CN109971661A - 一株产酯酵母zb406及其应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一株扣囊复膜酵母ZB406，其中筛选分离来源于发酵酒曲的扣囊复膜酵母，利用其与酿酒酵母的共酵实现酒精发酵与香气物质合成的同步进行，充分发挥不同菌株的代谢特性，并有助于酒液中酯类等呈香代谢产物的积累与转化，实现液态发酵米醋香气风味的明显提升。

Description

一株产酯酵母ZB406及其应用
技术领域
本本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及一株分离筛选获得的产酯酵母，以及所述产酯酵母在提升液态发酵米醋质量风味与质量方面的应用。
背景技术
液态深层醋酸发酵工艺由德国Frings公司于20世纪50年代开创，该工艺在酒精、醋酸发酵阶段均采用纯种发酵，具有发酵周期短、原料利用率高、机械化程度高等特点，其发酵产品澄清度好、卫生质量好，是食醋行业的巨大技术创新。然而，由于其采用纯菌发酵工艺，液态发酵食醋中呈香呈味成分较少，色泽、香气浓郁度和口感丰富度远不如固态发酵食醋。作为发酵食醋香气的主体成分，以乙酸乙酯为代表的酯类在液态发酵食醋中含量极低，因此提升酯类物质含量对改善液态发酵食醋香气与质量具有重要意义。
为提高液态发酵食醋的香气，可采用的技术手段包括：(1)在酒精发酵阶段添加生香酵母，利用生香酵母的酯化能力提升酒液中的酯类物质含量；(2)在酒精发酵阶段添加乳酸菌，利用代谢产物乳酸与乙醇反应增加乳酸乙酯含量；(3)熏醋增香：将发酵醋渣添加香辛料文火熏蒸后浸淋，添加至发酵醋胚中；(4)炒米色增香：将大米炒制至一定程度后添加至发酵醋胚，使其具有香醋特点；(5)物理陈化：微波、红外线、超高压电场、超声波等技术进行人工加速陈化。熏醋、炒米色是固态发酵食醋特有的工艺，其产生的香气接近陈醋、香醋，而人工陈化技术存在难以大规模应用的难点。在酒精发酵阶段添加生香酵母、乳酸菌等菌株进行多菌种混合发酵能够充分发挥不同菌株的代谢特性，并有助于酒液中酯类等呈香代谢产物的积累与转化。
中国发明专利申请201611129470.3提供了一种增香曲料(大曲：红曲：根霉曲)、增香酵母(酿酒酵母：生香酵母)复合使用制备米醋的方法，该专利申请并未介绍该增香酵母来源及其发酵特性，且该专利申请保护的是一种复合增香曲料、复合增香酵母的使用工艺，保护范围较窄。该专利申请保护的工艺复杂，与本发明提供的产酯酵母使用工艺不同。中国发明专利201510849370.7、中国发明专利申请201810311217.2分别提供了一株具有良好产酯能力的生香酵母，其筛选来源分别来自白酒曲药原料、发酵酱醪，且其主要应用为白酒、发酵酱油，与本发明菌种来源、种属、主要应用方向均不相同。中国发明专利201711075949.8、中国发明专利201711135657.9分别提供了一株根霉、米曲霉来提升液态发酵米醋风味，这与本发明提供的产香酵母不同。中国发明专利申请201010532413.6、中国发明专利申请201611064006.0分别提供了利用产香酵母制曲，进而强化提升发酵食醋香气的工艺，与本发明提供的直接添加产酯酵母种子液应用方式不同。
本发明背景技术中提及的发酵食醋增香技术有熏醋增香、炒米色增香、人工催陈以及多菌种共酵。(1)熏醋、炒米色工艺是我国固态发酵食醋特有工艺，其主要应用于陈醋、香醋，该工艺产生的香气与液态发酵食醋类型差异较大，协调性不佳；(2)红外、超声波、超高压等人工催陈技术虽然有一定陈化效果，但是存在“返生”现象，且难以实现大规模生产应用。在酒精发酵阶段添加生香酵母、乳酸菌等菌株进行多菌种混合发酵能够充分发挥不同菌株的代谢特性，并有助于酒液中酯类等呈香代谢产物的积累与转化。
发明内容
鉴于以上技术的不足，本发明的目的在于选育获得一株产酯能力突出的生香酵母，并将其应用于提升液态发酵食醋的香气与质量。
本发明提供如下技术方案：
1、本发明提供一株扣囊复膜酵母ZB406，该菌株已于2018年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60516。
本发明提供的扣囊复膜酵母ZB406是由发酵酒曲中分离筛选获得，具有产乙酸乙酯能力强、基本不产酒精的特点。
本发明提供的扣囊复膜酵母ZB406容易培养，其在酒精发酵阶段与酿酒酵母共同使用不影响酿酒酵母的产酒效率，同时能够大幅提升发酵米酒、米醋中的酯类物质含量，增香效果明显。
在一方面，本发明提供一株扣囊复膜酵母ZB406，其于2018年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60516。
在一个实施方案中，本发明提供扣囊复膜酵母ZB406在食品发酵中的用途。
在又一个实施方案中，所述食品发酵为米醋发酵。
在另一个实施方案中，所述食品发酵为米酒发酵。
在另一个实施方案中，本发明提供扣囊复膜酵母ZB406在米醋发酵中的用途。
在又一个实施方案中，其中所述扣囊复膜酵母ZB406用于在米醋发酵初期接入。
在另一个实施方案中，本发明提供扣囊复膜酵母ZB406在制备米醋中的用途。
在另一方面，本发明提供一种米醋，其采用扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母共同发酵获得。
在一个实施方案中，本发明提供一种米醋，其采用扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母共同发酵获得，其中同时添加或分步添加扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母进行所述发酵。
在又一方面，本发明提供一种制备米醋的方法，其包括采用扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母共同发酵。
在一个实施方案中，本发明提供一种制备米醋的方法，其包括采用扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母共同发酵，其中同时添加或分步添加扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母进行所述发酵。
在本发明中，米醋、食醋可互换使用，是以含淀粉多的粮食为原料，经过微生物发酵制成。
本发明创新点至少在于以下两点：(1)从酒曲中分离筛选获得一株产乙酸乙酯突出的产酯生香酵母；(2)利用产酯生香酵母与酿酒酵母的共酵，实现液态发酵米醋香气风味的明显提升。
本发明的有益效果至少在于：筛选分离来源于发酵酒曲中产酯酵母，利用其与酿酒酵母的共酵实现酒精发酵与香气物质合成的同步进行，充分发挥不同菌株的代谢特性，并有助于酒液中酯类等呈香代谢产物的积累与转化。
附图说明
图1为扣囊复膜酵母ZB406在麦芽汁琼脂培养基上的菌落形态图。
图2为扣囊复膜酵母ZB406的显微照片。
图3为扣囊复膜酵母ZB406的系统发育树。
图4为采用扣囊复膜酵母ZB406进行液态深层发酵米醋生产工艺的示意图。
图5为酿酒酵母单独发酵米醋、产酯酵母(ZB406和AS2.180)与酿酒酵母共酵米醋风味对比结果图。
生物保藏信息
一株扣囊复膜酵母ZB406，分类学名称为Saccharomycopsis fibuligera，其于2018年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60516，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。
具体实施方式
为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人员通常会想到的。
下述实施例中所述试验方法，如无特别说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特别说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
下述实施例对本发明的具体实施做进一步说明，但并不仅限于此实施例。
实施例1产酯酵母菌株筛选
1.材料准备
菌株分离来源：申请人采集的酒曲；
鲁氏酵母AS 2.180：购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心；
麦芽汁培养基、PDA培养基、液化酶、糖化酶：市售购买；
大米固体培养基：取适量市售大米，加入1～2倍重量的水，121℃高压灭菌15min。
大米糖化醪：取适量市售大米，加入适量自来水煮制，煮制过程中添加液化酶、糖化酶进行淀粉质原料的分解，获得大米糖化醪。
2.产酯酵母的分离与筛选
2.1菌株分离
取10g酒曲加入100mL麦芽汁培养基，30℃富集培养24h。取菌液0.1mL用灭菌去离子水稀释10-4、10-6、10-8倍，并涂布于PDA培养基置于30℃倒置培养24h，挑平板表面菌落划线2～3次后挑选单菌落培养活化备用。
2.2菌株初筛
液态发酵评价：将所挑选的单菌落接种麦芽汁液体培养基，30℃振荡培养24h，对发酵液的酯香、酸味、酒味进行感官评价，筛选总体整体表现较好的酵母进行固态发酵评价。
2.3菌株复筛
固态发酵评价：将初筛获得的酵母接种大米固体培养基，30℃培养24h，对发酵物的酯香、酸味、酒味进行感官评价，挑选表现最好的菌株进行产酯性能评估。
2.4 ZB406菌株保藏与产酯性能评估
通过复筛，获得一株酯香浓郁的酵母ZB406，其菌种形态、菌株形态见图1、图2，将其活化后添加30％甘油置于-70℃保藏。
同时，将ZB406菌株以及对照菌株AS2.180分别接种大米糖化醪，30℃静置发酵48h，对发酵液检测乙酸乙酯含量并进行感官鉴评，具体结果见表1。
表1产酯性能评估结果与感官鉴评结果
指标 AS 2.180 ZB406
酒精度(％vol) 4.82 0.54
乙酸乙酯(g/100mL) 0.41 0.70
感官鉴评结果 酯香较好，酒味明显 酯香浓郁，果香，清新愉悦，基本无酒味
2.5菌种鉴定与系统发育树构建
将保藏的产酯酵母菌株ZB406送上海生工生物工程有限公司测序鉴定，结果为扣囊复膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)。该产酯酵母菌株ZB406已于2018年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60516。
系统发育树构建：将菌种鉴定测序结果导入NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行核酸序列Blast，根据比对结果挑选相似度超过97％菌株，下载其fasta格式序列文件。将下载的序列文件导入Mega 5软件进行序列比对，并根据比对结果构建系统发育树，结果见图3。
实施例2ZB406菌株遗传稳定性评估
将实施例1获得的ZB405酵母接种大米糖化醪，30℃静置发酵48h，取发酵液继续接种新的大米糖化醪，30℃静置发酵48h，依次类推获得不同代数的发酵液，检测发酵液中乙酸乙酯含量，具体结果见表2。
表2 ZB406菌株遗传稳定性评估结果
指标 第1代 第5代 第10代
乙酸乙酯(g/100mL) 0.71 0.72 0.70
从表2所示检测结果看，第1代、第5代、第10代菌种产乙酸乙酯能力稳定。这表明产酯酵母ZB406的遗传稳定性好，非常适于工业化生产。
实施例3产酯酵母与酿酒酵母共酵制酒
1.大米糖化液的制备
以市售大米为原料，加入3～4倍重量的自来水，升温至60～70℃加入0.1～0.3％的市售液化酶进行液化水解，90～95℃保温1h，碘液测试判定液化终点，得到的糖化液备用。
2.米酒制备
以大米糖化液为原料，产酯酵母菌株ZB406用麦芽汁培养基进行活化，与酿酒酵母按照不同比例同时添加或者分步添加(产酯酵母先发酵2～4天后再接入酿酒酵母)，总添加量为大米原料重量的0.3～0.5％，30℃酒精发酵8～10天，压滤酒醪获得发酵米酒。取不同工艺米酒送检乙酸乙酯，并进行感官鉴评，结果见表3。
表3产酯酵母与酿酒酵母共酵米酒结果
由表3结果可以看出，无论是同时添加还是分步添加，ZB406与酿酒酵母共酵不影响酿酒酵母的产酒效率，而且发酵米酒中乙酸乙酯含量提升3倍以上，效果明显。感官鉴评显示，ZB406与酿酒酵母共酵米酒酯香较好，有果香，香气清新愉悦。
实施例4添加产酯酵母发酵米酒制备发酵米醋
为进一步评价添加产酯酵母对液态发酵米醋的影响，将产酯酵母(AS 2.180、ZB406)与酿酒酵母同时添加共酵发酵米酒采用Frings醋酸发酵系统制备液态深层发酵米醋，具体发酵工艺见图4，发酵温度控制在29.5～30.5℃，发酵16～20小时后获得酸度为10g/100mL左右的米醋，其理化指标检测结果见表4。
表4产酯酵母与酿酒酵母共酵米醋检测结果(g/100mL)
指标 pH 总酸 氨基氮 残酒 乙酸乙酯 不挥发酸
酿酒酵母单独发酵 2.58 9.94 0.01 0.20 0.5 0.15
AS 2.180与酿酒酵母共酵 2.66 9.81 0.02 0.25 1.1 0.25
ZB406与酿酒酵母共酵 2.69 9.95 0.02 0.23 1.7 0.28
由表4可以看出，产酯酵母与酿酒酵母共酵制备米醋能够显著提升发酵米醋中的乙酸乙酯含量，其中添加ZB406后乙酸乙酯提升达3倍以上。同时，添加产酯酵母对发酵米醋的指标也有一定改善，特别是提升发酵米醋的pH，降低酸味刺激性而改善口感。
在此基础上，我们将不添加产酯酵母发酵米醋、产酯酵母与酿酒酵母共酵发酵米醋在公司内部组织鉴评人员进行了感官鉴评，其鉴评结果见表5、图5。
表5米醋感官鉴评打分结果(取平均值)
样品 色泽 香气 酸味 回甜感 刺激性
酿酒酵母单独发酵 3.0 3.0 3.5 2.5 2.5
AS 2.180与酿酒酵母共酵 3.5 4.0 4.0 3.0 3.5
ZB406与酿酒酵母共酵 3.5 5.0 4.0 3.0 4.0
如表5所示，与酿酒酵母单独发酵制备米醋相比，产酯酵母与酿酒酵母发酵米醋在香气、口感的酸味与刺激性方面有较大改善，而且ZB406综合表现也要优于AS 2.180。
综上来看，采用ZB406与酿酒酵母共酵工艺能够明显改善液态深层发酵米醋的香气与口感，提升米醋质量。
上述实施例只是用于对本发明的内容进行阐述，而不是限制；因此在和本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应该认为是包括在权利要求书的范围内。
本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明，但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。

Claims (10)

1.一株扣囊复膜酵母ZB406，其于2018年12月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60516，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码：510075。
2.权利要求1所述的扣囊复膜酵母ZB406在食品发酵中的用途。
3.权利要求2所述的用途，其中食品发酵为米醋发酵或米酒发酵。
4.权利要求1所述的扣囊复膜酵母ZB406在米醋发酵中的用途。
5.权利要求4所述的用途，其中所述扣囊复膜酵母ZB406用于在米醋发酵初期接入。
6.权利要求1所述的扣囊复膜酵母ZB406在制备米醋中的用途。
7.一种米醋，其采用扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母共同发酵获得。
8.权利要求7所述的米醋，其中同时添加或分步添加扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母进行所述发酵。
9.一种制备米醋的方法，其包括采用扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母共同发酵。
10.权利要求9所述的方法，其中同时添加或分步添加扣囊复膜酵母ZB406与酿酒酵母进行所述发酵。
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