CN103002734A - 防神经毒性剂的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供防止或降低暴露于神经毒性剂时的神经毒性的方法，包括施用如本文所提供的电动力学改变的水性液体，其量足以提供对所述神经毒性剂的神经保护作用，优选地，其中在暴露于神经毒素的受试者中防止或降低运动协调的丧失。在某些方面，防止或降低神经毒素介导的神经元凋亡，和/或激活或诱导神经元中PI-3激酶和Akt磷酸化中的至少一种。优选地，施用所述液体包括在暴露于所述神经毒性剂前施用所述液体。本发明另外还提供在患有神经变性病症或疾病的受试者中保护或改善运动协调的方法，包括施用如本文所提供的电动力学改变的水性液体，其量足以在所述受试者中提供对运动协调的保护或改善。

Description

防神经毒性剂的方法和组合物
发明领域
特定的方面整体涉及防止或降低暴露于神经毒性剂时的神经毒性的方法，包括施用如本文所提供的电动力学改变的水性液体，并且优选地，其中在暴露于神经毒素的受试者中防止或降低运动协调的丧失。特定的方面涉及防止或降低神经毒素介导的神经元凋亡，和/或激活或诱导神经元中PI-3激酶和Akt磷酸化中的至少一种。特定的方面整体涉及在患有神经变性病症或疾病的受试者中保护或改善运动协调的方法，包括施用如本文所提供的电动力学改变的水性液体。相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2010年4月30日提交的且题为″COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OFNEURODEGENERATIVE DISEASES″的美国专利申请No.12/771,476、2010年11月15日提交的且题为″METHODS ANDCOMPOSITIONS FOR PROTECTING AGAINST NEUROTOXICITYOF A NEUROTOXIC AGENT，AND IMPROVING MOTORCOORDINATION ASSOCIATED WITH A NEURODEGENERATIVECONDITION OR DISEASE″的美国临时专利申请No.61/413,899以及以相同名称于2011年3月18日提交的美国临时专利申请No.61/454,409的优先权，它们均全文以引用方式并入本文。
发明背景
神经变性疾病是一组以神经元或其髓鞘退化为典型特征的疾病。这种神经元的破坏最终导致功能障碍和失能。通常发现炎症是神经变性疾病的组成部分并会加重神经变性的发病(Minagar，等(2002)J.Neurological Sci.202：13-23；Antel and Owens(1999)J.Neuroimmunol.100：181-189；Elliott(2001)Mol.Brain.Res.95：172-178；Nakamura(2002)Biol.Pharm.Bull.25：945-953；Whitton PS.(2007)Br JPharmacol.150：963-76)。共同地，这些疾病包括本领域公知的炎性神经变性疾病。在一些神经变性疾病中，在神经元存在任何明显的损失前数年，神经炎症便可发生(Tansey等，Fron Bioscience 13：709-717，2008)。许多不同类型的免疫细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞，可促使免疫相关疾病的发病，这些疾病如多发性硬化(M.S.)、帕金森病、淀粉样变性(如阿尔茨海默病)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、朊病毒病和HIV相关痴呆。更具体地讲，研究小组已注意到，在MS中髓磷脂受损由炎性反应介导(Ruffini等(2004)Am J Pathol 164：1519-1522)，并且M.S.发病在白细胞浸润CNS时加重(Dos Santos等(2008)J Neuroinflammation 5：49)。一个研究小组已开发了遗传模型来测试CNS炎症及其在MS中的作用(通过动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE))。此外，已发现前炎症因子(具体地讲TNF-α)在阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症(ALS)中升高。(Greig等(2006)Ann NY Acad of Sci1035：290-315)。这些炎性神经变性疾病因此可通过抗炎药物得到有效治疗。
炎性神经变性疾病包括但不限于哺乳动物中的多发性硬化(MS)、帕金森病、淀粉样变性(如阿尔茨海默病)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、HIV相关痴呆、中风/脑缺血、头部外伤、脊髓损伤、亨廷顿氏舞蹈病、偏头痛、大脑淀粉样血管病、AIDS、与年龄相关的认知功能减退；轻度认知损害和朊病毒病。
多发性硬化(MS)是一种中枢神经系统(CNS)的慢性炎性神经变性疾病，它在全世界影响着大约1,100,000人，尤其是困扰着青壮年(Pugliatti等(2002)Clin.Neurol.Neuros.104：182-191)。MS的病理学特征在于神经组织的髓鞘脱失，其在临床上导致许多疾病形式中的一种，范围从病情的良性到慢性进展型模式。更具体地讲，五种主要的多发性硬化形式已有描述：1)良性多发性硬化；2)复发缓解型多发性硬化(RRMS)；3)继发进展型多发性硬化(SPMS)；4)原发进展型多发性硬化(PPMS)；以及5)进展复发型多发性硬化(PRMS)。慢性进展型多发性硬化是用于统称SPMS、PPMS和PRMS的术语。多发性硬化的复发形式为具有叠加复发的SPMS、RRMS和PRMS。
在整个病程中，轴突周围的髓鞘存在进行性破坏。由于完整的髓磷脂对于保持轴突完整性必不可少(Dubois-Dalcq等，Neuron.48，9-12(2005))，因此，系统性破坏最终在临床上导致各种神经功能障碍，包括麻痹和疼痛、协调及平衡问题、失明和一般认知损害。令人关注的是，MS的进展在患者中可存在显著的差异，一些人在患病几十年的生活后只有轻微的残疾，而其他人在诊断后仅几年就得依赖轮椅。
MS的病因目前仍不得而知，但调查遗传学证据、分子学基础和免疫学因素的研究正开始阐明病程以及髓鞘脱失的发生机制。在遗传分析中，一些报告已表明，相关的个体与正常人群(0.1％的MS流行率)相比具有更高的MS发病率：同卵双生一者患有MS则另一者具有30％的发病机率，异卵双生及兄弟姐妹一者患MS则另一者具有1-2％的机率。多个小组已利用连锁和关联研究来发现负责这种遗传性的基因，并已发现，患MS的相对风险是携带人白细胞抗原(HLA)-DR2等位基因的主要组织相容性复合体(MHC)II类等位基因的人群的3-4倍。也已鉴定了与MS相关的其他基因，但风险要低得多。MS易感性与MHC II类之间的联系强烈表明CD4+T细胞在MS的发病中发挥着作用(Oksenberg等，JAMA 270：2363-2369(1993)；Olerup等，Tissue Antigens 38：1-3(1991))。
此外，已经尝试了鉴定与健康个体相比在患MS的MS患者中差异表达的基因。基因芯片已用于：1)通过MS斑块类型(急性与慢性)和斑块区域(活性与非活性)研究转录(Lock and Heller(2003))；2)通过用干扰素β治疗以及未用干扰素β治疗的患者比较RRMS患者与对照中的外周血单核细胞(PBMC)(Sturzebecher等(2003))；以及3)研究小鼠(MS的动物模型)实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)各阶段中的CNS细胞(Lock等(2002))。预计了这些实验所发现的其中许多结果，包括发现抗炎、抗凋亡基因受到下调，而促炎性、增殖基因受到上调。令人惊讶的结果包括鉴定出适于治疗应用的潜在新型靶点，诸如骨桥蛋白(Chabas等2001)和TRAIL(Wandinger等2003))。然而，当比较MS患者与健康个体的表达时具有差异调节的许多基因在MS发展中具有未知的意义，因为，可能影响MS易感性和/或进展的任何基因尚不清楚。
进一步的研究已确定，由自身反应性CD4+T细胞引发的炎性反应可介导对髓磷脂的损伤(Bruck等，J.Neurol.Sci.206：181-185(2003))。一般来讲，据信，在MS发作期间髓鞘和轴突发生的大部分损坏通过产生炎性反应的自体反应性T细胞应答而发生，所述炎性反应包括分泌促炎性(如Th1和Th17)细胞因子(Prat等，J.Rehabil.Res.Dev.39：187-199(2002)；Hemmer等，Nat.Rev.Neurosci.3：291-301(2002))。
目前可用于MS的治疗包括醋酸格拉替雷、干扰素β、那他珠单抗和米托蒽醌。一般来讲，这些药物以非特异性方式抑制免疫系统并且对疾病总体进展的限制极其有限。(Lubetzki等(2005)，Curr.Opin.Neurol.18：237-244)。因此，存在开发更好地治疗MS的治疗策略的需要。
醋酸格拉替雷由谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸和酪氨酸作为无规聚合物而组成。醋酸格拉替雷的效果有限，并且具有明显的副作用，例如，注射部位肿块、发冷、发烧、疼痛、呼吸短促、心跳加快和焦躁不安。在一项使用943名患有原发进展型MS的重要临床研究中，醋酸格拉替雷未能阻止无能和疾病的进展(Wolinsky，等(2007)An Neurol 61：13-24)。
干扰素β是一种由成纤维细胞产生的天然存在的蛋白并为先天免疫应答的一部分。作为MS的药物，干扰素β在降低MS发作率方面的有效性为约18-38％。副作用包括轻微的流感样症状和注射部位的反应以及更严重的情况(例如，抑郁、癫痫和肝问题)。
米托蒽醌是MS的一种治疗药物。其作为用于对抗癌症的化疗剂而开发，作用机理是干扰DNA修复及合成，对癌细胞无特异性。米托蒽醌的副作用可能非常严重，并包括恶心、呕吐、脱发、损害心脏以及免疫抑制。
那他珠单抗是一种人源化单克隆抗体，其靶向细胞粘附分子α4整合素。据信，那他珠单抗通过阻止导致炎症的免疫细胞跨过血脑屏障(BBB)而发挥作用。副作用包括疲劳、头痛、恶心、感冒和过敏反应。
帕金森病
帕金森病(PD)是另一种炎性神经变性疾病，特征在于运动障碍，包括肌肉强直和躯体运动缓慢。PD是第二大常见的神经变性疾病，仅在美国就困扰着多达一百万人。PD流行率随年龄而增加，从普通美国人群中的0.3％升至65岁及以上人群中的1％至2％，以及85岁及以上个体中的4％至5％。随着预期寿命的整体增加，在美国和其他国家的PD患者数预计到20302年将翻倍。
PD是一种进行性疾病，特征在于运动症状，包括震颤、僵直、动作迟缓(运动徐缓)、步态障碍和体位改变。该疾病还涉及非运动症状，诸如认知缺陷、抑郁和睡眠障碍。像阿尔茨海默病一样，PD是一种蛋白质病。错误折叠的α-突触核蛋白在神经元内蓄积，并形成所谓的Lewy体，这是PD的一种神经病理学特征。最初认为原因只是黑质中多巴胺能神经元的丢失，但最近已认识到PD具有激活大脑小胶质细胞并参与到神经元细胞死亡进展中的炎症成分。人们认为帕金森病的一种病理生理学原因是基底神经节(包括黑质的致密部、位于脑干中的基底核的)中多巴胺生成细胞的进行性破坏。多巴胺能神经元的丢失导致乙酰胆碱相对过多。Jellinger，K.A.，Post MortemStudies in Parkinson′s Disease-Is It Possible to Detect Brain Areas ForSpecific Symptoms？，J Neural Transm 56(Supp)；1-29：1999。此外，对帕金森病的最近研究已观察到，由于细胞因子和HLA-DR抗原的增强表达，免疫应答可能促使神经元损伤(Czlonkowska等(2002)MedSci Monit 8：RA 165-77)。
在照料PD患者方面，早期的有效治疗还不能满足临床需要。左旋多巴(L-DOPA)是PD最有效的药物治疗措施，但因严重的副作用通常在病程晚期医生才会开出。多巴胺受体激动剂和单胺氧化酶B型抑制剂已显示出疗效与副作用的发生率和严重性逆相关，而研究其他治疗选择(包括辅酶Q10、生育酚(维生素E)、金刚胺和β受体阻滞剂)的试验要么未能表现出有益效果，要么未获得足够的数据进行透彻的风险与益处评估。尤其是神经保护已成为PD治疗中的关键但又难以达到的目标。
淀粉样变性在某些蛋白质具有改变的结构并趋于彼此结合从而在特定组织中堆积并阻断正常组织功能时发生。这些改变的结构化蛋白称为淀粉体。通常，淀粉样变性分成两类：原发性或继发性。原发性淀粉样变性因免疫细胞功能不正确的疾病而发生。继发性淀粉样变性通常因某些其他慢性感染或炎性疾病的并发症而发生。这些疾病的实例包括阿尔茨海默病和类风湿性关节炎。由于继发性淀粉样变性的潜在问题是炎症，因此治疗炎症将可能是有益的。
阿尔茨海默病是另一种类型的炎性神经变性疾病。例证为学习和记忆障碍不断加重，但该病也可以通过表明认知能力发生改变的其他方式自我显露出来。在整个疾病中，大脑皮层中神经元和突触的进行性丢失导致神经组织的严重萎缩。虽然阿尔茨海默病的原因尚不清楚，但是许多人相信炎症在起着重要的作用，并且临床研究已表明炎症在很大程度上促使了疾病的发病(Akiyama，等(2000)Neurobiol Aging.21：383-421)。
在肌萎缩性侧索硬化症中，已表明了炎症与疾病之间存在联系(Centonze，等(2007)Trends Pharm Sci 28：180-7)。此外，已发现TNF-αmRNA在肌萎缩性侧索硬化症转基因小鼠模型的脊髓中表达。令人感兴趣的是，早在发生运动困难前就检测出了转录物，直至ALS导致死亡(Elliot(2001)Brain Res Mol Brain Res 95：172-8)。
神经毒素
神经毒素是特异性作用于神经元、其突触或整个神经系统的毒素。这些物质导致大脑结构受损，继而导致慢性疾病。神经毒素包括例如肾上腺素能神经毒素、胆碱能神经毒素、多巴胺能神经毒素、兴奋性毒素以及其他神经毒素。肾上腺素能神经毒素的实例包括N-(2-氯乙基)-N-乙基-2-溴苄胺盐酸盐。胆碱能神经毒素的实例包括乙酰基乙基胆碱氮芥盐酸盐(acetylethylcholine mustard hydrochloride)。多巴胺能神经毒素的实例包括6-羟基多巴胺氢溴酸盐(6-OHDA)、1-甲基-4-(2-甲基苯基)-1，2，3，6-四氢吡啶盐酸盐、1-甲基-4-苯基-2，3-二氢吡啶鎓高氯酸盐、N-甲基-4-苯基-1，2，5，6-四氢吡啶盐酸盐(MPTP)、碘化1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)、百草枯和鱼藤酮。兴奋性毒素的实例包括NMDA和红藻氨酸。
已表明MPTP、MPP+、百草枯、鱼藤酮和6-OHDA会在动物模型中诱导PD样症状。(参见K.Ossowska，等，(2006).″Degeneration ofdopaminergic mesocortical neurons and activation of compensatoryprocesses induced by a long-term paraquat administration in rats：Implications for Parkinson′s disease″.Neuroscience 141(4)：2155-2165；以及Caboni P，等，(2004).″Rotenone，deguelin，their metabolites，andthe rat model of Parkinson′s disease″.Chem Res Toxicol 17(11)：1540-8；Simon等，Exp Brain Res，1974，20：375-384；Langston等，Science，1983，219：979-980；Tanner，Occup Med，1992，7：503-513；Liou等，Neurology，1997，48：1583-1588)。
发明概述
特定的方面提供防止或降低暴露于神经毒性剂时的神经毒性的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的电动力学改变的水性液体，所述液体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径并在所述离子水性液体中以足以提供对所述神经毒性剂的神经保护作用的量稳定配置，其中提供防止或降低暴露于神经毒性剂时的神经毒性的方法。在某些方面，该方法包括防止或降低暴露于神经毒素的受试者中的运动协调丧失。在特定的方面，防止或降低神经毒素介导的神经元凋亡，和/或激活或诱导(例如，受试者的)神经元中PI-3激酶和Akt磷酸化中的至少一种。
在特定的方面，电荷稳定的含氧纳米结构稳定配置在离子水性液体中，其量在液体与活细胞接触时足以提供细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节。
在特定的实施方案中，施用液体包括在暴露于神经毒素剂前施用液体。
在某些方面，电荷稳定的含氧纳米结构是液体中主要的电荷稳定的含气体纳米结构物质。在特定的方面，作为电荷稳定的含氧纳米结构存在于液体中的溶解氧分子的百分比为选自大于以下值的百分比：0.01％、0.1％、1％、5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％和95％。在某些方面，总溶解氧基本上存在于电荷稳定的含氧纳米结构中。在某些实施方案中，电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有低于选自以下值的尺寸的平均直径：90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm以及低于5nm。
在某些方面，离子水溶液包括盐水溶液，和/或为超充氧的。在某些方面，该液体包括溶剂化电子的形式。
在特定的方面，电动力学改变的水性液体的改变包括将液体暴露于水动力学引起的局部电动力学效应。在某些实施方案中，暴露于局部电动力学效应包括暴露于电压脉冲和电流脉冲中的至少一种。在某些实施方案中，将液体暴露于水动力学引起的局部电动力学效应包括将液体暴露于用于产生所述液体的装置的电动力学效应引起结构特征。
在某些方面，电动力学改变的水性液体调节一氧化氮的局部或细胞水平。
在特定的方面，电动力学改变的水性液体促进施用部位的选自以下的至少一种细胞因子的局部降低：IL-1β、IL-8、TNF-α和TNF-β。
该方法的特定方面包括联合治疗，其中将至少一种另外的治疗剂施用给患者。在某些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自：肾上腺素能神经毒素、胆碱能神经毒素、多巴胺能神经毒素、兴奋性毒素和化疗剂。
在特定的方面，调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种包括调节细胞膜结构或功能中的至少一种，调节细胞膜结构或功能中的至少一种包括调节膜相关蛋白的构象、配体结合活性或催化活性中的至少一种。在特定的方面，膜相关蛋白包括选自以下的至少一种：受体、跨膜受体、离子通道蛋白、细胞内附着蛋白、细胞粘附蛋白和整合素。在特定的方面，跨膜受体包括G-蛋白偶联受体(GPCR)。在特定的方面，G蛋白偶联受体(GPCR)与G蛋白α亚基相互作用。在特定的方面，G蛋白α亚基包括选自Gαs、Gαi、Gαq和Gα12中的至少一种。在特定的方面，所述至少一种G蛋白α亚基为Gαq。
在某些方面，调节细胞膜电导率包括调节全细胞电导。在特定的实施方案中，调节全细胞电导包括调节全细胞电导的至少一种电压依赖性贡献因素。
在特定的方面，细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，调节细胞内信号转导包括调节钙依赖性细胞信息传递途径或系统。在特定的方面，细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，调节细胞内信号转导包括调节磷脂酶C活性。在特定的方面，细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，调节细胞内信号转导包括调节腺苷酸环化酶(AC)活性。在特定的方面，细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节与选自以下的至少一种病症或症状相关的细胞内信号转导：中枢神经和大脑慢性炎症以及中枢神经和大脑急性炎症。
该方法的某些方面包括施用到细胞网络或细胞层，并进一步包括调节其中的细胞间连接。在特定的方面，细胞内连接包括选自紧密连接、间隙连接、粘着带和细胞桥粒的至少一种。在某些实施方案中，细胞网络或细胞层包括选自以下的至少一种：CNS血管中的内皮细胞和内皮-星形胶质细胞紧密连接，血液-脑脊髓液紧密连接或屏障，肺上皮型连接，支气管上皮型连接以及肠上皮型连接。
在特定的方面，电动力学改变的水性液体为充氧的，并且在大气压下氧在液体中的含量为至少8ppm、至少15ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。在某些方面，在大气压下在电动力学改变的液体的电荷稳定的含氧纳米结构中氧的含量为至少8ppm、至少15ppm、至少20ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。
在某些方面，电动力学改变的水性液体包含溶剂化电子形式以及电动力学改性或带电的氧物质中的至少一种。在特定的实施方案中，溶剂化电子形式或电动力学改性或带电的氧物质的含量为至少0.01ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少3ppm、至少5ppm、至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm或至少20ppm。在某些方面，电动力学改变的充氧水性液体包含至少部分地通过分子氧稳定的溶剂化电子。
在特定的方面，调节细胞膜电位和细胞膜电导率至少一种的能力在密闭气密性容器中持续至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少6个月、至少12个月或更长的时间。
在某些方面，膜相关蛋白包括CCR3。
在特定的方面，治疗或施用包括通过局部、吸入、鼻内、口腔和静脉内方式中的至少一种方式而施用。
在某些实施方案中，电动力学改变的液体的电荷稳定的含氧纳米结构包括本文所公开的表1和表2中的至少一种盐或离子。
另外的方面提供包含一定量的电动力学改变的水性液体的药物组合物，所述液体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径并在所述离子水性液体中以足以防止和或降低暴露于神经毒性剂时的神经毒性的量稳定配置。
其他方面提供保护或改善患有神经变性病症或疾病的受试者中的运动协调的方法，包括向患有特征在于运动协调丧失的神经变性病症或疾病的受试者施用治疗有效量的电动力学改变的水性液体，所述液体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径并在所述离子水性液体中以足以保护或改善所述受试者中运动协调的量稳定配置，其中提供了保护或改善患有神经变性病症或疾病的受试者中的运动协调的方法。在某些方面，激活或诱导PI-3激酶和Akt磷酸化中的至少一种。
在特定的方面，神经变性病症或疾病包括哺乳动物中选自以下的至少一种炎性神经变性病症或疾病：多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、中风/脑缺血、头部外伤、脊髓损伤、亨廷顿氏舞蹈病、偏头痛、大脑淀粉样血管病、与AIDS相关的炎性神经变性病症、与年龄相关的认知功能减退、轻度认知损害和朊病毒病。优选地，炎性神经变性病症或疾病包括多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病中的至少一种。
该方法的某些方面包括通过用另一种抗炎剂同时地或附加地治疗受试者而协同或非协同抑制或减轻炎症，例如，其中所述其他抗炎剂包括类固醇或糖皮质类固醇。在某些方面，糖皮质类固醇包括布地奈德或其活性衍生物。
该方法的某些方面包括联合治疗，其中将至少一种另外的治疗剂施用给患者。在特定实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自：醋酸格拉替雷、干扰素β、米托蒽醌、那他珠单抗、包括MMP-9和MMP-2的抑制剂的MMP的抑制剂、短效β2激动剂、长效β2激动剂、抗胆碱能剂、皮质类固醇、全身性皮质类固醇、肥大细胞稳定剂、白三烯调节剂、甲基黄嘌呤、β2激动剂、沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇、吡布特罗、阿莫特罗、福莫特罗、沙美特罗、包括异丙托铵和噻托溴铵抗胆碱能剂；包括倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、莫米松、曲安西龙、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松的皮质类固醇；包括蒙鲁司特、扎鲁司特和齐留通的白三烯调节剂；包括色甘酸和奈多罗米的肥大细胞稳定剂；包括茶碱的甲基黄嘌呤；包括异丙托铵与沙丁胺醇、氟替卡松与沙美特罗、布地奈德与福莫特罗的复方药物；包括羟嗪、苯海拉明、氯雷他定、西替利嗪和氢化可的松的抗组胺药；包括他克莫司和吡美莫司的免疫系统调节药物；环孢霉素；硫唑嘌呤；吗替麦考酚酯；以及它们的组合。
在某些方面，所述至少一种另外的治疗剂为TSLP和/或TSLPR拮抗剂。在特定的实施方案中，TSLP和/或TSLPR拮抗剂选自：对TSLP和TSLP受体特异性的中和抗体、可溶性TSLP受体分子以及TSLP受体融合蛋白，包括编码不止一条受体链的组分的TSLPR-免疫球蛋白Fc分子或多肽。
在特定的方面，电动力学改变的液体的电荷稳定的含氧纳米结构包括本文所公开的表1和表2中的至少一种盐或离子。
附图简述
图1A-C展示了一系列膜片钳实验的结果，这些实验评价了电动力学产生的液体(例如RNS-60和Solas)在两个时间点(15分钟(左图)和2小时(右图))以及不同的电压方案下对上皮细胞膜极性和离子通道活性的作用。
图2A-C相对于图1A-C的相关实验显示了：在三种电压方案(A.从0mV阶跃；B.从-60mV阶跃；C.从-120mV阶跃)以及两个时间点(15分钟(空心圈)和2小时(实心圈))从RNS-60电流数据减去Solas电流数据得到的曲线图。
图3A-D展示了一系列膜片钳实验的结果，这些实验评价了电动力学产生的液体(例如Solas(图A和图B)以及RNS-60(图C和图D))在使用不同的外部盐溶液以及在不同的电压方案(图A和C显示了从0mV阶跃；图B和D显示了从-120mV阶跃)下对上皮细胞膜极性和离子通道活性的作用。
图4A-D相对于图3A-D的相关实验显示了：Solas(图A和B)和Revera 60(图C和D)在两种电压方案(图A和图C从0mV阶跃；图B和图D从-120mV阶跃)下从20mM CaCl2(菱形)和40mM CaCl2(实心方形)电流数据减去CsCl电流数据(图3所示)得到的曲线图。
图5显示了本发明的电动力学液体(RNS-60)在本领域公认的多发性硬化(MS)实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型中明显有效。
图6显示了用于图7所示实验的EAE诱导和治疗方案的图示。
图7A是接受用于图5和图6所示实验中的EAE治疗方案的动物的体重(克)的图示。图7B显示了接受EAE治疗方案的动物的体重变化计算值(百分比)。
图8A-D显示了本发明的电动力学液体(RNS-60)相比于载体对照在用于图5和图6所示实验中的EAE治疗方案期间对总白细胞(WBC)、中性粒细胞和淋巴细胞的水平影响很小。图A、B、C和D分别显示了研究第0、7、14和21天的结果。
图9A-H(A-D)显示了本发明的电动力学液体(RNS-60)在以下时间对细胞因子水平的影响：启动用于图5和图6所示实验中的EAE治疗方案后7天(A-D)和18天(E-H)。图A和图E显示了治疗后的IL-17水平。图B和图F显示了治疗后的IL-1α水平。图C和图G显示了治疗后的IL-1β水平。图D和图H显示了治疗后的IL-4水平。
图10显示了本发明的电动力学液体(RNS-60)但非对照生理盐水(NS)减弱了MPP+诱导的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及白介素1β(IL-1β)在激活的小鼠小胶质细胞(BV-2小胶质细胞)中的表达。
图11A和B显示了RNS60但非生理盐水对照(NS)抑制了纤维状Aβ(1-42)介导的人SHSY5Y神经元细胞(图11A)和人初级神经元(图11B)凋亡。分化后，将SHSY5Y细胞用不同浓度的RNS60或NS温育1小时，然后用1μM纤维状Aβ(1-42)肽损伤。18小时的处理后，通过TUNEL(Calbiochem)监测细胞凋亡。还作为对照温育了Aβ(42-1)肽。各图中的结果代表三个独立的实验。DAPI染色用于显现细胞的核。
图12显示了RNS60但非载体对照(载体)在本领域公认的多发性硬化(MS)实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)小鼠MOG模型中以剂量反应性方式抑制临床评分方面明显有效。RNS-60的高低剂量每日一次治疗施用以及每三天一次的RNS-60高剂量施用(RNS-60的施用在所有情况下均随第一临床体征而开始)均表现出临床评分的明显下降(空心菱形＝载体对照；空心方形＝地塞米松阳性对照；亮″x″＝从临床体征出现时每日一次施用低剂量(0.09ml RNS60)；暗″x″＝从临床体征出现时每三天一次施用高剂量(0.2ml RNS60)；以及空心三角形＝从临床体征出现时每日一次施用高剂量(0.2ml RNS60))。
图13A-C显示了两个凝胶迁移实验(图A和图B)和荧光素酶活性(报告基因)测定(图C)的结果，它们研究了RNS60对MBP预处理T细胞中NFKB激活的作用。
图14A-C是对PD小鼠模型中小鼠协调运动进行评分的图示，其中小鼠的协调运动在用RNS60预处理时有所改善。图A和图B分别显示总运动时间和距离。图C显示小鼠在转棒上保持平衡的能力。
图15A和B是对PD小鼠模型中小鼠纹状体依赖性行为进行评分的图示，其中RNS60处理防止了纹状体依赖性行为-刻板性动作(理毛，图A)和竖立(垂直运动，图B)的缺失。
图16A-C显示了黑质致密部中用抗酪氨酸羟化酶抗体进行的免疫染色，酪氨酸羟化酶是多巴胺合成中涉及到的限速酶。图A显示了黑质致密部中抗酪氨酸羟化酶抗体的正常染色。图B显示了MPTP对黑质致密部的作用，其中黑质致密部的染色降到大约三分之一。图C显示了在MPTP中毒的小鼠中RNS60处理解救了多巴胺能神经元。
图17A和B显示了人神经元中磷酸化Akt的免疫荧光分析。图17A的左、中、右图分别显示了得自研究对照、RNS60(RIS60；10％)和等渗盐水(10％)对初级神经元中Akt磷酸化的作用的实验的结果。Akt磷酸化使用针对β微管蛋白和磷酸化Akt的抗体通过双重标记免疫荧光进行监测。β微管蛋白用作神经元的标记物，DAPI染色用于显现细胞的核。图17B显示了RNS60抑制纤维状Aβ(1-42)介导的人初级神经元凋亡，并显示了这种RNS60介导的抑制可通过特异性Akt抑制剂AktI阻断。经不同浓度的AktI预温育30分钟的神经元用RNS60处理。温育1小时后，将细胞用纤维状Aβ1-42攻击。12h后，通过TUNEL监测了神经元凋亡。结果代表三个独立的实验。DAPI染色用于显现细胞的核。
图18是当用RNS60或生理盐水处理时磷酸化Akt的量与存在于星形胶质细胞中的Akt总量之间的比例的图示。
图19A-B显示了得自研究初级神经元中RNS60对纤维状Aβ(1-42)介导的tau磷酸化的作用的实验的结果。Tau磷酸化使用针对β微管蛋白和磷酸化tau的抗体通过双重标记免疫荧光进行监测。β微管蛋白用作神经元的标记物，DAPI染色用于显现细胞的核。
图20显示了RNS60抑制纤维状Aβ(1-42)介导的人初级神经元凋亡，并显示了这种RNS60介导的抑制可通过PI-3激酶抑制剂(LY)阻断。经不同浓度的PI-3激酶抑制剂(LY)预温育30分钟的神经元用RNS60处理。温育1小时后，将细胞用纤维状Aβ1-42攻击。12h后，通过TUNEL监测了神经元凋亡。
图21是根据特定方面的示意图，显示了在神经元中纤维状Aβ1-42介导的细胞凋亡受RNS60介导的抑制作用的信号通路。不希望受机理的约束，该示意性通路显示了对PI-3激酶的RNS60介导的激活，其继而通过磷酸化激活Akt。根据进一步的方面，磷酸化Akt介导细胞凋亡抑制。
发明详述
本文公开的某些实施方案涉及提供治疗炎性神经变性疾病和/或多发性硬化的至少一种症状的组合物和方法，方式是将包含新型电动力学产生的液体的治疗性组合物接触治疗部位或施用给受试者。在某些具体实施方案中，该电动力学产生的液体包括富气体的含富氧水的电力学产生的液体。
神经保护组合物和方法
本文的某些实施方案涉及治疗受试者的治疗性组合物和方法，方式是防止或缓解与暴露于神经毒素或神经毒性剂相关的至少一种症状。
帕金森疾病和病症
本文的某些实施方案涉及治疗受试者的治疗性组合物和方法，方式是防止或缓解帕金森病和/或相关病症或疾病的至少一种症状。
在进一步的实施方案中，本文涉及防止或缓解与帕金森病和/或相关病症相关的并发症的治疗性组合物和方法，包括缓解运动症状(如震颤、僵直、动作迟缓(运动徐缓)和步态障碍)和非运动症状(如，认知缺陷、抑郁和睡眠障碍)。
电动力学产生的液体：
如本文所用，“电动力学产生的液体”是指申请人的发明性电动力学产生的液体，其出于本文工作实施例的目的通过本文详细描述的示例性混合装置而产生(另见US200802190088和WO2008/052143，均以引用方式全文并入本文)。如本文所公开和展示的数据所表明，该电动力学液体代表了新型且与现有技术非电动力学液体根本性不同的液体，包括相对于现有技术的充氧非电动力学液体(例如，压力罐充氧液体等等)。如本文的各方面所公开，该电动力学产生的液体具有独特新颖的物理和生物学性质，包括但不限于以下方面：
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并在离子水性液体中以液体接触活细胞时足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种进行调节的量稳定配置。
在特定的方面，电动力学产生的液体是指在存在水动力学引起的局部(相对于整个液体体积不均匀的)电动力学效应(如，电压/电流脉冲)下产生的液体，诸如本文所述的装置特征局部效应。在特定的方面，所述水动力学引起的局部电动力学效应与如本文所公开和论述的表面相关双层和/或流动电流效应相结合。
在特定的方面，施用的本发明的电动力学改变的液体包含电荷稳定的含氧纳米结构，其量足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节。在某些实施方案中，该电动力学改变的液体是超充氧的(如RNS-20、RNS-40和RNS-60，在标准盐水中分别含20ppm、40ppm和60ppm的溶解氧)。在特定的实施方案中，该电动力学改变的液体不是超充氧的(如RNS-10或Solas，在标准盐水中含10ppm(如，约为环境水平)的溶解氧)。在某些方面，本发明的电动力学改变的液体的盐度、无菌性、pH等在电动力学产生所述液体时确立，并通过合适的途径施用所述无菌液体。作为另外一种选择，在施用液体前适当地调节(例如，使用无菌盐水或合适的稀释剂)液体盐度、无菌性、pH等的至少一种以与施用途径在生理学上相容。优选地，用于调节液体盐度、无菌性、pH等的至少一种的稀释剂和/或盐水溶液和/或缓冲组合物也是电动力学液体，或者以其他方式相容。
在特定的方面，本发明的电动力学改变的液体包括盐水(例如，一种或多种溶解盐；例如，碱金属类盐(Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+等)、碱土金属类盐(如Mg++、Ca++)等或过渡金属类阳离子(如Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn等)，在每种情况下均与任何合适的阴离子组分一起，包括但不限于F-、Cl-、Br-、I-、PO4-、SO4-和氮类阴离子。特定的方面包括基于混合盐的电动力学液体(如，Na+、K+、Ca++、Mg++、过渡金属离子等)，它们以各种组合和浓度存在，并且任选地与反离子的混合物一起。在特定的方面，本发明的电动力学改变的液体包括标准盐水(例如，约0.9％NaCl或约0.15M NaCl)。在特定的方面，本发明的电动力学改变的液体包括浓度为至少0.0002M、至少0.0003M、至少0.001M、至少0.005M、至少0.01M、至少0.015M、至少0.1M、至少0.15M或至少0.2M的盐水。在特定的方面，本发明的电动力学改变的液体的电导率为至少10μS/cm、至少40μS/cm、至少80μS/cm、至少100μS/cm、至少150μS/cm、至少200μS/cm、至少300μS/cm或至少500μS/cm、至少1mS/cm、至少5mS/cm、10mS/cm、至少40mS/cm、至少80mS/cm、至少100mS/cm、至少150mS/cm、至少200mS/cm、至少300mS/cm或至少500mS/cm。在特定的方面，任何盐均可用于制备本发明的电动力学改变的液体，前提条件是它们允许形成如本文所公开的具有生物活性的盐稳定化纳米结构(如，盐稳定化含氧纳米结构)。
根据特定的方面，本发明的包含电荷稳定的含气体纳米结构的液体组合物的生物学效应可通过改变液体的离子组分和/或改变液体的气体组分而调节(例如，增强、减弱、微调等)。
根据特定的方面，本发明的包含电荷稳定的含气体纳米结构的液体组合物的生物学效应可通过改变液体的气体组分而调节(例如，增强、减弱、微调等)。在优选的方面，氧用于制备本发明的电动力学液体。在另外的方面，氧与选自氮、氧、氩、二氧化碳、氖、氦、氪、氢和氙的至少一种其他气体一起形成混合物。如上所述，也可以改变离子，包括与改变气体成分一起。
鉴于本文所公开的教导和测定系统(如，基于细胞的细胞因子测定、膜片钳测定等)，本领域的技术人员将能够容易地选择合适的盐及其浓度以实现本文所公开的生物学活性。
表1.示例性阳离子和阴离子。
普通阳离子：
Figure BDA00002659551900191
Figure BDA00002659551900201
普通阴离子：
简单离子：
Figure BDA00002659551900202
含氧阴离子：
Figure BDA00002659551900211
得自有机酸的阴离子：
乙酸根离子    CH3COO-    甲酸根离子    HCOO-
其他：
Figure BDA00002659551900212
表2.示例性阳离子和阴离子。
单原子阳离子
化学式 电荷 名称
H+ 1+ 氢离子
Li+ 1+ 锂离子
Na+ 1+ 钠离子
K+ 1+ 钾离子
Cs+ 1+ 铯离子
Ag+ 1+ 银离子
Mg2+ 2+ 镁离子
Ca2+ 2+ 钙离子
Sr2+ 2+ 锶离子
Ba2+ 2+ 钡离子
Zn2+ 2+ 锌离子
Cd2+ 2+ 镉离子
Al3+ 3+ 铝离子
多原子阳离子
化学式 电荷 名称
NH4 + 1+ 铵离子
H3O+ 1+ 水合氢离子
多价阳离子
Figure BDA00002659551900221
单原子阴离子
化学式 电荷 名称
H- 1- 氢负离子
F- 1- 氟离子
Cl- 1- 氯离子
Br- 1- 溴离子
I- 1- 碘离子
O2- 2- 氧离子
S2- 2- 硫离子
N3- 3- 氮离子
多原子阴离子
Figure BDA00002659551900232
Figure BDA00002659551900241
本发明阐述可用于治疗糖尿病或糖尿病相关疾病的新型富含气体的液体，包括但不限于富含气体的离子水溶液、盐水溶液(如，标准盐水溶液，以及如本文所论述和本领域将认识到的其他盐水溶液，包括任何生理相容性盐水溶液)、细胞培养基(例如，基本培养基和其他培养基)。培养基在只含生长必需的营养物质时称为“基本”培养基。对于原核宿主细胞，基本培养基通常包含碳、氮、磷、镁以及痕量铁和钙源。(Gunsalus and Stanter，The Bacteria，V.1，Ch.1Acad.PressInc.，N.Y.(1960))。大多数基本培养基使用葡萄糖作为碳源、氨作为氮源以及正磷酸盐(如PO4)作为磷源。培养基组分可根据生长的具体原核或真核生物而变化或补充，以便支持最佳生长而不抑制目标蛋白的产生。(Thompson等，Biotech，and Bioeng.27：818-824(1985))。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体适于调节溶于其中的报告溶质(如海藻糖)的13C-NMR线宽。NMR线宽效应存在于如本文所述尤其是工作实施例中测量(例如)测试液体中的溶质“翻滚”(tumbling)的间接方法中。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体特征在于以下至少一种：在-0.14V、-0.47V、-1.02V和-1.36V任一者下存在区别性的方波伏安法峰差异；在-0.9伏特下存在极谱峰；以及在-0.19和-0.3伏特下不存在极谱峰，这是本文所公开的尤其是工作实施例中的电动力学产生的液体所特有。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体适于改变细胞膜电导率(如，在本文所公开的膜片钳研究中测量的全细胞电导的电压依赖性贡献因素)。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体为充氧的，其中在大气压下氧在液体中的含量为至少15ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm的溶解氧。在特定的方面，该电动力学改变的水性液体在大气压下具有低于15ppm、低于10ppm的溶解氧或大约为环境氧水平。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体为充氧的，其中氧在液体中的含量介于约8ppm和约15ppm之间，在这种情况下本文有时称为″Solas″。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体包含溶剂化电子(如，通过分子氧稳定的)和电动力学改性和/或带电的氧物质中的至少一种，并且其中在某些实施方案中，该溶剂化电子和/或电动力学改性或带电的氧物质的含量为至少0.01ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少3ppm、至少5ppm、至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm或至少20ppm。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体适于改变细胞膜结构或功能(如，改变膜相关蛋白的构象、配体结合活性或催化活性)，足以提供细胞内信号转导的调节，其中在特定的方面，膜相关蛋白包括选自受体、跨膜受体(如G蛋白偶联受体(GPCR)、TSLP受体、β2肾上腺素能受体、缓激肽受体等)、离子通道蛋白、细胞内附着蛋白、细胞粘附蛋白和整合素中的至少一种。在某些方面，受影响的G蛋白偶联受体(GPCR)与G蛋白α亚基(如Gαs、Gαi、、Gαq和Gα12)相互作用。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体适于调节细胞内信号转导，包括调节钙依赖性细胞信息传递途径或系统(如，调节磷脂酶C活性或调节腺苷酸环化酶(AC)活性)。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体特征在于工作实施例和本文其他地方所述的各种生物活性(如，调节细胞因子、受体、酶及其他蛋白和细胞内信号通路)。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体显示出与促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(promitochondrials)(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和生长因子(GDNF)的任一种的协同作用。在特定的方面，该电动力学改变的水性液体降低如本文工作实施例中所示的支气管上皮细胞(BEC)中DEP诱导的TSLP受体表达。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体抑制如本文工作实施例中所示的支气管上皮细胞(BEC)中DEP诱导的细胞表面结合MMP9水平。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体的生物效应由白喉毒素抑制，表明β阻滞、GPCR阻滞和钙通道阻滞影响电动力学改变的水性液体的活性(如，对调节性T细胞功能的活性)，如本文工作实施例中所示。
在特定的方面，该电动力学改变的水性液体的物理和生物效应(如，改变细胞膜结构或功能足以提供细胞内信号转导调节的能力)在密闭容器(如，密闭气密性容器)中持续至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少6个月或更长的时间。
因此，进一步的方面提供所述电动力学产生的溶液以及产生电动力改变的含氧水性液体或溶液的方法，包括：在相对运动的并在其间限定混合容积的两个间隔表面之间使液体材料流动，其中流动的液体材料从混合容积内单次通过的停留时间大于0.06秒或大于0.1秒；以及将氧(O2)引入混合容积内的流动液体材料中，引入所处的条件适于将至少20ppm、至少25ppm、至少30、至少40、至少50或至少60ppm的氧溶于所述材料以及电动力学改变的液体或溶液中。在某些方面，在短于100毫秒、短于200毫秒、短于300毫秒或短于400毫秒的时间内将氧注入材料中。在特定的实施方案中，表面积与容积的比例为至少12、至少20、至少30、至少40或至少50。
另外的方面提供产生电动力学改变的充氧的水性液体或溶液的方法，包括：在其间限定混合容积的两个间隔表面之间使液体材料流动；以及将氧引入混合容积内的流动材料中，引入所处的条件适于将至少20ppm、至少25ppm、至少30、至少40、至少50或至少60ppm的氧注入所述材料中，引入的时间短于100毫秒、短于200毫秒、短于300毫秒或短于400毫秒。在某些方面，流动材料在混合容积内的停留时间大于0.06秒或大于0.1秒。在特定的实施方案中，表面积与容积的比例为至少12、至少20、至少30、至少40或至少50。
另外的实施方案提供产生电动力学改变的充氧水性液体或溶液的方法，包括使用混合装置通过混合第一材料和第二材料形成输出混合物，该装置包括：被构造成从第一材料源接纳第一材料的第一室；定子；具有旋转轴的转子，该转子设置在定子内部并被构造成在其中绕旋转轴旋转，转子和定子的至少一者具有多个通孔；在转子与定子之间限定的混合室，该混合室与第一室液体连通并被构造成从第一室接纳第一材料，而第二材料则通过转子和定子之一中形成的多个通孔提供给混合室；与混合室液体连通并被构造成接纳混合室输出材料的第二室；以及容纳在第一室内部的第一内部泵，该第一内部泵被构造成从第一室将第一材料泵送进混合室。在某些方面，第一内部泵被构造成在第一材料进入混合室前使第一材料中产生圆周速度。
进一步的实施方案提供产生电动力学改变的充氧水性液体或溶液的方法，包括使用混合装置通过混合第一材料和第二材料形成输出混合物，该装置包括：定子；具有旋转轴的转子，该转子设置在定子内部并被构造成在其中绕旋转轴旋转；在转子与定子之间限定的混合室，该混合室具有开口第一末端，第一材料通过该末端进入混合室，以及开口第二末端，输出材料通过该末端离开混合室，而第二材料则通过转子和定子中至少一者进入混合室；与混合室的开口第一末端的至少大部分连通的第一室；以及与混合室的开口第二末端连通的第二室。
另外的方面提供根据任何上述方法制备的电动力学改变的充氧水性液体或溶液。在特定的方面，施用的本发明的电动力学改变的液体包含电荷稳定的含氧纳米结构，其量足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节。在某些实施方案中，该电动力学改变的液体是超充氧的(如RNS-20、RNS-40和RNS-60，在标准盐水中分别含20ppm、40ppm和60ppm的溶解氧)。在特定的实施方案中，该电动力学改变的液体不是超充氧的(如RNS-10或Solas，在标准盐水中含10ppm(如，约为环境水平)的溶解氧)。在某些方面，本发明的电动力学改变的液体的盐度、无菌性、pH等在电动力学产生所述液体时确立，并通过合适的途径施用所述无菌液体。作为另外一种选择，在施用液体前适当地调节(例如，使用无菌盐水或合适的稀释剂)液体盐度、无菌性、pH等的至少一种以与施用途径在生理学上相容。优选地，用于调节液体盐度、无菌性、pH等的至少一种的稀释剂和/或盐水溶液和/或缓冲组合物也是电动力学液体，或者以其他方式与之相容。
本发明阐述新型富含气体的液体，包括但不限于富含气体的离子水溶液、盐水溶液(如，标准盐水溶液，以及如本文所论述和本领域将认识到的其他盐水溶液，包括任何生理相容性盐水溶液)、细胞培养基(例如，基本培养基和其他培养基)。
神经毒素：
所谓“毒性剂”或“神经毒性剂”(神经毒素)是指通过其化学作用损伤、危害或抑制神经系统组成部分的活性的物质。导致神经病变的神经毒性剂非常多(参见下表3中提供的示例性神经毒性剂列表)。此类神经毒性剂包括但不限于肿瘤药剂，诸如长春新碱、长春碱、顺铂、紫杉醇或双脱氧化合物，如双脱氧肌苷；醇；金属；职业或环境暴露中涉及到的工业毒素；食品或药品中的污染物；或超过剂量的维生素或治疗药物，如抗生素诸如青霉素或氯霉素，或特大剂量的维生素A、D或B6。
神经毒性可在暴露于天然或人工毒性物质(神经毒素)时发生，这些毒性物质以导致神经组织受损的方式改变神经系统的正常活性，并可最终破坏或杀死神经元。神经毒性可因暴露于化疗、放疗、药物治疗、某些药物滥用和器官移植中所用的物质，以及暴露于重金属、某些食品和食品添加剂、农药、工业和/或清洁溶剂、化妆品以及某些天然存在的物质而引起。症状可在暴露后立即出现或延迟出现。它们可包括四肢无力或麻木，记忆、视力和/或智力丧失，不可控制的迷恋和/或强迫行为，妄想，头痛，认知和行为问题以及性功能障碍。患有某些疾病的个体可能尤其易受神经毒素的危害。
根据特定的实施方案，本文所公开的组合物用于防止或减轻暴露于本文所述的多种毒性剂而导致的神经毒性。
某些毒素可导致周围神经病变。铅毒性会引起运动神经病变。砷和汞将导致感觉神经病变。铊会致使感觉和自主神经病变。若干有机溶剂和杀虫剂也会导致多发性神经病。酒精对神经具有直接毒性，酗酒是神经病变的主要原因。在某些实施方案中，主题方法可用作更宽的解毒方案的一部分。
在又一实施方案中，本发明的方法和组合物可用于治疗药物所致的神经病变。若干药物已知会导致神经病变。它们包括用于癌症的长春新碱和顺铂、用于肾盂肾炎的呋喃妥英、用于心律失常的胺碘酮、用于酒精中毒的双硫仑、用于AIDS的ddC和ddI以及用于治疗麻风的氨苯砜等等。如上，在某些实施方案中，主题方法可用作更宽的解毒方案的一部分。
本发明的另一方面提供联合治疗，其中与主题化合物一起施用一种或多种其他治疗剂。这种联合治疗可通过同时、相继或单独地给药各种治疗用组分而实现。联合施用因此包括以同一药物制剂的一部分施用，同时施用单独的药物制剂以及在同一天的不同时间、相邻天施用单独的药物制剂，或以其他方式作为单个治疗方案的一部分而施用。例如，主题方法可联合其他神经保护剂而实施。本文所列举的剂量将经过调整以补偿治疗组合物中的此类附加组分。受治疗的患者的进展可通过常规方法进行监测。
在其他实施方案中，主题方法可联合生长和/或营养因子的施用而实施。例如，联合治疗可包括营养因子，诸如胶质细胞源性神经营养因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、神经鞘瘤源性生长因子、胶质生长因子、纹状体源性神经营养因子、血小板衍生生长因子、脑源性神经营养因子(BDNF)和离散因子(HGF-SF)。也可使用抗有丝分裂剂，例如胞嘧啶、阿拉伯糖苷、5-氟尿嘧啶、羟基脲和甲氨蝶呤。
本领域的技术人员通过使用已知的技术可容易地确定本发明所施用的组合物的治疗有效量和/或预防有效量，例如，将具有足够的神经保护作用的量。剂量可根据以下方面而变化：主治临床医生所判断的患者需要，所治疗的病症的严重性、CNS进一步变性的风险以及特定的神经毒素。在确定治疗有效的营养量或剂量和/或预防有效量或剂量时，主治临床医生将考虑多种因素，包括但不限于：变性状态的具体原因及其复发或恶化的可能性；特定神经毒性剂的药效动力学特性；所需的疗程；哺乳动物物种；其大小、年龄和总体健康状况；各个患者的响应；施用的特定化合物；施用的制剂的生物利用率特性；选择的剂量方案；并治的种类；以及其他相关情况。
治疗可以通过低于最佳剂量的较低剂量启动。之后，可以通过小的增量提高剂量，直到达到这种情况下的最佳效果。为了方便，需要时，可将总的每日剂量进行划分，并在这一天中分部分施用。例如，预计治疗性组合物的治疗有效营养量和预防有效神经保护量可根据施用途径以及上述其他因素而变化。
在动物(如狗、啮齿动物)中对防止或治疗神经元(如多巴胺能神经元和运动神经元等)变性有效的组合物也可用于治疗人类疾病。本领域的技术人员在治疗这些人类疾病时将受动物研究中得到的数据的指导，以通过正确的剂量和施用途径将化合物施用给人类。一般来讲，预计确定人类剂量和施用途径与用于确定动物施用情况时类似。
确定需要预防性治疗以神经元(如多巴胺能神经元和/或运动神经元等)变性为标志的疾病的那些患者将在本领域技术人员的能力和知识范围内。用于确定存在风险并可通过主题方法治疗的患者的某些方法在医学领域是熟知的，诸如在主题患者中发生特定病情的家族史以及与发生该病情相关的风险因素的存在性。环境(如，化学)暴露风险。本领域的临床医生可通过使用(例如)临床检验、体检、医疗/家族史、行业/职业等容易地确定此类候选患者。
让士兵免受任何种类的威胁并保持他们的战斗力已成为军队的主要关注问题。神经毒气(如，沙林、索曼或Vx)便是一种这样的威胁。一类神经毒剂(也称为神经毒气)为含磷有机化学物质(有机磷酸酯)，其可阻断乙酰胆碱酯酶，这是一种通常释放乙酰胆碱(一种神经递质)的活性的酶。存在两类主要的神经毒剂：G毒剂(如，GA，塔崩或N，N-二甲氨基氰磷酸乙酯；GB，沙林或甲氟膦酸O-异丙酯；GD，索曼或甲氟膦酸0-频哪酯；GF，环沙林或甲氟膦酸环己酯；GV，P-[2-(二甲氨基)乙基]-N，N-二甲基膦酰胺氟)以及V毒剂(VE，S-乙基硫代膦酸(二乙氨基)乙基O-乙酯；VG，Amiton或Tetram或S-[2-(二乙氨基)乙基]硫代磷酸O，O-二乙酯；VM，硫代磷酸，甲基-，S-(2-(二乙氨基)乙基)0-乙酯)；VX，0-乙基-S-[2(二异丙氨基)乙基]甲基硫代磷酸酯)。第三组毒剂-诺维乔克毒剂是有机磷酸酯化合物，其可抑制胆碱酯酶，从而防止乙酰胆碱的正常分解。
杀虫剂有机酸酸酯(诸如敌敌畏、马拉硫磷和对硫磷)是神经毒剂。
表3-神经毒性剂
毒剂 活性 毒剂 活性
乙酰唑胺 利尿剂 米帕明 抗抑郁剂
丙烯酰胺 絮凝剂、灌浆剂 吲哚美辛 抗炎剂
阿霉素 抗肿瘤剂 无机铅 颜料等中的有毒金属
酒精(即，乙醇) 溶剂、娱乐性药物 异烟肼 抗结核剂
阿米脱林 呼吸兴奋剂 锂 抗抑郁剂
胺碘酮 抗心律失常剂 甲基汞 工业废物
两性霉素 抗微生物剂 二甲双胍 抗糖尿病剂
砷 除草剂、杀虫剂 甲基肼 合成中间体
金硫葡糖 抗风湿剂 甲硝唑 抗原虫药
巴比妥类 抗惊厥剂、镇静剂 米索硝唑 放射增敏剂
鼠李 有毒浆果 呋喃妥英 泌尿道抗菌剂
氨基甲酸酯 杀虫剂 氮芥 抗肿瘤剂、神经毒气
二硫化碳 工业应用 一氧化二氮 麻醉剂
氯霉素 抗菌剂 有机磷酸酯 杀虫剂
氯喹 抗疟疾剂 欧司旁特 抗惊厥剂
考来烯胺 抗高脂蛋白药 青霉素 抗菌剂
顺铂 抗肿瘤剂 哌克昔林 抗心律失常药
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在特定的实施方案中，本发明的方法和组合物可用于防止或缓解化疗引起的神经毒性(参见例如美国专利号7,129,250(以2004/0220202公布)，其以引用方式全文并入本文，尤其是其在示例性神经毒素方面的教导)。
例如，在特定的实施方案中，本发明的方法和组合物可与抗癌剂(诸如抗癌药物)、细胞因子和/或补充性增效剂一起使用。使用混合物治疗癌症是常见的。
在此实施方案中，常见的施用载体(如，可经口使用的或可注射的溶液等)可包含本发明的组合物以及抗癌药物和/或补充性增效剂。因此，包含本发明的组合物以及其他化合物的混合物在本发明的范围内。
具有抗肿瘤性质的化合物包括但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿可达佐；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸比生群；二甲磺酸双奈法德；比折来新；硫酸博来霉素；布喹那；溴匹立明；白消安；放线菌素；卡鲁睾酮；卡拉酰胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡米诺霉素；卡折来新；西地芬戈；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克立那托；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；更生霉素；盐酸柔红霉素；地西他滨；右奥马铂；Dezaguanin；Dezaguanine Mesylate；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；乙碘油I 131；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜宁；盐酸法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟西他滨；磷喹酮；福司曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；金Au 198；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-Ia；干扰素γ-Ib；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；罗莫司丁；盐酸洛索蒽醌；马丙考；美坦生；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托洁林；米托马星；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；麦考酚酸；诺考达唑；诺拉霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；泊非霉素；泼尼莫司汀；盐酸甲基苄肼；嘌罗霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；磷乙酰天冬氨酸钠；司帕霉素；盐酸螺旋锗；螺莫司汀；螺铂；链黑霉素；链佐星；氯化锶Sr 89；磺氯苯脲；他利霉素；紫杉烷；紫杉类；替可加兰钠；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替罗昔隆；睾内酪；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；塞替派；噻唑呋林；替拉扎明；盐酸拓扑替康；柠檬酸托瑞米芬；乙酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡萄糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；乌拉莫司汀；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸环氧长春碱；酒石酸长春瑞滨；硫酸异长春碱；硫酸长春利定；伏氯唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。
其他抗肿瘤化合物包括：20-表-1，25-二羟维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯(acylfulvene)；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；2，4-二氯苯氧乙酸；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管新生抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯；抗背部化形态发生蛋白-1；前列腺癌抗雄激素药(antiandrogen，prostatic carcinoma)；抗雌激素药；抗癌肽类；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；凋亡基因调节剂；凋亡调节剂；脱嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱亚氨基酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯佐利定；苯甲酰十字孢碱；β内酰胺衍生物；β-alethine；βclamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；双氮丙啶基精胺；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫氨酸硫酸亚胺；卡泊三醇；卡弗他丁C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；氨甲酰基氨基三唑；羧酰氨三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨源性抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；澳粟精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；绿素类(chlorlns)；氯喹喔啉磺酰胺；西卡前列素；顺式卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；考布他汀A4；考布他汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克立那托；cryptophycin 8；cryptophycin A衍生物；curacin A；环戊烯蒽醌(cyclopentanthraquinone)；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸盐；溶细胞因子；磷酸己烷雌酚；达昔单抗；地西他滨；脱氢代代宁B(dehydrodidemninB)；地洛瑞林；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；代代宁B；3，4-二羟基苯并氧肟酸；二乙基去甲精胺；二氢-5-氮胞苷；9-二氢紫杉醇；dioxamycin；二苯基螺莫司汀；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；倍癌霉素SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；维甲酰酚胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；盐酸fluorodaunorunicin；福酚美克；福美坦；福司曲星；福莫司汀；莫特沙芬钆；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；六亚甲基双乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；肽免疫激动剂；胰岛素样生长因子-1受体抑制；干扰素激动剂；干扰素；白介素；碘苄胍；碘阿霉素；4-甘薯苦醇；伊立替康；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；三醋酸片螺素-N；兰瑞肽；leinamycin；来格司亭；硫酸蘑菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林(leuprolide)+雌激素+孕酮；亮丙瑞林(leuprorelin)；左旋咪唑；利阿唑；直链多胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯蚓磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；莫特沙芬镥；利索茶碱；裂解肽；美坦新；制甘糖酶素A；马立马司他；马索罗酚；maspin；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；merbarone；美替瑞林；蛋氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体；人绒毛膜促性腺激素；单磷酸类脂A+结核分枝杆菌细胞壁sk；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；基于多肿瘤抑制基因1的治疗；芥末抗癌剂；印度洋海绵B；分支杆菌属细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；那瑞替喷；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性肽链内切酶；尼鲁米特；nisamycin；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；06-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口腔细胞因子诱导因子；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；紫杉醇类似物；紫杉醇衍生物；palauamine；棕榈酰根霉素；帕米磷酸；人参三醇；帕诺米芬；副球菌素；帕折普汀；培门冬酶；培得星；木聚硫钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏醇；苯连氮霉素；乙酸苯酯；磷酸酶抑制剂；溶链菌；盐酸匹罗卡品；吡柔比星；吡曲克辛；帕斯婷A；帕斯婷B；纤溶酶原激活因子抑制剂；铂络合物；铂化合物；铂-三胺络合物；卟吩姆钠；泊非霉素；丙基双吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；微藻蛋白激酶C抑制剂；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡醇羟乙酯血红蛋白聚氧化烯共轭物；raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras-GAP抑制剂；脱甲基化瑞替普汀；依替膦酸铼Re 186；根霉素；核酶；RII视黄酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老源抑制剂1(senescence derived inhibitor1)；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节剂；单链抗原结合蛋白；西佐喃；索布佐生；硼卡钠；苯乙酸钠；solverol；生长介素结合蛋白；索纳明；膦门冬酸；穗霉素D(spicamycin D)；螺莫司汀；脾脏五肽；海绵抑制素1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；stipiamide；间充质溶解素抑制剂；sulfinosine；超强血管肠道活性肽拮抗剂；suradista；苏拉灭；苦马豆碱；合成的葡萄糖胺聚糖；他莫司汀；他莫昔芬甲碘化物(tamoxifen methiodide)；牛磺莫司汀；他佐罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；tetrachlorodecaoxide；tetrazomine；厚果唐松草碱；沙利度胺；噻可拉林；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新；胸腺喷丁受体激动剂；胸腺曲南；甲状腺刺激激素；本紫红素乙酯锡(tin ethyl etiopurpurin)；替拉扎明；二氯化环戊二烯钛；拓扑替康；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；转化抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；酪氨酸磷酸化抑制剂；UBC抑制剂；乌苯美司；尿生殖窦源性生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统红细胞基因治疗剂；维拉雷琐；藜芦胺；verdins；维替泊芬；长春瑞滨；vinxaltine；整合素拮抗剂(vitaxin)；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；净司他丁斯酯。
抗癌补充性增效剂包括但不限于：三环类抗抑郁药(如，米帕明、地昔帕明、阿米替林、氯米帕明、曲米帕明、多塞平、去甲替林、普罗替林、阿莫沙平和马普替林)；非三环类抗抑郁药(如，舍曲林、曲唑酮和西酞普兰)；Ca++拮抗剂(如，维拉帕米、硝苯地平、尼群地平和卡罗维林)；钙调蛋白抑制剂(如，普尼拉明、三氟拉嗪和氯米帕明)；两性霉素B；三苯乙醇类似物(如，他莫昔芬)；抗心律失常药(如，奎尼丁)；抗高血压药(如，利血平)；硫醇消除剂(如，丁硫氨酸亚砜胺)和多药耐性还原剂，诸如Cremaphor EL。
炎症
炎症可作为对外源物质(尤其是微生物源的)入侵受试者的防御反应而发生。另外，机械性创伤、毒素和瘤变也可引起炎性反应。白细胞的积聚及随后的激活是大多数形式的炎症发病中的核心事件。炎症障碍会损害宿主，使其感染或创伤易于恶化。过度发炎(诸如长期炎性反应)可导致炎性疾病，包括但不限于糖尿病、动脉硬化、白内障、慢性皮肤疾病、再灌注损伤和癌症；导致感染后综合征，诸如在感染性脑膜炎、风湿热中；以及导致风湿性疾病，诸如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎。这些疾病在全世界每年困扰着数百万人，并导致死亡率和患病率升高。在这些不同的疾病过程中炎性反应的共性使其成为防止或治疗人类疾病的主要调节要素。
促炎性细胞因子的过量产生已在许多炎性和自身免疫性疾病中存在牵连。TNFα的分泌是引发炎症级联反应的主要事件(Brennan F.M.，等Lancet，1989，2：244-7；Haworth C，等Eur.J.Immunol.1991，21：2575-2579)并直接促使了这些疾病的发生和维持。其他细胞因子也在发挥着作用，包括白介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-12、一氧化氮(NO)、IFN-γ、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和IL-10。其中某些细胞因子(如IL-8)可增强或加剧炎性反应，而其他的(如IL-10)则可降低或缓解炎性反应。
免疫系统的细胞(尤其是巨噬细胞)响应激活刺激而分泌其中许多细胞因子。细胞因子的靶细胞可位于任何体室中并可通过长距离机制发挥作用或可作用于相邻细胞。因此，细胞因子可以局部或全身性方式调节炎症。
金属蛋白酶
金属蛋白酶是分类成家族和亚家族的蛋白酶(酶)的超家族，如例如在N.M.Hooper FEBS Letters 354：1-6，1994中所述。金属蛋白酶的实例包括基质金属蛋白酶(MMP)，诸如胶原酶(MMP1、MMP8、MMP13)、明胶酶(MMP2、MMP9)、间质溶解素(MMP3、MMP10，MMP II)、基质溶解因子(MMP7)、金属弹性蛋白酶(MMP12)、釉质溶解素(MMP19)、MT-MMP(MMP 14、MMP15、MMP 16、MMP17)；reprolysin或蛇毒蛋白酶或MDC家族，包括分泌酶和脱落酶，诸如TNF转化酶(ADAM 10和TACE)；虾红素家族，包括诸如前胶原加工蛋白酶(PCP)的酶；以及其他金属蛋白酶，诸如聚蛋白多糖酶、内皮素转化酶家族和血管紧张素转化酶家族。总之，金属蛋白酶已知可裂解多种多样的基质底物，诸如胶原、蛋白聚糖和纤粘蛋白。金属蛋白酶牵涉在生物学上具有重要意义的细胞调节因子(诸如肿瘤坏死因子(TNF))的加工或分泌中；以及生物学上具有重要意义的膜蛋白(诸如低亲和IgE受体CD23)的翻译后蛋白质水解加工或脱落中(参见例如N.M.Hooper等，Bioche m.J.321：265-279，1997)。
因此，不出意料地，据信金属蛋白酶在涉及组织重塑(如，胚胎发育、骨形成、月经期子宫重塑等)的许多生理疾病过程中具有重要意义。此外，抑制一种或多种金属蛋白酶的活性将在以下疾病或病症中带来充分的益处，例如：各种炎性和过敏性疾病，诸如关节炎症(尤其是类风湿性关节炎、骨关节炎和痛风)、胃肠道疾病(尤其是炎性肠病、溃疡性结肠炎和胃炎)、皮肤炎症(尤其是牛皮癣、湿疹、皮炎)；肿瘤转移或侵袭；与不受控的细胞外基质降解相关的疾病，诸如骨关节炎；骨吸收疾病(诸如骨质疏松和佩吉特氏病)；与异常血管新生相关的疾病；与糖尿病、牙周病(诸如齿龈炎)、角膜溃疡、皮肤溃疡、术后病症(诸如结肠吻合术)及表皮伤口愈合相关的增强的胶原重塑；中枢神经系统和周围神经系统的脱髓鞘疾病(诸如多发性硬化)；阿尔茨海默病；在心血管疾病诸如再狭窄和动脉硬化中观察到的细胞外基质重塑；哮喘；鼻炎；和慢性阻塞性肺病(COPED)。
MMP12也称为巨噬细胞弹性蛋白酶或金属弹性蛋白酶，最初在小鼠中进行了克隆(Shapiro等，Journal of Biological Chemistry 267：4664，1992)并已在1995年由同一小组在人体中进行了克隆。MMP12优先地在激活的巨噬细胞中表达，并已表明其从吸烟者的肺泡巨噬细胞中分泌(Shapiro等，1993，Journal of Biological Chemistry，268：23824)以及在粥样硬化病变的泡沫细胞中分泌(Matsumoto等，Am.J.Pathol.153：109，1998)。COPD小鼠模型基于用香烟烟雾攻击小鼠六个月，每天两只烟，每周六天。野生型小鼠在该处理后发生了肺气肿。当对MMP12敲除小鼠在此模型中进行测试时，它们未发生显著的气肿，从而强烈表明MMP12是COPD发病中的关键酶。MMP(诸如MMP12)在COPD(气肿和支气管炎)的作用在Anderson andShinagawa，1999，Current Opinion in Anti-inflammatory andImmunomodulatory Investigational Drugs 1(1)：29-38中进行了论述。最近已发现，吸烟会增加巨噬细胞浸润和人颈动脉粥样斑块中巨噬细胞源性MMP-12的表达(Matetzky S，Fishbein M C等，Circulation102：(18)，36-39Suppl.S，Oct.31，2000)。
MMP9(明胶酶B；92kDa IV型胶原酶；92kDa明胶酶)是一种分泌蛋白，其最早在1989年得到了纯化，然后克隆和测序(S.M.Wilhelm等，J.Biol.Chem.264(29)：17213-17221，1989；勘误发表于J.Biol.Che m.265(36)：22570，1990)(对于详细信息的综述以及此蛋白酶的参考文献，参见T.H.Vu&Z.Werb(1998)(MatrixMetalloproteinases，1998，W.C.Parks&R.P.Mecham编辑，pp.115-148，Academic Press.ISBN 0-12-545090-7)。MMP9的表达一般限制在少数细胞类型中，包括滋养细胞、破骨细胞、中性粒细胞和巨噬细胞(Vu&Werb，上文)。然而，通过若干调节剂，包括将细胞暴露于生长因子或细胞因子，可在这些相同的细胞以及其他细胞类型中诱导表达。这些调节剂与通常牵涉在引发炎性反应中的相同。与其他分泌的MMP一样，MMP9作为无活性的酶原释放，其随后裂解形成具有酶活性的酶。在体内这种激活所需的蛋白酶尚不清楚。活性MMP9与无活性的酶的平衡在体内进一步受与TIMP-1(金属蛋白酶1的组织抑制剂，一种天然存在的蛋白)的相互作用的调节。TIMP-1结合到MMP9的C端区域，从而导致MMP9催化结构域受到抑制。ProMMP9的诱导型表达的平衡、Pro-裂解成活性MMP9以及TIMP-1的存在一起决定了局部位点存在的催化活性MMP9的量。具有蛋白分解活性的MMP9攻击包括明胶、弹性蛋白和天然IV型及V型胶原的底物；其对天然I型胶原、蛋白聚糖或层粘蛋白无活性。已有越来越多的数据暗示MMP9在各种生理和病理过程中的作用。生理作用包括在胚胎植入早期通过子宫上皮侵袭胚胎滋养细胞；骨生长及发育中的一些作用；以及炎性细胞从脉管系统向组织的迁移。
未治疗的哮喘患者与其他人群相比，MMP9的释放(使用酶免疫测定法测定)在体液和AM上清液中明显升高(Am.J.Resp.Cell&Mol.Biol.，5：583-591，1997)。另外，在某些其他病理状态中也观察到了增加的MMP9表达，从而暗示MMP9存在于疾病过程中，诸如COPD、关节炎、肿瘤转移、阿尔茨海默病、多发性硬化以及动脉硬化中的斑块破裂，从而导致急性冠心病，诸如心肌梗塞(另见WO07087637A3，以引用方式并入本文)。
最近，已证实与健康的对照受试者相比MMP-9的水平在患有稳定哮喘的患者中明显升高，在患有急性哮喘的患者中甚至更高。MMP-9在气道炎性细胞的浸润以及气道高反应性的诱导中发挥着至关重要的作用，从而表明MMP-9可能在引起和维持哮喘中具有重要的作用(Vignola等，Sputum metalloproteinase-9/tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1ratio correlates with airflow ob struction in asthmaand chronic bronchitis，Am J Respir Crit Care Med 158：1945-1950，1998；Hoshino等，Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagendeposition by modulation of the balance between matrixmetalloproteinase-9and tissue inhibitor of metalloproteinase-1expressionin asthma，J Allergy Clin Immunol 104：356-363，1999；Simpson等，Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilicasthma，Am J Respir Crit Care Med 172：559-565，2005；Lee等，A murinemodel of toluene diisocyanate-induced asthma can be treated with matrixmetalloproteinase inhibitor，J Allergy Clin Immunol 108：1021-1026，2001；以及Lee等，Matrix metalloproteinase inhibitor regulatesinflammatory cell migration by reducing ICAM-1and VCAM-1expression in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma，JAllergy Clin Immunol 2003；111：1278-1284)。
MMP抑制剂：
许多金属蛋白酶抑制剂是已知的(参见例如以下文献作出的MMP抑制剂综述Beckett R.P.and Whittaker M.，1998，Exp.Opin.Ther.Patents，8(3)：259-282；和Whittaker M.等，1999，Chemical Reviews99(9)：2735-2776)。WO 02/074767公开了可用作MMP抑制剂尤其是用作强效MMP12抑制剂的化学式的乙内酰脲衍生物。美国专利申请序列No.11/721,590(以20080032997公布)公开了另一组乙内酰脲衍生物，它们为金属蛋白酶抑制剂并在抑制MMP诸如MMP12和MMP9中尤其引人关注。抑制MMP诸如MMP12和MMP9的新型三唑酮衍生物在美国专利申请序列No.10/593543(以20070219217公布)中有所公开。另外的MMP12和MMP9抑制剂在11/509,490(以20060287338公布)中有所公开(另见10/831265(以20040259896公布))。
另外，已表明两种化合物4-(4-苯氧基苯基磺酰基)丁烷-1，2-二硫醇(1)和5-(4-苯氧基苯基磺酰基)戊烷-1，2-二硫醇(2)可选择性结合并强效抑制MMP-2和MMP-9(Bernardo，et.al(2002)J.Biol.Chem.277：11201-11207)。这两种化合物在临床中抑制MMP-2和-9并因此减轻炎症具有重要的用途。此外，已表明，以亚抗生素水平使用某些四环素抗生素(如，米诺环素和强力霉素)可有效抑制MMP活性。本发明的某些方面包括与可用于抑制MMP的亚抗生素水平结合使用本发明的液体。
治疗方法
术语“治疗”是指并包括逆转、缓解、防止疾病、障碍或病症或其一种或多种症状或抑制其进展；以及“治疗”和“治疗学”是指治疗行动，如本文所定义。
“治疗有效量”是用于实施本文提供的发明的过程的任何化合物的任何量，该量足以逆转、缓解、防止疾病、障碍或病症或其一种或多种症状或抑制其进展。
本文的某些实施方案涉及治疗受试者的治疗性组合物和方法，方式是防止或缓解与暴露于神经毒素相关的至少一种症状。例如，本文所公开的治疗性组合物和/或方法可用于治疗或防止选自以下的一种或多种病症或疾病：多发性硬化(MS)、帕金森病、淀粉样变性(如阿尔茨海默病)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、朊病毒病和HIV相关痴呆。
与炎症相关的许多病症或疾病已通过以下物质得到了治疗：类固醇、甲氨蝶呤、免疫抑制药物(包括环磷酰胺、环孢霉素、硫唑嘌呤和来氟米特)、非甾体抗炎剂(诸如阿司匹林、对乙酰氨基酚和COX-2抑制剂)、金药剂和抗疟疾治疗药。这些药物具有多种缺点和不良反应，包括注射部位反应、皮疹、上呼吸道感染、自身免疫障碍以及对感染的易感性增加。此外，与更方便和依从性更高的口服或皮肤外用途径相对，许多抗炎药物需要经静脉内(IV)或皮下(SC)施用。因此，仍需要开发用于炎症相关病症和疾病的新型药剂和治疗方法。
联合疗法：
另外的方面提供本文所公开的发明方法，其进一步包括联合疗法，其中将至少一种另外的治疗剂施用给患者。在某些方面，所述至少一种另外的治疗剂选自以下任一种：促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和/或生长因子(GDNF)。电动力学产生的富含气体的液体和溶液的抗炎活性：
根据本发明的某些方面，本文所公开的富含气体的液体和/或溶液具有抗炎性质和效果，并可用作抗炎剂治疗受炎性神经变性相关疾病或障碍折磨的受试者。之前的结果已表明，本发明的富氧液体(水)影响健康献血者经刺激的淋巴细胞中特定细胞因子的下调，尤其是细胞因子谱中的IL-6、IL-8和IL-1β。
促炎性细胞因子的产生增加已在许多炎性和自身免疫性疾病中存在牵连。TNFα的分泌是引发炎症级联反应的主要事件(Brennan F.M.，等Lancet，1989，2：244-7；Haworth C，等Eur.J.Immunol.1991，21：2575-2579)并直接促使炎性和自身免疫性疾病的引发和维持。其他促炎性细胞因子也发挥着作用，包括白介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-12一氧化氮、IFN-γ和GM-CSF，而抗炎细胞因子诸如IL-10则可减轻疾病。免疫系统的细胞(尤其是巨噬细胞)响应激活刺激而分泌其中许多细胞因子。
炎性过程中涉及到多种细胞类型。单核细胞、巨噬细胞及其他免疫细胞过量产生TNFα是多种疾病发病中的关键因素。巨噬细胞和T细胞尤其在免疫应答的引发和维持中发挥着核心作用。一旦通过病理或免疫原性刺激激活后，巨噬细胞通过释放出许多细胞因子作出响应，包括TNFα、IL-1β、IL-8、IL-12、一氧化氮(NO)、IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CSF等等。T细胞释放IL-2、IL-4、INF-γ及其他炎性细胞因子。这些细胞因子激活其他免疫细胞，一些还可作为独立的细胞毒素剂。巨噬细胞和T细胞源性炎症介质的过量释放尤其会导致正常细胞和周围组织受到损害。
促炎性细胞因子已在HIV-AIDS和其他病毒感染包括巨细胞病毒、流感病毒和病毒疱疹家族中有所牵连。TNFα增强人巨细胞病毒的主要即刻早期增强子/启动子的基础活性，并可能在前单核细胞中的潜在HCMV感染的再激活中发挥作用(Prosch S.，等Virology 1995，208：197-206)。
另外，许多炎性细胞因子提高患败血病或内毒素休克的患者的死亡率。例如，TNFα和IL-1β在败血病、败血性休克和内毒素休克中具有研究透彻的核心作用。这些细胞因子的水平升高引起发烧、低血压和休克(Smith J.W.等J.Clin.Oncol.1992，10：1141-1152；Chapman P.B.，等J.Clon.Oncol.1987，5：1942-1951)同时诱导磷脂酶A2(Gronich J.，等J.Clin.Invest.1994，93：1224-1233)和NO合酶的基因表达。
从平滑肌细胞诱导NO介导败血性休克期间平均动脉压和体循环血管阻力的降低，从而表明NO的基础性作用。因此，靶向对IL-8、IL-1β和NO的下调作用的疗法可能对治疗炎性疾病或障碍有益，包括败血病、败血性休克和内毒素休克。
TNFα的过量产生加重多种自身免疫疾病诸如糖尿病和类风湿性关节炎的临床表现。系统性红斑狼疮(SLE)也因IL-1β和TNFα水平的升高而加重。在狼疮患者中，血清C反应蛋白、IL-1β和TNFα水平高于对照的水平，从而表明增加的炎性反应在疾病中发挥着作用(Liou L.B.Clin.Exp.Rheumatol.2001，19：515-523)。对一种形式的SLE-神经精神性红斑狼疮(NPLE)患者的研究表明，表达TNFα的mRNA的外周血单核细胞的数量以及NO代谢物的脑脊髓液水平与NPLE疾病的严重性相关(Svenungsson E.，等Ann.Rheu m.Dis.2001，60：372-9)。
IL-1和TNFα在动物模型的各种急性以及慢性反应中发挥着核心作用。另外，IL-11、IFNα和IFNβ也可上调炎性反应。相反，若干细胞因子则涉及炎性反应的下调(即，IL-4、IL-10、IL-13等等)。如实施例1中所示，与本发明的富含气体的液体接触的细胞表现出与含T3抗原的对照培养基中相比IFN-γ水平随T3抗原而升高，而与含T3抗原的对照培养基中相比，IL-8则在含T3抗原的本发明的富含气体的培养基中更低。另外，IL-6、IL-8和TNF-α水平在含PHA的本发明的富含气体的培养基中比在含PHA的对照培养基中更低，而IL-1β水平在含PHA的本发明的富含气体的液体中与含PHA的对照培养基相比时更低。在单独的本发明的富含气体的培养基中，IFN-γ水平比在对照培养基中高。这些结果与抗炎微环境一致。
NO被视为炎性反应的介质和调节因子。其具有对病原体的细胞毒性，但对受试者自身组织也有毒害作用。(Korhonen等，Curr DrugTargets Inflamm Allergy 4(4)：471-9，2005)。NO与可溶性鸟苷酸环化酶反应形成环磷酸鸟苷(cGMP)，其介导NO的许多作用。NO还可与分子氧和超氧阴离子反应产生反应性氧物质，其可改变多种细胞功能。NO的这些间接作用在炎症中发挥着重要作用，其中NO通过诱导型N0合酶(iNOS)大量产生，并且反应性氧物质通过激活的免疫细胞合成。
NO可通过角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及可能还有其他细胞产生。NO的一些血管作用包括血管舒张、抑制血细胞与血管内皮的粘附、抑制白细胞与血管内皮的粘附以及清除超氧化物。(Shah等，Env.Health Persp.v.106(5)：1139-1143.)
此外，抑制NO的合成已表明可延迟伤口收缩、改变胶原组织以及改变和新生表皮厚度。(Amadeu and Costa，J.Cutan.Pathol.33：465-473，2006.)伤口中的肥大细胞迁移和血管新生也受NO抑制的影响。(同上)不受任何特定机理理论的束缚，在某些实施方案中，本发明的富含气体的液体可以调节局部和/或细胞NO产生或降解，与本文所公开的实施例部分中所示的伤口愈合作用的谱图一致。由于调节途径的可变性，在某些实施方案中，本发明的富含气体的液体可增加NO的产生和/或延迟NO的降解，而在某些其他实施方案中，本发明的富含气体的液体可减少NO的产生和/或加快NO的降解。
具体地讲，用富氧盐水溶液处理的伤口表现出在第4至11天时以及在第3与11天之间的伤口愈合加快，用富氧盐水溶液处理的伤口中新的表皮的迁移速度是用生理盐水处理的伤口的表皮迁移速度的两到四倍快，如本文的实施例9中所示。研究还表明，在第15和22天之间，用富氧盐水溶液处理的伤口分化速率更快，如通过更早形成更成熟的表皮层所表明。在所有阶段，发生在与正常愈合相关的表皮中的增厚未发生在用富氧盐水溶液处理的伤口中。
因此，根据伤口愈合作用的这一谱图，但不希望受任何具体理论的束缚，据信，富氧盐水溶液可调节伤口中NO的局部和/或细胞水平。NO调节伤口愈合中的生长因子、胶原沉积、炎症、肥大细胞迁移、表皮增厚和血管新生。此外，一氧化氮还通过受氧调节的可诱导型酶产生。
就肥大细胞迁移而言，对于富氧溶液，在早期和晚期迁移中也存在差异。这与本领域就NO合成受到抑制所知的一致(Amadeu andCosta，J.Cutan Pathol 33：465-473，2006)。
在炎性过程的最初两个阶段中，外来物要么被破坏(例如，如果外来物为生物体)，要么其周围的组织被松开(例如，如果其为碎片)。在愈合阶段，炎症开始减退；各血管和血管模式再次变正常；以及伤口开始修复。在修复过程中的三个主要事件是(1)通过成纤维细胞增殖形成新的结缔组织；(2)上皮再生；以及(3)新的毛细血管长出。
甚至在炎症减退前，成纤维细胞就开始从周围的正常组织(其中它们通常以休眠状态存在)中进入受伤的区域。它们通过变形运动沿着纤维蛋白束迁移，并将自身分布在整个愈合区域中。在受伤组织中固定到位后，它们开始合成胶原并分泌这种蛋白，这些蛋白将自身安排到纤维中。纤维自身取向，使其纵向轴线在应力最大的方向上。随着胶原束长牢，成纤维细胞逐渐降解，并紧密附着到胶原束，而受伤的区域则转化成疤痕组织。
在疤痕组织形成的同时，伤口边缘的完整表皮细胞开始增殖并作为一个薄片向受伤区域的中心移动。随着炎症的减退，需要直接供血，在伤口部位出现血管新生。
炎症是涉及多种细胞类型的复杂过程。例如，肥大细胞释放调节因子，触发血管舒张的早期阶段，伴随内皮下层中内皮细胞的分离和胶原纤维的暴露。在血管中形成的细胞间隙中的纤维捕集血小板并触发这些细胞释放调节因子。
除了血小板外，暴露的胶原纤维还与通过扩张的血管壁的孔滤过的血浆蛋白相互作用，包括触发凝血级联、血管舒张增加、血管渗透性增加和趋化性的因子。
另外，补体级联可通过若干刺激而激活：受伤的血管、受损细胞释放的蛋白分解酶、参与的任何细菌的膜成分以及抗原-抗体复合物。一些激活的补体成分作为趋化因子发挥作用，其负责白细胞向发炎区域的流入，而其他的则有助于细胞吞噬作用并参与细胞裂解。
此外，据信，本发明的富含气体的液体或溶液还可调节炎症至少一个方面中涉及到的至少一种细胞因子，所述细胞因子包括但不限于MAF(巨噬细胞激活因子)、MMIF(巨噬细胞迁移抑制因子)、MCF(巨噬细胞趋化因子)、LMIF(白细胞迁移抑制因子)、HRF(组胺释放因子)、TF(转移因子)、白介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15等)、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ζ、IFN-δ等)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞CSF)、M-CSF(巨噬细胞CSF)、多重-CSF(IL-3)、成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)、EGF(上皮生长因子)、NGF(神经生长因子)、PDGF(血小板衍生生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、转化生长因子(TGF-α、TGF-β等)、NAP-2(中性粒细胞激活蛋白2)、PF-4(血小板因子4)、血小板球蛋白、MCP-1(单核细胞趋化蛋白1)、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β-+(巨噬细胞炎性蛋白)、RANTES(调节激活正常T细胞表达与分泌的趋化因子)、HSP(热休克蛋白)、GRP(葡萄糖调节蛋白)、泛素等等。
因此，在某些实施方案中，该富含气体的液体和/或治疗性组合物可增加抗炎分子或细胞因子的产生和/或分泌或减少抗炎分子或细胞因子的降解，从而缓解或防止炎症和/或炎性神经变性的至少一种症状。在其他实施方案中，本发明的富含气体的液体和/或治疗性组合物可减少促炎性分子或细胞因子的产生和/或分泌或增加促炎性分子或细胞因子的降解，从而缓解或防止炎症和/或炎性神经变性的至少一种症状。
之前的研究已表明，抗MOG抗体在加重髓鞘脱失和恶化EAE(实验性自身免疫性脑脊髓炎，一种类风湿性关节炎人自身免疫疾病的动物模型系统)中起着关键作用。(Linington，等1992.J.Neuroimmunol.40：219-224)。另外，针对MOG的抗体已在多发性硬化的发病中存在牵连。(Berger等N.Engl.J.Med.2003Jul 10；349(2)：139-45)。
如之前的实验所示，本发明的富含气体的液体可放大淋巴细胞对之前用来预处理动物的抗原的反应。如之前的实验所表明，当与加压充氧液体(压力罐)或对照去离子液体相比时，在用包含溶剂化电子的本发明的富含气体的液体所复原的液体中进行培养时，响应MOG攻击的淋巴细胞增殖更大。
示例性相关分子相互作用：
通常，量子特性被认为属于小于10-10米的基本粒子，而我们日常生活的宏观世界被称为经典的，原因在于其表现符合牛顿运动定律。
最近，已有人描述分子形成随着稀释而尺寸增大的簇。这些簇的直径量度达若干微米，并有报告称随着稀释其尺寸非线性地增大。已假设直径量度达100纳米的量子相干域在纯水中出现，并且在相干域中水分子的集体振动可最终变为对电磁场波动的相锁定，从而提供水中的稳定振荡，提供水中溶解物质特定的长效相干振荡激发形式的“记忆”形式，其改变水的总体结构，继而可确定发生的特定相干振荡。如果这些振荡通过磁场相耦合而变稳定，则水在稀释后仍可携带“种子”相干振荡。随着一簇分子尺寸的增大，其电磁特征相应地被放大，从而加强水携带的相干振荡。
尽管溶解分子的簇大小以及水的详细微观结构存在变化，但尽管如此仍可存在相干振荡的特异性。一种考虑水性质变化的模型基于结晶中涉及到的考虑因素。
形成纳米级笼状结构的简化质子化水簇在本申请人之前的专利申请WO 2009/055729中给出。质子化水簇通常呈H+(H2O)n的形式。一些质子化水簇天然存在，诸如在电离层中。不受任何特定理论的束缚，并根据特定的方面，其他类型的水簇或结构(簇、纳米笼等)也是可能的，包括赋予本发明的输出材料的含氧及稳定质子的结构。氧原子可被捕捉在所得的结构中。半结合纳米笼的化学性质允许氧和/或稳定化电子长期保持溶解。其他原子或分子(诸如药物化合物)也可被关在笼中以便持续递送。溶液材料和溶解化合物的特定化学性质取决于这些材料的相互作用。
由混合装置加工的液体之前已通过实验表明可表现出不同的结构特性，这与簇结构背景下的液体分析一致。参见例如WO2009/055729。
电荷稳定的纳米结构(如，电荷稳定的含氧纳米结构)：
如之前在本申请人的WO 2009/055729的“双层效应”、“停留时间”、“注入速率”和“气泡大小测量”中所述，电动力学混合装置在大约毫秒级内产生独特的第一材料和第二材料非线性液体动力学相互作用，其具有复杂的、动态的扰动，从而提供与有效巨大的表面积(包括装置的表面积以及低于100nm的极小气泡的表面积)接触的复杂混合，继而提供如本文所述的新型电动力学效应。另外，使用包括绝缘转子和定子特征的特别设计的混合装置证实了特征局部电动力学效应(电压/电流)。
如本领域所熟知，电荷再分布和/或溶剂化电子已知在水溶液中高度稳定。根据特定的方面，申请人的电动力学效应(如，电荷再分布，在特定的方面包括溶剂化电子)出人意料地在输出材料(如盐水溶液、离子溶液)中稳定。事实上，如本文所述，本发明的电动力学液体(如RNS-60或Solas)的性质和生物活性的稳定性可在气密封容器中保持数月，从而表明溶解气体(如，氧)涉及到有助于生成和/或维持和/或调节本发明的溶液的性质和活性。明显地，电荷再分布和/或溶剂化电子在本发明的电动力学离子水性液体中稳定配置，其量足以在液体与或细胞(如，哺乳动物细胞)接触时提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节(例如，参见WO 2009/055729中的细胞膜片钳工作实施例23以及如本文所述)。
如本文在“分子相互作用”下所述，为了解释本发明的电动力学液体(如，电动力学盐水溶液)的稳定性和生物相容性，申请人已提出水分子与溶于水中的物质(如氧)的分子之间的相互作用改变水的总体结构并提供纳米级笼簇，包括赋予本发明的输出材料的含氧和/或稳定化电子的纳米结构。不受机理的束缚，在特定方面纳米结构的构造使得它们：包含(至少针对形成和/或稳定性和/或生物活性)溶解气体(如，氧)；使电动力学液体(如RNS-60或Solas盐水液体)能够调节(如，赋予或接受)与细胞膜或其相关成分接触时的电荷和/或电荷效应；以及在特定的方面，以生物学相关形式提供溶剂化电子的稳定化(如，携带、包藏、捕获)。
根据特定的方面，以及如本公开所支持，在离子或盐水(如，标准盐水，NaCl)溶液中，本发明的纳米结构包括电荷稳定的纳米结构(如，平均直径小于100nm)，其在电荷稳定的水化壳内包含至少一个溶解的气体分子(如，氧)。根据另外的方面，该电荷稳定的水化壳可包括包藏所述至少一个溶解的气体分子(如，氧)的笼或空隙。根据进一步的方面，通过提供合适的电荷稳定的水化壳，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构可另外包含溶剂化电子(如，稳定的溶剂化电子)。
不受机理或特定理论的束缚，在本发明优先权日之后，已有人提出了在水性液体中通过离子稳定的电荷稳定化微泡与环境(大气)气体平衡(Bunkin等，Journal of Experimental and Theoretical Physics，104：486-498，2007；以引用方式全文并入本文)。根据本发明的特定方面，申请人的新型电动力学液体包含新型、生物活性形式的电荷稳定的含氧纳米结构，并可进一步包括新型阵列、簇或此类结构的缔合。
根据电荷稳定的微泡模型，水结构的短程分子有序因气体分子的存在而破坏(如，最初与非吸附性粒子复合的溶解气体分子提供短程有序缺陷)，从而提供离子液滴的凝聚，其中该缺陷被水分子的第一和第二配位层围绕，其作为另外一种选择被在配位层中分别占据六个和12个空位的吸附性离子(如，获得Na+粒子的屏蔽壳形成双电层)和非吸附性粒子(如占据第二配位层的Cl-离子)填充。在不饱和离子溶液(如，不饱和盐水溶液)中，此水合“核”保持稳定，直到第一和第二层分别被六个吸附性和五个非吸附性离子填充，然后发生库仑爆炸，形成含气体分子的内部空隙，其中吸附性离子(如Na+离子)被吸附到所得空隙的表面，而非吸附性离子(或其某一部分)则扩散到溶液中(Bunkin等，上文)。在此模型中，纳米结构中的空隙通过吸附到其表面上的离子(如Na+离子)之间的库仑排斥而防止塌陷。假设含空隙纳米结构的稳定性是由于具有同样电荷的溶解离子选择性吸附到空隙/气泡表面上以及溶解气体与气泡内部气体之间的扩散平衡，其中所得双电层施加的向外静电负压提供表面张力的稳定补偿，并且气泡内部的气体压力通过环境压力得到平衡。根据该模型，此类微泡的形成需要离子组分，并且在某些方面，粒子之间碰撞介导的缔合可使得形成更大的有序簇(阵列)(同上)。
电荷稳定的微泡模型表明，粒子可以是气体微泡，但是设想只能在与环境气体平衡的离子溶液中自发形成此类结构，至于氧能否形成此类结构尚不得而知，同样，溶剂化电子是否可通过此类结构缔合和/或稳定也不清楚。
根据特定的方面，本发明的包含电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构的电动力学液体是新型的并与根据微泡模型的假设非电动力学、大气电荷稳定的微泡结构本质不同。明显地，此结论不可避免至少部分地基于以下事实：对照盐水溶液不具有本文所公开的生物学性质，而申请人的电荷稳定的纳米结构则提供新型的、生物学活性形式的电荷稳定化含氧纳米结构。
根据本发明的特定方面，申请人的新型电动力学装置和方法提供新型电动力学改变的液体，其包含大量的电荷稳定的纳米结构，这种量超过可以或不能在与空气平衡的离子液体中或在任何非电动力学产生的液体中自发形成的任何量。在特定的方面，电荷稳定的纳米结构包括电荷稳定的含氧纳米结构。在另外的方面，电荷稳定的纳米结构全部或基本上全部为电荷稳定的含氧纳米结构，或电荷稳定的含氧纳米结构是电动力学液体中的主要电荷稳定的含气体纳米结构物质。
根据进一步的方面，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构可包含或包藏溶剂化电子，并因而提供新型稳定的溶剂化电子载体。在特定的方面，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构提供新类型的电子化合物(或逆电子化合物)，其与具有单个有机配位阳离子的常规溶质电子化合物相对，具有多个围绕空隙或含氧原子的空隙稳定阵列化的多个阳离子，其中阵列化的钠离子通过水化壳而不是有机分子配位。根据特定的方面，溶剂化电子可通过水分子的水化壳容纳，或优选地容纳在分布在整个阳离子上的纳米结构空隙内。在某些方面，本发明的纳米结构在溶液中提供新型“超电子化合物”结构，方式是不仅通过提供溶剂化电子在多个阵列化钠阳离子上的分布/稳定化，还通过提供空隙中溶剂化电子与笼中氧分子的缔合或部分缔合-溶剂化电子分布在一系列钠原子和至少一个氧原子上。因此，根据特定的方面，如本文结合本发明的电动力学液体公开的“溶剂化电子”可以不在包含水分子的直接水合的传统模型中溶剂化。作为另外一种选择，在用干燥的电子化合物有限类推中，本发明电动力学液体中的溶剂化电子可以分布在多个电荷稳定的纳米结构上，以提供“晶格胶”使水溶液中的更高阶阵列稳定化。
在特定的方面，本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构能够与细胞膜或其成分或蛋白质等相互作用，从而调节生物活性。在特定的方面，本发明的包藏溶剂化电子的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构能够与细胞膜或其成分或蛋白质等相互作用，从而调节生物活性。
在特定的方面，本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构与细胞膜或其成分或蛋白质等相互作用，作为电荷/或电荷效应供体(提供)和/或作为电荷和/或电荷效应受体以调节生物活性。在特定的方面，本发明的包藏溶剂化电子的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构与细胞膜或其成分或蛋白质等相互作用，作为电荷和/或电荷效应供体和/或作为电荷和/或电荷效应受体以调节生物活性。
在特定的方面，本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构与本发明的电动力学液体观察到的稳定性和生物学性质一致，并对这些性质作出解释，以及进一步提供新型电子化合物(或逆电子化合物)，其在水性离子溶液(如，盐水溶液、NaCl等)中提供稳定的溶剂化电子。
在特定的方面，电荷稳定的含氧纳米结构基本上包含电荷稳定的含氧纳米泡、呈所述纳米泡的形式或可形成所述纳米泡。在特定的方面，电荷稳定的含氧簇使得形成相对更大阵列的电荷稳定的含氧纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米泡或其阵列。在特定的方面，电荷稳定的含氧纳米结构可使得在与疏水表面接触时形成疏水纳米泡。
在特定的方面，电荷稳定的含氧纳米结构基本上包含至少一个氧分子。在某些方面，电荷稳定的含氧纳米结构节本上包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少50个、至少100个或更多个氧分子。在特定的方面，电荷稳定的含氧纳米结构包含或产生约20nmx1.5nm的纳米泡(如，疏水纳米泡)，包含约12个氧分子(如，基于氧分子的大小(约0.3nmx0.4nm)，假定理想气体并应用n＝PV/RT，其中P＝1atm，R＝0.082□057□1.atm/mol.K；T＝295K；V＝pr2h＝4.7x10-22L，其中r＝10x10-9m，h＝1.5x10-9m以及n＝1.95x10-22mol)。
在某些方面，在以离子水性液体中具有电荷稳定化配置的此类纳米结构或其阵列形式的液体中，氧分子的百分比选自大于以下值的百分比：0.1％、1％，2％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％以及大于95％。优选地，此百分比大于约5％、大于约10％、大于约15％或大于约20％。在另外的方面，在离子水性液体中具有电荷稳定配置的电荷稳定含氧纳米结构或其阵列的基本尺寸选自小于以下值的尺寸：100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm和1nm。优选地，该尺寸小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm、小于约20nm或小于约10nm。
在某些方面，本发明的电动力学液体包含溶剂化电子。在进一步的方面，本发明的电动力学液体包含电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构和/或其阵列，其包含以下至少一者：溶剂化电子；以及独特的电荷分布(极性、对称或非对称电荷分布)。在某些方面，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构和/或其阵列具有顺磁性。
相比之下，相对于本发明的电动力学液体，对照压力罐充氧液体(非电动力学液体)等不含能够调节细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的此类电动力学产生的电荷稳定的生物活性纳米结构和/或生物活性电荷稳定的含氧纳米结构和/或其阵列。
制备富含气体的液体的系统
如之前申请人的WO 2009/055729专利申请中所公开的系统和方法可让气体(如，氧)以最少的被动损失高浓度地稳定富集。该系统和方法可有效地用于以高百分比将多种气体富集到多种液体中。仅以举例的方式，使用本发明所公开的系统和/或方法，在室温通常具有约2-3ppm(百万分之一)溶解氧水平的去离子水可实现以下范围内的溶解氧水平：至少约5ppm、至少约10ppm、至少约15ppm、至少约20ppm、至少约25ppm、至少约30ppm、至少约35ppm、至少约40ppm、至少约45ppm、至少约50ppm、至少约55ppm、至少约60ppm、至少约65ppm、至少约70ppm、至少约75ppm、至少约80ppm、至少约85ppm、至少约90ppm、至少约95ppm、至少约100ppm或者更大或其间的任何值。根据特定的示例性实施方案，可生成溶解氧水平为约30-60ppm的富氧水。
表3示出了在用富氧盐水溶液(表3)处理的愈合伤口中以及本发明的富含气体的富氧盐水溶液样品中获取的各种分压测量值。
表3
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施用途径和形式
在特定的示例性实施方案中，本发明的富含气体的液体可单独地或与另一种治疗剂相结合用作治疗性组合物，使得该治疗性组合物防止或缓解炎症的至少一种症状。本发明的治疗性组合物包括能够施用到对其有需要的受试者的组合物。在某些实施方案中，治疗性组合物配方还可以包含选自以下的至少一种另外的物质：载体、佐剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、矫味剂、香料和粘结剂。
如本文所用，“药学上可接受的载体”和“载体”通常是指任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填料、稀释剂、包封材料或配方辅剂。可用作药学上可接受的载体的材料的某些非限制性实例为糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，诸如可可油和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；不含热源的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒相容性润滑剂，诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂及芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可根据配方人员的判断存在于组合物中。在特定的方面，此类载体和赋形剂可以是本发明的富含气体的液体或溶液。
本文所述的药学上可接受的载体(例如，介质、佐剂、赋形剂或稀释剂)是本领域的技术人员熟知的。通常，药学上可接受的载体对治疗剂是化学惰性的，并且在使用条件下无有害副作用或毒性。药学上可接受的载体可包括聚合物和聚合物基质、纳米粒子、微泡等。
除了本发明的治疗性富含气体的液体外，治疗性组合物可进一步包含惰性稀释剂，诸如另外的不富含气体的水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇脂肪酸酯以及它们的混合物。如本领域的技术人员将认识到，特定治疗性组合物的新型改进配方、新型富含气体的治疗性液体以及递送新型富含气体的治疗性液体的新方法可通过将一种或多种惰性稀释剂用相同、相似或不同组成的富含气体的液体进行替换而获得。例如，常规的水可用将氧混合到水或去离子水中以提供富含气体的液体而产生的富含气体的液体替换或补充。
在某些实施方案中，本发明的富含气体的液体可与一种或多种治疗剂结合和/或单独使用。在特定的实施方案中，掺入富含气体的液体可包括将本领域已知的一种或多种溶液，诸如去离子水、盐水溶液等用一种或多种富含气体的液体替换，从而提供用于递送给受试者的改进的治疗性组合物。
某些实施方案提供治疗性组合物，其包含本发明的富含气体的液体、药物组合物或其他治疗剂或药学上可接受的盐或其溶剂化物，以及至少一种药学载体或稀释剂。这些药物组合物可用于上述疾病或病症的预防和治疗中以及如上所述的疗法中。优选地，载体必须是药学上可接受的载体，并且必须与组合物的其他成分相容，即，不对其他成分产生有害作用。载体可以是固体或液体，并优选地配制成单位剂量制剂，例如，可包含0.05至95重量％的活性成分的片剂。
可能的施用途径包括口腔、舌下、颊面、肠胃外(例如，皮下、肌内、动脉内、腹膜内、脑池内、膀胱内、鞘内或静脉内)、直肠、外用(包括经皮、阴道内、眼内、耳内、鼻内、吸入)以及注射或插入可植入式装置或材料。
施用途径
针对特定受试者最合适的施用方式将取决于所治疗的疾病或病症的性质和严重性或所用疗法的性质以及治疗性组合物或另外治疗剂的性质。在某些实施方案中，口腔施用或外用是优选的。
适于口腔施用的制剂可作为分立的单位提供，例如片剂、胶囊、囊片、糖浆、酏剂、口香糖、“棒棒糖”制剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、锭剂或胶衣安瓿，每一者都含有预定量的活性化合物；作为粉末剂或颗粒剂提供；作为水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂提供；或作为水包油或油包水乳剂提供。
可提供适于口腔施用的另外制剂以包含可通过各种类型的计量剂量的加压气溶胶、喷雾器、雾化器或吹入器产生的细小离子粉尘或薄雾。具体地讲，治疗剂的粉末或其他化合物可溶于或悬浮在本发明的富含气体的液体中。
适于经粘膜方法(诸如通过舌下或颊面施用)的制剂包括锭剂、贴片、片剂等，它们包含活性化合物以及通常还包含风味基质，诸如糖和金合欢或黄蓍胶，以及在惰性基质(诸如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶)中包含活性化合物的糖果锭剂。
适于非肠道施用的制剂通常包括无菌水溶液，其包含预定浓度的活性富含气体的液体以及可能的另一种治疗剂；该溶液优选地为与预期受体的血液等渗。适于非肠道施用的另外制剂包括含有生理上合适的共溶剂和/或络合剂诸如表面活性剂和环糊精的制剂。水包油乳剂也可适用于富含气体的液体的非肠道施用。虽然此类溶液优选地在静脉内施用，但是它们也可通过皮下或肌内注射而施用。
适于尿道、直肠或阴道施用的制剂包括凝胶剂、霜剂、洗剂、水或油混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、可溶性固体物质、冲洗剂等等。制剂优选地以单位剂量栓剂提供，其在形成栓剂基质的一种或多种载体(例如，可可油)中包含活性成分。作为另外一种选择，可配制具有本发明的富含气体的液体的结肠洗剂，用于结肠或直肠施用。
适于外用、眼内、耳内或鼻内应用的制剂包括油膏剂、霜剂、糊剂、洗剂、凝胶剂(诸如，水凝胶)、喷剂、可分散粉剂和颗粒剂、乳剂、使用流动推进剂的喷剂或气溶胶(诸如脂质体喷剂、滴鼻剂、喷鼻剂等等)和油剂。此类制剂的合适石油凝胶、羊毛脂、聚乙二醇、醇类以及它们的组合。鼻腔或鼻内递送可包括计量剂量的任何这些制剂或其他制剂。同样，耳内或眼内制剂可包括滴剂、油膏剂、冲洗液等。
本发明的制剂可通过任何合适的方法配制，通常通过按所需的比例将富含气体的液体(任选地具有活性化合物)与液体或细分的固体载体或这两者均匀紧密地配混，然后在必要时将所得的混合物形成所需的形状。
例如，可通过以下方法制备片剂：压制包含活性成分与一种或多种任选成分(诸如粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂或表面活性分散剂)的粉末或颗粒的紧密混合物，或模制粉末化活性成分与本发明的富含气体的液体的紧密混合物。
适于通过吸入而施用的制剂包含可通过各种类型的计量剂量的加压气溶胶、喷雾器、雾化器或吹入器产生的细小离子粉尘或薄雾。具体地讲，治疗剂的粉末或其他化合物可溶于或悬在本发明的富含气体的液体中。
对于经口进行肺部施用，粉末或液滴的粒度通常在0.5-10μm、优选1-5μm的范围内，以确保递送到支气管树中。对于经鼻施用，10-500μm范围内的粒度是优选的以确保留在鼻腔内。
计量剂量的吸入器是加压气溶胶喷罐，通常装有治疗剂在液化推进剂中形成的混悬剂或溶液。在某些实施方案中，如本文所公开，本发明的富含气体的液体可除了标准液化推进剂外或取代标准液化推进剂使用。在使用期间，这些装置将制剂通过适于递送计量体积(通常为10至150μL)的阀门而排出，以产生包含治疗剂和富含气体的液体的细颗粒喷雾。合适的推进剂包括氯氟烃化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷以及它们的混合物。
制剂可另外包含一种或多种共溶剂，例如乙醇表面活性剂，诸如油酸或三油酸山梨酯，抗氧化剂和矫味剂。雾化器是可商购获得的装置，其将活性成分的溶液或悬浮液转化成治疗性气溶胶薄雾，方式为通过加速压缩气体(通常为空气或氧气)通过窄文丘里孔，或者通过超声搅拌。适用于雾化器的制剂由富含气体的液体中的并占制剂最多40％w/w优选低于20％w/w的另一种治疗剂组成。此外，可以使用其他载体，诸如蒸馏水、无菌水或稀水性醇溶液，优选地通过加入盐诸如氯化钠制备为与体液等渗。任选的添加剂包括防腐剂，尤其是当制剂不是以无菌方式制备时，并可包括羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂、矫味剂、挥发油、缓冲剂和表面活性剂。
适于通过吹入施用的制剂包括细粉碎的粉末，其可通过吹入器递送或以鼻烟的方式送入鼻腔。在吹入器中，粉末被容纳在通常由明胶或塑料制成的胶囊或药筒中，其被原位刺穿或打开，粉末在吸入时通过穿过装置的空气而递送，或通过手动操作的泵而递送。吹入器中所用的粉末仅由活性成分组成或由包含活性成分、合适的粉末稀释剂(诸如乳糖)和任选的表面活性剂的粉末共混物组成。活性成分通常占制剂的0.1至100w/w。
除了上文具体提及的成分外，本发明的制剂可包含本领域技术人员就组织中的制剂类型所知的其他物质。例如，适于经口施用的制剂可包含矫味剂，以及适于鼻内施用的制剂可包含香料。
本发明的治疗性组合物可通过可与药物(作为单独的治疗剂或与治疗剂相结合)联合使用的任何常规方法施用。
施用的剂量当然将根据已知的因素而变化，诸如特定药剂的药效动力学特性及其施用模式和途径；受体的年龄、健康情况和体重；症状的性质和程度；并治的种类；治疗的频率；以及所需的效果。活性成分的每日剂量预计可为约0.001至1000毫克(mg)每千克(kg)体重，优选剂量为0.1至约30mg/kg。根据某些方面，活性成分的每日剂量可为0.001升至10升，优选的剂量为约0.01升至1升。
剂型(适于施用的组合物)每单位包含约1mg至约500mg活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将通常以组合物总重量的约0.5-95重量％存在。
油膏剂、糊剂、泡沫剂、闭塞剂、霜剂和凝胶剂可包含赋形剂，诸如淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、硅树脂、膨润土、硅石和滑石粉或它们的混合物。粉末剂和喷剂也可包含赋形剂，诸如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝和硅酸钙，或这些物质的混合物。纳米晶抗微生物金属的溶液可通过任何已知的通常用于制备气溶胶药物的方式转化成气溶胶或喷剂。一般来讲，此类方法包括加压溶液容器或提供加压溶液容器的方法，通常使用惰性载气，以及让压缩气体通过小孔。喷剂另外可包含惯用的推进剂，诸如氮气、二氧化碳和其他惰性气体。此外，微球或纳米粒子可与本发明的富含气体的治疗性组合物或液体一起用于将治疗性化合物施用给受试者所需的任何途径。
注射用制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器中，诸如安瓿和药水瓶中，并可保存在只需在紧接使用前添加无菌液体赋形剂或富含气体的液体的冷冻干燥(冻干)条件下。即时注射溶液和混悬液可通过无菌粉末、颗粒和片剂制备。对注射用组合物的有效药物载体的要求对本领域的技术人员而言是熟知的。参见例如Pharmaceutics andPharmacy Practice，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa.，Banker andChalmers，Eds.，238-250(1982)和ASHP Handbook on Injectable Drugs，Toissel，4th ed.，622-630(1986)。
适于外用的制剂包括含有本发明的富含气体的液体和任选地另外的治疗剂和芳香剂(通常为的蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)的锭剂；在惰性基质(诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶)中包含富含气体的液体和任选的另外治疗剂的糖果锭剂；以及在合适的液体载体中包含富含气体的液体和任选的另外治疗剂的漱口剂或漱口水；以及霜剂、乳剂、凝胶剂等等。
另外，适用于经直肠施用的制剂可通过混合多种基质(诸如乳化基质或水溶性基质)以栓剂提供。适用于经阴道施用的制剂可作为阴道栓剂、卫生棉条、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾配方提供，它们除了活性成分外还包含本领域已知合适的载体。
合适的药用载体在Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company(本领域的标准参考文献)中有所描述。
在本发明背景下施用给受试者特别是动物尤其是人的剂量应足以在合理的时间段内在动物中影响治疗反应。本领域的技术人员将认识到剂量将取决于多种因素，包括动物的病症、动物的体重以及治疗的病症。合适的剂量为将会在受试者中产生已知会影响所需反应的治疗组合物浓度的量。
剂量大小还将通过施用途径、时间和频率以及可伴随治疗性组合物的施用的任何副作用的存在性、性质和程度以及所需的生理效应而决定。
将认识到，可施用组合的化合物：(1)通过在共同制剂中组合化合物而同时施用，或(2)通过交替施用，即，在单独的药物制剂中按顺序地、依次地、平行地或同时地递送化合物。在交替疗法中，施用第二种任选地第三种活性成分的延迟不应丧失活性成分的联合所带来的协同治疗效果的益处。根据某些实施方案，通过施用方法(1)或(2)，理想的是，联合用药应达到最有效的结果。在某些实施方案中，通过施用方法(1)或(2)，理想的是，联合用药应达到每种活性成分的峰值血浆浓度。通过施用联合共同制剂的每日一次一粒药丸的方案对预计将暴露于神经毒素的某些患者是可行的。根据某些实施方案，联合用药的活性成分的有效峰值血浆浓度将在约0.001至100μM的范围内。最佳的峰值血浆浓度可通过开具给特定患者的制剂和给药方案而实现。还将理解的是，本发明的液体以及促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和/或生长因子(GDNF)或它们任何一种的生理功能性衍生物中的任一者(无论是同时地还是依次地提供)可单独地、多次地或以其任何组合而施用。一般来讲，在交替疗法(2)期间，每种化合物的有效剂量按顺序施用，而在共同制剂疗法(1)中，两种或更多种化合物的有效剂量同时施用。
本发明的联合用药可便利地作为单位剂型的药物制剂提供。便利的单位剂量制剂包含的活性成分的每一者的量为1mg至1g的任何量，例如但不限于10mg至300mg。本发明的液体联合促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和/或生长因子(GDNF)任一者的协同效应可在宽比例范围内实现，例如1∶50至50∶1(本发明的液体∶促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和/或生长因子(GDNF))。在一个实施方案中，该比例可以在约1∶10至10∶1。在另一个实施方案中，本发明的液体与促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和/或生长因子(GDNF)任一者在共同配制的组合剂型(诸如丸剂、片剂、囊片或胶囊)中的重量/重量比将为约1，即，本发明的液体和促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和/或生长因子(GDNF)任一者的量大致相等。在其他示例性共同制剂中，可以存在更多或更少的本发明的液体和促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和/或生长因子(GDNF)的任一者。在一个实施方案中，每种化合物将按单独使用时表现出抗炎活性的量用在联合用药中。在本发明的范围内设想了所述联合用药的化合物的其他比例和量。
单位剂型可进一步包含本发明的液体和促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和生长因子(GDNF)或它们任何一种的生理功能性衍生物中的任一者，以及药学上可接受的载体。
本领域的技术人员将认识到，用于治疗所需的本发明联合用药中活性成分的量将根据多种因素而变化，包括所治疗的病症的性质以及患者的年龄和状况，并将最终由主治医生或保健医师决定。要考虑的因素包括但不限于施用途径和制剂性质，动物体重、年龄和整体状况，以及待治疗的疾病的性质和严重性。
还可能的是，将用于同时或顺序施用的单位剂型中活性成分的任何两种与第三种活性成分联合。三部分联合用药可同时地或按顺序地施用。当按顺序施用时，联合用药可以两次或三次施用。根据某些实施方案，本发明的液体和促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和/或生长因子(GDNF)任一者的三部分联合用药可按任何顺序施用。
神经毒性剂：
神经毒性剂是特异性作用于神经元、其突触或整个神经系统的毒素。这些物质导致大脑结构受损，继而导致慢性疾病。神经毒素包括肾上腺素能神经毒素、胆碱能神经毒素、多巴胺能神经毒素、兴奋性毒素以及其他神经毒素。肾上腺素能神经毒素的实例包括N-(2-氯乙基)-N-乙基-2-溴苄胺盐酸盐。胆碱能神经毒素的实例包括乙酰基乙基胆碱氮芥盐酸盐(acetylethylcholine mustard hydrochloride)。多巴胺能神经毒素的实例包括6-羟基多巴胺氢溴酸盐(6-OHDA)、1-甲基-4-(2-甲基苯基)-1，2，3，6-四氢吡啶盐酸盐、1-甲基-4-苯基-2，3-二氢吡啶鎓高氯酸盐、N-甲基-4-苯基-1，2，5，6-四氢吡啶盐酸盐(MPTP)、碘化1-甲基-4-苯基吡啶鎓(MPP+)、百草枯和鱼藤酮。兴奋性毒素的实例包括NMDA和红藻氨酸。
已表明MPTP、MPP+、百草枯、鱼藤酮和6-OHDA会在动物模型中诱导PD样症状。(参见K.Ossowska，等，(2006).″Degeneration ofdopaminergic mesocortical neurons and activation of compensatoryprocesses induced by a long-term paraquat administration in rats：Implications for Parkinson′s disease″.Neuroscience 141(4)：2155-2165；以及Caboni P，等，(2004).″Rotenone，deguelin，their metabolites，andthe rat model of Parkinson′s disease″.Chem Res Toxicol 17(11)：1540-8；Simon等，Exp Brain Res，1974，20：375-384；Langston等，Science，1983，219：979-980；Tanner，Occup Med，1992，7：503-513；Liou等，Neurology，1997，48：1583-1588)。
神经保护
神经系统内的神经保护作用防止神经元凋亡或变性，例如，在脑损伤后或因慢性神经变性疾病。“神经保护作用”旨在防止和治疗可导致中枢神经系统(CNS)受损的并发症。神经保护可通过细胞存活或细胞死亡延迟、疾病进展停止或减缓、疾病发生和疾病死亡率延迟的参数来估计。
如本文所述的实施例表明电动力学改变的水性液体具有神经保护性质，其中已表明电动力学改变的水性液体可避免神经细胞MPTP诱导的PD症状。根据某些实施方案，电动力学改变的水性液体在避免和/或减轻暴露于神经毒素时的相关作用方面具有实质性效果。
神经保护剂包括但不限于：促红细胞生成素、抗凋亡剂(TCH346、CEP-1347)、抗谷氨酸能剂、单胺氧化酶抑制剂(司来吉兰、雷沙吉兰)、促线粒体生物能转换剂(辅酶Q10、肌酸)、钙通道阻滞剂(伊拉地平)、α突触核蛋白和生长因子(GDNF)。
以下实施例意在仅为例证性的，不以任何方式进行限制。
实施例
实施例1
微泡大小
通过使用本发明的扩散器用富含气体的液体进行了实验，以便确定气体微泡大小限值。通过使富含气体的液体通过0.22和0.1微米的过滤器确立了微泡大小限值。在执行这些测试时，一定体积的液体通过本发明的扩散器并生成富含气体的液体。将六十毫升这种液体吸入60ml注射器。然后通过温克勒尔滴定测量了注射器中液体的溶解氧水平。将注射器中的液体通过0.22微米Millipore Millex GP50过滤器注射进50ml烧杯中。然后测量50ml烧杯中材料的溶解氧率。进行实验三次，得到下表4中所示的结果。
表4
注射器中的溶解氧 0.22微米过滤器后的溶解氧
42.1ppm 39.7ppm
43.4ppm 42.0ppm
43.5ppm 39.5ppm
可以发现，在注射器内测得的溶解氧水平和50ml烧杯中的溶解氧水平在将扩散材料通过0.22微米过滤器后未明显变化，这意味着液体内的溶解氧的微泡不大于0.22微米。
进行了第二测试，其中将一批盐水溶液用本发明的扩散器富集，以未过滤的状态采集输出溶液的样品。未过滤样品的溶解氧水平为44.7ppm。将0.1微米过滤器用于过滤得自本发明扩散器的富氧溶液，采集了另外两个样品。对于第一个样品，溶解氧水平为43.4ppm。对于第二个样品，溶解氧水平为41.4ppm。最后，移除过滤器，从未过滤的溶液中采集最终样品。在此情况下，最终样品的溶解氧水平为45.4ppm。这些结果与使用Millipore 0.22微米过滤器的结果一致。因此，盐水溶液中大部分的气泡或微泡的尺寸约小于0.1微米。
实施例2
(对用本发明的电动力学产生的液体(RNS-60和Solas)灌注的Calu-3细胞进行的膜片钳分析表明：(i)暴露于RNS-60和Solas导致了全细胞电导的增加，(ii)细胞暴露于RNS-60使电导非线性增加，在15分钟的温育时间时很明显，以及(iii)细胞暴露于RNS-60产生了RNS-60盐水对钙渗透通道的影响)
概述。在该实施例中，进行了膜片钳研究以进一步确认本发明的电动力学产生的盐水液体(RNS-60和Solas)如本文所述的实用性，包括调节全细胞电流的实用性。进行了两组实验。
第一组实验的数据汇总表明，用Solas盐水得到的全细胞电导(电流与电压关系)对于两个温育时间(15分钟，2小时)以及对于所有电压方案均是高度线性的。然而，显然的是，用Solas较长时间温育(2小时)增加了全细胞电导。细胞暴露于RNS-60使电导非线性增加，如δ电流(Rev-Sol相减)所示，其只在15分钟的温育时间时才明显。在两小时温育时间时，RNS-60对此非线性电流的影响消失，而成为高度线性的。如之前所观察，非线性全细胞电导的贡献因素为电压敏感性的，但存在于所有电压方案下。
第二组实验的数据汇总表明，RNS-60盐水存在对非线性电流的影响，其在外部溶液中钙浓度较高时明显。非线性全细胞电导的贡献因素虽然为电压敏感性的，但在两种电压方案中均存在，并表明RNS-60盐水对钙渗透通道的影响。
第一组实验(电导增加；以及非线性电压整定电导的激活)
材料和方法：
将支气管上皮细胞系Calu-3用于膜片钳研究。让Calu-3支气管上皮细胞(ATCC#HTB-55)在Ham′s F12与补充了10％FBS的DMEM培养基的1∶1混合物中生长到盖玻片上，直至实验结束。简而言之，将全细胞电压钳制仪用于测量对暴露于本发明的电动力学产生的液体(如，RNS-60；电动力学处理过的含60ppm溶解氧的生理盐水；在本实施例中有时称为“药物”)的Calu-3细胞的影响。
将膜片钳技术用于评价测试材料(RNS-60)对上皮细胞膜极性和离子通道活性的影响。具体地讲，在由135mM NaCl、5mM KCl、1.2mMCaCl2、0.8mM MgCl2和10mM HEPES(用N-甲基-D-葡糖胺将pH调至7.4)组成的浴液中对支气管上皮细胞系Calu-3进行了全细胞电压钳分析。测量了基础电流，之后，将RNS-60灌注到细胞上。
更具体地讲，将膜片电极用双步Narishige PB-7垂直拉伸器从硼硅酸盐玻璃(Garner Glass Co，Claremont，CA)中拉出，然后用NarishigeMF-9显微控制仪(Narishige International USA，East Meadow，NY)火焰抛光到6-12兆欧的电阻。将电极用含有以物质(mM)的细胞内溶液填充：135KCl、10NaCl、5EGTA、10Hepes，将pH用NMDG(N-甲基-D-葡糖胺)调节到7.4。
将培养的Calu-3细胞放在装有以下细胞外溶液(mM)的室中：135NaCl、5KCl、1.2CaCl2、0.5MgCl2和10Hepes(游离酸)，将pH用NMDG调节到7.4。
使用Olympus 1X71显微镜(Olympus Inc.，Tokyo，Japan)的40XDIC物镜观察细胞。建立了细胞粘附的高阻封接(gigaseal)后，施加温和的抽吸以打乱并获得全细胞形态。打乱后立即将细胞在-120、-60、-40和0mV下电压钳制，并用±100mV(500ms/阶跃)之间的电压阶跃刺激。在对照条件下采集全细胞电流后，让相同的细胞通过具有测试液体(含有与上述对照液体相同的细胞外溶质和pH)的浴进行灌注，并通过相同的方案记录在不同保持电位下的全细胞电流。
电生理学数据通过Axon Patch 200B放大器获取，在10kHz下低通滤波，并用1400A Digidata(Axon Instruments，Union City，CA)数字化。将pCLAMP 10.0软件(Axon Instruments)用于获取和分析数据。电流(I)与电压(V)关系(全细胞电导)通过相对于保持电位(V)将大约400msec时的实际电流值作图到阶跃中而获得。I/V关系的斜率即为全细胞电导。
药物和化学试剂。每当指定时，均将细胞用含有8-Br-cAMP(500mM)、IBMX(异丁基-1-甲基黄嘌呤，200mM)和毛喉素(10mM)的cAMP刺激混合物进行刺激。通过25mM的H20溶液储液使用cAMP类似物8-Br-cAMP(Sigma Chem.Co.)。通过同时含有10mM毛喉素和200mM IBMX储液的DMSO溶液使用毛喉素(Sigma)和IBMX(Sigma)。将获得的数据表示为5-9个细胞的平均±SEM全细胞电流。
结果：
图1A-C显示了一系列膜片钳实验的结果，这些实验评价了电动力学产生的液体(例如RNS-60和Solas)在两个时间点(15分钟(左图)和2小时(右图))以及不同的电压方案(A，从0mV阶跃；B，从-60mV阶跃；以及C，从-120mV阶跃)下对上皮细胞膜极性和离子通道活性的影响。结果表明，RNS-60(实心圆形)对全细胞电导的影响比Solas(空心圆形)更大。在该实验中，在三个电压方案以及15分钟和两小时温育两个时间点均观察到了类似的结果。
图2A-C显示了：在三种电压方案(“δ电流”)(A，从0mV阶跃；B，从-60mV阶跃；以及C，从-120mV阶跃)和两个时间点(15分钟(空心圆形)和2小时(实心圆形))从RNS-60电流数据减去Solas电流数据得到的曲线图。这些数据表明，在用RNS-60的15分钟时间点，存在非线性电压依赖性分量，该分量在2小时时间点时不存在。
如在之前的实验中，“生理”盐水的数据给出了用作参考的非常一致且无时间依赖性的电导。本发明的结果通过将小组与Solas或RNS-60盐水进行匹配而获得，并表明在基础条件(无cAMP或任何其他刺激)下将Calu-3细胞暴露于RNS-60盐水产生了时间依赖性影响，与在较短温育时间(15分钟)下电压整定电导的激活一致。这种现象不如在两小时温育时间点时明显。如本文其他地方所述，当通过用cAMP“混合物”进行刺激而增加电导时，该线性分量更明显。尽管如此，两小时温育时间表明RNS-60和Solas盐水的线性电导均更高，并且在此情况下，与仅有Solas相比，RNS-60盐水使全细胞电导翻倍。这一证据表明全细胞电导的至少两个贡献因素受RNS-60盐水影响，即，非线性电压整定电导的激活以及线性电导，后者在较长的温育时间时更明显。
第二组实验(对钙渗透通道的影响)
第二组实验的方法：
参见上文的一般性膜片钳方法。在以下第二组实验中，进行了另外的膜片钳研究，以进一步确认本发明的电动力学产生的液体(RNS-60和Solas)调节全细胞电流的实用性，实验使用Calu-3细胞在基础条件下进行，方案从0mV或-120mV保持电位阶跃。
在每种情况下，全细胞电导均得自电流与电压关系，而该关系则得自用任一盐水温育15分钟的细胞。为了确定钙渗透通道是否对全细胞电导有贡献，以及这部分全细胞电导是否受RNS-60盐水温育的影响，将细胞在温育期(采用高NaCl的外部溶液，而内部溶液则含高KCl)后在生理盐水中钳制。然后将外部盐水用其中NaCl被CsCl替换的溶液替换，以确定通过更换主要外部阳离子是否存在电导的变化。在这些条件下，将相同的细胞暴露于提高浓度的钙，使得钙进入步骤变得更明显。
结果：
图3A-D显示了一系列膜片钳实验的结果，这些实验评价了电动力学产生的液体(例如Solas(图A和图B)以及RNS-60(图C和图D))在使用不同的外部盐溶液以及在不同的电压方案下(图A和C显示了从0mV阶跃；而图B和图D显示了从-120mV阶跃)对上皮细胞膜极性和离子通道活性的作用。在这些实验中，使用了15分钟的一个时间点。对于Solas(图A和B)，结果表明：1)使用CsCl(方形符号)而不是NaCl作为外部溶液当与对照(菱形符号)相比时增加了全细胞电导，并具有线性行为；以及2)CaCl2在20mM CaCl2(圆形符号)和40mM CaCl2(三角形符号)两种浓度下均以非线性方式增加了全细胞电导。对于RNS-60(图C和D)，结果表明：1)使用CsCl(方形符号)而不是NaCl作为外部溶液当与对照(菱形符号)相比时对全细胞电导的作用甚微；以及2)CaCl2在40mM(三角形符号)下以非线性方式增加了全细胞电导。
图4A-D显示了：Solas(图A和B)和RNS-60(图C和D)在两种电压方案(图A和图C从0mV阶跃；图B和图D从-120mV阶跃)下从20mM CaCl2(菱形符号)和40mM CaCl2(方形符号)电流数据减去CsCl电流数据(图3所示)得到的曲线图。结果表明，Solas和RNS-60溶液均激活了钙诱导的非线性全细胞电导。使用RNS-60时影响更大(表明存在剂量反应关系)，而使用RNS-60时仅在较高的钙浓度下才使影响增加。此外，在较高钙浓度下的非线性钙依赖性电导也通过电压方案增加。
第二组实验的数据进一步表明了RNS-60盐水和Solas盐水对在Calu-3细胞中获得的全细胞电导数据的影响。数据表明，任一盐水15分钟的温育均对全细胞电导产生了明显的影响，在使用RNS-60时以及增加外部钙时最明显，并且进一步表明RNS-60盐水增加了全细胞电导的钙依赖性非线性分量。
积累的证据表明Revalesio盐水对离子通道的激活，其对基础细胞电导产生不同的贡献。
与申请人的其他数据(如，申请人其他工作实施例的数据)合在一起，本发明的特定方面提供调节细胞内信号转导的组合物和方法，包括调节以下至少一者：膜结构、膜电位或膜电导率、膜蛋白或受体、离子通道、脂质成分或细胞可交换的细胞内成分(如，信号通路，诸如钙依赖性细胞信号系统，包括使用本发明的电动力学产生的溶液赋予膜结构(如，膜和/或膜蛋白、受体或其他膜成分)的电化学和/或构象变化)，包括但不限于GPCR和/或g蛋白。根据另外的方面，这些影响将调节基因表达，并可例如根据各信息传递成分的半衰期等因素而持续存在。
实施例3
(本发明的电动力学液体表明在本领域公认的多发性硬化(MS)的急性实验性过敏性(自身免疫)脑脊髓炎(EAE)大鼠MBP模型中以剂量反应性方式明显有效)
概述：
在该工作实施例中，在本领域公认的髓磷脂碱性蛋白MBP诱导的急性实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型中，以两个剂量在预防性和治疗性施用两个方案中评价了本发明的电动力学液体RNS-60。本发明的电动力学液体RNS-60表明以剂量反应性方式明显有效。治疗性(与MBP注射一起开始每日施用RNS-60)和预防性(从MBP注射前七天开始每日施用RNS-60)RNS-60剂量方案均表现出临床评分的显著降低以及延迟发作(在高剂量组中)。因此，根据本发明的特定方面，本发明的电动力学组合物对于治疗(包括缓解和防止)本领域公认的人MS大鼠模型中的EAE症状具有明显的效用。因此，根据本发明进一步的方面，本发明的电动力学组合物对于治疗(包括缓解和防止)受累哺乳动物(优选人)中的MS症状具有明显的效用。在进一步的方面，本发明的电动力学组合物跨过血脑屏障(BBB)，并因此提供治疗中枢神经系统炎性病症的新方法。
多发性硬化(MS)。多发性硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘疾病，是青壮年中最常见的失能神经疾病之一。该疾病的主要特征是脱髓鞘和炎症病灶区域。病程不可预知并会伴随终生，与男性相比，在女性中更常见。疾病的病因似乎依赖于遗传和环境因素。在外周，抗原通过MCH II被抗原呈递细胞(APC)结合。Th0细胞结合到抗原并发生激活和分化。粘附分子和基质金属蛋白酶(MMP)有助于Th1细胞结合并渗透血脑屏障(BBB)。跨过BBB进入CNS后，Th1细胞接合抗原-MHC复合物，并产生促炎性细胞因子，从而导致CNS损伤。自身免疫系统将髓磷脂蛋白视为外源物，并开始攻击。以历史观点，虽然Th1细胞被视为在疾病病理中发挥着主导作用，但是最近的证据表明Th17细胞、IL-6和TGF-β的促炎性级联反应在EAE和MS的发病中起着关键作用。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)也称为实验性过敏性脑脊髓炎，是多发性硬化(MS)的非人类动物模型。虽然并不是MS，但EAE的不同形式和阶段与MS的各种形式和阶段以许多方式密切相似。更具体地讲，EAE是一种急性或慢性复发性、获得性、炎性及脱髓鞘自身免疫疾病。向动物注射构成髓磷脂(围绕神经细胞(神经元)的绝缘鞘)的各种蛋白(如，髓磷脂碱性蛋白(MBP)、蛋白脂质蛋白(PLP)和髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG))的全部或一部分，以诱导与人类MS密切相似的针对动物自身髓磷脂的自身免疫应答。EAE已在许多不同的动物物种中诱导，包括小鼠、大鼠、豚鼠、兔、恒河猴、猕猴和狨猴。出于各种原因，包括免疫工具的数量，动物的可获性、生命周期和繁殖力，以及诱导疾病与MS的相似性，小鼠和大鼠是最常用的物种。急性大鼠EAE模型具有强炎性成分，因此是研究靶向MS中的免疫事件的药剂的治疗潜能的合适模型。
MBP诱导的EAE。Lewis大鼠中一剂量MPB后将导致主要特征在于后爪瘫痪的复发。在第0天，让Lewis大鼠接受MBP注射。疾病在第12-16天之间发生，而疾病完全恢复则在第18-21天之间。该模型为自我限制性的，不会减缓脱髓鞘。
材料和方法：
产生并表征测试液体(RNS-60)。除菌过滤的RNS-60由申请人根据US2008/0219088(2008年9月11日公布)、US2008/0281001(2008年11月11日公布)和WO2008/052143(2008年5月2日公布)中所述的方法制得，所有这些专利全文以引用方式并入本文，尤其是针对与制备申请人的发明电动力学液体的设备和/或方法相关的所有方面。所用的RNS-60的溶解氧(DO)含量为59ppm，如通过Winkler滴定分析(Y.C.Wong&C.T.Wong.New Way Chemistry for Hong KongA-Level Volume 4，Page 248.或Standard Methods for the Examinationof Water and Wastewater-20th Edition ISBN 0-87553-235-7)进行测定。将RNS-60液体标上测试项目(TI)编号、收到日期、储存条件和有效期。RNS-60的储存条件和处理根据申请人的说明书进行，以确保在测试机构测试期间的稳定性。液体不使用时保持在2-8℃冷藏。装液体的小瓶作为一次性容器使用。
载体对照液体。载体对照液体为得自Hospira的注射用生理盐水(0.9％)。
地塞米松。地塞米松购自Sigma(目录号D1756；批号096K1805)。对于施用，将地塞米松(白色粉末)在乙醇中稀释，达到1mg/ml的浓度，然后再次在蒸馏水中稀释，达到0.1mg/ml的剂量浓度。
EAE诱导项目：
MBP抗原剂。MBP为得自豚鼠的髓磷脂碱性蛋白(Des-Gly-77，Des-His-78)-MBP(68-84)；目录号H-6875；MD Bioscience提供)。将MBP以2mg/ml的浓度溶于生理盐水；
CFA增敏剂。完全弗氏佐剂(CFA)得自MD Biosciences Division ofMorwell Diagnostics GmbH(目录号IMAD-4)。将含有4mg/ml浓度的热杀死分枝杆菌H37Ra的CFA悬浮液按供货状态使用；以及
MBP/CFA乳液(抗原/增敏剂)。在研究第0天进行的单次接种前，采用通过鲁尔接头连接的两只注射器将一体积的MBP溶液与等体积的CFA4mg/ml混合，以彻底混合乳状混合物，得到100μl/动物的总剂量体积。将该剂量以2x50μl皮下(SC)双侧注射递送到爪子足底区域。
测试动物：大鼠。六十(60)只雌性Lewis大鼠(研究开始时为6-7周龄)得自Harlan Laboratories Israel，Ltd。在处理开始时动物的体重差异不应超过平均体重的20％。在送达时，检查用于研究中的动物的健康状况。只让健康状况良好的动物适应实验室条件及用于研究。在进入研究前，让动物适应至少5天。在适应期间以及整个研究过程中，将动物关在进入受限的啮齿动物房间中并以最多5只大鼠为一组关在聚丙烯笼中，笼底坚实，笼中装有木屑作为垫料。为动物随意提供商品啮齿动物饲料，并让动物自由饮水，水通过具有不锈钢饮管的聚丙烯瓶供往每只笼中。研究所用的饲料的批次分析也与研究数据一起包括在档案中。定期监控饮水。将自动控制的环境条件设定为维持研究房间中20-24℃的温度，30-70％的相对湿度(RH)，12：12小时的光照：黑暗循环，以及15-30次换气/小时。每日监控温度和RH。通过控制时钟监控光照循环。使用尾标记为动物提供唯一的标识。此编号也出现在每只笼前可见的笼牌上。笼牌还包括研究和组编号、施用途径、雌雄性、品系以及对于处理组的其他相关详细信息。
表5.测试组和剂量水平的构成，列出了组成研究的6个实验组：
Figure BDA00002659551900781
Figure BDA00002659551900791
急性EAE鼠模型的测试程序及原理。实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)是中枢神经系统(CNS)自身免疫脱髓鞘疾病，其模拟多发性硬化(MS)的许多临床和病理特征。急性大鼠模型包括致敏期，其由在研究第0天单次皮下(SC)注射在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的髓磷脂碱性蛋白(MBP)而诱导。
EAE诱导和处理方案的示意图在图6)中示出。
EAE诱导：
MBP/CFA。如图6)中的示意图所示，所有动物在研究第0天(研究开始)时接受单次接种注射，其由MBP和CFA的均匀乳状混合物组成(将MBP/CFA致脑炎乳状接种物(100μg MBP/200μg CFA)以100μl/动物的总剂量体积注射，作为2x50μl皮下(SC)双侧注射递送到爪子足底区域)。
处理：
处理方案和程序。所有化合物均由不同于对动物评分的人每天现制。对动物评分的人收到只标有组编号的小瓶，并且不知道处理情况。
施用途径：(i)RNS-60(IV)；(ii)载体对照(IV)；以及(iii)阳性对照(IP)。
剂量水平和体积剂量：(i)RNS-60：低剂量2ml用于350g；高剂量4ml用于350g；(ii)载体对照0；以及(iii)阳性对照(地塞米松)：1mg/kg。
支持性护理。除非在研究过程中确定，一旦预计和/或观察到EAE实验作用后(大约在单次致脑炎接种后8-12天)或当动物表现出相对于之前的测定值体重降低大于15％或相对于最初体重测量值降低大于20％时，逐例实施合适的支持性护理。
喂食喂水。将由浸泡在饮用水中的碎粒或粉状啮齿动物饲料组成的另外水源放在笼底的爬行/不活动动物前。
脱水。动物可接受使用5％葡萄糖溶液的皮下(SC)补液治疗，每天至少两次，最多2ml/动物/天，直到体重回到初始测定值的10％内。
排尿。触按动物腹部腔，以便帮助排尿并观察动物能否排空膀胱。
其他特殊护理。根据需要，用润湿的纱布垫清理动物肛周和后腿。
观察和检查：
临床体征。在整个21天的研究中，除了EAE临床评分和评估(见下)外，还进行了仔细的临床检查并每日记录至少一次。观察包括以下方面的变化：皮肤、毛皮、眼睛、粘膜、分泌与排泄(如，痢疾)和自主活动(如，流泪、流涎、立毛、瞳孔大小、异常呼吸模式)发生情况、步态、姿势和对处理的反应以及异常行为、颤抖、抽搐、睡眠和昏迷的存在。
体重。体重减轻可以是起病的第一体征，而突然明显的体重增加则往往伴随EAE症状的缓解。因此，在研究第0天(研究开始)的EAE诱导前不久测定动物的个体体重，之后在整个21天的观察期每日测定一次。
EAE临床评分和评估。最初，在EAE诱导前(研究第0天)检查所有动物的任何神经反应和症状的体征，之后在整个21天的观察期每日检查一次。为了避免实验偏差，由不知道所采用的具体处理的人员尽可能以盲性方式确定EAE反应。对EAE反应根据经典的、本领域公认的常规0-5分值(严重性按升序排列，如下表6所示)进行评分并记录：
表6.对EAE反应根据经典的、本领域公认的常规0-5分值(严重性按升序排列)进行评分并记录。
Figure BDA00002659551900811
血样。在研究终止当天(第21天)，在注射后1小时抽取所有动物血样。在研究第0天(仅预防性组)、第7天、第14天和第21天采样。将血浆采集在肝素化小瓶中并保持在-20℃。储存300μl体积用于血细胞计数分析，储存100μl用于通过Luminex技术的进一步细胞因子分析。分析第0天、第7天、第14天和第21天的血细胞计数。
组织采集。在研究终止时，对动物灌注4％PFA。采集大脑和脊髓，并保持在4％PFA中。
人道终点。对发现处于濒死状态的动物和/或表现出剧痛和持续遭受痛苦体征的动物进行人道安乐死。
统计/数据评价：
评价主要基于神经症状和体重的相对记录变化，其表示为在所有处理组中获得的绝对值、百分比(％)变化以及组平均值与载体对照的相应值。采用通过合适统计方法进行的数据分析确定处理作用的显著性。
动物护理及使用情况说明：
本研究在提交给相应的实验动物护理和使用伦理委员会的申请表得到批准后进行，研究符合所述的规章制度。
结果
研究结果如图5所示，其中时间(MBP注射后的天数)在X轴上示出，“临床评分”(参见上文“材料和方法”项下)在Y轴上显示。
图5显示了本发明的电动力学液体(RHS-60)在本领域公认的多发性硬化(MS)实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型中明显有效(参见上文“材料和方法”项下)。
具体地讲，与载体对照组(实心菱形)相比，在为期17天中，治疗性(与MBP注射一起开始每日施用RNS-60)和预防性(从MBP注射前七天开始每日施用RNS-60)RNS-60剂量方案均显示出临床评分的显著降低以及延迟发作(在高剂量组中)。
低剂量(每日1cc注射)RNS-60治疗组的临床评分约为载体对照组的二分之一(1/2)，而高剂量(每日2cc注射)RNS-60治疗组的临床评分不仅是载体对照组的大约五分之一(1/5)至十分之一(1/10)，还显示出发作延迟。
低剂量(每日1cc注射)RNS-60预防组的临床评分约为载体对照组的三分之一(1/3)，而高剂量(每日2cc注射)RNS-60预防组的临床评分不仅在前16天中为0(无可测的临床评分)从而显示出明显的发作延迟，而且当在第17天可观察到时，也低于相同时间点载体对照组的十分之一(1/10)。
因此，根据本发明的特定方面，本发明的电动力学组合物对于治疗(包括缓解和防止)本领域公认的人MS大鼠模型中的EAE症状具有明显的效用。
实施例4
(本发明的电动力学液体表明在本领域公认的多发性硬化(MS)的急性实验性过敏性(自身免疫)脑脊髓炎(EAE)大鼠MBP模型中对维持大鼠体重有效)
概述：
本工作实施例公开了接受实施例7中所述的实验的大鼠的体重变化。体重减轻可以是起病的第一体征，而突然明显的体重增加则往往伴随EAE症状的缓解。因此，在研究第0天(研究开始)的EAE诱导前不久测定动物的个体体重，之后在整个21天的观察期每日测定一次。本发明的电动力学液体RNS-60对体重的作用表明对维持接受EAE大鼠模型的大鼠体重有效(图7)。
体重数据：
图7显示了以克为单位的体重(图A)以及基于100克的百分比(图B)。在此实施例处理的动物中平均体重略微降低后，平均体重开始增加直到研究终止。在研究终止时，载体处理动物(1F组)中的平均体重增加值为20％。在整个研究中，在研究第0天开始施用的地塞米松处理组(2F组)在研究期间具有10％的平均体重减轻。在研究终止时，地塞米松处理动物的平均体重减轻2％。预防性低剂量处理组(3F组)显示出在研究第1-3天高达4％的平均体重减轻，而后在研究终止当天增加了23％的平均体重。预防性高剂量处理组(4F组)显示出在研究第1-3天高达5％的平均体重减轻，而后在研究终止当天增加了28％的平均体重。治疗性低剂量处理组(5F组)显示出在研究第1-3天高达4％的平均体重减轻，而后在研究终止当天增加了21％的平均体重。治疗性高剂量处理组(6F组)显示出在研究第1-3天高达4％的平均体重减轻，而后在研究终止当天增加了19％的平均体重。
因此，据发现本发明的电动力学液体RNS-60对维持接受EAE大鼠模型的大鼠体重有效。
因此，根据本发明的特定方面，本发明的电动力学组合物对于治疗(包括缓解和防止)本领域公认的人MS大鼠模型中的EAE症状具有明显的效用。
实施例5
(在从接受本领域公认的多发性硬化(MS)的急性实验性过敏性(自身免疫)脑脊髓炎(EAE)大鼠MBP模型的大鼠采集的血样中，本发明的电动力学液体表明对白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞水平的影响甚微)
概述：
本工作实施例公开了在如实施例7所述的实验期间从大鼠采集的血样中白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的水平。为了确定细胞因子水平的变化是否是由于白细胞的总体变化所致，申请人从接受EAE实验的大鼠在整个实验中采集了血样。
白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的水平：
图8A-D显示了在整个EAE实验中采集的血样中的白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的水平。
在研究第0天(图A)、第7天(图B)、第14天(图C)和第21天(图D)施用测试项目后一小时对白细胞(WBC)、中性粒细胞和淋巴细胞进行了计数。在研究第7天用载体处理动物后一小时的最大WBC计数为8.23±0.36点。用地塞米松处理与载体相比明显降低了平均WBC计数，达到了2.46±0.38点(p＜0.05)。低剂量(5F组)测试项目治疗性处理与载体相比明显增加了平均WBC计数，达到了9.59±0.46点(p＜0.1)。高剂量(6F组)测试项目治疗性处理与载体相比明显增加了平均WBC计数，达到了10.84±0.88点(p＜0.05)。
在研究第14天用载体处理动物后一小时的最大WBC计数为6.34±0.28点。用地塞米松处理与载体相比明显降低了平均WBC计数，达到了3.79±0.69点(p＜0.05)。高剂量(4F组)测试项目预防性处理与载体相比明显增加了平均WBC计数，达到了7.83±0.51点(p＜0.05)。低剂量(5F组)测试项目治疗性处理与载体相比明显增加了平均WBC计数，达到了7.65±0.52点(p＜0.05)。高剂量(6F组)测试项目治疗性处理与载体相比明显增加了平均WBC计数，达到了8.05±0.43点(p＜0.05)。在研究第21天用载体处理动物后一小时的最大WBC计数为9.09±0.75点。用地塞米松处理与载体相比明显降低了平均WBC计数，达到了5.12±0.57点(p＜0.05)。
在研究第7天用载体处理动物后一小时的最大中性粒细胞计数为26.20±1.62点。用地塞米松处理与载体相比明显增加了平均中性粒细胞计数，达到了65.38±4.62点(p＜0.05)。高剂量(4F组)测试项目预防性处理与载体相比明显增加了平均中性粒细胞计数，达到了31.90±0.96点(p＜0.05)。高剂量(6F组)测试项目治疗性处理与载体相比明显增加了平均中性粒细胞计数，达到了33.90±2.79点(p＜0.05)。
在研究第14天用载体处理动物后一小时的最大中性粒细胞计数为33.00±2.58点。用地塞米松处理与载体相比明显增加了平均中性粒细胞计数，达到了73.10±3.15点(p＜0.05)。
在研究第21天用载体处理动物后一小时的最大中性粒细胞计数为41.40±2.32点。用地塞米松处理与载体相比明显增加了平均中性粒细胞计数，达到了89.33±1.97点(p＜0.05)。高剂量(6F组)测试项目治疗性处理与载体相比明显增加了平均中性粒细胞计数，达到了34.60±3.08点(p＜0.1)。
在研究第7天用载体处理动物后一小时的最大淋巴细胞计数为73.20±1.95点。用地塞米松处理与载体相比明显降低了平均淋巴细胞计数，达到了30.63±1.31点(p＜0.05)。高剂量(4F组)测试项目预防性处理与载体相比明显降低了平均淋巴细胞计数，达到了68.30±1.42点(p＜0.1)。高剂量(6F组)测试项目治疗性处理与载体相比明显降低了平均淋巴细胞计数，达到了64.80±3.00点(p＜0.05)。
在研究第14天用载体处理动物后一小时的最大淋巴细胞计数为66.10±2.53点。用地塞米松处理与载体相比明显降低了平均淋巴细胞计数，达到了26.80±3.23点(p＜0.05)。
在研究第21天用载体处理动物后一小时的最大淋巴细胞计数为57.50±2.09点。用地塞米松处理与载体相比明显降低了平均淋巴细胞计数，达到了10.11±2.08点(p＜0.05)。高剂量(6F组)测试项目治疗性处理与载体相比明显增加了平均淋巴细胞计数，达到了66.20±2.74点(p＜0.05)。
因此，以高剂量预防性和治疗性施用的本发明的电动力学液体RNS-60与载体相比在研究第7天明显增加了中性粒细胞计数且明显降低了淋巴细胞计数。以高剂量预防性施用的以及以两种剂量治疗性施用的本发明的电动力学液体RNS-60与载体相比在研究第14天明显增加了WBC计数。以高剂量治疗性施用的测试项目RNS60与载体相比在研究第21天明显降低了中性粒细胞计数且增加了淋巴细胞计数。因此，据发现本发明的电动力学液体RNS-60对WBC、中性粒细胞和淋巴细胞总体水平的影响甚微。
实施例6
(在从接受本领域公认的多发性硬化(MS)的急性实验性过敏性(自身免疫)脑脊髓炎(EAE)大鼠MBP模型的大鼠采集的血样中，本发明的电动力学液体表明对某些细胞因子的水平有影响)
概述：
本工作实施例公开了在如实施例7所述的实验期间从大鼠采集的血样中发现的细胞因子水平。如实施例7中所述，在治疗性施用方案中评价了本发明的电动力学液体RNS-60。本发明的电动力学液体RNS-60表明会影响从接受EAE大鼠模型的大鼠采集的血样中的某些细胞因子的水平。
已表明，某些细胞因子对多发性硬化起着作用。具体地讲，已证实，也称为CTLA-8或IL-17A的白介素17(IL-17)在急性和慢性EAE中在中枢神经系统中的水平升高(Hofstetter，H.H.，等，Cellular Immunology(2005)，237：123-130)。IL-17是一种促炎性细胞因子，其刺激多种非免疫细胞分泌多种多样的其他细胞因子。IL-17能够诱导贴壁细胞如成纤维细胞、角质细胞、上皮和内皮细胞分泌IL-6、IL-8、PGE2、MCP-1和G-CSF，并且能够诱导ICAM-1表面表达、T细胞增殖，以及在辐射成纤维细胞存在下共培养时诱导CD34+人祖细胞生长并分化成中性粒细胞(Fossiez等，1998，Int.Rev.Immunol.16，541-551)。IL-17主要由激活的记忆T细胞产生，并通过结合到广泛分布的细胞表面受体(IL-17R)而发挥作用(Yao等，1997，Cytokine，9，794-800)。已鉴定出在调节炎性反应中同时具有相似和不同作用的多种IL-17同系物。对于IL-17细胞因子/受体家族的综述，参见Dumont，2003，Expert Opin.Ther.Patents，13，287-303。
IL-17可促使多种由异常免疫应答介导的疾病，诸如类风湿性关节炎和气道炎症以及器官移植排斥和抗肿瘤免疫。IL-17活性的抑制剂在本领域是熟知的，例如将IL-17R:Fc融合蛋白用于证实IL-17在胶原诱导型关节炎中的作用(Lubberts等，J.Immunol.2001，167，1004-1013)，以及将中和性多克隆抗体用于减少腹膜粘连形成(Chung等，2002，J.Exp.Med.，195，1471-1478)。中和性单克隆抗体可商购获得(R&D Systems UK)。
因此，基于IL-17在MS发病中的作用，申请人研究了本发明的电动力学液体RNS-60对从EAE研究中的大鼠采集的血样中IL-17水平的影响。
细胞因子数据：
在研究期间分析了血液中的多种细胞因子的水平。简而言之，在注射后1小时采集所有动物的血样，将血浆采集中肝素化小瓶中。通过Luminex技术分析了100μl样品的多种炎性细胞因子(使用得自Panomics的Procarta大鼠细胞因子测定试剂盒PC4127)，这种技术能同时测量同一样品中的多种细胞因子。由于非高斯分布数据以及偶尔的结果在测定检测阈值之下，采用截尾数据的非参数Cox回归模型来比较不同的液体。如图9A-H中所示，IL1a、IL1b和IL17的水平通过RNS60的两个治疗性处理剂量(高和低)得到了最明显降低。MBP诱导型EAE的临床表现在第10天左右开始出现，并在第18天左右达到峰值。因此，我们认为第7天(正好在疾病表现前)和第18天(大约为疾病峰值)是细胞因子分析最重要的时间点。在第7天和第18天的IL1a、IL1b和IL17的全身性水平(得自10只动物/组)展示在图9A-H中。...
IL-1是主要的促炎性细胞因子之一，并为先天免疫应答的上游调节因子。IL-1直接和间接地以及使用正反馈循环诱导多种生长和营养因子、炎症介质、粘附分子以及其他细胞因子的产生(A.Basu等，Thetype 1interleukin-1receptor is essential for the efficient activation ofmicroglia and the induction of multiple proinflammatory mediators inresponse to brain injury，J.Neurosci.22(2002)，pp.6071-6082；P.N.Moynagh，The interleukin-1signaling pathway in astrocytes：a keycontributor to inflammation in the brain，J.Anat.207(2005)，pp.265-269)。这些包括重要的调节因子，诸如NGF、ICAM 1、IL6、TNFα、CSF等。MS的进展涉及外周中自体抗原反应性T细胞的激活，然后侵入CNS。IL-1在MS的发展中至关重要，因为它们不仅参与髓磷脂特异性T细胞激活，还代表了外周中巨噬细胞激活的主要调节因子[R.Furlan等，HSV-1-mediated IL-1receptor antagonist gene therapyameliorates MOG(35-55)-induced experimental autoimmuneencephalomyelitis in C57BL/6mice，Gene Ther.14(2007)，pp.93-98))。在MS的EAE模型中，已表明IL-1α和IL-1β均为炎性过程的调节因子。IL-1β的外周水平与临床过程相关，并且已在EAE期间在CNS浸润性巨噬细胞和常驻型小胶质细胞中证实了IL-1β反应性((C.A.Jacobs等，Experimental autoimmune encephalomyelitis is exacerbatedby IL-1alpha and suppressed by soluble IL-1receptor，J.Immunol.146(1991)，pp.2983-2989))。因此，IL-1是EAE和MS中的合适治疗靶标。已在MS的现有治疗剂中证实了IL-1的非选择性抑制机制；即干扰素β、抗炎糖皮质激素、免疫抑制剂、阿托伐他汀和ω-3多不饱和脂肪酸[F.L.Sciacca等，Induction of IL-1receptor antagonist byinterferon beta：implication for the treatment of multiple sclerosis，J.Neurovirol.6(Suppl.2)(2000)，pp.S33-S37；R.Pannu等，Attenuationof acute inflammatory response by atorvastatin after spinal cord injury inrats，J.Neurosci.Res.79(2005)，pp.340-350；A.P.Simopoulos，Omega-3fatty acids in inflammation and autoimmune diseases，J.Am.Coll.Nutr.21(2002)，pp.495-505))。如图9C-F所示，IV施用RNS60有效降低了IL1α和IL1β两者的全身性水平。对于IL1α，RNS60处理与载体处理组相比明显降低了血液水平，以及在此时间点与地塞米松一样有效。然而，在第18天时间点，该处理对IL1α全身性水平无明影响。IL1β的全身性水平在RNS60IV处理7天后也明显降低，达到相当于地塞米松处理组的水平，而无任何惰性副作用的迹象。虽然在第18天时间点观察到了相同的趋势，但是当与对照组相比时，差异无统计学显著性。IL-17也是一种至关重要的效应细胞因子，具有强效的促炎性作用。其降低其他促炎性细胞因子(诸如肿瘤坏死因子-α和趋化因子)的表达、吸引中性粒细胞以及增强树突状细胞的成熟(KollsJK，Linden A.Interleukin-17family members and inflammation.Immunity.2004Oct；21(4)：467-76)。据认为，产IL-17的细胞是自身免疫疾病诸如胶原诱导型关节炎、结肠炎、牛皮癣和EAE中必不可少的炎症介质。EAE中的Th17细胞为CD4+细胞，它们同时存在于EAE的免疫外周和发炎中枢神经系统中。此外，IL-17的中和可缓解临床疾病，这一发现与IL-17缺陷型动物中EAE严重性减轻一致(Gold andLühder，Interleukin-17-Extended Features of a Key Player in MultipleSclerosis Am J Pathol.2008January；172(1)：8-10.)。7天RNS60IV处理导致了血液中IL17水平的明显降低，再次达到了与地塞米松处理动物相似的水平。即使在18天的处理后也观察到了相同的情况，但结果无统计意义上的显著性。值得注意到是，RNS60不仅对降低IL1水平有效，还对降低EAE中的两种关键细胞因子(IL1和IL17)的组合有效，而甚至在21天的IV注射后也无明显的毒性副作用。
除了IL1和IL17外，许多在神经系统炎症中发挥关键作用的其他分子也受RIS60调节。这些包括Rantes、KC、NGF和ICAM(未示出数据)。
因此，本发明的电动力学液体RNS-60对从EAE研究中的大鼠采集的血样中的IL-17水平有显著影响。此外，由于IL-17会刺激IL-6、IL-8、PGE2、MCP-1和G-CSF的分泌，因此看来本发明的电动力学液体RNS-60可能对血液中这些细胞因子的水平有显著影响。因此，根据本发明的特定方面，本发明的电动力学组合物对于治疗(包括缓解和防止)本领域公认的人MS大鼠模型中的EAE症状具有明显的效用。
实施例7
(本发明的电动力学液体(如RNS60)表明以剂量依赖性方式抑制小胶质细胞中iNOS和IL-1β两者的表达)
概述：
根据本文所述的特定方面，本发明的电动力学液体对于治疗帕金森病(PD)具有明显的效用。
帕金森病(PD)是人类中最具摧毁性的神经变性疾病之一。PD可在任何年龄出现，但在30岁以下的人群中不常见。在临床上，PD的特征在于震颤、运动迟缓、僵直和姿势不稳定。在病理学上，其由黑质致密部(SNpc)中与细胞质内包涵体(Lewy体)的存在相关的胶质增生和多巴胺能神经元进行性变性所指示。在死后PD大脑中，据报告，垂死神经元显示出细胞凋亡的形态特征，包括细胞萎缩、染色质凝聚和DNA片断化。因此，开发阻止疾病进展的有效的神经保护治疗方法具有非常重要的意义。MPTP小鼠模型对于测试和验证针对PD的治疗方法具有明显的效用。
小胶质细胞激活在帕金森病(PD)以及其他神经变性疾病的发病中起着重要的作用。将PD的特定特征在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)中毒的动物中建模。MPTP的神经毒作用取决于其转化成MPP+。在胶质细胞中，单胺氧化酶B(MAO-B)将MPTP转化成MPP+，其随后激活胶质细胞，并且最近以来，已表明MPP+会诱导小胶质细胞中促炎性分子的表达。此外，MPP+可导致多巴胺能神经元的凋亡。
在本工作实施例中，确认了RNS60调节MPP+刺激的小胶质细胞中促炎性分子的表达的能力。
材料和方法：
简而言之，在无血清条件下将小鼠BV-2小胶质细胞用不同浓度的RNS60和生理盐水(NS)温育1小时然后用2μM MPP+刺激。6小时后，分离总RNA，并通过半定量RT-PCR测量了iNOS和IL-1β的mRNA。数据代表了三个独立的实验。
结果：
如图10中的半定量RT-PCR分析所证实，单独的MPP+诱导了小鼠BV-2小胶质细胞中的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和白介素-1β(IL-1β)mRNA。明显地，RNS60以剂量依赖性方式抑制了小胶质细胞中iNOS和IL-1β两者的表达(图10)。相比之下，在相似的实验条件下，生理盐水对照(NS)对这两种促炎性基因的表达无影响(图10)，从而表明该影响的特异性。
具体地讲，图10显示了本发明的电动力学液体(RNS-60)但非对照生理盐水(NS)减弱了MPP+诱导的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及白介素1β(IL-1β)在小鼠小胶质细胞中的表达。将在无血清培养基中用不同浓度的RNS60和生理盐水(NS)预温育1h的BV-2小胶质细胞用MPP+(帕金森毒素)刺激。6h的刺激后，分离总RNA，并通过半定量RT-PCR分析了iNOS和IL-1β的mRNA表达。结果代表三个独立的实验。
因此根据特定的方面，由于MPP+是帕金森毒素，这些结果表明RNS60在本领域公认的帕金森病的MPTP诱导型小鼠模型中具有保护作用。
根据特定的方面，本发明的电动力学液体对于治疗帕金森病(PD)具有明显的效用。
实施例8
(本发明的电动力学液体(如RNS60)表明可使神经细胞和原代人神经元避免β淀粉样蛋白毒性)
概述：
根据本文所述的特定方面，本发明的电动力学液体对于治疗阿尔茨海默病(AD)具有明显的效用。
阿尔茨海默病(AD)是一种导致进行性神经元死亡和记忆丧失的神经变性疾病。死后AD大脑中增强的TUNEL染色表明AD患者大脑中的神经元通过细胞凋亡而死亡。纤维状β淀粉样蛋白参与AD的病理生理作用。在神经病理学上，该疾病的特征在于神经原纤维缠结以及由β淀粉样(Aβ)蛋白(衍生自淀粉样前体蛋白的40-43个氨基酸的蛋白水解片段)的聚集体和磷酸化tau组成的神经炎性斑块。已发现，在转基因小鼠中细胞内Aβ肽的过表达会导致染色质分割、凝聚以及TUNEL染色增强。细胞培养研究也表明Aβ肽对神经元细胞具有凋亡和毒害作用，并且已表明纤维状Aβ1-42肽能够诱导神经元细胞中的凋亡。
另外，研究目标正日渐面向表征炎症与AD之间的联系，并且在斑块和缠结周围发现了广泛的胶质激活。
在本实施例中，确认了在人SHSY5Y神经细胞和原代人神经元中RNS60阻断Aβ(1-42)诱导的凋亡的作用。
材料和方法：
使用从Calbiochem商购获得的试剂盒(TdT FragELTM)，通过响应纤维状Aβ1-42生成的DNA片段的3′-OH端的末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)介导的结合，原位检测了SHS5Y人神经元细胞的片段化DNA。简而言之，在TdT染色前，将盖玻片在室温下用20μg/ml蛋白酶K处理15分钟，并洗涤。如之前所述(1，2)分离神经元并培养。
结果：
如图11A和B所示，纤维状Aβ1-42肽明显诱导了神经元细胞中凋亡小体的形成。我们还观察到Aβ1-42处理后神经元加工的丧失(图11A第2行)。相比之下，反向肽Aβ42-1未能诱导神经元凋亡和加工丧失(图11A第3行)。明显地，不同测试剂量的RNS60明显阻断了Aβ(1-42)诱导的细胞凋亡并保持了神经元细胞中的加工(图11A和B，第4、5和6行)。相比之下，生理盐水对照液体(NS)对Aβ(1-42)诱导的细胞凋亡和加工丧失无影响(图11A第7和8行)。
具体地讲，图11A显示了RNS60但非生理盐水对照(NS)抑制了人SHSY5Y神经元细胞的纤维状Aβ(1-42)介导的凋亡。分化后，将SHSY5Y细胞用不同浓度的RNS60或NS温育1小时，然后用1μM纤维状Aβ(1-42)肽损伤。18小时的处理后，通过TUNEL(Calbiochem)监测细胞凋亡。还作为对照温育了Aβ(42-1)肽。结果代表三个独立的实验。
此外，图11B第2和3行显示了RNS60抑制了原代人神经元的纤维状Aβ(1-42)介导的凋亡。将神经元用RNS60温育1小时，然后用1μM纤维状Aβ(1-42)肽损伤。18小时的处理后，通过TUNEL(Calbiochem)监测细胞凋亡。还作为对照温育了Aβ(42-1)肽。结果代表三个独立的实验。
这些结果表明AD的病因试剂(纤维状Aβ1-42)可通过RNS60敏感性通路诱导神经元凋亡，以及表明RNS60可强烈抑制培养的和原代神经元两者中纤维状诱导的凋亡。
根据特定的方面，本发明的电动力学液体对于治疗阿尔茨海默病(AD)并在优选的方面防止或减缓AD进展具有明显的效用。
实施例9
(本发明的电动力学液体表明在本领域公认的多发性硬化(MS)的小鼠MOG模型中以剂量反应性方式抑制临床评分明显有效)
概述：
在本工作实施例中，在本领域公认的多发性硬化(MS)的实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)小鼠MOG模型中以两个剂量在治疗性施用方案中评价了本发明的电动力学液体RNS-60。
材料和方法：
实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)是中枢神经系统(CNS)自身免疫脱髓鞘疾病，其模拟多发性硬化(MS)的许多临床和病理特征。MOG鼠模型包括致敏期，其通过以下方式诱导：在研究第0天单次皮下(SC)注射在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的MOG(200μg MOG/300μg CFA，总注射剂量体积为200μl/动物，以腰旁区域的2X100μl皮下双侧注射而施用)；然后，在研究第0天进行EAE诱导时用20μg/kg(大约400ng/小鼠)的百日咳毒素(PT)通过腹膜内(IP)注射而腹膜内(IP)补充免疫刺激，并在研究第2天后的48小时再次注射(Gilgun-Sherki Y.等，Neurosciences Research 47：201-207，2003)。然后如图12所指示，对动物进行RNS60IV灌注处理。所用的动物为得自Harlan LaboratoriesIsrael，Ltd.的年轻成年雌性C57BL/6J小鼠(10只动物/组)；在研究开始时为8-9周龄。
在EAE诱导前(研究第0天)检查所有动物的神经反应和症状的体征，之后在整个35天的观察期每日检查一次。对EAE反应根据本领域公认的0-15分值(严重性按升序排列)进行评分并记录。通过汇总每部分的评分而确定临床评分(参见例如Weaver等，FASEB2005；The FASEB Journal express article 10.1096/fj.04-2030fje.Published online August 4，2005.)。
结果：
图12显示了RNS60但非载体对照(载体)在本领域公认的多发性硬化(MS)小鼠MOG模型中以剂量反应性方式抑制临床评分方面明显有效。RNS-60的高低剂量每日一次治疗施用以及每三天一次的RNS-60高剂量施用(RNS-60的施用在所有情况下均随第一临床体征而开始)均表现出临床评分的明显下降(空心菱形＝载体对照；空心方形＝地塞米松阳性对照；亮″x″＝从临床体征出现时每日一次施用低剂量(0.09ml RNS60)；暗″x″＝从临床体征出现时每三天一次施用高剂量(0.2ml RNS60)；以及空心三角形＝从临床体征出现时每日一次施用高剂量(0.2ml RNS60))。
在与上文实施例的MBP模型进行比较中，该小鼠MOG模型在本领域中因其模拟MS的特征性轴突损伤而为人所知，而MBP模型并不能表现出这种损伤，并且该模型还能延长在较长时期观察到的疗效(28-30天，相比之下MBP模型为21天)。根据进一步的方面，RNS60但非载体对照(载体)在此小鼠MOG模型中对减轻轴突损伤明显有效。
根据本发明的特定方面，本发明的电动力学组合物对于治疗(包括缓解和防止)本领域公认的人MS小鼠模型中的症状具有明显的效用。根据本发明进一步的方面，本发明的电动力学组合物对于治疗(包括缓解和防止)受累哺乳动物(优选人)中的MS症状具有明显的效用。
在进一步的方面，本发明的电动力学组合物跨过血脑屏障(BBB)，并因此提供治疗中枢神经系统炎性病症的新方法。
实施例10
(RNS60但非生理盐水(NS)减弱了MBP灌注T细胞中NFκB的激活)
概述。NF-κB激酶是一种在炎症介导的病症和疾病中调节炎性反应的本领域广泛认可的激酶。
本实施例显示了RNS60但非生理盐水(NS)减弱了MBP灌注T细胞中NFkB的激活。因此，根据特定的方面，本发明的电动力学产生的液体对于治疗炎症和炎症介导的病症和疾病具有明显的效用，包括但不限于糖尿病及相关代谢障碍、胰岛素抗性、神经变性疾病(如M.S.、帕金森病、阿尔茨海默病等)、哮喘、囊性纤维化、血管疾病/冠心病、视网膜和/或黄斑变性、消化障碍(如炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病等)。
方法。对于图13A和13B中所示的实验，将从MBP免疫小鼠中分离的T细胞用MBP再次灌注，24h后，细胞接受不同浓度的RNS60和NS。处理2h后，通过电泳迁移率改变分析(EMSA)监测了核抽提物中NF-κB的DNA结合活性。
对于图13C中所示的实验，将从MBP免疫小鼠中分离的T细胞用PBIIX-Luc(NF-κB依赖性报告构建体)转染，然后用MBP再次灌注。MBP灌注后24小时，将细胞用不同浓度的RNS60和NS处理2h，然后通过荧光素酶测定试剂盒(Promega)测定总细胞提取物中的荧光素酶活性。在其他情况下，将MBP灌注的T细胞也用30nM PMA处理1h。在这些情况下，在1h的RNS60和NS预处理后加入PMA。结果为三个不同实验的平均值+SD。
结果。图13A-C显示了RNS60但非生理盐水(NS)减弱了MBP灌注T细胞中NFkB的激活。具体地讲，图13A和13B显示了RNS60(参见图13A和124B的中间三个图)但非NS(参见图13A和13B最右边的图)以剂量反应性方式减弱了MBP灌注T细胞中NF-κB的激活。
同样，图13C的条形图显示了RNS60(参见图13A和13B的第二、三和四个条)但非NS(参见图13A和13B的第五个条)以剂量反应性方式减弱了MBP灌注T细胞中NF-κB的激活，并因此也减弱了总细胞提取物中来自转染的NF-κB依赖性报告构建体(PBIIX-Luc)的荧光素酶活性。
因此，根据特定的方面，本发明所公开的电动力学产生的液体对于治疗炎症和炎症介导的病症和疾病具有明显的效用，包括但不限于糖尿病及相关代谢障碍、胰岛素抗性、神经变性疾病(如M.S.、帕金森病、阿尔茨海默病等)、哮喘、囊性纤维化、血管疾病/冠心病、视网膜和/或黄斑变性、消化障碍(如炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病等)。
实施例11
(RNS60但非生理盐水(NS)减弱了小鼠中帕金森病的MPTP诱导型病理征象)
概述：
可通过用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处理小鼠而诱导小鼠表现出帕金森病(PD)的病理征象(如，运动时间缩短、运动距离减小、在转动杆上保持平衡的能力降低、震颤以及纹状体控制的行为模式刻板性动作和竖立(垂直运动))。MPTP的神经毒作用取决于其转化成MPP+。在胶质细胞中，单胺氧化酶B(MAO-B)将MPTP转化成MPP+，其随后激活胶质细胞，并且最近以来，已表明MPP+会诱导小胶质细胞中促炎性分子的表达。此外，MPP+已表明会导致多巴胺能神经元的凋亡。
在本工作实施例中，在MPTP处理的小鼠中确认了RNS60减少PD病理症状的能力(如，改善协调运动、防止纹状体依赖性行为的丧失以及补救多巴胺能神经元)。
材料和方法：
简而言之，C57BL/6小鼠以2小时的间隔接受四次MPTP-HCl(18mg/kg的游离碱)盐水溶液的腹膜内注射。对照动物接受相同体积的盐水。RNS60或生理盐水(NS)处理在MPTP中毒前1天开始。在MPTP注射后7天用计算机辅助的Digiscan红外活动监视仪测量了自发活动(图14和15)。将数据标识为平均值±SEM，P值通过ANOVA计算；*＝P＜.05，**＝P＜.01，***＝P＜.001，ns＝不显著。
对于确认RNS60治疗可补救MPTP中毒小鼠中的多巴胺能神经元的实验，在MPTP中毒后7天解剖了纹状体(图16)。通过酪氨酸羟化酶(多巴胺合成中涉及到的限速酶)的抗体进行免疫染色检测到了黑质致密部中多巴胺能神经元的存在。图A显示了对照小鼠(即未发生MPTP中毒的健康对照小鼠)的纹状体，图B显示了MPTP(即MPTP攻击的小鼠)的纹状体，图C显示了MPTP+RNS60(即用RNS60处理过的MPTP攻击的小鼠)的纹状体。
结果：
如图14和15中的运动分析所证实，单独的MPP+在受试者中诱导了PD样症状，包括缩短运动时间(图14A)、距离
(图14B)、小鼠在转动杆上保持平衡的能力(图14C)、纹状体控制的行为模式刻板性动作(理毛)(图15A)和竖立(垂直运动)(图15B)的丧失。明显地，RNS60实质缓解了这些症状并且在一些协调运动实验中小鼠行为与对照小鼠类似。相比之下，在类似的实验条件下，用生理盐水对照(NS)预处理然后用MPP+诱导的小鼠具有与仅用MPP+处理的小鼠类似的症状(图14和15)。因此，这些数据表明RNS60对MPP+中毒小鼠具有特定的保护作用。
因此，图14和15表明，本发明的电动力学液体(RNS-60)但非对照生理盐水(NS)可改善PD小鼠模型中的协调运动并防止小鼠纹状体依赖性行为的丧失。
此外，黑质致密部(PD中主要受累的部分)中的免疫染色揭露出在用RNS60处理的小鼠中多巴胺能神经元的明显补救(图16)，从而确认了该处理的神经保护活性。如图16中可见，MPP+中毒导致了酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的丧失以及RNS60预处理保护了黑质致密部(SNpc)中的TH阳性神经元。
此外，将如前所述进行所有组小鼠(n＝6只/组)的纹状体TH免疫染色的定量(1，2)。将通过数字图像分析(Scion)获得光密度测量值。纹状体TH光密度基本上反映多巴胺能纤维神经支配。
因此，根据特定的方面，由于MPP+为神经毒素，因此这些结果表明RNS60有防止神经毒素的作用。根据进一步特定的方面，由于MPP+为多巴胺能神经毒素，因此这些结果表明RNS60有防止多巴胺能神经毒素的作用。
根据特定的方面，本发明的电动力学液体对防止暴露于神经毒素产生的神经毒性症状有明显的效用。
以上章节引用的参考文献：
1.Ghosh，A.，Roy，A.，Liu，X.，Kordower，J.H.，Mufson，E.J.，Mosely，R.L.，Ghosh，S.，Gendelman，H.E.&Pahan，K.2007.Selectiveinhibition of NF-κB activation prevents dopaminergic neuronal loss in amouse model of Parkinson′s disease.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104：18754-18759.
2.Ghosh，A.，Roy，A.，Matras，J.，Brahmachari，S.，Gendelman，H.E.，&Pahan，K.2009.Simvastatin inhibits the activation of p21ras andprevents the loss of dopaminergic neurons in a mouse model ofParkinson′s disease.J.Neurosci.29：13543-13556.
实施例12
(RNS60但非生理盐水(NS)可体内抑制黑质致密部(SNpc)中小胶质细胞iNOS的MPTP诱导型表达)
概述：
根据本文所述的特定方面，本发明的电动力学液体使神经细胞免受神经毒素具有明显的效用。
可通过用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)处理小鼠而诱导小鼠表现出帕金森病(PD)的病理征象。MPTP的神经毒作用取决于其转化成MPP+。在胶质细胞中，单胺氧化酶B(MAO-B)将MPTP转化成MPP+，其随后激活胶质细胞，并且最近以来，已表明MPP+会诱导小胶质细胞中促炎性分子的表达。此外，MPP+可导致多巴胺能神经元的凋亡。
在工作实施例7和11中，显示了在PD的MPTP小鼠模型中RNS60抑制小胶质细胞中MPP+诱导的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和IL-1β的表达以及保护多巴胺能神经元并改善自发活动的能力。进行了另外的实验以a)在体内研究RIS60在MPTP中毒小鼠的黑质致密部(SNpc)中对小胶质细胞iNOS的影响。
材料和方法：
在MPTP中毒前一天接受RIS60或IS(300μl/天/小鼠，通过i.p.注射)的雄性C57BL/6小鼠(n＝3只/组)将以每2h的间隔接受四次MPTP注射。RIS60/IS处理将继续，并在MPTP中毒后1天，将小鼠杀死，固定大脑、包埋并加工以进行如之前所述(1，2)的iNOS免疫染色。简而言之，如所述(1-3)，所有组小鼠(盐水、MPTP、MPTP-RIS60-300μl、MPTP-IS-300μl)的腹侧中脑切片接受用针对iNOS和CD11b(对于小胶质细胞而言)的抗体进行的漂片法双重免疫标记。
CD11b阳性、iNOS阳性以及CD11b与iNOS双阳性细胞将使用Olympus IX81荧光显微镜中的″Microsuite Biological Suite″软件进行计数，以确定小胶质细胞激活和iNOS表达是否在RIS60处理的MPTP中毒小鼠的SNpc中与对照MPTP小鼠和IS(载体)处理MPTP小鼠相比有所降低。将从三只动物每一只中分离而得的各大脑的六个黑质切片用于确定RIS60对MPTP处理小鼠的SNpc中CD11b和iNOS蛋白水平的影响。
结果：
根据某些实施方案，RNS60但非生理盐水在体内抑制了黑质致密部(SNpc)中小胶质细胞iNOS的MPTP诱导型表达。因此，这些体内实验确认了实施例7中所见的结果，其中半定量PCR表明RNS60但非生理盐水抑制了小鼠小胶质细胞中iNOS的MPTP诱导型表达。
以上章节引用的参考文献：
1.Ghosh，A.，Roy，A.，Liu，X.，Kordower，J.H.，Mufson，E.J.，Mosely，R.L.，Ghosh，S.，Gendelman，H.E.&Pahan，K.2007.Selectiveinhibition of NF-κB activation prevents dopaminergic neuronal loss in amouse model of Parkinson′s disease.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104：18754-18759.
2.Ghosh，A.，Roy，A.，Matras，J.，Brahmachari，S.，Gendelman，H.E.，&Pahan，K.2009.Simvastatin inhibits the activation of p21ras andprevents the loss of dopaminergic neurons in a mouse model ofParkinson′s disease.J.Neurosci.29：13543-13556.
3.Roy，A.&Pahan，K.2010.Prospects of statins in Parkinson′sdisease.Neuroscientist 16：000-000.
实施例13
(RNS60但非生理盐水(NS)诱导了原代神经元中以及星形胶质细胞中Akt磷酸化的激活)
概述。Akt是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在多种细胞过程中起着作关键作用，包括葡萄糖代谢、细胞增殖、细胞凋亡、转录和细胞迁移。Akt已知可调节细胞生存。具体地讲，已表明磷酸化Akt可通过使BAD(促凋亡蛋白)失活而抑制细胞凋亡。(参见Song G，等，(2005).″The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival″.J.Cell.Mol.Med.9(1)：59-71.)如本领域所认识，Akt的磷酸化是保护细胞(包括神经细胞)免受毒性和促凋亡刺激的主导者。
在本工作实施例中，确认了RNS60诱导原代神经细胞和星形胶质细胞中Akt磷酸化的能力。此外，证实了Akt在RNS60阻断细胞凋亡的能力方面的作用。
材料和方法：
如之前所述(1，2)分离神经元并培养。如之间所述分离星形胶质细胞并培养。将神经元或星形胶质细胞用10％RIS60或IS(用作对照)处理0′、15′、30′、60′、90′、120′和180′，并通过用针对磷酸化Akt和正常Akt(细胞信号传导)的抗体对细胞提取物进行western印迹分析而监测Akt的激活。通过针对正常Akt的抗体检测了总Akt。将神经元或星形胶质细胞用不同剂量的RIS60(2％、5％、10％和20％)处理。将不同剂量的IS用作对照。如上所述监测了Akt的激活。
图17A显示了从研究RNS60(与生理盐水(NS)对照相比)对诱导原代神经元中Akt磷酸化的影响的实验获得的结果。Akt磷酸化使用针对β微管蛋白和磷酸化Akt的抗体通过双重标记免疫荧光进行监测。β微管蛋白用作神经元的标记物，DAPI染色用于显现细胞的核。图B和C显示了Akt磷酸化通过10％RNS60所诱导，而对照生理盐水(″NS″)则无影响。
图17B显示了从研究在存在和不存在RNS60下对抑制原代神经元中Akt的影响的实验的结果。纤维状Aβ1-42(Bachem Biosciences)如之前所述(1，3)变成了纤维状形式。神经元中磷酸化Akt的功能被AktI(得自Calbiochem的Akt特异性抑制剂)所抑制。经不同浓度的AktI预温育30分钟的神经元用RNS60处理。温育1小时后，将细胞用纤维状Aβ1-42攻击。12h后，通过TUNEL监测神经元凋亡，24h后，如之前所述(1，2)通过MTT和LDH释放评估细胞死亡。结果(图17B)显示了Akt抑制剂即AktI使RNS60对纤维状Ab攻击的神经元的保护作用失效。
因此，结果确认了RNS60需要Akt来保护神经元免受Ab毒性。图18显示了从研究RNS60(与生理盐水(NS)对照相比)对诱导原代神经元中Akt磷酸化的影响的时程(0分钟、15分钟、60分钟和120分钟)实验获得的结果。该坐标图代表了当用RNS60或生理盐水处理时磷酸化Akt的量与存在于星形胶质细胞中的Akt总量之间的比例。如图18中可见，RNS60当与生理盐水(NS)的影响相比时诱导了星形胶质细胞中Akt磷酸化增加四倍。因此，RNS60可特异性诱导Akt磷酸化。
根据如本文所述的特定方面，并且不受任何特定机理的束缚，本发明的电动力学液体通过防止暴露于毒素诱导的细胞凋亡而保护神经细胞免受神经毒素具有明显的效用。
以上章节引用的参考文献：
1.Jana，A.&Pahan，K.2004.Fibrillar amyloid-βpeptides killhuman primary neurons via NADPH oxidase-mediated activation ofneutral sphingomyelinase：Implications for Alzheimer′s disease.J.Biol.Chem.279：51451-51459.
2.Jana，A.&Pahan，K.2004.HIV-1 gpl20 induces apoptosis inhuman primary neurons through redox-regulated activation of neutralsphingomyelinase.J.Neurosci.24：9531-9540.
实施例14
(RNS60但非生理盐水(NS)减弱了原代神经元中Aβ1-42肽诱导的Tau磷酸化)
概述。Tau过度磷酸化是大脑和神经元组织中缠结的标志，并可导致多种合在一起被称为tau蛋白病的疾病之一。Tau蛋白病包括但不限于阿尔茨海默病、嗜银颗粒病、额颞痴呆、进行性核上性麻痹、基底节变性、额颞叶变性(皮克氏病)和拳击员痴呆(DP)(亦称慢性拳击师脑病)。
图19A-B显示了从研究RNS60(与生理盐水(NS)对照相比)对原代神经元中纤维状Aβ(1-42)介导的tau磷酸化的影响的实验获得的结果。Tau磷酸化使用针对β微管蛋白和磷酸化tau的抗体通过双重标记免疫荧光进行监测。β微管蛋白用作神经元的标记物，DAPI染色用于显现细胞的核。从标记为″(p)-Tau″的列中的顶部开始的第三和第四幅图表明Tau磷酸化被RNS60以剂量依赖性方式抑制，而对照生理盐水(″NS″)则无影响，即使在10％的高剂量下(参见标记为″(p)-Tau″的列的底图)。
实施例15
(在存在神经毒素下RNS60的保护作用被Akt抑制剂阻断)
概述。Akt是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在多种细胞过程中起着作关键作用，包括葡萄糖代谢、细胞增殖、细胞凋亡、转录和细胞迁移。具体地讲，Akt已知可调节细胞存活。具体地讲，已表明磷酸化Akt可通过使BAD(促凋亡蛋白)失活而抑制细胞凋亡。(参见SongG，等，(2005).″The activation of Akt/PKB signaling pathway and cellsurvival″.J.Cell.Mol.Med.9(1)：59-71.)如本领域所认识，Akt的磷酸化是保护细胞(包括神经细胞)免受毒性和促凋亡刺激的主导者。
工作实施例13和14表明a)在原代神经元中在存在RNS60下Akt发生磷酸化，以及b)RNS60减弱了原代神经元中纤维状Aβ1-42肽诱导的Tau磷酸化。本工作实施例中公开的实验确认了在存在神经毒素下RNS60的保护作用可通过Akt抑制剂阻断。因此，本实施例确认了RNS60需要Akt来保护神经元免受Aβ毒性。
如之前所述(1，2)分离了神经元或星形胶质细胞并进行培养。将神经元或星形胶质细胞用10％RIS60或IS(用作对照)处理0′、15′、30′、60′、90′、120′和180′，并通过用针对磷酸化Akt和正常Akt(细胞信号传导)的抗体对细胞提取物进行western印迹分析而监测Akt的激活。通过针对正常Akt的抗体检测了总Akt。将神经元或星形胶质细胞用增加剂量的RNS60(2％、5％、10％和20％)处理。将不同剂量的NS用作对照。如上所述监测了Akt的激活。
纤维状Aβ1-42(Bachem Biosciences)如之前所述(1，3)变成了纤维状形式。神经元中磷酸化Akt的功能被AktI(得自Calbiochem的Akt特异性抑制剂)所抑制。
经不同浓度的AktI预温育30分钟的神经元用RNS60处理。温育1小时后，将细胞用纤维状Aβ1-42攻击。12h后，通过TUNEL监测神经元凋亡，24h后，如之前所述(1，2)通过MTT和LDH释放评估细胞死亡。
结果显示了Akt抑制剂即AktI使RNS60对纤维状Aβ攻击的神经元的保护作用失效。因此，结果确认了RNS60需要Akt来保护神经元免受Aβ毒性。
以上章节引用的参考文献：
1.Jana，A.&Pahan，K.2004.Fibrillar amyloid-βpeptides killhuman primary neurons  via NADPH  oxidase-mediated  activation ofneutral sphingomyelinase：Implications for Alzheimer′s disease.J.BiolChem.279：51451-51459.
2.Jana，A.&Pahan，K.2004.HIV-1 gpl20 induces apoptosis inhuman primary neurons through redox-regulated activation of neutralsphingomyelinase.J.Neurosci.24：9531-9540.
3.Jana，M.&Pahan，K.2008.Fibrillar amyloid-βpeptides activatemicroglia via toll-like receptor 2：Implications for Alzheimer′s disease.J.Immunol.181：7254-7262.
实施例16
(在存在神经毒素下RNS60的保护作用被PI-3激酶抑制剂阻断)
概述。PI-3激酶在多种细胞过程中起着重要作用，包括细胞生长、增殖、分化、运动性、生存和细胞内移行。此外，PI 3激酶也是胰岛素信号通路的关键组分。具体地讲，PI-3激酶已知可使Akt磷酸化并因此使其激活，而Akt是保护细胞(包括神经细胞)免受毒性和促凋亡刺激的主导者。
上文的工作实施例13和15表明：a)在原代神经元中在存在RNS60下Akt发生了磷酸化；以及b)RNS60介导的避免神经毒素可通过Akt抑制剂所阻断。本实施例进一步证实，RNS60介导的避免神经毒素诱导的细胞凋亡需要PI-3激酶通路。
图20显示了从研究RNS60对人原代神经元(已用PI-3激酶抑制剂处理)的影响的实验获得的结果。如之前所述(1，2)分离了人原代神经元并进行培养。纤维状Aβ1-42(Bachem Biosciences)如之前所述(1，3)变成了纤维状形式。神经元中PI-3激酶的功能被LY294002(得自Enogene的PI-3激酶的特异性抑制剂)所抑制。
将用2μm LY294002预温育的神经元用RNS60处理。温育1小时后，将细胞用纤维状Aβ1-42攻击。12h后，通过TUNEL监测神经元凋亡，24h后，如之前所述(1，2)通过MTT和LDH释放评估细胞死亡。
结果显示了PI-3激酶抑制剂LY294002使RNS60对纤维状Aβ攻击的神经元的保护作用失效。因此，结果证实了RNS60需要PI-3激酶来保护神经元免受Aβ毒性。
因此，根据某些实施方案，并如图21中示意性所示，在神经元中，RNS60通过膜效应(如，通过离子通道的调节)激活了PI-3激酶，继而使Akt磷酸化和激活。磷酸化的Akt然后阻断神经元细胞的神经毒素介导的细胞凋亡。
以引用方式并入。在本说明书中参考的和/或在申请数据表中所列的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及非专利出版物均全文以引用方式并入本文。
应当理解，本文的附图和详细描述应视为示例性的而非限制性的，并且不旨在将本发明限制到所公开的特定形式和实施例。相反，在不脱离本发明的精神和范围(如以下权利要求书所限定)的情况下本发明包括任何进一步的修改、变化、重排、替换、替代、设计选择以及对本领域普通技术人员显而易见的实施方案。因此，以下权利要求书意在被视为包括所有此类进一步的修改、变化、重排、替换、替代、设计选择以及实施方案。
前述实施方案示出了不同的组件，它们包含在另外的不同组件中或与另外不同的组件相联系。应当理解，此类示出的构造仅为示例性的，并且事实上可实施能实现相同功能的许多其他构造。在概念意义上，为实现相同功能的组件的任何安排有效“相关”，以使得实现所需的功能。因此，本文相结合以实现特定功能的任何两个组件可视为彼此“相关”，以使得实现所需的功能，而不论构造或中间组件如何。同样，如此相关的任何两个组件也可被视为彼此“操作相关”或“操作连接”的，以实现所需的功能。
虽然已经示出和描述了本发明的特定实施方案，但是对本领域的技术人员显而易见的是，基于本文的教导，可在不脱离本发明及其更宽方面的情况下作出改变和变型，并且因此，所附的权利要求书将在其范围内涵盖所有此类改变和变型，如同落在本发明的真实精神和范围内。此外，应当理解本发明仅由所附权利要求书限定。本领域的技术人员将理解的是，一般来讲，本文所用的特别是在所附权利要求书(如，所附权利要求书的主体)中的术语通常旨在为“开放式”术语(如，术语“包括”应被视为“包括但不限于”，术语“具有”应被视为“具有至少”，以及术语“包含”应被视为“包含但不限于”等等)。本领域的技术人员将进一步理解的是，如果有意给出所介绍的权利要求表述的特定数量，则此意图将为在该权利要求中明确表述的，并且在不存在此表述的情况下，不存在此意图。例如，为了有助于理解，以下所附权利要求可包含介绍性短语“至少一个(种)”和“一个(种)或多个(种)”的使用以介绍权利要求表述。然而，使用此类短语不应被视为暗示通过词语“一”或“一个(种)”来介绍的权利要求表述将含有此类介绍的权利要求表述的任何特定权利要求限制到只含一个此类表述的发明，即使当相同的权利要求包含介绍性短语“一个(种)或多个(种)”或“至少一个(种)”以及诸如“一”或“一个(种)”的词语也是如此(例如，“一”和/或“一个(种)”通常应被视为表示“至少一个(种)”和“一个(种)或多个(种)”)；使用“该”和“所述”来介绍表述时也一样。此外，即使当明确表述了所介绍的权利要求表述的特定数量，本领域的技术人员也将认识到此类表述通常应被视为至少表示所表述的数量(如，无其他修饰词的仅表述为“两个表述”通常表示至少两个表述或者两个或更多个表述)。因此，除了由所附权利要求书限制外，本发明不应受其他限制。

Claims (56)

1.一种防止或降低暴露于神经毒性剂时的神经毒性的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的电动力学改变的水性液体，所述液体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径并在所述离子水性液体中以足以提供对所述神经毒性剂的神经保护作用的量稳定配置，其中提供防止或降低暴露于神经毒性剂时的神经毒性的方法。
2.根据权利要求1所述的方法，包括在暴露于神经毒素的受试者中防止或降低运动协调的丧失。
3.根据权利要求1所述的方法，其中防止或降低神经毒素介导的神经元凋亡。
4.根据权利要求1所述的方法，包括激活或诱导所述受试者的神经元中PI-3激酶和Akt磷酸化中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构稳定配置在所述离子水性液体中，其量在所述液体与活细胞接触时足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中施用所述液体包括在暴露于所述神经毒性剂前施用所述液体。
7.根据权利要求1所述的电动力学液体，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构是所述液体中主要的电荷稳定的含气体纳米结构物质。
8.根据权利要求1所述的电动力学液体，其中作为所述电荷稳定的含氧纳米结构存在于所述液体中的溶解氧分子的百分比为选自大于以下值的百分比：0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％。
9.根据权利要求1所述的电动力学液体，其中总溶解氧基本上存在于所述电荷稳定的含氧纳米结构中。
10.根据权利要求1所述的电动力学液体，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有低于选自以下值的尺寸的平均直径：90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm以及低于5nm。
11.根据权利要求1所述的电动力学液体，其中所述离子水溶液包括盐水溶液。
12.根据权利要求1所述的电动力学液体，其中所述液体为超充氧的。
13.根据权利要求1所述的电动力学液体，其中所述液体包括溶剂化电子的形式。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动力学改变的水性液体的改变包括将所述液体暴露于水动力学引起的局部电动力学效应。
15.根据权利要求14所述的方法，其中暴露于所述局部电动力学效应包括暴露于电压脉冲和电流脉冲中的至少一种。
16.根据权利要求14所述的方法，其中将所述液体暴露于水动力学引起的局部电动力学效应包括将所述液体暴露于用于产生所述液体的装置的电动力学效应引起的结构特征。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动力学改变的水性液体调节一氧化氮的局部或细胞水平。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动力学改变的水性液体促进施用部位的选自以下的至少一种细胞因子的局部减少：IL-1β、IL-8、TNF-α和TNF-β。
19.根据权利要求1所述的方法，进一步包括联合疗法，其中向所述患者施用至少一种另外的治疗剂。
20.根据权利19所述的方法，其中所述至少一种另外的治疗剂选自：肾上腺素能神经毒素、胆碱能神经毒素、多巴胺能神经毒素、兴奋性毒素和化疗剂。
21.根据权利要求5所述的方法，其中调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种包括调节细胞膜结构或功能中的至少一种，所述调节细胞膜结构或功能中的至少一种包括调节膜相关蛋白的构象、配体结合活性或催化活性中的至少一种。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述膜相关蛋白包括选自以下的至少一种：受体、跨膜受体、离子通道蛋白、细胞内附着蛋白、细胞粘附蛋白和整合素。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述跨膜受体包括G蛋白偶联受体(GPCR)。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述G蛋白偶联受体(GPCR)与G蛋白α亚基相互作用。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述G蛋白α亚基包括选自以下的至少一种：Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一种G蛋白α亚基为Gαq。
27.根据权利要求5所述的方法，其中调节细胞膜电导率包括调节全细胞电导。
28.根据权利要求27所述的方法，其中调节全细胞电导包括调节所述全细胞电导的至少一种电压依赖性贡献因素。
29.根据权利要求5所述的方法，其中细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节钙依赖性细胞信息传递途径或系统。
30.根据权利要求5所述的方法，其中细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节磷脂酶C活性。
31.根据权利要求5所述的方法，其中细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节腺苷酸环化酶(AC)活性。
32.根据权利要求5所述的方法，其中细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节与选自以下的至少一种病症或症状相关的细胞内信号转导：中枢神经和大脑慢性炎症以及中枢神经和大脑急性炎症。
33.根据权利要求1所述的方法，包括施用到细胞网络或细胞层，并进一步包括调节其中的细胞间连接。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞内连接包括选自紧密连接、间隙连接、粘着带和细胞桥粒的至少一种。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞网络或细胞层包括选自以下的至少一种：CNS血管中的内皮细胞和内皮-星形胶质细胞紧密连接、血液-脑脊髓液紧密连接或屏障、肺上皮型连接、支气管上皮型连接以及肠上皮型连接。
36.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动力学改变的水性液体为充氧的，并且其中在大气压下氧在所述液体中的含量为至少8ppm、至少15ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。
37.根据权利要求1所述的方法，其中在大气压下在所述电动力学改变的液体的电荷稳定的含氧纳米结构中氧的含量为至少8ppm、至少15ppm、至少20ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。
38.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动力学改变的水性液体包含溶剂化电子形式以及电动力学改性或带电的氧物质中的至少一种。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述溶剂化电子形式或电动力学改性或带电的氧物质的含量为至少0.01ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少3ppm、至少5ppm、至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm或至少20ppm。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述电动力学改变的充氧水性液体包含至少部分地通过分子氧稳定的溶剂化电子。
41.根据权利要求5所述的方法，其中调节细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的能力在密闭气密性容器中持续至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少6个月、至少12个月或更长的时间。
42.根据权利要求21所述的方法，其中所述膜相关蛋白包括CCR3。
43.根据权利要求1所述的方法，其中治疗包括通过局部、吸入、鼻内、口腔和静脉内方式中的至少一种方式而施用。
44.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动力学改变的液体的所述电荷稳定的含氧纳米结构包括本文所公开的表1和表2中的至少一种盐或离子。
45.一种药物组合物，包含一定量的电动力学改变的水性液体，所述液体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径并在所述离子水性液体中以足以防止或降低暴露于神经毒性剂时的神经毒性的量稳定配置。
46.一种保护或改善患有神经变性病症或疾病的受试者中的运动协调的方法，包括向患有特征在于运动协调丧失的神经变性病症或疾病的受试者施用治疗有效量的电动力学改变的水性液体，所述液体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径并在所述离子水性液体中以足以保护或改善所述受试者中运动协调的量稳定配置，其中提供了保护或改善患有神经变性病症或疾病的受试者中的运动协调的方法。
47.根据权利要求46所述的方法，包括激活或诱导PI-3激酶和Akt磷酸化中的至少一种。
48.根据权利要求46所述的方法，其中所述神经变性病症或疾病包括哺乳动物中选自以下的至少一种炎性神经变性病症或疾病：多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病、中风/脑缺血、头部外伤、脊髓损伤、亨廷顿氏舞蹈病、偏头痛、大脑淀粉样血管病、与AIDS相关的炎性神经变性病症、与年龄相关的认知功能减退、轻度认知损害和朊病毒病。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述炎性神经变性病症或疾病包括多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病中的至少一种。
50.根据权利要求46所述的方法，进一步包括通过用另一种抗炎剂同时地或附加地治疗所述受试者而协同或非协同抑制或减轻炎症。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述其他抗炎剂包括类固醇或糖皮质类固醇。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述糖皮质类固醇包括布地奈德或其活性衍生物。
53.根据权利要求46所述的方法，进一步包括联合疗法，其中向所述患者施用至少一种另外的治疗剂。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述至少一种另外的治疗剂选自：醋酸格拉替雷、干扰素β、米托蒽醌、那他珠单抗、包括MMP-9和MMP-2的抑制剂的MMP的抑制剂、短效β2激动剂、长效β2激动剂、抗胆碱能剂、皮质类固醇、全身性皮质类固醇、肥大细胞稳定剂、白三烯调节剂、甲基黄嘌呤、β2激动剂、沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇、吡布特罗、阿莫特罗、福莫特罗、沙美特罗、包括异丙托铵和噻托溴铵的抗胆碱能剂；包括倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、莫米松、曲安西龙、甲基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松的皮质类固醇；包括蒙鲁司特、扎鲁司特和齐留通的白三烯调节剂；包括色甘酸和奈多罗米的肥大细胞稳定剂；包括茶碱的甲基黄嘌呤；包括异丙托铵与沙丁胺醇、氟替卡松与沙美特罗、布地奈德与福莫特罗的复方药物；包括羟嗪、苯海拉明、氯雷他定、西替利嗪和氢化可的松的抗组胺药；包括他克莫司和吡美莫司的免疫系统调节药物；环孢霉素；硫唑嘌呤；吗替麦考酚酯；以及它们的组合。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述至少一种另外的治疗剂为TSLP和/或TSLPR拮抗剂。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述TSLP和/或TSLPR拮抗剂选自：对TSLP和TSLP受体特异性的中和抗体、可溶性TSLP受体分子以及TSLP受体融合蛋白，包括编码不止一条受体链的组分的TSLPR-免疫球蛋白Fc分子或多肽。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9745567B2 (en) 2008-04-28 2017-08-29 Revalesio Corporation Compositions and methods for treating multiple sclerosis
US9523090B2 (en) 2007-10-25 2016-12-20 Revalesio Corporation Compositions and methods for treating inflammation
US10125359B2 (en) 2007-10-25 2018-11-13 Revalesio Corporation Compositions and methods for treating inflammation
JP2013533320A (ja) * 2010-08-12 2013-08-22 レバレジオ コーポレイション タウオパチーを治療するための組成物および方法
JP6159584B2 (ja) * 2012-06-14 2017-07-05 松本　高明 輸液、輸液の製造方法および輸液装置
US9763992B2 (en) 2014-02-13 2017-09-19 Father Flanagan's Boys' Home Treatment of noise induced hearing loss
US20180243247A1 (en) * 2017-02-28 2018-08-30 Bryan J. Katz Drug combinations for cerebrovascular disease

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100028441A1 (en) * 2008-04-28 2010-02-04 Revalesio Corporation Compositions and methods for treating multiple sclerosis

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA05010042A (es) * 2003-03-20 2006-05-25 Aquaphotonics Inc Composiciones de farmacos en micro-agregados, composiciones bioafectadoras, composiciones para el tratamiento corporal, medios de cultivo, alimentos y bebidas.
ITMI20061737A1 (it) * 2006-09-12 2008-03-13 Snam Progetti Procedimento per il trasporto di zolfo a basso rischio e ad emissione zero da depositi di zolfo solido in blocchi di notevoli dimensioni
US20100310609A1 (en) * 2007-10-25 2010-12-09 Revalesio Corporation Compositions and methods for treatment of neurodegenerative diseases
MX337862B (es) * 2008-04-28 2016-03-16 Revalesio Corp Composiciones y métodos para el tratamiento de la esclerosis multiple.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100028441A1 (en) * 2008-04-28 2010-02-04 Revalesio Corporation Compositions and methods for treating multiple sclerosis

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MURGA ET AL: "Activation of Akt/Protein Kinase B by G Protein-coupled Recepotrs", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
NGUYEN ET AL: "Neuroprotection by NGF and BDNF Against Neurotoxin-Exerted Apoptotic Death in Neural Stem Cells Are Mediated Through Trk Receptors, Acticating PI3-Kinase and MAPK Pathways", 《NEUROCHEMICAL RESERCH》 *

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