CN103004602B - 一种抑制山核桃外植体褐化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及林木种苗繁殖技术，具体是涉及一种抑制山核桃外植体褐化的方法。于春季选取山核桃带腋芽茎段作为外植体，对外植体进行消毒处理，再将外植体接种于添加了儿茶素和抗褐化剂的培养基中，接种初期先将组培瓶置于低温黑暗环境下培养，然后转入常规培养环境。本发明抑制山核桃外植体褐化的方法，能够显著降低山核桃外植体的褐变率以及提高其诱导率，操作简便，抑制褐化效果较好，为山核桃组织培养以及山核桃无性繁殖提供技术依托。
Description
技术领域
本发明涉及林木种苗繁殖技术，具体是涉及一种抑制山核桃外植体褐化的方法。
背景技术
山核桃(Carya cathayensis Sarg)是胡桃科山核桃属落叶乔木，集中分布于北纬29°30′～30°35′，东经118°45′～119°25′范围内的安徽宁国、绩溪，浙江临安、淳安等区域。
山核桃是南方地区重要的木本油料和干果树种，果实炒熟后色味香美，果仁香脆可口，为大众所喜爱。经测定其干仁含油率69.8～74.1％，蛋白质含量7.8～9.6％；包含8种脂肪酸，17种氨基酸，其中人体必须的氨基酸占7种；山核桃果肉中还具有22种矿物质元素，有极高的营养价值，并且有降低血脂，预防冠心病之功效；长期食用，还对癌症具有一定的预防效果。
目前，山核桃生产上使用的繁殖方法主要采用播种繁殖，其苗期长、质量参差不齐且苗木易退化，严重阻碍了生产的发展；山核桃植株受伤后，其体内的PPO活性随着酚类物质含量的增加而提高，在植株受伤处形成褐色坏死层，严重阻碍了山核桃嫁接和扦插繁殖的成活率；在山核桃的组织培养研究中，外植体的褐化问题也是阻碍其组织培养的主要因素之一，抑制山核桃外植体的褐变研究不仅对其组织培养，也对其无性繁殖具有重大意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种能够显著降低山核桃外植体的褐变率以及提高其诱导率的抑制山核桃外植体褐化的方法。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种抑制山核桃外植体褐化的方法，其特征在于，于春季选取山核桃带腋芽茎段作为外植体，对外植体进行消毒处理，再将外植体接种于添加了儿茶素和抗褐化剂的培养基中，接种初期先将组培瓶置于低温黑暗环境下培养，然后转入常规培养环境。
优选地，所述培养基包括基本培养基和附加成分，基本培养基为WPM基本培养基、DKW基本培养基、MS基本培养基或B5基本培养基。
最优选地，所述基本培养基为WPM基本培养基。
进一步，附加成分为6-苄基氨基嘌呤4～6mg/L、6-呋喃甲基腺嘌呤0.5～2.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸0.05～0.2mg/L、a-萘乙酸0.04～0.06mg/L、琼脂7～8g/L、蔗糖20～30g/L。
研究表明，不同种类的基本培养基对于外植体褐化的抑制效果不同，本发明通过对基本培养基基本种类的研究，筛选得到最适合山核桃诱导培养的基本培养基，即WPM基本培养基，接种于此的外植体外植体褐变率最低，且诱导率较高。
同时，由于抗氧化剂对山核桃外植体抗褐化具有重要的影响，本发明选择具有较强的抗氧化作用的茶叶中的儿茶素作为抗氧化剂，抗氧化效果较好。
优选地，所述儿茶素的浓度为2～4g/L。
优选地，所述抗褐化剂的浓度为0.01～3g/L。
进一步，所述抗褐化剂为聚乙烯吡咯烷酮、活性碳、硫代硫酸钠、硝酸银和维生素C中的一种或多种。
优选地，所述抗褐化剂为0.05～0.1g/L硝酸银。
优选地，所述抗褐化剂为0.3～0.5g/L硫代硫酸钠。
优选地，所述抗褐化剂为0.3～0.5g/L聚乙烯吡咯烷酮。
本发明抑制山核桃外植体褐化的方法，通过儿茶素配合抗褐化剂对山核桃外植体抗褐化的筛选，结果显示3g/L儿茶素与0.05g/L硝酸银为最佳的抗褐化剂种类及浓度，其抗褐化率约为74.58％，诱导率约为30.48％。同时，3g/L儿茶素与0.3g/L硫代硫酸钠的组合，其抗褐化效果也较好，其抗褐化率和诱导率分别约为73.38％和31.32％。
另外，本发明在接种后，先将培养瓶置于低温黑暗环境下培养，可以较有效控制褐化，其抗褐化率为80.76％，同时保证芽的诱导率，诱导率为22.24％。相对于未置于低温黑暗培养的外植体(抗褐化率为76.76％，诱导率为23.42％)具有较显著的抑制外植体褐化的效果。
本发明抑制山核桃外植体褐化的方法，能够显著降低山核桃外植体的褐变率以及提高其诱导率，操作简便，抑制褐化效果较好，为山核桃组织培养以及山核桃无性繁殖提供技术依托。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
抑制山核桃外植体褐化的方法，包括如下步骤：
①、消毒处理
以春季山核桃优树当年生带腋芽茎段作为外植体，用流水冲洗1～2h后，以多菌灵(1000重量倍液)浸泡30min，再置于超净工作台，以75％酒精(体积百分比)浸泡90s，无菌水清洗3次，再用0.1％的升汞(氯化汞)浸泡15min，无菌水清洗3次。
②、培养基配制
以1L(总的)培养基(pH调至5.8～6.0)计，培养基中含有：
儿茶素3g。
附加成分为：6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)5mg、6-呋喃甲基腺嘌呤(Kinetin，激动素)1mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenyloxyacetic acid)0.1mg、a-萘乙酸(A-naphthlceticacid)0.05mg、琼脂7.5g、蔗糖30g。
硝酸银(抗褐化剂)0.05g。
余量为WPM基本培养基(按现有技术配制)。
③、接种
将消毒好的带腋芽茎段修剪好接入配置好的培养基中，先置于10℃、黑暗条件下培养48h，随后再转至环境温度为25℃，光照时间为12h·d-1，光照强度为1200lx，相对湿度为50～70％的常规培养环境中培养30d。
实施例2和3
培养基中，儿茶素依次为2g、4g，其它均同实施1。
实施例4
附加成分为：6-苄基氨基嘌呤4mg、6-呋喃甲基腺嘌呤2.0mg、2，4-二氯苯氧乙酸0.05mg、a-萘乙酸0.04mg、琼脂8g、蔗糖25g。
其它同实施例1。
实施例5
附加成分为：6-苄基氨基嘌呤6mg、6-呋喃甲基腺嘌呤0.5mg、2，4-二氯苯氧乙酸0.2mg、a-萘乙酸0.06mg、琼脂7g、蔗糖20g。
其它同实施例1。
对比实施例1～3
依次选择基本培养基为DKW基本培养基、MS基本培养基和B5基本培养基(均按现有技术配制)，其它均同实施1。
对比实施例4～6
抗褐化剂依次选择0.1g、0.3g和0.5g硫代硫酸钠，其它均同实施1。
对比实施例7和8
抗褐化剂依次选择0.01g和0.1g硝酸银，其它均同实施1。
对比实施例9～11
抗褐化剂依次选择0.02g、0.05g和0.08g维生素C，其它均同实施1。
对比实施例12～14
抗褐化剂依次选择0.1g、0.3g和0.5g聚乙烯吡咯烷酮，其它均同实施1。
对比实施例15～17
抗褐化剂依次选择1g、2g和3g活性炭，其它均同实施1。
对比实施例18
未添加抗褐化剂，其它均同实施1。
对比实施例19
设计低温为5℃，黑暗条件下培养1d，再进行常规环境培养30d，其它同实施1。
对比实施例20
设计低温为5℃，黑暗条件下培养2d，再进行常规环境培养30d，其它同实施1。
对比实施例21
设计低温为5℃，黑暗条件下培养3d，再进行常规环境培养30d，其它同实施1。
对比实施例22
设计低温为10℃，黑暗条件下培养1d，再进行常规环境培养30d，其它同实施1。
对比实施例23
设计低温为10℃，黑暗条件下培养3d，再进行常规环境培养30d，其它同实施1。
对比实施例24
设计低温为15℃，黑暗条件下培养1d，再进行常规环境培养30d，其它同实施1。
对比实施例25
设计低温为15℃，黑暗条件下培养2d，再进行常规环境培养30d，其它同实施1。
对比实施例26
设计低温为15℃，黑暗条件下培养3d，再进行常规环境培养30d，其它同实施1。
对比实施例27
未进行低温黑暗条件培养，直接进入常规环境培养30d，其它同实施1。
对比分析结果如下：
1、基本培养基对山核桃外植体抗褐化的影响
分析实施例1、对比实施例1～3处理后的抗褐化率和诱导率，结果如表1所示。
表1不同基本培养基对山核桃外植体抗褐化的影响
| 实施例 | 基本培养基 | 诱导率(％) | 抗褐化率(％) |
| 实施例1 | WPM基本培养基 | 35.36 | 58.32 |
| 对比实施例1 | DKW基本培养基 | 26.48 | 47.66 |
| 对比实施例2 | MS基本培养基 | 13.34 | 31.62 |
| 对比实施例3 | B5基本培养基 | 6.68 | 24.78 |
通过表1可知，四种基本培养基对于山核桃外植体抗褐化影响效果由大到小的顺序为：WPM、DKW、MS、B5；诱导效果由大到小的顺序为：WPM、MS、DKW、B5。其中WPM效果最佳，抗褐化率最高，为58.32％，诱导率为35.36％；其次为DKW基本培养基，其抗褐化率为47.66％，诱导率为13.34％；B5基本培养基效果最差，不仅抗褐化率最低(24.78％)，其诱导率也最低，仅为6.68％。
在日常观察中发现，接种后最快15d外植体即出现愈伤组织，其中WPM、MS基本培养基的愈伤组织较好，均为黄绿色的松散结构；而接种于B5基本培养基上的外植体生出的愈伤组织量少，颜色为黄褐色，质地较硬。褐变反应最早出现在接种后4d，其过程一部分表现为最初外植体基部向培养基释放褐色物质，随后整个外植体颜色变黑，另一部分则是外植体不释放褐色物质，但是整个植株逐渐变黑。结合抗褐化效果及诱导效果综合来看，WPM基本培养基为最适山核桃组织培养的基本培养基。
2、抗褐化剂对山核桃外植体抗褐化的影响
分析实施例1、对比实施例4～18处理后的抗褐化率和诱导率，结果如表2所示。
表2不同基本培养基对山核桃外植体抗褐化的影响
| 实施例 | 抗褐化剂 | 浓度(g/L) | 抗褐化率(％) | 诱导率(％) |
| 对比实施例4 | 硫代硫酸钠 | 0.10 | 59.62 | 35.65 |
| 对比实施例5 | 硫代硫酸钠 | 0.30 | 73.38 | 31.32 |
| 对比实施例6 | 硫代硫酸钠 | 0.50 | 73.52 | 22.34 |
| 对比实施例7 | 硝酸银 | 0.01 | 59.66 | 36.38 |
| 实施例1 | 硝酸银 | 0.05 | 74.58 | 30.48 |
| 对比实施例8 | 硝酸银 | 0.10 | 76.76 | 23.42 |
| 对比实施例9 | 维生素C | 0.02 | 60.52 | 36.22 |
| 对比实施例10 | 维生素C | 0.05 | 61.66 | 35.38 |
| 对比实施例11 | 维生素C | 0.08 | 64.78 | 33.62 |
| 对比实施例12 | 聚乙烯吡咯烷酮 | 0.10 | 62.58 | 34.32 |
| 对比实施例13 | 聚乙烯吡咯烷酮 | 0.30 | 63.66 | 30.68 |
| 对比实施例14 | 聚乙烯吡咯烷酮 | 0.50 | 70.58 | 23.48 |
| 对比实施例15 | 活性炭 | 1.00 | 66.64 | 33.34 |
| 对比实施例16 | 活性炭 | 2.00 | 64.62 | 31.48 |
| 对比实施例17 | 活性炭 | 3.00 | 68.56 | 26.38 |
| 对比实施例18 | —— | —— | 58.32 | 35.36 |
通过表2可知，不同种类、浓度的抗褐化剂对抑制山核桃外植体褐变影响程度不同。
在共16组试验中，对比实施例18(对照组)的抗褐化率为58.32％，诱导率为35.36％；对比实施例8抗褐化效果最好，抗褐化率为76.76％；其次为对比实施例6抗褐化率为73.52％；抗褐化效果最差的为对比实施例4和对比实施例7，抗褐化率分别为59.62％和59.66％。
综合而言，硫代硫酸钠、硝酸银、维生素C、聚乙烯吡咯烷酮对山核桃外植体均有一定的抗褐化效果，其中硝酸银与硫代硫酸钠的抗褐化效果较好，而不同含量活性炭的抗褐化效果没有明显的变化。
综合褐化率和诱导率两方面而言，实施例1为最佳的抗褐化剂种类及浓度，其抗褐化率为74.58％，诱导率为30.48％，其次为对比实施例5，其抗褐化率和诱导率分别为73.38％和31.32％。
在日常观察中发现，添加了硫代硫酸钠的培养基中的外植体在褐变发生后，其培养基逐渐变浑浊，并有酸味生成；添加了维生素C的培养基褐变发生后，外植体逐渐腐烂，并产生酸味；而添加了聚乙烯吡咯烷酮、活性炭的培养基在褐变发生后，其外植体变黑，但不腐烂。
3、不同温度、时间的低温黑暗条件培养对山核桃外植体抗褐化的影响
分析实施例1、对比实施例19～27处理后的抗褐化率和诱导率，结果如表3所示。
表3不同温度、时间的低温黑暗条件培养对山核桃外植体抗褐化的影响
| 实施例 | 温度(℃) | 天数(d) | 抗褐化率(％) | 诱导率(％) |
| 对比实施例19 | 5 | 1 | 82.48 | 16.34 |
| 对比实施例20 | 5 | 2 | 84.52 | 12.46 |
| 对比实施例21 | 5 | 3 | 86.16 | 10.38 |
| 对比实施例22 | 10 | 1 | 79.54 | 20.26 |
| 实施例1 | 10 | 2 | 80.76 | 22.24 |
| 对比实施例23 | 10 | 3 | 81.68 | 18.72 |
| 对比实施例24 | 15 | 1 | 76.46 | 22.68 |
| 对比实施例25 | 15 | 2 | 78.24 | 20.46 |
| 对比实施例25 | 15 | 3 | 78.56 | 23.32 |
| 对比实施例27 | 25 | —— | 76.76 | 23.42 |
前期不同温度、时间的低温黑暗条件培养对抑制山核桃外植体褐变影响程度不同。原因在于，由于在酚类化和物合成及氧化的过程中，部分参与其中的酶系统活性是受光诱导的，且一定低温的黑暗条件培养对于减少外植体褐化具有一定的功效。
通过表3可知，前期培养中，于5℃黑暗条件培养下外植体抗褐化率均高于其他组；15℃黑暗条件培养下的外植体褐化率及诱导率与25℃培养下的褐化率及诱导率差异不大。
综合而言，10℃下黑暗培养2d(48h)，即实施例1方案，可以较有效控制外植体褐化，其抗褐化率为80.76％％，诱导率为22.24％，相对于未置于低温黑暗培养的外植体(抗褐化率为76.76％，诱导率为23.42％)具有较显著的抑制外植体褐化的效果。
综上所述，在林木植物组织培养中，外植体材料的褐化是导致培养失败的主要原因，引起褐化的原因有多种，需要进行分项研究。不同种类的基本培养基对于褐化的抑制效果不同，试验结果表明WPM基本培养基是山核桃组织培养的最适基本培养基，在四中不同基本培养基中，WPM的褐化率最小，且芽的诱导率也保持一个较好水平。儿茶素具有较强的抗氧化特性，将之与硝酸银配合可以有效抑制山核桃外植体的褐化；而一定温度及时间的低温暗培养对于抑制外植体褐化亦有一定的抑制作用。
以上内容仅仅是对本发明构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种抑制山核桃外植体褐化的方法，其特征在于，步骤如下：
①、消毒处理
以春季山核桃优树当年生带腋芽茎段作为外植体，用流水冲洗1～2h后，以多菌灵浸泡30min，再置于超净工作台，以75％酒精(体积百分比)浸泡90s，无菌水清洗3次，再用0.1％的升汞(氯化汞)浸泡15min，无菌水清洗3次；
②、培养基配制
以1L pH调至5.8～6.0的培养基计，培养基中含有：
儿茶素3g；
附加成分为：6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)5mg、6-呋喃甲基腺嘌呤(Kinetin，激动素)1mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenyloxy acetic acid)0.1mg、a-萘乙酸(A-naphthlcetic acid)0.05mg、琼脂7.5g、蔗糖30g；
硝酸银0.05g；
余量为WPM基本培养基；
③、接种
将消毒好的带腋芽茎段修剪好接入配制好的培养基中，先置于10℃、黑暗条件下培养48h，随后再转至环境温度为25℃，光照时间为12h·d-1，光照强度为1200lx，相对湿度为50～70％的常规培养环境中培养30d；
或者
①、消毒处理
以春季山核桃优树当年生带腋芽茎段作为外植体，用流水冲洗1～2h后，以多菌灵浸泡30min，再置于超净工作台，以75％酒精(体积百分比)浸泡90s，无菌水清洗3次，再用0.1％的升汞(氯化汞)浸泡15min，无菌水清洗3次；
②、培养基配制
以1L pH调至5.8～6.0的培养基计，培养基中含有：
儿茶素2g；
附加成分为：6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)5mg、6-呋喃甲基腺嘌呤(Kinetin，激动素)1mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenyloxy acetic acid)0.1mg、a-萘乙酸(A-naphthlcetic acid)0.05mg、琼脂7.5g、蔗糖30g；
硝酸银0.05g；
余量为WPM基本培养基；
③、接种
将消毒好的带腋芽茎段修剪好接入配制好的培养基中，先置于10℃、黑暗条件下培养48h，随后再转至环境温度为25℃，光照时间为12h·d-1，光照强度为1200lx，相对湿度为50～70％的常规培养环境中培养30d；
或者
①、消毒处理
以春季山核桃优树当年生带腋芽茎段作为外植体，用流水冲洗1～2h后，以多菌灵浸泡30min，再置于超净工作台，以75％酒精 (体积百分比)浸泡90s，无菌水清洗3次，再用0.1％的升汞(氯化汞)浸泡15min，无菌水清洗3次；
②、培养基配制
以1L pH调至5.8～6.0的培养基计，培养基中含有：
儿茶素4g；
附加成分为：6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)5mg、6-呋喃甲基腺嘌呤(Kinetin，激动素)1mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenyloxy acetic acid)0.1mg、a-萘乙酸(A-naphthlcetic acid)0.05mg、琼脂7.5g、蔗糖30g；
硝酸银0.05g；
余量为WPM基本培养基；
③、接种
将消毒好的带腋芽茎段修剪好接入配制好的培养基中，先置于10℃、黑暗条件下培养48h，随后再转至环境温度为25℃，光照时间为12h·d-1，光照强度为1200lx，相对湿度为50～70％的常规培养环境中培养30d；
或者
①、消毒处理
以春季山核桃优树当年生带腋芽茎段作为外植体，用流水冲洗1～2h后，以多菌灵浸泡30min，再置于超净工作台，以75％酒精(体积百分比)浸泡90s，无菌水清洗3次，再用0.1％的升汞(氯化汞)浸泡15min，无菌水清洗3次；
②、培养基配制
以1L pH调至5.8～6.0的培养基计，培养基中含有：
儿茶素3g；
附加成分为：6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)4mg、6-呋喃甲基腺嘌呤(Kinetin，激动素)2.0mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenyloxy acetic acid)0.05mg、a-萘乙酸(A-naphthlcetic acid)0.04mg、琼脂8g、蔗糖25g；
硝酸银0.05g；
余量为WPM基本培养基；
③、接种
将消毒好的带腋芽茎段修剪好接入配制好的培养基中，先置于10℃、黑暗条件下培养48h，随后再转至环境温度为25℃，光照时间为12h·d-1，光照强度为1200lx，相对湿度为50～70％的常规培养环境中培养30d；
或者
①、消毒处理
以春季山核桃优树当年生带腋芽茎段作为外植体，用流水冲洗1～2h后，以多菌灵浸泡30min，再置于超净工作台，以75％酒精(体积百分比)浸泡90s，无菌水清洗3次，再用0.1％的升汞(氯化汞)浸泡15min，无菌水清洗3次；
②、培养基配制
以1LpH调至5.8～6.0的培养基计，培养基中含有：
儿茶素3g；
附加成分为：6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine)6mg、6-呋喃甲基腺嘌呤(Kinetin，激动素)0.5mg、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-Dichlorophenyloxy acetic acid)0.2mg、a-萘乙酸(A-naphthlcetic acid)0.06mg、琼脂7g、蔗糖20g；
硝酸银0.05g；
余量为WPM基本培养基；
③、接种
将消毒好的带腋芽茎段修剪好接入配制好的培养基中，先置于10℃、黑暗条件下培养48h，随后再转至环境温度为25℃，光照时间为12h·d-1，光照强度为1200lx，相对湿度为50～70％的常规培养环境中培养30d。
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