸乙酯的生成量又开始下降趋势。因此，菌液细胞浓度以10⁶个/mL计，接种量控制在2.5%～3.5%时，代谢产物中乙酸乙酯浓度最高。

4）酒精添加量的控制

本发明方法中，添加酒精的多少直接影响代谢产物含量的高低。从前期实验可以看出，随着酒精添加量的增加，代谢产物浓度升高。但酒精添加只能微量，一旦超过细胞耐受程度会导致细胞生长停滞，反而使产量降低。因而，本发明对不同的酒精添加量进行了研究。在发酵前，添加体积占添加前培养基体积0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%的无水乙醇（成都科龙，分析纯），做生产性能测试。其它操作与2）pH的选择中相同。其结果见图7。

从图7结果可知，酒精添加量低于1.5%，乙酸乙酯生成量较低；随着酒精添加量的增加，乙酸乙酯的生成量成倍上升；当酒精添加量超过2.5%时，乙酸乙酯生成量的增幅减缓，随后趋于稳定。当酒精添加量控制在3%～4%之间，乙酸乙酯含量最高。

5）糖度的选择

发酵前糖化液的糖度也会影响发酵过程中生成的乙酸乙酯的量，因而，发明人对糖度进行了研究，使用菌株为JNC-EA002CGMCC No.5955，糖度以白利糖度为单位，符号为°Bx。即换算成在20°C情况下，每100克水溶液中溶解的蔗糖克数。分别通过添加蒸馏水稀释的方法调整糖度为8度,9度,10度,11度,12度,13度和14度，做生产性能测试。其它操作与2）pH的选择中相同。结果见图8。

由图8可知，糖度在11～14度时，乙酸乙酯生成量较高，糖度在12~13度时，乙酸乙酯生成量最高。根据发明人对发酵结果的研究来看，无论糖化液中糖度如何变化，发酵液中糖度都在8度以上。由此可见，在发酵中，异常毕赤酵母对糖的利用并不完全，糖是过剩的。但不同糖度，乙酸乙酯的生成量又不同，又产生不同的结果，因此，对糖度的调整可以影响其它相关营养成分的利用情况倍影响，从而影响乙酸乙酯的生成量。

糖度高使得营养物质含量高，但是也会增加粮食消耗，而且高浓度液体都会使细胞脱水，反而会使产量下降；糖度低又不利于代谢产物的累积，因此优选糖度为12~13度。

实施例5采用本发明方法生产EA风味调味酒

以大麦芽为原料，制作大麦芽糖化液，制作方法同实施例4。调整糖化液的糖度为12度，pH值为3.4，于115℃，灭菌20min，冷却备用。接种毕赤酵母JNC-EA002至1L的大麦芽糖化液中，接种菌悬液的细胞浓度10⁶个/mL，接种量为2.5%，即菌悬液体积占糖化液体积的2.5%。添加占糖化液3%的无水乙醇。混匀，静置好氧发酵。通过板式塔精馏塔（购买自宜宾岷江集团岷江机械）将乙酸乙酯和酒精从发酵液中分离出来，浓缩后调味酒中乙酸乙酯浓度为3872mg/100mL，酒精浓度为59.5%voL，即为最终的调味酒，使用陶坛密封保存。

取调味酒进行感官鉴定，判断其风味质量标准。调节室温为24℃，先用60%voL的酒精将调味酒样品稀释到200mg/100mL。经专业的白酒评委进行尝评鉴定，结果如表5。

表5本发明方法生产的EA风味调味酒的感官鉴定

从表5中感官鉴定结果来看，使用本发明工艺生产的调味酒具：无色透明、清香纯正、乙酸乙酯气味突出，酒体醇和、绵柔，香味协调、尾味净爽等风味特征。经尝评员认定，本发明方法生产的EA风味调味酒，非常适合调味使用。

实施例6采用本发明方法生产的EA风味调味酒用于基础酒中

对浓香型基础酒进行色谱检测，对乙酸乙酯含量达不到80mg/100mL基础酒添加EA风味调味酒进行调整，将其做适当添加补足80mg/100mL。分别对添加后的基础酒进行感官质量鉴定和色谱数据检测。色谱数据只要满足添加后达到80mg/100mL，正负误差不超过1%即可。对添加前后的基酒进行感官质量鉴定，结果如下（表6）：

表6本发明方法生产的EA风味调味酒在基础酒中的应用

从表6中鉴定结果可以看出，添加前基础酒的风味特征为：无色透明、窖香浓郁、陈香突出、酒体醇厚绵甜、香味协调、尾味净爽、带有典型的浓香型白酒风格特征。添加EA风味调味酒后基础酒的风味特征：无色透明、窖香浓郁、陈香舒适、酒体醇和、绵甜、口味协调、尾味爽净，也带有典型的浓香型白酒风格特征，同时具有以己酸乙酯为主体的复合型香气特征。浓香型白酒的特点就是香浓醇厚，以己酸乙酯为主体香气。添加乙酸乙酯调味酒主要是为了让基础酒中各种香气成分更加协调，让人喝了更加舒适，而不改变白酒的整体风格特征。从前述描述可以看出，添加后酒体醇和，与醇厚相比，拥有更好的口感。添加前基础酒酒体陈香突出，这说明酒体的香气成分单一，香味单调，才会有某种气味特别明显；而添加后酒体陈香舒适，即说明酒体香气协调感很强，各种香气成分比例合适，闻香和口感都较好。由此可见，添加EA风味调味酒后，可使酒体变得更协调，口感更圆润丰满。

实施例7本发明方法与传统方法和其它方法的比较

为进一步说明本发明方法的特点，将本发明方法的产品和传统方法的产品以及其它利用微生物发酵方法生产的调味酒进行对比分析。

1）生产方法对比：

①传统EA风味调味酒生产方法（传统EA风味调味酒的生产方法较多，包括使用小曲、麸曲、大曲为酒母的发酵方法，大曲发酵的产酯量明显高于其它工艺，因此以常用的大曲发酵为例进行说明）

采用大曲作为酒母，利用大缸或陶坛做酒醅进行发酵，一般发酵周期为21～28天。其工艺流程见图10。

具体步骤为：以高粱为原料，将高粱碾碎成糁，细粉占粮食总量的20%，每班投料1000kg。堆成凹形，加水翻拌，润料12h，每隔4h翻拌1次。将原料装甑，用占原料1.4%的冷水泼在糁面上，再撒7cm厚的糠壳，在压力0.01MPa下，蒸80min出甑。将糁蒸完后取出，堆成长方形，泼入原料质量30%的新鲜开水。经数次翻拌、降温后下曲，曲的用量为原料的30%。搅拌均匀，待温度降到30℃时开始入缸密闭发酵28天。发酵后，拌糠蒸酒。将一次蒸馏的酒醅冷却到30℃后，再加入占原料质量的9%的大曲，翻拌均匀。待温度下降到30℃时，下缸发酵，发酵条件与第一次相同。发酵完毕，甑桶蒸馏取酒。蒸馏时，控制酒度为70%voL，最后用纯净水稀释成60%voL。

②其它方法1：利用酿酒酵母和产酯酵母（汉逊酵母）共同发酵生产EA风味调味酒

将酿酒酵母和产酯酵母同时加入到大麦芽糖化液（制备方法和实施例4相同）中，先进行细胞增值，采用间歇式通氧方式让发酵液产生微量的酒精后，再缓慢通氧发酵7天，达到产酒和产酯的目的。发酵完毕，蒸馏取酒。

③其它方法2：使用野生型的毕赤酵母发酵生产生产EA风味调味酒，其它操作与实施例5同。

④本发明方法：发酵过程与实施例5同。

3)风味质量对比

由7位白酒尝评专家对不同生产方法生产的EA风味调味酒进行风味质量鉴定。结果如表7：

表7不同方法生产的EA风味调味酒的感官质量鉴定

由此可见，使用传统方法生产的EA风味调味酒，具有乙酸乙酯为主体的复合香气特征，而采用本发明方法生产的调味酒，由于副产物相对较少，目的代谢产物浓度和纯度更高，因此口味更协调、醇甜，乙酸乙酯典型性更突出。另外，其它方法2和发明方法均使用单一纯菌种的方法发酵，而其它方法1则同时使用酿酒酵母和产酯酵母。从风味质量上看，其它方法2和本发明方法生产的调味酒口味更加清爽，其乙酸乙酯典型性较其它方法1更突出。而其它方法2和发明方法相比，后者比前者乙酸乙酯香气更浓，典型性更为突出。

4)不同生产方法代谢产物分析

采用高效液相色谱检测不同方法生产的调味酒的主要香味物质成分及含量，见表8。其中，传统方法发酵后，经甑桶蒸馏取酒，用于检测。其它方法1、其它方法2和本发明方法发酵后进行等体积蒸馏，取馏出液用于检测。

表8不同方法生产的调味酒的主要香味物质含量

香味物质名称	传统方法	其它方法1	其它方法2	发明方法
					乙醛	12.31	8.35	1.32	1.14
正丙醛	-	-	-	-
					丙酮	20.39	5.36	0.09	0.12
甲酸乙酯	1.44	1.34	0.12	-
					二乙氧基甲烷	-	-	-	0.01
乙酸乙酯	272.34	523.08	703.62	875.06
					乙缩醛	5.56	3.36	2.33	1.61
甲醇	11.18	2.82	0.33	0.86
					2-丁酮	2.09	1.9	-	-
3-甲基丁醛	3.35	3.13	-	-
					异丁酸乙酯	-	-	0.01	-
丙酸乙酯	-	-	-	-
					2-戊酮	17.04	1.86	0.12	0.34
2,3-丁二酮	-	-	-	-
					乙酸异丁酯	-	-	-	-
2-丁醇	2.01	1.8	-	-

丁酸乙酯	18.80	1.40	0.01	0.02
					正丙醇	19.38	5.09	0.44	0.82
异戊酸乙酯	-	-	-	-
					1,1-二乙氧基-2-甲基丁烷	-	-	-	-
1,1-二乙氧基-3-甲基丁烷	-	-	-	-
					正己醛	-	-	-	-
异丁醇	17.98	7.47	2.11	1.30
					乙酸异戊酯	-	-	0.02	-
戊酸乙酯	7.71	2.75	0.33	-
					2-戊醇	9.38	0.06	0.42	0.56
正丁醇	5.60	4.00	0.52	0.94
					2-庚酮	-	-	-	-
己酸甲酯	-	-	-	-
					异戊醇	37.41	15.50	3.55	2.54
丁酸丁酯	-	-	-	-
					1,1-二乙氧基己烷	-	-	-	-
己酸乙酯	73.41	2.29	2.10	0.80
					正戊醇	-	-	-	0.15
2-乙氧基-5-甲基呋喃	1.51	-	-	0.49
					丁酸异戊酯	1.96	-	0.01	-
3-羟基-2-丁酮	13.08	1.68	0.54	0.20
					羟基丙酮	-	-	-	-
2-庚醇	-	-	-	1.51
					己酸丙酯	-	-	0.02	-
庚酸乙酯	5.01	0.96	1.45	0.79
					乳酸乙酯	205.54	9.05	2.33	2.19
正己醇	11.71	3.82	0.31	0.44
					2-甲基-(5)6-乙基吡嗪	-	-	-	-
三甲基吡嗪	-	-	-	-
					辛酸乙酯	7.32	2.62	1.54	1.81
己酸异戊酯	-	-	-	-
					乙酸	65.21	5.73	1.54	0.63
正庚醇	2.02	-	-	0.43
					糠醛	9.71	-	-	-
2-乙酰基呋喃	0.03	-	-	-
					四甲基吡嗪	-	-	-	1.43
苯甲醛	-	-	0.07	-
					2,3-丁二醇（左旋）	-	-	-	-
2-羟基-4-甲基戊酸乙酯	2.11	0.56	-	-
					丙酸	10.59	0.21	-	-
3-乙基-2-戊醇	-	-	-	-
					异丁酸	12.32	1.24	0.11	0.06
2,3-丁二醇（内消旋）	-	-	-	-
					1,2-丙二醇	-	-	-	-
己酸己酯	-	-	-	-
					丁酸	24.94	0.15	0.18	0.09

苯乙醛	-	0.03	-	-
					3-呋喃甲醇	3.34	-	-	-
异戊酸	12.65	0.57	0.37	0.21
					丁二酸二乙酯	-	-	-	-
2,2-二乙氧基苯	-	-	-	-
					3-甲基-2(5H)呋喃酮	-	-	-	-
戊酸	15.47	0.65	0.53	0.47
					苯乙酸乙酯	2.58	0.01	-	-
苯乙酸苯乙酯	1.31	-	-	-
					月桂酸乙酯	-	-	-	-
己酸	47.90	0.05	0.02	-
					苯丙酸乙酯	2.18	-	-	-
β－苯乙醇	8.02	1.45	1.20	0.78
					庚酸	-	-	-	-
二甲基对二苯酚	-	-	-	-
					肉豆蔻酸乙酯	-	-	-	-
辛酸	-	-	-	-
					己酸苯乙酯	-	-	-	-
壬酸	-	-	-	-
					棕榈酸乙酯	2.66	0.22	0.21	0.14
甘油	-	-	-	-
					油酸乙酯	2.23	0.02	-	-
亚油酸乙酯	8.95	1.08	0.19	0.44

注：以上表格中“-”表示未检出，上表中各检测数据的单位为mg/100mL。

从表8中色谱数据来看，本发明方法、其它方法1和其它方法2生产的调味酒中，乙酸乙酯的其含量明显高于使用传统方法生产的调味酒。其中又以本发明方法生产的调味酒中乙酸乙酯含量最高，达到875mg/100mL，是传统方法的3倍，是其它方法1的1.5倍，是其它方法2的1.2倍。就发酵副产物而言，以传统发酵方法生成的种类最多，含量最高；特别是异丁醇、异戊醇、正丙醇等杂醇油的含量，要明显高于本发明方法。

由此可见，使用本发明方法生产的EA风味调味酒，无论是风味质量还是乙酸乙酯产量，都明显优于其它方法生产的产品。此外，本发明方法的发酵周期短，有利于降低生产成本。

Claims (13)

1.EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：利用异常毕赤酵母Pichia anomalaJNC-EA002CGMCC No.5955发酵后，蒸馏生产EA风味调味酒；所述的发酵是指将异常毕赤酵母JNC-EA002的菌悬液接种到糖化液中进行发酵；其中，菌悬液的细胞浓度为10⁴～10⁶个/mL，菌悬液与糖化液体积百分比为2.5～3.5％；所述的发酵周期为60～72h，发酵温度为28～30℃。

2.根据权利要求1所述的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：在发酵完毕后，将发酵液抽入精馏设备中进行蒸馏浓缩，使调酒液中乙酸乙酯的质量浓度为3000mg/100mL～4000mg/100mL，酒度为58～60％voL。

3.根据权利要求1所述的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述的糖化液为大麦芽糖化液或/和粮食糖化液。

4.根据权利要求3所述的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述的粮食糖化液以小麦、玉米、糯米、大米或高粱中的至少一种为原料制成。

5.根据权利要求4所述的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述的粮食糖化液以小麦为原料制成的小麦糖化液。

6.根据权利要求3所述的的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述的糖化液为大麦芽糖化液和小麦糖化液各50％混合而成。

7.根据权利要求1所述的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述糖化液使用前调节糖含量为11～14白利糖度；调节pH为2.8～4.0，于115～121℃灭菌15～20min；添加体积占添加前糖化液体积2.5～4.5％的酒精，酒精中乙醇的质量分数大于95％。

8.根据权利要求7所述的的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述糖化液的糖含量调节为12～13白利糖度。

9.根据权利要求7所述的的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述糖化液调节pH为3.2～3.6。

10.根据权利要求7所述的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述糖化液中添加的酒精体积占添加前糖化液体积3～4％。

11.根据权利要求3～6任一项所述的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述的大麦芽糖化液的制备方法如下：将大麦芽粉碎，粉碎细度为能通过20目筛的细粉含量占大麦芽总量的70～80％；加水混合，大麦芽与水质量比为1︰4～1︰5，于58℃～60℃液化、糖化6～8小时；以糖化液滴加稀典液后不变蓝为液化、糖化的终点，过滤，即可。

12.根据权利要求3～6任一项所述的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述的粮食糖化液的制备方法包括如下步骤：将粮食原料粉碎，粉碎细度为能通过20目筛的细粉含量占粮食总量的70～80％；加水混合，粮食原料与水质量比为1︰4～1︰5，调整pH为5.0～7.0；加入耐高温α-淀粉酶液化；滴加稀典液后不变蓝即结束液化；调整pH为4.0～5.0，加入糖化酶糖化使葡萄糖值达到95％以上，即得糖化液。

13.根据权利要求12所述的EA风味调味酒的生产方法，其特征在于：所述的粮食糖化液的制备方法包括如下步骤：将粮食原料粉碎，粉碎细度为能通过20目筛的细粉含量占粮食总量的70～80％；加水混合，粮食原料与水质量比为1︰4～1︰5，调整pH为5.0～7.0；加入质量分数为0.10～0.15％的氯化钙；加入耐高温α-淀粉酶；搅拌均匀，用泵打入喷射液化器，升温到95～97℃，保温60～70min；进行2次喷射，使温度升高到140～145℃，保温3～5min；经真空闪急冷却系统使温度降低到95～97℃，加入耐高温α-淀粉酶，液化25～35min，滴加稀典液后不变蓝即结束液化；将液化液冷却至55～60℃，调整pH为4.0～5.0，加入曲霉糖化酶，糖化16～24h，使葡萄糖值达到95％以上，即得糖化液。