CN109757381B - 一种白芨组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种白芨组培快繁方法，包括以下步骤：S1：外植体的选择及预处理：以新鲜白芨茎尖或幼根为外植体；S2：不定芽的诱导：诱导培养基配方：MS培养基+1.5mg/L 6‑BA+0.8mg/L NAA+3.5g/L蜂胶提取物+10mg/L白藜芦醇+5mg/L儿茶素+10％椰子汁+15g/L蔗糖+5g/L琼脂，PH为5.8；S3：不定芽的继代与分化；S4：分化苗的生根及驯化；S5：组培苗的移栽。本发明首次以白芨的茎尖和幼根为外植体建立组培快繁体系，相比于传统以蒴果为外植体的种子萌发过程，本发明组织培养程序不经过原球茎增殖，而直接进行丛生芽诱导，繁殖速度更快，操作更简单便捷，污染率更低，不定芽褐变率低、增殖率高。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培育技术领域，具体涉及一种白芨组培快繁方法。
背景技术
白芨属兰科植物白芨属的一种，为多年生草本植物，具有较高的观赏价值；其干燥假鳞茎为我国民间传统中药材，药用价值极高，其味苦、甘、涩，性凉，归肺、胃、肝经功能，具有收敛止血、消肿生肌等功能，主治肺胃出血、外伤出血、痈肿疮疡、皮肤毅裂、水火烫伤等。
由于白芨较高的观赏价值和极高的药用价值，使其市场需求量不断增长，导致野生白芨被长期过度采挖，加之，白芨在自然情况下，有性繁殖困难(杜鹃兰种子的胚发育不完全，萌发率低)，为了克服白芨先天的生殖缺陷，研究人员利用植物组织培育技术实现杜鹃兰的快速繁殖，以提高白芨的自然存储量。目前，白芨快繁体系建立的方法是一般以蒴果(种子)、块茎、侧芽为外植体，其中，以蒴果(种子)为外植体建立快繁体系最为常见，而尚未有以白芨茎尖或幼根为外植体建立快繁体系的研究报道，相比于种子萌发过程，以白芨茎尖或幼根为外植体的组织培养程序不经过原球茎增殖，而直接进行丛生芽诱导，繁殖速度更快，操作更简单。如申请号为CN201810563101.8 的专利，公开一种利用碳纳米管进行白芨组培快繁的方法，如申请号为CN201711452192.X的专利，公开一种白芨快速繁殖成苗的组培方法，如申请号为CN201510594125.6的专利，公开一种高效繁殖白芨组培苗的方法及白芨的种植方法，如申请号为CN201811066484.4的专利，公开一种紫花三叉白芨组培快繁培养基及方法，以上组培快繁方法均以蒴果(种子)为外植体；如申请号为CN201510666090.2的专利，公开利用白芨块茎进行分割繁殖育苗方法，如申请号为CN201510662836.2的专利，公开利用白芨块茎进行快速繁殖育苗方法，以上组培快繁方法均以块茎为外植体；如CN201310282940.X白芨的侧芽组培繁殖方法；如申请号为CN201510733897.3的专利，公开一种白芨组培育苗的方法，以上组培快繁方法均以侧芽为外植体。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种以白芨茎尖或幼根为外植体建立组培快繁体系的方法。
本发明的技术方案概述如下：
一种白芨组培快繁方法，包括以下步骤：
S1：外植体的选择及预处理：取新鲜白芨茎尖或幼根，清水冲洗干净后，用10％次氯酸钠溶液浸泡5-7min，期间不断搅拌，在超净工作台上，用75％酒精进行表面消毒30-60s，再转入溶菌酶溶液中消毒10-15min，用无菌水冲洗4-6次，无菌滤纸吸干表面水分待用；
S2：不定芽的诱导：用解剖刀将茎尖或幼根切割成5-10mm的小段，接种至诱导培养基上，在相对湿度为68-72％、温度为23-27℃的环境下，先以红、蓝光交替光照8-12d,控制光照时间为8-10h/d,再以1600-1800lux复合光光照30-40d,控制光照时间为10-12h/d,获得白芨不定芽；
所述诱导培养基配方：MS培养基+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA +3.5g/L蜂胶提取物+10mg/L白藜芦醇+5mg/L儿茶素+10％椰子汁 +15g/L蔗糖+5g/L琼脂，PH为5.8；
S3：不定芽的继代与分化：将白芨不定芽继代至分化培养基，在相对湿度为74-78％、温度为23-27℃的环境下，以2000-2200lux复合光光照38-42d,控制光照时间为12-14h/d,进行不定芽的增殖分化培养，获得白芨分化苗；
S4：分化苗的生根及驯化：选择生长长度为2.5-3cm的分化苗，剥去基部叶梢，转接至生根培养基中，在湿度为80-85％、温度为25-28℃的环境下，以2000-2400lux的复合光进行光照处理，光照时间为14 -16h/d,生根培养40-45d，打开瓶盖，在室温和自然光照下，炼苗3d；
所述生根培养基配方：1/2 MS培养基+1/2 PDA培养基+0.5mg/L IAA+0.2mg/LGA3+0.5％番茄汁+1.0mg/L IBA+0.3mg/L BR+25g/L蔗糖 +5g/L琼脂，PH为5.8；
S5：组培苗的移栽：将脱毒组培苗移栽到白芨专用苗床上，进行正常的水肥管理，并喷施800倍百菌清稀释液，之后每隔15d，用 1:0.5:200的波尔多液和800倍百菌清稀释液交替喷施1次。
优选的是，所述溶菌酶溶液浓度为5×104-105U/ml，PH为6.0。
优选的是，所述红光和蓝光交替辐照周期为30min,辐射时间比为2：1。
优选的是，所述红光的光照强度为1000-1200Lux。
优选的是，所述蓝光的光照强度为800-1000Lux。
优选的是，所述蜂胶提取物中蜂胶黄酮的含量≥15％。
优选的是，所述分化培养基配方：1/2 MS培养基+1/2 PDA培养基+1.2mg/L 6-BA+0.6mg/LNAA+0.2mg/L CTK+30g/L蔗糖+5g/L琼脂,PH为5.8。
优选的是，所述白芨专用苗床基质由泥炭土、腐叶土、粗椰糠、食用菌菌渣、钙镁磷肥按2:3:1:1:0.05的重量比混合而成。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次以白芨的茎尖和幼根为外植体建立组培快繁体系，
相比于传统以蒴果为外植体的种子萌发过程，本发明组织培养程序不经过原球茎增殖，而直接进行丛生芽诱导，繁殖速度更快，操作更简单便捷，污染率更低，不定芽褐变率低、增殖率高。
(2)本发明诱导培养基中添加蜂胶提取物(蜂胶黄酮的含量≥ 15％)、白藜芦醇、儿茶素等天然成分，协同抗氧化，抑制不定芽发生褐变反应，使初代培养的褐变率降低至1％以下。
(3)本发明生根培养基中添加GA3和番茄汁，能明显的促进分化苗根系发育和增生，生根培养后的分化苗平均根数≥22.8根，平均根长≥7.2cm。
(4)本发明消毒过程中以溶菌酶溶液代替升汞溶液，安全性高，无毒无害，不会造成环境污染。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
一种白芨组培快繁方法，包括以下步骤：
S1：培养基及苗床基质的配制：
a.诱导培养基配方：MS培养基+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA +3.5g/L蜂胶提取物+10mg/L白藜芦醇+5mg/L儿茶素+10％椰子汁 +15g/L蔗糖+5g/L琼脂，PH为5.8；其中，蜂胶提取物中蜂胶黄酮的含量为15％；
b.生根培养基配方：1/2 MS培养基+1/2 PDA培养基+0.5mg/L IAA+ 0.2mg/LGA3+0.5％番茄汁+1.0mg/L IBA+0.3mg/L BR+25g/L蔗糖+5g/L 琼脂，PH为5.8；
c.分化培养基配方：1/2 MS培养基+1/2 PDA培养基+1.2mg/L 6-BA+0.6mg/LNAA+0.2mg/L CTK+30g/L蔗糖+5g/L琼脂,PH为5.8；
d.白芨专用苗床基质：由泥炭土、腐叶土、粗椰糠、食用菌菌渣、钙镁磷肥按2:3:1:1:0.05的重量比混合而成；
S2：外植体的选择及预处理：取新鲜白芨茎尖，清水冲洗干净后，用10％次氯酸钠溶液浸泡5min，期间不断搅拌，在超净工作台上，用75％酒精进行表面消毒30s，再转入PH为6.0、浓度为5×104U/ml 的溶菌酶溶液中消毒10min，用无菌水冲洗4次，无菌滤纸吸干表面水分待用；
S3：不定芽的诱导：用解剖刀将茎尖或幼根切割成5mm的小段，接种至诱导培养基上，在相对湿度为68％、温度为23℃的环境下，先以红、蓝光交替光照8d,其中，红光和蓝光交替辐照周期为30min, 辐射时间比为2：1，红光的光照强度为1000Lux，蓝光的光照强度为800Lux，控制光照时间为8h/d,再以1600lux复合光光照30-40d,控制光照时间为10h/d,获得白芨不定芽；
S4：不定芽的继代与分化：将白芨不定芽继代至分化培养基，在相对湿度为74％、温度为23℃的环境下，以2000lux复合光光照38d, 控制光照时间为12h/d,进行不定芽的增殖分化培养，获得白芨分化苗；
S5：分化苗的生根及驯化：选择生长长度为2.5-3cm的分化苗，剥去基部叶梢，转接至生根培养基中，在湿度为80％、温度为25℃的环境下，以2000lux的复合光进行光照处理，光照时间为14h/d,生根培养40d，打开瓶盖，在室温和自然光照下，炼苗3d；
S6：组培苗的移栽：将脱毒组培苗移栽到白芨专用苗床上，进行正常的水肥管理，并喷施800倍百菌清稀释液，之后每隔15d，用 1:0.5:200的波尔多液和800倍百菌清稀释液交替喷施1次。
实施例2
一种白芨组培快繁方法，包括以下步骤：
S1：培养基及苗床基质的配制：
a.诱导培养基配方：MS培养基+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA +3.5g/L蜂胶提取物+10mg/L白藜芦醇+5mg/L儿茶素+10％椰子汁 +15g/L蔗糖+5g/L琼脂，PH为5.8；其中，蜂胶提取物中蜂胶黄酮的含量为18％；
b.生根培养基配方：1/2 MS培养基+1/2 PDA培养基+0.5mg/L IAA+ 0.2mg/LGA3+0.5％番茄汁+1.0mg/L IBA+0.3mg/L BR+25g/L蔗糖+5g/L 琼脂，PH为5.8；
c.分化培养基配方：1/2 MS培养基+1/2 PDA培养基+1.2mg/L 6-BA+0.6mg/LNAA+0.2mg/L CTK+30g/L蔗糖+5g/L琼脂,PH为5.8；
d.白芨专用苗床基质：由泥炭土、腐叶土、粗椰糠、食用菌菌渣、钙镁磷肥按2:3:1:1:0.05的重量比混合而成；
S2：外植体的选择及预处理：取新鲜白芨幼根，清水冲洗干净后，用10％次氯酸钠溶液浸泡6min，期间不断搅拌，在超净工作台上，用75％酒精进行表面消毒45s，再转入PH为6.0、浓度为7.5×104U /ml 的溶菌酶溶液中消毒12min，用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分待用；
S3：不定芽的诱导：用解剖刀将茎尖或幼根切割成8mm的小段，接种至诱导培养基上，在相对湿度为70％、温度为25℃的环境下，先以红、蓝光交替光照10d,其中，红光和蓝光交替辐照周期为30min, 辐射时间比为2：1，红光的光照强度为1100Lux，蓝光的光照强度为900Lux，控制光照时间为9h/d,再以1700lux复合光光照35d,控制光照时间为11h/d,获得白芨不定芽；
S4：不定芽的继代与分化：将白芨不定芽继代至分化培养基，在相对湿度为76％、温度为25℃的环境下，以2100lux复合光光照40d, 控制光照时间为13h/d,进行不定芽的增殖分化培养，获得白芨分化苗；
S5：分化苗的生根及驯化：选择生长长度为2.5-3cm的分化苗，剥去基部叶梢，转接至生根培养基中，在湿度为82％、温度为26℃的环境下，以2200lux的复合光进行光照处理，光照时间为15h/d,生根培养42d，打开瓶盖，在室温和自然光照下，炼苗3d；
S6：组培苗的移栽：将脱毒组培苗移栽到白芨专用苗床上，进行正常的水肥管理，并喷施800倍百菌清稀释液，之后每隔15d，用 1:0.5:200的波尔多液和800倍百菌清稀释液交替喷施1次。
实施例3
一种白芨组培快繁方法，包括以下步骤：
S1：培养基及苗床基质的配制：
a.诱导培养基配方：MS培养基+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA +3.5g/L蜂胶提取物+10mg/L白藜芦醇+5mg/L儿茶素+10％椰子汁+15g/L蔗糖+5g/L琼脂，PH为5.8；其中，蜂胶提取物中蜂胶黄酮的含量为20％；
b.生根培养基配方：1/2 MS培养基+1/2 PDA培养基+0.5mg/L IAA+ 0.2mg/LGA3+0.5％番茄汁+1.0mg/L IBA+0.3mg/L BR+25g/L蔗糖+5g/L 琼脂，PH为5.8；
c.分化培养基配方：1/2 MS培养基+1/2 PDA培养基+1.2mg/L 6-BA+0.6mg/LNAA+0.2mg/L CTK+30g/L蔗糖+5g/L琼脂,PH为5.8；
d.白芨专用苗床基质：由泥炭土、腐叶土、粗椰糠、食用菌菌渣、钙镁磷肥按2:3:1:1:0.05的重量比混合而成；
S2：外植体的选择及预处理：取新鲜白芨茎尖或幼根，清水冲洗干净后，用10％次氯酸钠溶液浸泡7min，期间不断搅拌，在超净工作台上，用75％酒精进行表面消毒60s，再转入PH为6.0、浓度为 105U/ml的溶菌酶溶液中消毒15min，用无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分待用；
S3：不定芽的诱导：用解剖刀将茎尖和幼根切割成10mm的小段，接种至诱导培养基上，在相对湿度为72％、温度为27℃的环境下，先以红、蓝光交替光照12d,其中，红光和蓝光交替辐照周期为30min, 辐射时间比为2：1，红光的光照强度为1200Lux，蓝光的光照强度为1000Lux，控制光照时间为10h/d,再以1800lux复合光光照40d,控制光照时间为12h/d,获得白芨不定芽；
S4：不定芽的继代与分化：将白芨不定芽继代至分化培养基，在相对湿度为78％、温度为27℃的环境下，以2200lux复合光光照42d, 控制光照时间为14h/d,进行不定芽的增殖分化培养，获得白芨分化苗；
S5：分化苗的生根及驯化：选择生长长度为2.5-3cm的分化苗，剥去基部叶梢，转接至生根培养基中，在湿度为85％、温度为28℃的环境下，以2400lux的复合光进行光照处理，光照时间为16h/d,生根培养45d，打开瓶盖，在室温和自然光照下，炼苗3d；
S6：组培苗的移栽：将脱毒组培苗移栽到白芨专用苗床上，进行正常的水肥管理，并喷施800倍百菌清稀释液，之后每隔15d，用 1:0.5:200的波尔多液和800倍百菌清稀释液交替喷施1次。
表1列出实施例1-3白芨不定芽的增殖情况
表1：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 增殖率/％ | 420 | 400 | 430 |
| 褐变率/％ | 1.0 | 0.7 | 0.8 |
表2列出实施例1-3白芨分化苗的生长情况
表2：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 平均根数/根 | 23.5 | 22.8 | 23.2 |
| 平均根长/cm | 7.2 | 7.4 | 7.5 |
| 分化苗长势 | 植株浓绿 | 植株浓绿 | 植株浓绿 |
表3列出实施例1-3白芨分化苗炼苗成活率和组培苗移栽成活率
表3：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 分化苗炼苗成活率/％ | 95.2 | 94.3 | 95.5 |
| 组培苗移栽成活率/％ | 100 | 99.8 | 100 |
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (7)
1.一种白芨组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：外植体的选择及预处理：取新鲜白芨茎尖或幼根，清水冲洗干净后，用10％次氯酸钠溶液浸泡5-7min，期间不断搅拌，在超净工作台上，用75％酒精进行表面消毒30-60s，再转入溶菌酶溶液中消毒10-15min，用无菌水冲洗4-6次，无菌滤纸吸干表面水分待用；
S2：不定芽的诱导：用解剖刀将茎尖或幼根切割成5-10mm的小段，接种至诱导培养基上，在相对湿度为68-72％、温度为23-27℃的环境下，先以红、蓝光交替光照8-12d,控制光照时间为8-10h/d,再以1600-1800lux复合光光照30-40d,控制光照时间为10-12h/d,获得白芨不定芽；
所述诱导培养基配方：MS培养基+1.5mg/L 6-BA+0.8mg/L NAA+3.5g/L蜂胶提取物+10mg/L白藜芦醇+5mg/L儿茶素+10％椰子汁+15g/L蔗糖+5g/L琼脂，PH为5.8；
S3：不定芽的继代与分化：将白芨不定芽继代至分化培养基，在相对湿度为74-78％、温度为23-27℃的环境下，以2000-2200lux复合光光照38-42d,控制光照时间为12-14h/d,进行不定芽的增殖分化培养，获得白芨分化苗；
所述分化培养基配方：1/2MS培养基+1/2PDA培养基+1.2mg/L 6-BA+0.6mg/LNAA+0.2mg/L CTK+30g/L蔗糖+5g/L琼脂,PH为5.8；
S4：分化苗的生根及驯化：选择生长长度为2.5-3cm的分化苗，剥去基部叶梢，转接至生根培养基中，在湿度为80-85％、温度为25-28℃的环境下，以2000-2400lux的复合光进行光照处理，光照时间为14-16h/d,生根培养40-45d，打开瓶盖，在室温和自然光照下，炼苗3d；
所述生根培养基配方：1/2MS培养基+1/2PDA培养基+0.5mg/L IAA+0.2mg/LGA3+0.5％番茄汁+1.0mg/L IBA+0.3mg/L BR+25g/L蔗糖+5g/L琼脂，PH为5.8；
S5：组培苗的移栽：将脱毒组培苗移栽到白芨专用苗床上，进行正常的水肥管理，并喷施800倍百菌清稀释液，之后每隔15d，用1:0.5:200的波尔多液和800倍百菌清稀释液交替喷施1次。
2.根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于，所述溶菌酶溶液浓度为5×104-105U/ml，PH为6.0。
3.根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于，所述红光和蓝光交替辐照周期为30min,辐射时间比为2：1。
4.根据权利要求3所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于，所述红光的光照强度为1000-1200Lux。
5.根据权利要求3所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于，所述蓝光的光照强度为800-1000Lux。
6.根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于，所述蜂胶提取物中蜂胶黄酮的含量≥15％。
7.根据权利要求1所述一种白芨组培快繁方法，其特征在于，所述白芨专用苗床基质由泥炭土、腐叶土、粗椰糠、食用菌菌渣、钙镁磷肥按2:3:1:1:0.05的重量比混合而成。
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