MX2012012634A - Métodos y composiciones para proteger contra agentes neurotóxicos. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para proteger o reducir contra la neurotoxicidad o la exposición a un agente neurotóxico, que comprenden administrar un fluido acuoso alterado electrocinéticamente según se proporciona en la presente en una cantidad suficiente para proporcionar neuroprotección contra el agente neurotóxico, de preferencia en donde se produce la protección o reducción contra la pérdida de la coordinación motora en el sujeto expuesto a la neurotoxina. En ciertos aspectos, se produce la protección o reducción de la apoptosis neuronal mediada por una neurotoxina, y/o se produce la activación o inducción de al menos una de la fosforilación de la PI-3 quinasa y Akt en las neuronas. De preferencia, la administración del fluido comprende administrar el fluido antes de la exposición al agente neurotóxico. Adicionalmente, se proporcionan los métodos para conservar o mejorar la coordinación motora en un sujeto que padece una condición o enfermedad neurodegenerativa, que comprenden administrar un fluido acuoso alterado electrocinéticamente, según se proporciona en la presente, en una cantidad suficiente para proporcionar la conservación o mejora de la coordinación motora en el sujeto.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA PROTEGER CONTRA AGENTES NEUROTÓXICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Aspectos particulares se refieren generalmente a métodos para proteger contra o reducir la neurotoxicidad de la exposición a un agente neurotóxico, los cuales comprenden administrar un fluido acuoso alterado electrocinéticamente como se describe en la presente y preferentemente donde se logra la protección contra o la reducción de la pérdida de la coordinación motriz en el sujeto expuesto a la neurotoxina. Aspectos particulares se refieren a proteger contra o reducir la apoptosis neuronal mediada por neurotoxinas y/o se logra activar o inducir al menos una de fosforilación de cinasa PI-3 y Akt en neuronas. Los aspectos particulares se refieren generalmente a métodos para preservar o mejorar la coordinación motriz en un sujeto que tiene una afección o enfermedad neurodegenerativa, que comprenden administrar un fluido acuoso alterado electrocinéticamente como se describe en la presente.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades neurodegenerativas son un grupo de enfermedades tipificadas por el deterioro de neuronas o su vaina de mielina. Esta destrucción de las neuronas lleva eventualmente a disfunciones y discapacidades. A veces la inflamación parece ser un componente de las enfermedades neurodegenerativas y aumenta la patogénesis de la neurodegeneración (Minagar, et ál. (2002) J. Neurological Sci. 202:13-23; Antel y Owens (1999) J. Neuroimmunol . 100: 181-189; Elliott (2001) Mol. Brain. Res. 95:172-178; Nakamura (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:945-953; Whitton PS . (2007) Br J Pharmacol . 150:963-76) . De manera colectiva, estas enfermedades comprenden las enfermedades neurodegenerativas inflamatorias reconocidas en la técnica. La neuroinflamación puede ocurrir años antes de cualquier pérdida considerable de neuronas en algunos trastornos neurodegenerativos (Tansey et. ál., Fron Bioscience 13:709-717, 2008). Muchos tipos de células inmunitarias, incluyendo los macrófagos, neutrófilos, linfocitos T, astrocitos y microglia, pueden contribuir con la patología de enfermedades inmunitarias relacionadas, como esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Parkinson, amiloidosis (por ej,emplo, enfermedad de Alzheimer) , esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , enfermedades priónicas y demencia asociada a VIH. Más específicamente, los grupos de investigación han observado que en la EM el daño a la mielina está mediado por una respuesta inflamatoria (Ruffini et ál . (2004) Am J Pathol 164:1519-1522) y que la patogénesis de la EM es exacerbada cuando los leucocitos se infiltran en el SNC (Dos Santos et ál. (2008) J Neuroinflammation 5:49). Un grupo de investigación ha desarrollado modelos genéticos para analizar la inflamación del SNC y sus efectos en la E (a través del modelo animal de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) ) . De manera adicional, se descubrió que las citocinas proinflamatorias (específicamente TNF-alfa) tenían niveles elevados en la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica (ELA) (Greig et ál . (2006) Ann NY Acad of Sci 1035:290-315) . Estas enfermedades neurodegenerativas inflamatorias podrían, por lo tanto, ser tratadas de manera efectiva mediante fármacos antiinflamatorios.

Las enfermedades neurodegenerativas inflamatorias incluyen, de modo no taxativo: esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Parkinson, amiloidosis (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer) , esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , demencia asociada a VIH, isquemia cerebral/apoplejía isquémica, traumatismo de cráneo, lesión de la médula espinal, enfermedad de Huntington, migraña, angiopatía amiloide cerebral, SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero .

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neurodegenerativa inflamatoria crónica del sistema nervioso central (SNC) que afecta aproximadamente a 1,100,000 de personas en todo el mundo, en particular afecta a adultos jóvenes (Pugliatti et ál. (2002) Clin. Neurol. Neuros. 104:182-191). La EM está caracterizada patológicamente mediante la desmielinización del tejido neuronal, lo cual clínicamente da como resultado una de muchas formas de la enfermedad, que va desde patrones benignos a crónico-progresivos del estado de la enfermedad. Más específicamente, se han descrito cinco formas principales de esclerosis múltiple: 1) esclerosis múltiple benigna; 2) esclerosis múltiple con recaídas y remisiones (EMRR) ; 3) esclerosis múltiple secundaria progresiva (EMSP); 4) esclerosis múltiple primaria progresiva (EMPP) y 5) esclerosis múltiple progresiva recurrente (EMPR) . Esclerosis múltiple progresiva crónica es un término utilizado para referirse colectivamente a EMSP, EMPP y EMPR. Las formas recurrentes de esclerosis múltiple son la EMSP con recaídas superpuestas, EMRR y EMPR.

Durante el curso de la enfermedad hay una destrucción progresiva de la vaina de mielina que rodea los axones . Dado que la mielina intacta es esencial para la preservación de la integridad de los axones (Dubois-Dalcq et ál., Neuron. 48, 9-12 (2005)) la destrucción sistemática eventualmente lleva, en un aspecto clínico, a varias disfunciones neurológicas que incluyen entumecimiento y dolor, problemas con la coordinación y el balance, ceguera y deterioro cognitivo general. Resulta interesante que la evolución de la EM puede diferir considerablemente entre pacientes, donde algunos tienen una discapacidad leve después de décadas de vivir con la enfermedad, mientras que otros dependen de una silla de ruedas apenas unos años después de haber sido diagnosticados.

La etiología de la EM es actualmente desconocida, pero los estudios que analizan evidencia genética, la base molecular y los factores inmunológicos están comenzando a esclarecer el curso de la enfermedad y el mecanismo mediante el cual ocurre la desmielinización. En análisis genéticos, algunos reportes indicaron que los individuos emparentados tienen una incidencia más elevada de EM cuando se compara con la población normal (0.1% de prevalencia de EM) : un gemelo idéntico tiene un 30% de posibilidades de desarrollar la enfermedad si el otro gemelo tiene EM y los mellizos y hermanos tienen un 1-2% de posibilidades si otro hermano está afectado por EM. Varios grupos han utilizado estudios de enlace y de asociación para descubrir los genes responsables de la heredabilidad y encontraron que el riesgo relativo de estar afectado por EM es 3-4 veces mayor para aquellos que portan el alelo clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) del alelo DR2 del antigeno leucocito humano (HLA, por sus siglas en inglés) . Se han identificado otros genes que se asocian a la EM, pero con un riesgo mucho menor. El vinculo entre la susceptibilidad a la EM y la CMH clase II indica de manera contundente un papel para los linfocitos T CD4+ en la patogénesis de la EM (Oksenberg et ál . , JAMA 270:2363-2369 (1993)/ Olerup et ál., Tissue Antigens 38:1-3 (1991)).

Además, se ha intentado identificar los genes que se expresan de manera diferencial en pacientes que sufren de EM en comparación con los individuos sanos. Los micro-ensayos genéticos se han usado 1) para examinar la transcripción de los tipos de placas de EM (aguda contra crónica) y las regiones de placas (activa contra inactiva) (Lock y Heller (2003)); 2) para comparar las células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) en pacientes con EMRR en comparación con controles, de pacientes con y sin tratamiento con interferón-ß (Sturzebecher et ál. (2003)); y 3) para examinar las células del SNC en etapas de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en ratones, un modelo animal de EM (Lock et ál. (2002)). La mayoría de lo que se descubrió con estos experimentos era esperado, incluyendo el descubrimiento de que los genes antiapoptóticos antiinflamatorios están regulados por disminución y los genes de proliferación proinflamatorios están regulados por incremento. Los resultados sorprendentes incluyen la identificación de dianas nóveles para la aplicación terapéutica tal como osteopontina (Chabas et ál. 2001) y TRAIL (Wandinger et ál. 2003). Sin embargo, muchos de estos genes que tienen regulación diferencial cuando se compara la expresión en pacientes con EM con la de individuos sanos tienen una importancia desconocida en el desarrollo de la EM, porque cualesquiera genes que puedan afectar la susceptibilidad a la EM y/o su evolución son todavía desconocidos.

La investigación adicional determinó que las respuestas inflamatorias iniciadas por linfocitos T CD4+ autorreactivos pueden mediar los daños a la mielina (Bruck et ál., J. Neurol. Sci . 206:181-185 (2003)). En general, se cree que la mayoría del daño provocado a las vainas de mielina y los axones durante un episodio de EM ocurre debido a la respuesta de las linfocitos T autorreactivos que producen una respuesta inflamatoria que incluye la secreción de citocinas proinflamatorias (por ejemplo Thl y Thl7) (Prat et ál . , J. Rehabil. Res. Dev. 39:187-199 (2002); Hemmer et ál., Nat. Rev. Neurosci. 3:291-301 (2002)).

Los tratamientos disponibles actualmente para la EM incluyen acetato de glatirámero, interferón-ß, natalizumab y mitoxantrona . En general, estos fármacos suprimen el sistema inmunitario de una manera no especifica y limitan solo de una manera marginal la evolución general de la enfermedad. (Lubetzki et ál . (2005), Curr. Opin. Neurol . 18:237-244.) Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar estrategias terapéuticas para tratar mejor la EM.

El acetato de glatirámero está compuesto de ácido glutámico, lisina, alanina y tirosina como un polímero al azar. El acetato de glatirámero tiene una eficacia limitada y efectos secundarios significativos, por ejemplo, hi-nchazón en el sitio de inyección, escalofríos, fiebre, dolores, falta de aire, latidos acelerados y ansiedad. En un estudio clínico importante que utilizó 943 pacientes con EM primaria progresiva, el acetato de glatirámero no pudo detener el avance de la discapacidad y de la enfermedad ( olinsky, et ál (2007) Ann Neurol 61:13-24).

El interferón-ß es una proteína natural producida por los fibroblastos y es parte de la respuesta inmunitaria innata. Como fármaco para la EM, el interferón-ß es alrededor de 18-38% eficaz para reducir el índice de episodios de EM. Los efectos secundarios incluyen síntomas leves similares a los de la gripe y reacciones en el sitio de inyección y síntomas más graves (por ejemplo, depresión, convulsiones y problemas hepáticos).

La mitoxantrona es un tratamiento contra la EM. Se desarrolló como un tratamiento de quimioterapia para su uso en la lucha contra el cáncer, el cual funciona mediante la interferencia en la reparación y síntesis del ADN y no es específico de células cancerosas. Los efectos secundarios de la mitoxantrona pueden ser bastante graves e incluyen náuseas, vómitos, caída de cabello, daño cardíaco e inmunosupresión .

El natalizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige hacia la integrina alfa 4, que es una molécula de adhesión celular. Se cree que el natalizumab funciona evitando que las células inmunitarias que causan la inflamación crucen la barrera hematoencefálica (BHE) . Los efectos secundarios incluyen fatiga, dolor de cabeza, náuseas, resfríos y reacciones alérgicas.

Enfermedad de Parkinson La enfermedad de Parkinson (EP) , otra enfermedad de neurodegeneración inflamatoria, se caracteriza por trastornos motores, incluyendo rigidez muscular y movimientos físicos lentos. La EP es el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente, que afecta hasta a 1 millón de personas en los Estados Unidos solamente. La prevalencia de la EP aumenta con la edad, desde 0.3% en la población general de los EUA hasta 1% a 2% en las personas de 65 años o mayores, y 4% a 5% en individuos de 85 años o mayores. Con una expectativa de vida general en aumento, el número de pacientes con EP en los EUA y en otros países se espara que sea el doble en el 20302.

La EP es una enfermedad progresiva caracterizada por síntomas motores que incluyen temblores, rigidez, bradiquinesia (lentitud de movimiento), impedimento para andar y cambio de postura. La enfermedad también involucra síntomas no motores tal como déficit cognitivo, depresión y trastornos del sueño. Como la enfermedad de Alzheimer, la EP es una proteinopatía . La x-sinucleína mal plegada se acumula dentro de las neuronas y forma los llamados cuerpos de Lewy, uno de los signos neuropatológicos característicos de la EP. Se ha descubierto recientemente que la EP, que al principio se pensaba que era causada exclusivamente por la pérdida de las neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra, tiene un componente inflamatorio que activa las células microgliales del cerebro y está involucrada en la evolución de la muerte de células neuronales. Una causa patofisiológica percibida de la enfermedad de Parkinson es la destrucción progresiva de las células que producen dopamina en los ganglios básales que comprenden la parte compacta de la sustancia negra, los núcleos básales ubicados en el tronco del encéfalo. La pérdida de las neuronas dopaminéricas da como resultado un exceso relativo de acetilcolina . Jellinger, K. A., Post Mortem Studies in Parkinson' s Disease—Is It Possible to Detect Brain Areas For Specific Symptoms?, J Neural Transm 56 (Sup.); 1-29:1999. Además, se ha observado en investigaciones recientes de la enfermedad de Parkinson que debido a la expresión mejorada de citocinas y antigenos HLA-DR es probable que la respuesta inmunitaria contribuya al daño neuronal (Czlonkowska et. ál. (2002) Med Sci Monit 8:RA 165-77) .

El tratamiento efectivo en una etapa temprana representa una necesidad que no ha podido concretarse en el cuidado de pacientes con EP. La levodopa (L-DOPA) es el tratamiento farmacológico más eficaz para la EP, pero usualmente se prescribe en etapas tardías en el curso de la enfermedad debido a sus efectos secundarios graves. Se ha observado que los agonistas del receptor de dopamina y los inhibidores de la monoamino oxidasa tipo B tienen una correlación inversa entre eficacia y la aparición y gravedad de efectos secundarios, y los ensayos que exploran otras opciones de tratamiento que incluyen la coenzima Q10, tocoferol (vitamina E) , amantidina y beta bloqueadores no han podido demostrar los beneficios o no han producido suficientes datos para una evaluación exhaustiva del riesgo en relación al beneficio. La neuroprotección en particular ha sido un objetivo clave, aunque elusivo, del tratamiento de la EP.

La amiloidosis se desarrolla cuando se altera la estructura de determinadas proteínas y estas tienden a unirse unas a otras, acumulándose en tejidos particulares y bloqueando el funcionamiento normal del tejido. Estas proteínas con estructuras alteradas se denominan amiloides. A veces las amiloidosis se dividen en dos categorías: primarias o secundarias. Las amiloidosis primarias se producen a partir de una enfermedad con una función celular inmunitaria inadecuada. Las amiloidosis secundarias surgen usualmente de una complicación de alguna infección crónica o enfermedad inflamatoria. Los ejemplos de estas incluyen la enfermedad de Alzheimer y la artritis reumatoide. Dado que el problema subyacente en la amiloidosis secundaria es la inflamación, tratar la inflamación será probablemente beneficioso.

La enfermedad de Alzheimer es otro tipo de enfermedad neurodegenerativa inflamatoria. Se manifiesta por el deterioro creciente del aprendizaje y la memoria, aunque la enfermedad puede manifestarse en otras formas que indiquen una alteración en la capacidad cognitiva. Durante la enfermedad la pérdida progresiva de neuronas y sinapsis en la corteza cerebral conlleva a la atrofia total del tejido neuronal . Aunque la causa del Alzheimer es desconocida, muchos creen que la inflamación juega un papel importante y los estudios clínicos demostraron que la inflamación contribuye considerablemente con la patogénesis de la enfermedad (Akiyama, et. ál. (2000) Neurobiol Aging. 21:383-421) .

Se ha sugerido que existe un vinculo entre la inflamación y la enfermedad en el caso de la esclerosis lateral amiotrófica (Centonze, et. ál.. (2007) Trends Pharm Sci 28:180-7). Además, se descubrió que el ARNm de TNF-alfa se expresa en las espinas dorsales de un modelo de ratón transgénico para esclerosis lateral amiotrófica. Resulta interesante que la transcripción se detectó tan temprano como antes del comienzo de las dificultades motrices hasta la muerte causada por ELA (Elliot (2001) Brain Res Mol Brain Res 95: 172-8) .

Neurotoxinas Las neurotoxinas son toxinas que actúan específicamente sobre las neuronas, su sinapsis o el sistema nervioso en su totalidad. Son sustancias que causan daño a las estructuras del cerebro que a su vez conlleva a una enfermedad crónica. Las neurotoxinas incluyen, por ejemplo, neurotoxinas adrenérgicas, neurotoxinas colinérgicas, neurotoxinas dopaminérgicas , excitotoxinas y otras neurotoxinas. Los ejemplos de neurotoxinas adrenérgicas incluyen clorhidrato de N- (2-cloroetil ) -N-etil-2-bromobencilamina . Los ejemplos de neurotoxinas colinérgicas incluyen clorhidrato de mostaza de acetilcolina. Los ejemplos de neurotoxinas dopaminérgicas incluyen HBr 6-hidroxidopamina (6-OHDA), clorhidrato de l-metil-4- (2-metilfenil ) -1, 2, 3, 6-tetrahidro-piridina, perclorato de l-metil-4-fenil-2 , 3-dihidropiridinio, HC1 N-metil-4-fenil-1 , 2 , 5, 6-tetrahidropiridina (MPTP) , yoduro de l-metil-4-fenilpiridinio (MPP+), paraquat y rotenona. Los ejemplos de excitotoxinas incluyen MDA y ácido kainico.

Se ha observado que MPTP, MPP+, paraquat, rotenona y 6-OHDA inducen síntomas similares a la EP en modelos animales. (Véase, K. Ossowska, et ál., (2006). "Degeneration of dopaminergic mesocortical neurons and activation of compensatory processes induced by a long-term paraquat administration in rats: Implications for Parkinson's disease". Neuroscience 141 (4) : 2155-2165; y Caboni P, et ál., (2004) . "Rotenone, deguelin, their metabolites, and the rat model of Parkinson's disease". Chem Res Toxicol 17 (11) : 1540-8; Simón et ál . , Exp Brain Res, 1974, 20: 375-384; Langston et ál., Science, 1983, 219: 979-980; Tanner, Occup Med, 1992, 7: 503-513; Liou et ál . , Neurology, 1997, 48: 1583-1588) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Aspectos particulares proporcionan métodos para proteger contra o reducir la neurotoxicidad de la exposición a un agente neurotóxico, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxigeno y que tienen carga estabilizada, que sustancialmente tienen un diámetro promedio menor de alrededor de 100 nanómetros y están configuradas de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar protección contra el agente neurotóxico, donde se logra un método para proteger contra o reducir la neurotoxicidad de la exposición a un agente neurotóxico. En determinados aspectos, los métodos comprenden proteger contra o reducir la pérdida de coordinación motriz en un sujeto expuesto a la neurotoxina. En aspectos particulares, se logra proteger contra o reducir la apoptosis neuronal mediada por neurotoxinas y/o se logra activar o inducir al menos una de fosforilación de cinasa PI-3 y Akt en neuronas (por ejemplo, de un sujeto) .

En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxigeno y que tienen carga estabilizada están configuradas de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar, tras el contacto de una célula viva por el fluido, la modulación de al menos un potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular .

En modalidades particulares, administrar el fluido comprende administrar el fluido antes de la exposición al agente neurotóxico.

En determinados aspectos, las nanoestructuras que contienen oxigeno y que tienen carga estabilizada son la principal especie de nanoestructuras que contienen gas y que tienen carga estabilizada en el fluido. En aspectos particulares, el porcentaje de moléculas de oxigeno disuelto presentes en el fluido que conforman las nanoestructuras que contienen oxigeno y que tienen carga estabilizada es un porcentaje seleccionado del grupo que consiste en mayor a: 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95%. En determinados aspectos, el oxigeno disuelto total está sustancialmente presente en las nanoestructuras que contienen oxigeno que tienen carga estabilizada. En determinadas modalidades, las nanoestructuras que contienen oxigeno que tienen carga estabilizada sustancialmente tienen un diámetro promedio menor a un tamaño seleccionado del grupo que consiste en: 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 10 nm y menos de 5 nm.

En determinados aspectos, la solución acuosa iónica comprende una solución salina y/o está superoxigenada . En determinados aspectos, el fluido comprende una forma de electrones solvatados.

En aspectos particulares, la alteración del fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados inducidos de forma hidrodinámica. En determinadas modalidades, la exposición a los efectos electrocinéticos localizados comprende la exposición a al menos uno de pulsos de voltaje o pulsos de corriente. En determinadas modalidades, la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados inducidos de forma hidrodinámica, comprende la exposición del fluido a características estructurales que inducen efectos electrocinéticos de un dispositivo usado para generar el fluido .

En determinados aspectos, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente modula los niveles localizados o celulares del óxido nítrico.

En aspectos particulares, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente promueve una disminución localizada en el sitio de administración de al menos una citocina seleccionada del grupo que consiste en: IL-lbeta, IL-8, TNF-alfa y TNF-beta.

Aspectos particulares de los métodos comprenden una terapia de combinación, donde al menos un agente terapéutico adicional se administra al paciente. En determinadas modalidades al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en: neurotoxinas adrenérgicas, neurotoxinas colinérgicas, neurotoxinas dopaminérgicas, excitotoxinas y agentes quimioterapéuticos .

En aspectos particulares, modular al menos una del potencial de la membrana celular y de la conductividad de la membrana celular comprende modular al menos una de la estructura o la función de membrana celular que comprende la modulación de al menos uno de una conformación, una actividad de unión al ligando o una actividad catalítica de una proteina asociada a una membrana. En aspectos particulares, la proteina asociada a una membrana comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en receptores, receptores transmembrana, proteínas del canal iónico, proteínas de unión intracelular, proteínas de adhesión celular e integrinas. En aspectos particulares, el receptor transmembrana comprende un receptor acoplado a proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) . En aspectos particulares, el receptor acoplado a proteína G (GPCR) interactúa con la subunidad de una proteína G. En aspectos particulares la subunidad ot de una proteína G comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en Gas, GOÍÍ, Gaq y Go¡i2. En aspectos particulares, al menos una subunidad o¡ de proteína G es Goíq.

En determinados aspectos, la modulación de la conductividad de membrana celular comprende modular la conductancia de célula completa. En modalidades particulares, la modulación de la conductancia de célula completa comprende modular al menos una contribución dependiente del voltaje en la conductancia de célula completa.

En aspectos particulares, la modulación de al menos una de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular comprende modular la transducción de señal intracelular que comprende la modulación de una vía o sistema de mensajero celular dependiente de calcio. En aspectos particulares, la modulación de al menos uno de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular comprende modular la transducción de señal intracelular que comprende la modulación de la actividad de fosfolipasa C. En aspectos particulares, la modulación de al menos uno de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular comprende modular la transducción de señal intracelular que comprende la modulación de la actividad de adenilato ciclasa (AC) . En aspectos particulares, la modulación de al menos una de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular comprende modular la transducción de señal intracelular asociada a al menos una afección o síntoma seleccionado del grupo que consiste en: inflamación crónica en el sistema nervioso central y el cerebro, e inflamación aguda en el sistema nervioso central y el cerebro.

Determinados aspectos de los métodos comprenden la administración a una red o capa celular y comprende adicionalmente la modulación de una unión intracelular en esta. En aspectos particulares, la unión intracelular comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en uniones herméticas, uniones de hendidura, adherinas de zona y desmasomas . En determinadas modalidades, la red o capas celulares comprenden al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en células endoteliales y uniones herméticas endoteliales y de astrocito en los vasos del SNC, uniones estrechas o barrera del fluido hematoencefálico, uniones de tipo epitelio pulmonar, uniones de tipo epitelio bronquial y uniones de tipo epitelio intestinal .

En aspectos particulares, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente está oxigenado y el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 8 ppm, al menos 15, ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm o al menos 60 ppm de oxígeno a presión atmosférica. En determinados aspectos, la cantidad de oxígeno presente en las nanoestructuras que contienen oxígeno y que tienen carga estabilizada del fluido alterado electrocinéticamente es de al menos 8 ppm, al menos 15, ppm, al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm o al menos 60 ppm de oxígeno a presión atmosférica.

En determinados aspectos, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende al menos uno de una forma de electrones solvatados y especies de oxígeno cargadas o modificadas electrocinéticamente. En modalidades particulares, la forma de electrones solvatados o especies de oxígeno cargadas o modificadas electrocinéticamente están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm o al menos 20 ppm. En determinados aspectos, el fluido acuoso oxigenado alterado electrocinéticamente comprende electrones solvatados estabilizados, al menos en parte, por oxígeno molecular .

En aspectos particulares, la capacidad de modular de al menos una de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular persiste durante al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6, al menos 12 meses o períodos más prolongados, en un recipiente cerrado hermético al gas.

En determinados aspectos, la proteina asociada a una membrana comprende CCR3.

En aspectos particulares, el tratamiento o administración comprende la administración por al menos una vía entre vía tópica, inhalación, vía intranasal, vía oral y vía intravenosa.

En determinadas modalidades, las nanoestructuras que contienen oxigeno y que tienen carga estabilizada del fluido alterado electrocinéticamente comprenden al menos una sal o ión de las Tablas 1 y 2 descritas en la presente.

Aspectos adicionales proporcionan una composición farmacéutica, que comprende una cantidad de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxigeno y que tienen carga estabilizada, que sustancialmente tienen un diámetro promedio menor de alrededor de 100 nanómetros y están configuradas de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proteger contra- o reducir la neurotoxicidad de la exposición a un agente neurotóxico .

Aspectos adicionales proporcionan métodos para preservar o mejorar la coordinación motriz de un sujeto que sufre de una afección o enfermedad neurodegenerativa, que comprende administrar al sujeto que sufre de una afección o enfermedad neurodegenerativa, caracterizada por la pérdida de coordinación motriz, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno y que tienen carga estabilizada, que sustancialmente tienen un diámetro promedio menor de alrededor de 100 nanómetros y están configuradas de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para lograr la preservación o mejora de la coordinación motriz en el sujeto, donde se logra un método para preservar o mejorar la coordinación motriz en un sujeto que sufre una afección o enfermedad neurodegenerativa. En determinados aspectos, se logra la activación o inducción de al menos una de fosforilación de cinasa PI-3 o Akt .

En aspectos particulares, la afección o enfermedad neurodegenerativa comprende al menos una afección o enfermedad neurodegenerativa inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrópica, · enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, isquemia cerebral/apoplejía isquémica, traumatismo de cráneo, lesión de la médula espinal, enfermedad de Huntington, migraña, angiopatía amiloide cerebral, afección neurodegenerativa inflamatoria relacionada con el SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero. Preferentemente, la afección o enfermedad neurodegenerativa inflamatoria comprende al menos una de esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson.

Determinados aspectos de los métodos comprenden una inhibición o reducción sinérgica o no sinérgica de la inflamación mediante el tratamiento simultáneo o accesorio del sujeto con otro agente antiinflamatorio, por ejemplo, donde dicho agente antiinflamatorio comprende un esferoide o un esferoide glucocorticoide . En determinados aspectos, el esferoide glucocorticoide comprende budesonida o un derivado activo de esta.

Determinados aspectos de los métodos comprenden una terapia de combinación, donde se administra al menos un agente terapéutico adicional al paciente. En modalidades particulares, al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en: acetato de glatirámero, interferón-ß, mitoxantrona, natalizumab, inhibidores de MMP incluido el inhibidor de MMP-9 y MMP-2, agonistas de ß2 de acción corta, agonistas de ß2 de acción prolongada, anticolinérgicos, corticosteroides, corticosteroides sistémicos, estabilizadores de mastocitos, modificadores de leucotrieno, metilxantinas, agonistas de ß2, albuterol, levalbuterol, pirbuterol, artformoterol, formoterol, salmeterol; anticolinérgicos incluyendo ipratropio y tiotropio; corticosteroides incluyendo beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, mometasona, triamcinolona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona; modificadores de leucotrieno incluyendo montelukast, zafirlukast y zileutón; estabilizadores de mastocitos incluyendo cromolin y nedocromil ; metilxantinas incluyendo teofilina; combinaciones de fármacos incluyendo ipratropio y albuterol, fluticasona y salmeterol, budesonida y formoterol; antihistaminicos incluyendo hidroxizina, difenihidramina, loratadina, cetirizina e hidrocortisona; fármacos moduladores del sistema inmunitario incluyendo tacrolimus y pimecrolimus; ciclosporina, azatioprina, micofenolato mofetil y combinaciones de estos.

En algunos aspectos, al menos un agente terapéutico adicional es un antagonista de TSLP y/o TSLPR. En modalidades particulares, el antagonista de TSLP y/o TSLPR se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos neutralizantes específicos para TSLP y el receptor de TSLP, moléculas solubles del receptor de TSLP y proteínas de fusión del receptor de TSLP, incluyendo polipéptidos o moléculas Fe de inmunoglobulina TSLPR que codifican los componentes de más de una cadena receptora.

En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxigeno y que tienen carga estabilizada del fluido alterado electrocinéticamente comprenden al menos una sal o ión de las Tablas 1 y 2 descritas en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1 A-C muestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de membranas (patch-clamp) que evaluaron los efectos ' del fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, RNS-60 y Solas) en la polaridad de la membrana celular epitelial y la actividad del canal iónico en dos momentos específicos (15 min (paneles izquierdos) y 2 horas (paneles derechos) ) y a diferentes protocolos de voltaje.

Las Figuras 2 A-C muestran, en relación con los experimentos que se refieren a las Figuras 1 A-C, las gráficas que son el resultado de la resta de los datos de corriente de Solas de los datos de corriente de RNS-60 con tres protocolos de voltaje (A. a partir de cero mV; B. a partir de -60 mV; C. a partir de -120 mV) y en dos momentos específicos (15 min (círculos sin relleno) y 2 horas (círculos con relleno) ) .

Las Figuras 3 A-D demuestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de membranas que evaluaron los efectos del fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, Solas (paneles A. y B.) y RNS-60 (paneles C. y D.)) sobre la polaridad de la membrana celular epitelial y la actividad del canal iónico usando diferentes soluciones salinas externas y con diferentes protocolos de voltaje (paneles A. y C. muestran un incremento desde cero mV y los paneles B. y D. muestran un incremento desde -120 mV) .

Las Figuras 4 A-D muestran, respecto a los experimentos que se refieren a las Figuras 3 A-D, las gráficas que son el resultado de la resta de los datos de corriente de CsCl (que se muestran en la Figura 3) de los datos de corriente de CaCl2 20 mM (rombos) y CaCl2 40 mM (cuadrados con relleno) con dos protocolos de voltaje (paneles A. y C. a partir cero mV, B. y D. a partir de -120 mV) para Solas (paneles A. y B.) y Revera 60 (paneles C. y D.) .

La Figura 5 muestra que el fluido elctrocinético de la presente invención (RNS-60) fue sustancialmente eficaz en el modelo de ratas reconocido en la técnica de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) de esclerosis múltiple (EM) .

La Figura 6 muestra una representación de los regímenes de inducción y tratamiento de la EAE utilizados en el experimento que se muestra en la Figura 7.

La Figura 7A es una representación gráfica del peso corporal (en gramos) de los animales sometidos al régimen de tratamiento de EAE utilizado en el experimento qué se muestra en las Figuras 5 y 6.

La Figura 7B muestra el cambio en el peso corporal calculado (en porcentaje) de los animales sometidos al régimen de tratamiento de EAE.

Las Figuras 8 A-D muestran que el fluido electrociéntico de la presente invención (RNS-60) afectó muy poco el nivel total de leucocitos (WBC, por sus siglas en inglés), neutrófilos y linfocitos cuando se lo compara con el control con vehículo durante el régimen de tratamiento de EAE como se lo utilizó en el experimento que se muestra en las Figuras 5 y 6. Los paneles A, B, C y D muestran los resultados en los días 0, 7, 14 y 21 del estudio, respectivamente .

Las Figuras 9 A-H (A-D) muestran el efecto que el fluido electrocinético de la presente invención (RNS-60) tuvo en los niveles de citocina a los 7 días (A-D) y 18 días (E-H) después del inicio del régimen de tratamiento de EAE como se utilizó en el experimento que se muestra en las Figuras 5 y 6. Los paneles A y E muestran los niveles de IL-17 después del tratamiento. Los paneles B y F muestran los niveles de IL-la después del tratamiento. Los paneles C y G muestran los niveles de IL-?ß después del tratamiento. Los paneles D y H muestran los niveles de IL-4 después del tratamiento.

La Figura 10 muestra que el fluido electrocinético de la presente invención (RNS-60), pero no el control de solución salina normal (NS), atenúa la expresión inducida por MPP+ de óxido nítrico sintasa (iNOS) e interleucina-?ß (IL-1ß) inducibles en células microgliales activadas de ratón (células microgliales BV-2).

Las Figuras 11A y B muestran que RNS60, pero no el control de solución salina normal (NS), suprime la apoptosis mediada por ?ß(1-42) fibrilar de células neuronales humanas -SHSY5Y (Figura 11A) y neuronas primarias humanas (Figura 11B) . Después de la diferenciación, las células SHSY5Y se incubaron con diferentes concentraciones de RNS60 o NS durante 1 hora seguido de agresión con péptidos fibrilares ?ß(1-42) 1 uM. Después de 18 horas de tratamiento, se monitoreó la apoptosis mediante TUNEL (Calbiochem) . También se incubaron péptidos ?ß(42-1) como control. Los resultados en cada figura representan tres experimentos independientes. Se utilizó tinción con DAPI para visualizar el núcleo de las células .

La Figura 12 muestra que RNS60, pero no el control con Vehículo (Vehículo) , es sustancialmente eficaz para suprimir la puntuación clínica en una manera que responde a la dosis en un modelo MOG de ratón de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) de esclerosis múltiple (EM) reconocido en la técnica. Tanto la administración terapéutica diaria de dosis alta y baja de RNS-60, como la administración de dosis alta de RNS-60 cada tres días (la administración de RNS-60 en todos los casos comenzó de manera concomitante con la aparición de los primeros signos clínicos) , mostraron una disminución marcada de la puntuación clínica (rombos sin relleno = control con Vehículo; cuadrados sin relleno = control positivo con dexametasona; "x" claras = administración diaria de dosis baja (0.09 mi de RNS60) a partir de la aparición de signos clínicos; "x" oscuras = administración de dosis alta (0.2 mi de RNS60) cada tres días a partir de la aparición de signos clínicos y triángulos sin relleno = administración diaria de dosis alta (0.2 mi de RNS60) a partir de la aparición de signos clínicos) .

Las Figuras 13 A-C muestran los resultados de dos experimentos de cambio de gel (paneles A y B) y el ensayo de la actividad de luciferasa (gen reportero) (panel C) que examinó los efectos de RNS60 en la activación de NFKB en-linfocitos T cebadas con MBP.

Las Figures 14 A-C son representaciones gráficas que califican los movimientos coordinados de ratones en un modelo de ratón de EP, donde los movimientos coordinados de los ratones mejoraron al ser tratados previamente con RNS60. Los paneles A y B muestran el total del tiempo de movimiento y la distancia, respectivamente. El panel C muestra la capacidad de los ratones de mantener el balance en un eje rotatorio.

Las Figuras 15 A y B son representaciones gráficas que califican los comportamientos dependientes del cuerpo estriado en ratones en un modelo de ratón de EP, donde el tratamiento con RNS60 evita la previene la pérdida de comportamientos dependientes del cuerpo estriado, estereotipia (acicalamiento, Panel A) y alzado en dos patas (movimientos verticales, Panel B) .

Las Figuras 16 A-C muestran la inmunotinción con un anticuerpo anti tirosina hidroxilasa, la tirosina hidroxilasa es la enzima limitante involucrada en la síntesis de dopamina, en la parte compacta de la sustancia negra. El Panel A ' muestra la tinción normal del anticuerpo anti tirosina hidroxilasa en la parte compacta de la sustancia negra. El Panel B muestra el efecto que tiene la MPTP en la parte compacta de la sustancia negra, donde la tinción de la parte compacta de la sustancia negra se reduce a aproximadamente un tercio. El Panel C muestra que el tratamiento con RNS60 rescata las neuronas dopaminérgicas en ratones intoxicados con MPTP.

Las Figuras 17 A y B muestran el análisis de inmunofluorescencia de fosfo-Akt en neuronas humanas. Los paneles de la izquierda, centro y derecha de la Figura 17 A muestran los resultados de un experimento que examina los efectos del control, RNS60 (RIS60; 10%) y solución salina isotónica (10%), respectivamente, en la fosforilación de Akt en neuronas primarias. La fosforilación de Akt se monitoreó mediante inmunofluorescencia de doble marcado utilizando anticuerpos contra ß-tubulina y fosfo-Akt. Se utilizó beta-tubulina como marcador para neuronas y se utilizó tinción con DAPI para visualizar los núcleos de las células. La Figura 17B muestra que RNS60 suprime la apoptosis mediada por ?ß(1-42) fibrilar de neuronas primarias humanas y que esta supresión mediada por RNS60 puede bloquearse mediante el inhibidor especifico de Akt, Aktl. Las neuronas que se incubaron previamente con diferentes concentraciones de Aktl durante 30 minutos fueron tratadas con RNS60. Después de 1 hora de incubación, las células se sometieron a prueba con ?ß1-42 fibrilar. Después de 12 horas, se monitoreó la apoptosis neuronal mediante TUNEL. Los resultados representan tres experimentos independientes. Se utilizó tinción con DAPI para visualizar el núcleo de las células.

La Figura 18 es una representación gráfica de la relación entre la cantidad de Akt fosforilada y la cantidad total de Akt presente en astrocitos cuando se tratan con RNS60 o solución salina normal.

Las Figuras 19 A-B muestran los resultados de un experimento que analiza los efectos de RNS60 en la fosforilación de tau mediada por ?ß(1-42) fibrilar en neuronas primarias. La fosforilación de tau se monitoreó mediante inmunofluorescencia de doble marcado utilizando anticuerpos contra ß-tubulina y fosfo-tau. Se utilizó beta-tubulina como marcador para neuronas y se utilizó tinción con DAPI para visualizar los núcleos de las células.

La Figura 20 muestra que RNS60 suprime la apoptosis mediada por ?ß(1-42) fibrilar de neuronas primarias humanas y que esta supresión mediada por RNS60 puede bloquearse mediante un inhibidor de cinasa PI-3 (LY) . Las neuronas que se incubaron previamente con diferentes concentraciones de inhibidor de cinasa PI-3 (LY) durante 30 minutos fueron tratadas con RNS60. Después de 1 hora de incubación, las células se sometieron a prueba con ?ß1-42 fibrilar. Después de 12 horas, se monitoreó la apoptosis neuronal mediante TUNEL.

La Figura 21, de acuerdo con aspectos particulares, es un diagrama esquemático de una vía de señal para el efecto supresor mediado por RNS60 de la apoptosis mediada por ?ß1-42 fibrilar en neuronas. Sin apegarse a ningún mecanismo, el esquema de la vía muestra una activación mediada por RNS60 de la cinasa PI-3, la cual a su vez activa la Akt por medio de la fosforilación. De acuerdo con aspectos adicionales, la Akt forsforilada media la supresión de la apoptosis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Determinadas modalidades descritas en la presente se refieren a proporcionar composiciones y métodos de tratamiento de al menos un síntoma de una enfermedad neurodegenerativa inflamatoria y/o esclerosis múltiple mediante la puesta en contacto del sitio con o mediante la administración a un sujeto de una composición terapéutica que comprende un fluido generado electrocinéticamente de la presente invención. En determinadas modalidades específicas, los fluidos generados electrocinéticamente comprenden fluidos generados electrocinéticamente enriquecidos con gas que comprenden agua enriquecida con oxígeno.

Composiciones y métodos neuroprotectores Determinadas modalidades de la presente se refieren a composiciones y métodos terapéuticos para el tratamiento de un sujeto mediante la prevención o alivio de al menos un síntoma asociado a la exposición a una neurotoxina o agente neurotóxico .

Enfermedad de Parkinson y afecciones Determinadas modalidades de la presente se refieren a composiciones y métodos terapéuticos para el tratamiento de un sujeto mediante la prevención o alivio de al menos un síntoma de la enfermedad de Parkinson y/o una afección o enfermedad asociada.

Modalidades adicionales de la presente se refieren a composiciones y métodos terapéuticos para prevenir o aliviar complicaciones relacionadas con la enfermedad de Parkinson y/o una afección asociada, incluyendo aliviar los síntomas de síntomas motores (por ejemplo, temblores, rigidez, bradiquinesia (lentitud de movimientos) e impedimento para andar) y síntomas no motores (por ejemplo, tales como déficit cognitivo, depresión y trastornos del sueño) .

Fluidos generados electrocinéticamente : "Fluido generado electrocinéticamente", como se usa en la presente, se refiere a los fluidos generados electrocinéticamente de la invención del solicitante generados, con los fines de los Ejemplos prácticos de la presente, mediante el ejemplo de dispositivo de mezcla descrito en detalle en la presente (véase también los documentos US200802190088 y WO2008/052143, ambos incorporados en su totalidad a la presente mediante esta referencia) . Los fluidos electrocinéticos, tal como lo demuestran los datos descritos y presentados en la presente, representan fluidos novedosos y fundamentalmente distintos con respecto a los fluidos no electrocinéticos de la técnica previa, incluyendo los relacionados con fluidos no electrocinéticos oxigenados de la técnica previa (por ejemplo, flüidos oxigenados de recipiente de presión y similares) . Como se describe en varios aspectos de la presente, los fluidos generados electrocinéticaménte tienen propiedades físicas y biológicas únicas y novedosas incluyendo, de modo no taxativo, lo siguiente : En aspectos particulares, el fluido acuoso alterado electrocinéticaménte comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras que contienen oxígeno y que tienen carga estabilizada que tienen sustancialmente un diámetro promedio menor a alrededor de 100 nanómetros y están configuradas de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar, tras el contacto de una célula viva con el fluido, la modulación de al menos uno de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular .

En aspectos particulares, los fluidos generados electrocinéticaménte se refieren a fluidos generados en presencia de efectos electrocinéticos (por ejemplo pulsos de voltaje/corriente) inducidos de forma hidrodinámica, localizados (por ejemplo, no uniformes con respecto al volumen de fluido total), tales como los efectos de dispositivo localizados por característica como se describen en la presente. En aspectos particulares, dichos efectos electrocinéticos inducidos de forma hidrodinámica y localizados están en combinación con efectos de doble capa y/o efectos de corriente de flujo relacionados con la superficie como se describe y se expone en la presente.

En aspectos particulares los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención administrados comprenden nanoestructuras que contienen oxígeno y que tienen carga estabilizada en una cantidad suficiente para proporcionar la modulación de al menos uno de un potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular. En algunas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente se superoxigenan (por ejemplo, RNS-20, RNS-40 y RNS-60,- que comprenden 20 ppm, 40 ppm y 60 ppm de oxígeno disuelto, respectivamente, en solución salina estándar) . En modalidades particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente no se superoxigenan (por ejemplo, RNS-10 o Solas, que comprende 10 ppm (por ejemplo, aproximadamente niveles ambientales de oxígeno disuelto en solución salina estándar) ) . En algunos aspectos, la salinidad, esterilidad, pH, etc., de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención se establecen al momento de la producción electrocinética del fluido y los fluidos estériles se administran por una vía adecuada. De manera alternativa, al menos una de la salinidad, esterilidad, pH, etc., de los fluidos se ajusta de forma apropiada (por ejemplo, usando solución salina estéril o diluyentes adecuados) para que sea fisiológicamente compatible con la vía de administración antes de la administración del fluido. Preferentemente, los diluyentes y/o soluciones salinas y/o composiciones amortiguadoras utilizados para ajusfar al menos una de salinidad, esterilidad, pH, etc., de los fluidos también son fluidos electrocinéticos , o son compatibles de otra manera.

En aspectos particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención comprenden solución salina (por ejemplo, una o más sales disueltas, por ejemplo, sales basadas en metales alcalinos (Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+, etc.), sales basadas en metales alcalinotérreos (por ejemplo, Mg++, Ca++) , etc., o iones positivos basados en metales de transición (por ejemplo, Cr, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, etc.), en cada caso junto con cualquier componente aniónico adecuado incluidos, de modo no taxativo, F-, Cl-, Br-, I-, P04-, S04-y aniones basados en nitrógeno. Los aspectos particulares comprenden fluidos electrocinéticos basados en sal mezclada (por ejemplo, Na+, K+, Ca++, Mg++, iones de metal de transición, etc.) en varias combinaciones y concentraciones y opcionalmente con mezclas de contraiones. En aspectos particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención comprenden solución salina estándar (por ejemplo, de NaCl aproximadamente al 0.9% o NaCl alrededor de 0.15 M). En aspectos particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención comprenden solución salina a una concentración de al menos 0.0002 M, al menos 0.0003 M, al menos 0.001 M, al menos 0.005 M, al menos 0.01 M, al menos 0.015 M, al menos 0.1 M, al menos 0.15 M o al menos 0.2 M. En aspectos particulares, la conductividad de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención es al menos 10 pS/cm, al menos 40 yS/cm, al menos 80 pS/cm, al menos 100 uS/cm, al menos 150 S/cm, al menos 200 pS/cm, al menos 300 yS/cm o al menos 500 yS/cm, al menos 1 mS/cm, al menos 5 mS/cm, 10 mS/cm, al menos 40 mS/cm, al menos 80 mS/cm, al menos 100 mS/cm, al menos 150 mS/cm, al menos 200 mS/cm, al menos 300 mS/cm o al menos 500 mS/cm. En aspectos particulares, cualquier sal se puede usar para la preparación de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención, siempre que permitan la formación de nanoestructuras biológicamente activas de sal estabilizada (por ejemplo, nanoestructuras que contienen oxigeno y de sal estabilizada) como se describen en la presente.

Conforme a aspectos particulares, los efectos biológicos de las composiciones de fluido de la invención que comprenden nanoestructuras que contienen gas y que tienen carga estabilizada se pueden modular (por ejemplo, aumentar, disminuir, afinar, etc.) mediante la alteración de los componentes iónicos de los fluidos y/o mediante la alteración del componente gaseoso del fluido.

Conforme a aspectos particulares, los efectos biológicos de las composiciones de fluido de la invención que comprenden nanoestructuras que contienen gas y que tienen carga estabilizada se pueden modular (por ejemplo, aumentar, disminuir, afinar, etc.) mediante la alteración del componente gaseoso del fluido. En aspectos preferidos, se usa oxigeno para preparar los fluidos electrocinéticos de la invención. En aspectos adicionales se pueden usar mezclas de oxigeno junto con al menos otro gas seleccionado de nitrógeno, oxigeno, argón, dióxido de carbono, neón, helio, criptón, hidrógeno y xenón. Tal como se describió anteriormente, los iones también se pueden variar, junto con los 'variados constituyentes de gas.

Dado lo expuesto y los sistemas de ensayo descritos en la presente (por ejemplo, ensayos de citocina basados en células, ensayos de fijación de membranas, etc.) un experto en la técnica será fácilmente capaz de seleccionar sales apropiadas y concentraciones de estas para lograr las actividades biológicas descritas en la presente.

TABLA 1. Ejemplos de cationes y aniones.

Cationes comunes: Nombre Fórmula Otro/s nombre/s Aluminio Al+3 Amonio NH4+ Bario Ba+2 Calcio Ca+2 Cromo (II) Cr+2 Cromoso Cromo (III) Cr+3 Crómico Cobre (I) Cu+ Cuproso Cobre (II) Cu+2 Cúprico Hierro (II) Fe+2 Ferroso Hierro (III) Fe+3 Férrico Hidrógeno H+ Hidronio H30+ Plomo (II) Pb+2 Litio Li+ Magnesio Mg+2 Manganeso ( II ) Mn+2 Manganoso Manganeso ( III ) Mn+3 Mangánico Mercurio (I ) Hg2+2 Mercurioso Mercurio (II) Hg+2 Mercúrico Nitronio N02+ Potasio K+ Plata g+ Sodio Na+ Estroncio Sr+2 Estaño (II) Sn+2 Estañoso Estaño (IV) Sn+4 Estáñico Cinc Zn+2 Aniones comunes: Iones simples: Hidruro H" Oxido Fluoruro F~ Sulfuro 2· Cloruro Cl" Nitruro Bromuro Br Yoduro · I" Oxoaniones Arseniato ASO, 3- Fosfato 04 Arsenito ASO, Fosfato de hidrógeno PO4 Fosfato de dihidrógeno Sulfato S04 Nitrato 03" Sulfato de hidrógeno HS0 Nitrito 02" Tiosulfato S203¿~ Sulfito S032" Perclorato CIO4" Yodato 03" Clorato CIO3" Bromato r03" Clorito clo2" Hipoclorito OC1" Hipobromito Br" Carbonato C032" Cromato r042" Carbonato o bicarbonato de HCO3" Dicromato r hidrógeno 2072 Aniones de ácidos orgánicos: Acetato CH3COO" formiato COO" Otros: Cianuro CN~ Amida H2" Cianato OCN" Peróxido 2- 2 Tiocianato SCN" Oxalato 2O42" Hidróxido OH" Permanganato n04" TABLA 2. Cationes y aniones de ejemplo Cationes monoatómicos Cationes multivalentes Aniones monoatómicos Aniones poliatómicos La presente divulgación establece fluidos enriquecidos con gas novedosos que incluyen, a modo no taxativo, soluciones acuosas iónicas enriquecidas con gas, soluciones salinas acuosas (por ejemplo, soluciones salinas acuosas estándar y otras soluciones salinas como se describe en la presente y como se reconocería en la técnica, incluidas cualesquiera soluciones salinas fisiológicamente compatibles), medio de cultivo celular (por ejemplo, medio mínimo y otros medios de cultivo) útiles en el tratamiento de diabetes o trastornos relacionados con la diabetes. Un medio o medios se denominan "mínimos" si solamente contienen los nutrientes esenciales para el cultivo. Para las células hospedadoras procariotas, un medio mínimo comúnmente incluye una fuente de carbono, nitrógeno, fósforo, magnesio y trazas de hierro y calcio. (Gunsalus y Stanter, The Bacteria,' V. 1, Capítulo 1 Acad. Press Inc., N.Y. (1960)). La mayoría de los medios mínimos usan glucosa como una fuente de carbono, amoníaco como una fuente de nitrógeno y ortofosfato (por ejemplo, P04) como la fuente de fósforo. Los componentes de medio se pueden variar o complementar de acuerdo al o a los organismos procariotas o eucariotas específicos cultivados, para fomentar el crecimiento óptimo sin inhibir la producción de proteínas diana. (Thompson et ál . , Biotech, and Bioeng. 27: 818824 (1985) ) .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente son adecuados para modular anchos de línea de 13C-NMR de solutos reporteros (por ejemplo, Trehelosa) disueltos en este. Los efectos de los anchos de línea NMR son un método indirecto de medición de, por ejemplo, la "caída" de soluto en un fluido de prueba como se describe en la presente en Ejemplos prácticos particulares.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente se caracterizan por al menos una de: diferencias de picos de voltametría de onda cuadrada distintivas en cualquiera de -0.14 V, -0.47 V, -1.02 V y -1.36 V; picos polarográficos a -0.9 voltios y una ausencia de picos polarográficos a -0.19 y -0.3 voltios que son únicos para los fluidos generados electrocinéticamente como se describe en la presente en Ejemplos de prácticos particulares .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente son adecuados para alterar la conductividad de la membrana celular (por ejemplo, una contribución dependiente del voltaje de la conductancia de célula entera como una medida en estudios de fijación de membranas descritos en la presente) .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente están oxigenados y el oxígeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 15 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm o al menos 60 ppm de oxigeno disuelto a presión atmosférica. En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente tienen menos de 15 ppm, menos de 10 ppm de oxigeno disuelto a presión atmosférica o niveles de oxigeno aproximadamente de ambiente.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente están oxigenados y el oxigeno en el fluido está presente en una cantidad entre aproximadamente 8 ppm y aproximadamente 15 ppm y en este caso se hace referencia a este en la presente como "Solas".

En aspectos particulares, el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende al menos uno de electrones solvatados (por ejemplo, estabilizados por oxigeno molecular) y especies de oxigeno cargadas y/o modificadas electrocinéticamente y donde, en determinadas modalidades, los electrones solvatados y/o las especies de oxigeno cargadas y/o modificadas electrocinéticamente están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm o al menos 20 ppm.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente son adecuados para alterar la estructura o función de la membrana celular (por ejemplo, alteración de una conformación, actividad de unión al ligando o una actividad catalítica de una proteína asociada a una membrana) lo suficiente como para proporcionar la modulación de la transducción de la señal intracelular, donde, en aspectos particulares, la proteína asociada a una membrana comprende al menos una seleccionada del grupo que consiste en receptores, receptores de transmembrana (por ejemplo, receptor acoplado a la proteína G (GPCR) , receptor TSLP, receptor adrenérgico beta 2, receptor de bradiquinina, etc.) proteínas del canal iónico, proteínas de unión intracelular, proteínas de adhesión celular e integrinas. En algunos aspectos, el receptor acoplado a proteína G (GPCR) realizado interactúa con una subunidad de proteína G (por ejemplo, GOÍS, GOÍÍ, -Goíq y Gai2) .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente son adecuados para modular la transducción de la señal intracelular, que comprende la modulación de una vía o sistema mensajero celular dependiente de calcio (por ejemplo, modulación de la actividad de fofolipasa C o modulación de la actividad de adenilato ciclasa (AC) ) .

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente se caracterizan por diversas actividades biológicas (por ejemplo, regulación de citocinas, receptores, enzimas y otras proteínas y vías de señalización intracelular ) descritas en los Ejemplos prácticos y en otras partes en la presente.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente muestran sinergia con cualquiera de eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgicos , inhibidores de monoamino oxidasa (selegilina, rasagilina) , promitocondriales (coenzima Q10, creatina), bloqueadores del canal de calcio ( isradipina) , alfa sinucleína y factores de crecimiento (GDNF) . En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente reducen la expresión del receptor TSLP inducida por DEP en las células epiteliales bronquiales (CEB) como se muestra en los Ejemplos prácticos de la presente.

En aspectos particulares, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente inhiben los niveles de MMP9 unidos a la superficie celular inducidos por DEP en las células epiteliales bronquiales (CEB) como se muestra en los Ejemplos prácticos de la presente.

En aspectos particulares, los efectos biológicos de los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente son inhibidos por la toxina difteria, lo que indica que el bloqueo beta, bloqueo de GPCR y bloqueo del canal de Ca afectan la actividad de los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente (por ejemplo, en la función del linfocito T regulador) como se muestra en los Ejemplos prácticos de la presente.

En aspectos particulares, los efectos físicos y biológicos (por ejemplo, la capacidad de alterar la estructura o función de la membrana celular lo suficiente como para proporcionar la modulación de la transducción de la señal intracelular ) de los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente persisten durante al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6 meses o períodos más prolongados, en un recipiente cerrado (ppr ejemplo, recipiente cerrado de forma hermética al gas) .

Por lo tanto, aspectos adicionales proporcionan dichas soluciones generadas electrocinéticamente y los métodos para producir un fluido o una solución acuosos oxigenados alterados electrocinéticamente que comprenden: proporcionar un flujo de un material de fluido entre dos superficies separadas en movimiento relativo y definir un volumen de mezcla entre ellos donde el tiempo de permanencia de un solo pasaje del material de fluido dentro y a través del volumen de mezcla es mayor que 0.06 segundos o mayor que 0.1 segundos e introducir oxígeno (02) en el material de fluido dentro del volumen de mezcla en condiciones adecuadas para disolver al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o al menos 60 ppm de oxigeno en el material y alterar electrocinéticamente el fluido o la solución. En algunos aspectos, el oxigeno se infunde en el material en menos de 100 milisegundos, menos de 200 milisegundos, menos de 300 milisegundos o menos de 400 milisegundos. En modalidades particulares, la relación del área de superficie respecto al volumen es de al menos 12, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50.

Aún aspectos adicionales proporcionan un método para producir un fluido o una solución acuosos oxigenados alterados electrocinéticamente que comprende: proporcionar un flujo de un material de fluido entre dos superficies separadas que definen un volumen de mezcla entre ellos e introducir oxigeno en el material que fluye dentro del volumen de mezcla en condiciones adecuadas para infundir al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, .al menos 50 ppm o al menos 60 ppm de oxigeno en el material en menos de 100 milisegundos, menos de 200 milisegundos, menos de 300 milisegundos o menos de 400 milisegundos. En algunos aspectos, el tiempo de permanencia del material que fluye dentro del volumen de mezcla es mayor que 0.06 segundos o mayor que 0.1 segundos. En modalidades particulares, la relación del área de superficie respecto al volumen es de al menos 12, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50.

Las modalidades adicionales proporcionan un método para producir un fluido o una solución acuosos oxigenados alterados electrocinéticamente que comprende el uso de un dispositivo de mezcla para crear una mezcla de salida mediante el mezclado de un primer material y un segundo material; el dispositivo comprende: una primera cámara configurada para recibir el primer material de una fuente del primer material, un estator, un rotor que tiene un eje de rotación, el rotor está colocado dentro del estator y está configurado para rotar alrededor del eje de rotación de este, al menos uno del rotor y el estator tiene una pluralidad de agujeros de paso; una cámara de mezcla definida entre el rotor y el estator, donde la cámara de mezcla está en comunicación fluida con la primera cámara y está configurada para recibir el primer material de allí y el segundo material se proporciona a la cámara de mezcla mediante la pluralidad de agujeros de paso formados en uno del rotor o el estator; una segunda cámara en comunicación fluida con la cámara de mezcla y configurada para recibir el material de salida de allí y una primera bomba interna alojada dentro de la primera cámara; la primera bomba interna está configurada para bombear el primer material de la primera cámara hacia la cámara de mezcla. En algunos aspectos, la primera bomba interna está configurada para impartir una velocidad circunferencial al primer material antes de que ingrese a la cámara de mezcla.

Modalidades adicionales proporcionan un método para producir un fluido o una solución acuosos oxigenados alterados electrocinéticamente que comprende el uso de un dispositivo de mezcla para crear una mezcla de salida mediante la mezcla de un primer material y un segundo material; el dispositivo comprende: un estator, un rotor que tiene un eje de rotación, el rotor está colocado dentro del estator y está configurado para rotar alrededor del eje de rotación en este; una cámara de mezcla definida entre el rotor y el estator, la cámara de mezcla tiene un primer extremo abierto a través del cual ingresa el primer material a la cámara de mezcla y un segundo extremo abierto a través del cual sale el material de salida de la cámara de mezcla, el segundo material ingresa a la cámara de mezcla a través de al menos uno del rotor o el estator; una primera cámara en comunicación con al menos una porción mayoritaria del primer extremo abierto de la cámara de mezcla y una segunda cámara en comunicación con el segundo extremo abierto de la cámara de mezcla.

Los aspectos adicionales proporcionan un fluido o una solución acuosos oxigenados alterados electrocinéticamente realizados de acuerdo con cualquiera de los métodos anteriores. En aspectos particulares los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención administrados comprenden nanoestructuras que contienen oxigeno y que tienen carga estabilizada en una cantidad suficiente para proporcionar la modulación de al menos uno de un potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular. En determinadas modalidades, los fluidos alterados electrocinéticamente se superoxigenan (por ejemplo, RNS-20, RNS-40 y RNS-60, que comprende 20 ppm, 40 ppm y 60 ppm de oxigeno disuelto, respectivamente, en solución salina estándar) . En modalidades particulares, los fluidos alterados electrocinéticamente no se superoxigenan (por ejemplo, RNS-10 o Solas, que comprende 10 ppm (por ejemplo, aproximadamente niveles ambientales de oxígeno disuelto en solución salina estándar) . En determinados aspectos, la salinidad, esterilidad, pH, etc., de los fluidos alterados electrocinéticamente de la invención se establecen al momento de la producción electrocinética del fluido y los fluidos estériles se administran por una vía adecuada. De manera alternativa, al menos una de la salinidad, esterilidad, pH, etc., de los fluidos se ajusta de forma apropiada (por ejemplo, usando solución salina estéril o diluyentes adecuados) para que sea fisiológicamente compatible con la vía de administración antes de la administración del fluido. Preferentemente, los diluyentes y/o soluciones salinas y/o composiciones amortiguadoras utilizados para ajustar al menos una de salinidad, esterilidad, pH, etc., de los fluidos también son fluidos electrocinéticos, o son compatibles de otra manera con estos.

La presente divulgación establece fluidos enriquecidos con gas novedosos que incluye, a modo no taxativo, soluciones acuosas iónicas enriquecidas con gas, soluciones salinas acuosas (por ejemplo, soluciones salinas acuosas estándar y otras soluciones salinas como se describe en la presente y como se reconocería en la técnica, incluyendo cualesquiera soluciones salinas fisiológicamente compatibles), medio de cultivo celular (por ejemplo, medio mínimo y otros medios de cultivo) .

Neurotoxinas : Por "agente tóxico" o "agente neurotóxico" (neurotoxina) se entiende una sustancia que a través de su acción química daña, deteriora o inhibe la actividad de un componente del sistema nervioso. La lista de agentes neurotóxicos que causan neuropatías es extensa (véase una lista de ejemplos de agentes neurotóxicos que se proporciona en la Tabla 3 más adelante) . Dichos agentes neurotóxicos incluyen, de modo no taxativo, agentes neoplásicos tal como vincristina, vinblastina, cisplatino, taxol, o compuestos dideoxi, por ejemplo, dideoxiinosina; alcohol; metales; toxinas industriales involucradas en exposición profesional o ambiental; contaminantes en alimentos o medicamentos; o sobredosis de vitaminas o fármacos terapéuticos, por ejemplo, antibióticos tal como penicilina o cloranfenicol , o megadosis de vitaminas A, D o B6.

La neurotoxicidad puede ocurrir tras la exposición a sustancias tóxicas naturales o artificiales (neurotoxinas ) que altera la actividad normal del sistema nervioso de manera que causa un daño al tejido nervioso y puede eventualmente dañar o destruir las neuronas. La neurotoxicidad puede ser causada por la exposición a sustancias utilizadas en quimioterapia, tratamiento con radiación, terapias de fármacos, abuso de determinados de fármacos y transplantes de órganos, asi como la exposición a metales pesados, determinados alimentos y aditivos de alimentos, pesticidas, solventes industriales y/o de limpieza, cosméticos y algunas sustancias de origen natural. Los síntomas pueden aparecer inmediatamente después de la exposición o ser tardíos. Pueden incluir debilidad o entumecimiento en miembros, pérdida de memoria, visión y/o capacidad intelectual, comportamientos obsesivos y/o compulsivos incontrolables, alucinaciones, dolor de cabeza, problemas cognitivos y de comportamiento y disfunción sexual. Los individuos con determinados trastornos pueden ser especialmente vulnerables a las neurotoxinas .

De acuerdo con modalidades particulares, las composiciones descritas en la presente se utilizan para prevenir o mejorar la neurotoxicidad causada por la exposición a una variedad de agentes como se expone en la presente.

Determinadas toxinas pueden causar neuropatía periférica. La toxicidad del plomo sea asocia a una neuropatía motora. El arsénico y el mercurio causan neuropatía sensorial. El talio puede causar una neuropatía sensorial y autonómica. Varios insecticidas y solventes orgánicos puede también causar polineuropatía . El alcohol es directamente tóxico para los nervios y el abuso del alcohol es una causa importante de neuropatía. El método de la presente puede utilizarse, en determinadas modalidades, como parte de un programa de desintoxicación más amplio.

En aún otra modalidad, los métodos y composiciones de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento de neuropatías causadas por fármacos. Se sabe que varios fármacos casan neuropatía. Estos incluyen, entre otros, vincristina . y cisplatino para el cáncer, nitrofurantoina, utilizada para la pielonefritis, amiodarona para arritmias cardiacas, disulfiram para el alcoholismo, ddC y ddl para el SIDA y dapsona la cual se utiliza para tratar la lepra. Como se mencionó anteriormente, el método de la presente puede utilizarse, en determinadas modalidades, como parte de un programa de desintoxicación más amplio.

Otro aspecto de la invención proporciona una terapia conjunta donde uno o más agentes terapéuticos se administran con el compuesto de la presente. Dicho tratamiento en conjunto puede llevarse a cabo a través de dosificaciones simultáneas, secuenciales o separadas de los compuestos individuales del tratamiento. La administración conjunta, por lo tanto, incluye la administración como parte de una misma preparación farmacéutica, la administración simultánea de preparaciones farmacéuticas separadas, asi como la administración de preparaciones farmacéuticas separadas a diferentes horas en el mismo dia, días adyacentes o de otra manera como parte de un régimen terapéutico individual. Por ejemplo, el método de la presente puede llevarse a cabo conjuntamente con otros agentes neuroprotectores . Las dosis descritas en la presente pueden ajustarse para compensar por dichos componentes adicionales en la composición terapéutica. El progreso del paciente tratado puede monitorearse mediante métodos convencionales.

En todavía otras modalidades, el método de la presente puede llevarse a cabo conjuntamente con la administración de factores de crecimiento y/o tróficos. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un factor trófico tal como un factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrófico ciliar, factor de crecimiento derivado de schwanoma, factor de crecimiento glial, factor neurotrófico derivado del cuerpo estriado, factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor neotrófico derivado del cerebro (FNDC) y factor de dispersión (FCH/FD) . Los agentes antimitogénicos también pueden utilizarse, como por ejemplo, citosina, arabinósido, 5-fluorouracilo, hidroxiurea y metotrexato.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz y/o cantidad profilácticamente eficaz de la composición administrada de la invención, por ejemplo, para ser adecuadamente neuroprotectora, puede realizarse fácilmente por un experto en la técnica mediante el uso de técnicas conocidas. Las dosificaciones pueden variar dependiendo de los requisitos del paciente según el criterio del médico tratante, la gravedad de la afección tratada, el riesgo de degeneración adicional al SNC y la neurotoxina particular. Para determinar la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz, y/o la cantidad o dosis profilácticamente eficaz, el médico tratante debe considerar una serie de factores, que incluyen, de modo no taxativo: la causa especifica del estado degenerativo y la probabilidad de que este reaparezca o empeore; las características farmacodinámicas del agente neurotóxico particular; el tiempo de duración deseado del tratamiento; la especie del mamífero; su tamaño, edad y estado de salud general; la respuesta del paciente individual; el compuesto particular administrado; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; el régimen de dosis seleccionado; la clase de tratamiento concurrente y otras circunstancias relevantes.

El tratamiento puede iniciarse con dosificaciones más pequeñas que son menores que la dosis óptima. A partir de ese momento, la dosificación se aumenta mediante pequeños incrementos hasta alcanzar el efecto óptimo dadas las circunstancias. Por conveniencia la dosificación total diaria puede dividirse y administrarse en porciones durante el día, si así se desea. Se espera que una cantidad trófica terapéuticamente eficaz y una cantidad neuroprotectora profilácticamente eficaz, por ejemplo, varíen dependiendo de la vía de administración, y otros factores como se expusieron anteriormente.

Las composiciones eficaces para la prevención o tratamiento de la degeneración de neuronas (por ejemplo, neuronas dopaminérgicas y motoneuronas y similares) en animales, por ejemplo, perros, roedores, pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos en seres humanos. Los expertos en la técnica del tratamiento de dichos trastornos en seres humanos tendrán como guia los datos obtenidos en los estudios animales para corregir la dosificación y la vía de administración del compuesto en seres humanos. En general, la determinación de la dosificación y la ruta de administración en seres humanos se espera que sean similares a la utilizada para determinar la administración en animales.

La identificación de dichos pacientes que necesitan tratamiento profiláctico para trastornos caracterizados por la degeneración de neuronas (por ejemplo, neuronas dopaminérgicas y/o motoneuronas y similares) está dentro de la capacidad y el conocimiento de un experto en la técnica. Algunos de los métodos para la identificación de pacientes que están en riesgo y que pueden ser tratados con el método de la presente son apreciados en la técnica médica, tal como la historia familiar del desarrollo de una enfermedad particular y la presencia de factores de riesgo asociados al desarrollo de dicha enfermedad en el paciente. Riesgo de exposición ambiental (por ejemplo química) . Un médico experto en la técnica puede identificar fácilmente dichos pacientes candidatos, mediante el uso de, por ejemplo, pruebas clínicas, exámenes físicos, la historia familiar/clínica, vocación/ocupación, etc.

Proteger a los soldados contra cualquier clase de amenaza y preservar su capacidad de pelear se ha vuelto una preocupación principal de los ejércitos. El gas nervioso (por ejemplo, sarín, somán o Vx) es una de dichas amenazas. Una clase de agentes nerviosos (también conocidos como gases nerviosos) son los químicos orgánicos que contienen fósforo (organofosfatos) que bloquean la acetilcolinesterasa, una enzima que normalmente relaja la actividad de la acetilcolina, un neurotransmisor . Hay dos clases principales de agentes nerviosos, agentes G (por ejemplo, GA, tabún o N, N-dimetilfosforamidocianidato de etilo; GB, sarín o metilfosfonofluoridato de O-isopropilo; GD, somán o metilfosfonofluoridato O-pinacolilo; GF, ciclosarín o metilfosfonofluoridato de ciclohexilo; GV, fluoruro P-[2- (dimetilamino) etil] -N, N-dimetilfosfonamídico) ) y agentes V (VE, etilfosfonotioato de O-etil de S- (dietilamino) etilo ; VG, Amitón o Tetram u O, O-dietil-S- [2- (dietilamino) etil] fosforotioato; VM, ácido fosfonotioico, metil-, éster O-etil de S-(2- (dietilamino) etilo) ) ; VX, O-etil-S- [2 (diisopropilamino) etil ] metilfosfonotiolato) . Un tercer grupo de agentes, los agentes Novichok, son compuestos órganofosfato que inhiben la enzima colinesterasa, evitando la descomposición normal de la acetilcolina .

Los insecticidas, los organofosfatos, tal como diclorvos, malatión y paratión, son agentes nerviosos.

TABLA 3 - Agentes Neurotoxicos En modalidades particulares, los métodos y composiciones de la presente invención pueden utilizarse para la prevención o mejora de una neurotoxicidad inducida por quimioterapia {véase, por ejemplo, la patente estadounidense N° 7,129,250 (publicada como 2004/0220202), la cual se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia, y en particular por su exposición de ejemplos de neurotoxinas) .

Por ejemplo, en modalidades particulares, los métodos y composiciones de la presente invención pueden utilizarse con un agente anticanceroso tal como un fármaco anticanceroso, una citocina y/o agentes potenciadores suplementarios. El uso de cócteles es rutinario en el tratamiento del cáncer. En esta modalidad, un vehículo de administración común (por ejemplo, una solución oral o inyectable, etc.) puede contener una composición de la presente invención y el fármaco anticanceroso y/o agente potenciador suplementario. Por lo tanto, los cócteles que comprenden composiciones de la presente invención así como otros compuestos están dentro del alcance de la invención.

Los compuestos que tienen propiedades antineoplésicas incluyen, de modo no taxativo: acivicina; aclarubicina; hidrocloruro de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleukina; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona; aminoglutetimida; amsacrina; anastrozol; ' antramicina; asparaginasa; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina; ba.timastat; benzodepa; bicalutamida; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico; bropirimina; busulfan; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; clorhidrato de carubicina; carzelesina; cedefingol;' clorambucil; cirolemicina; cisplatino; cladribina mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbacina; dactinomicina; clorhidrato de daunorubicina; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; diazicuona; docetaxel; doxorubicina; clorhidrato de doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflornitina; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; clorhidrato de epirubicina; erbulozol; clorhidrato de esorubicina; estramustina; fosfato sódico de estramustina; etanidazol; aceite etionizado I 131; etopósido; fosfato de etopósido; etoprina; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fosfato de fludarabina; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; oro Au 198; hidroxiurea; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; imofosina; interferón alfa-2a; interferón alfa-2b; interferón alfa-nl; interferón alfa-n3; interferón beta-la; interferón gama-Ib; iproplatino; clorhidrato de irinotecan; acetato de lanreotida; letrozol; acetato de leuprolida; clorhidrato de liarozol; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato losoxantrona; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina; acetato de megestrol; acetato de melengestrol; melfalan; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitospero; mitotana; clorhidrato de mitoxantrona; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurano; paclitaxel; pegaspargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina; perfosfamida; pipobromán; piposulfán; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfímero sódico; porfiromicina; prednimustina; clorhidrato de . procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; rogletimida; safingol; clorhidrato de safingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico; esparsomicina, clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina; estreptozocina; cloruro de estroncio Sr 89; sulofenur; talisomicina; taxano; taxoide; tecogalán sódico; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; tenipósido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; clorhidrato de topotecán; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucuronato de trimetrexato; triptorelina; clorhidrato de tubulozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina; sulfato de vinblastina; sulfato de vincristina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatino; zinostatina; clorhidrato de zorubicina.

Otros agentes antineoplásicos incluyen: 20epi-l,25 dihiroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleukina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulinico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inhibidores de la angiogénesis; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteina morfogenética anti-dorsalización 1; antiandrógeno, carcinoma prostético; antiestrógeno; antineoplaston; oligonucleótidos antisentido; glicinato de afidicolina; moduladores genéticos de la apoptosis; reguladores de la apoptosis; ácido apurinico; ara- CDP-DL-PTBA; arginina deaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrón; azatoxina; azatirosina; derivados de baccatina III; balanol; batimastato; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas ; benzoilestaurosporina; derivados de beta lactama; beta-aletina ; betaclamicina B; ácido betulinico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol ; calfostina C; derivados de camptotecina; c naripox IL-2; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína cinasa (ICOS); castanoespermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas; cicloplatamo; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citólitico; citostatina; dacliximab; decitabina; dehidrodidemnina B; deslorelina; dexifosfamida; dexrazoxana; dexverapamil ; diazicuona; didemnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina; difenil espiromustina; docosanol; dolasetrón; doxifluridina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebseleno; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflomitina; elemeno; emiteftir; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina; agonistas de estrógeno; antagonistas de estrógeno; etanidazol; etopósido fosfato; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; texafirina de gadolinio; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutatión; hepsulfam; heregulina; hexametileno bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastat; imidazoacridonas; imiquimod; péptidos inmunoestimulantes ; inhibidor del receptor del factor de crecimiento similar a insulina 1; agonistas de interferón; interferonse ; interleucinas; iobenguano; yododoxorubicina; ipomeanol, 4-; irinotecan; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrona; j asplaquinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarina-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinano; leptolstatina; letrozol; factor de inhibición de la leucemia; interferón alfa leucocitario; leuprolida+estrógeno+progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido disacárido lipofilico; compuestos de platino lipofilico; lissoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona; lovastatina; loxoribina; lurtotecán; texafirina de lutecio; lisofilina; péptidos Uticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de la matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim;. ARN de cadena doble mal apareado; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; mitotoxina de factor de crecimiento de fibroblastos-saporina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; anticuerpo monoclonal, gonadotropina coriónica humana; monofosforil lipido A+pared celular de micobacterias sk; mopidamol; inhibidor genético de resistencia múltiple a fármacos; terapia basada en el supresor de múltiples tumores 1; agente anticanceroso de mostaza; micaperóxido B; extracto de pared de células micobacterianas; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorubicina; ácido neridrónico; endopeptidasa neutra; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; antioxidante nitróxido; nitrulina; 06-bencilguanina; octreotida; okicenona; oligonucleótidos ; onapristona; ondansetrona; ondansetrona; oracina; inductor de citocina oral; ormiaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina; análogos de paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; polisulfato sódico de pentosán; pentostatina; pentrozol; perflubrona; perfosfamida; alcohol perílico; fenazinomicina; fenilacetato ; inhibidores de fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor del activador de plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo platino-triamina; porfimero sódico; porfiromicina; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores de proteasoma; modulador inmunitario basado en proteina A; inhibidor de proteina cinasa C; inhibidores de microalgas de proteina cinasa C; inhibidores de proteina tirosina fosfatasa; inhibidores de purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina ; conjugado de polioxietileno y hemoglobina piridoxilada; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrón; inhibidores de proteina farnesil transferasa rasl; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; etidronato de renio Re 186; rizoxina; ribozimas; retinamida RII; rogletimida; rohituquina; romurtida; roquinimex; rubiginona B 1; ruboxilo; safingol; saintopin; SarCNU; sarcopitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor 1 derivado de senescencia; oligonucleótidos de sentido; inhibidores de la transducción de la señal; moduladores de la transducción de la señal; proteina de unión a antigeno de cadena simple; sizofirano; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteina de unión a somatomedina; sonermina; ácido esparfósico espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; inhibidor de células madre; inhibidores de la división de células madre; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista superactivo de péptidos intestinales vasoactivos; suradista; suramina; swainsonina; glicosaminoglicanos sintéticos; talimustina; metyoduro de tamoxifeno; tauromustina; tazaroteno; tecogalan sódico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasa; temoporfina; temozolomida; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina; taliblastina; talidomida; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina ; timotrinano; hormona simuladora de tiroides; etil etiopurpurina de estaño; tirapazamina; clorhidrato de titanoceno; topotecán; topsentina; toremifeno; factor de célula madre totipotente; inhibidores de la traducción; tretinoina; · triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina; tropisetrona; turosterida; inhibidores de tirosina cinasa; trifostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor urocinasa; vapreotida; variolina B; sistema vector, terapia génica de eritrocitos; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; estimalémero de zinostatina .

Los agentes anticancerosos potenciadores suplementarios incluyen, de modo no taxativo: fármacos antidepresivos triciclicos (por ejemplo, imipramina, desipramina, amitriptilina, clomipramina, trimipramina, doxepina, nortriptilina, protriptilina, amoxapina y maprotilina) ; fármacos antidepresivos no triciclicos (por ejemplo, sertralina, trazodona y citalopram) ; antagonistas de Ca++ (por ejemplo, yerapamilo, nifedipina, nitrendipina y caroverina) ; inhibidores de calmodulina (por ejemplo, prenilamina, trifluoroperazina y clomipramina) ; anfotericina B; análogos de triparanol (por ejemplo, tamoxifeno) ; fármacos antiarrítmicos (por ejemplo, quinidina) ; fármacos antihipertensivos (por ejemplo, reserpina) ; destructores de tiol (por ejemplo, butionina y sulfoximina) y agentes que reducen la Resistencia Múltiple a Fármacos tal como Cremafor EL.

Inflamación La inflamación puede ocurrir como una respuesta defensiva a la invasión del sujeto por materiales extraños, particularmente de origen microbiano. Además, el traumatismo mecánico, las toxinas · y la neoplasia pueden inducir respuestas inflamatorias. La acumulación y posterior activación de leucocitos son eventos principales en la patogénesis de la mayoría de las formas de inflamación. Las deficiencias de inflamación pueden poner en riesgo al hospedador, haciéndolo susceptible a que la infección o el traumatismo empeoren la inflamación excesiva, tal como las respuestas inflamatorias prolongadas, puede dar como resultado enfermedades inflamatorias que incluyen, de modo no taxativo, diabetes, arterieesclerosis, cataratas, trastornos crónicos de la piel, lesión por reperfusión y cáncer, síndromes post infecciosos tales como en la meningitis infecciosa, fiebre reumática y enfermedades reumáticas tales como lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide. Estas enfermedades afectan a millones de personas en todo el mundo cada año y llevan a un aumento de la mortalidad y morbilidad. Lo.s elementos en común de la respuesta inflamatoria en estos procesos de enfermedad variados hacen que su regulación sea un elemento principal en la prevención o tratamiento de enfermedades humanas.

La sobreproducción de citocinas proinflamatorias se ha involucrado en la patogénesis de numerosas enfermedades inflamatorias y autoinmunes. La secreción de TNF es un evento primario en el inicio de la cascada inflamatoria (Brennan F. M., et ál. Lancet , 1989, 2:244-7; Ha orth C, et ál. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579) y contribuye directamente con el inicio y el mantenimiento de estas enfermedades. Otras citocinas también están involucradas, incluyendo interleucina 1ß (IL-?ß), IL-6, IL-8, IL-12 óxido nítrico (ON) , IFN-?, factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de estimulación de colonias de macrófagos (GM-CSF) e IL-10. Algunas de estas citocinas (por ejemplo IL-8) podrían aumentar o exacerbar una respuesta inflamatoria, mientras que otros (por ejemplo IL-10) podrían disminuir o aliviar la respuesta inflamatoria.

Las células del sistema inmunitario, en particular los macrófagos, secretan muchas de estas citocinas en respuesta a los estímulos de activación. Las células diana de las citocinas se pueden ubicar en cualquier cavidad del cuerpo y pueden actuar por medio de mecanismos de larga distancia o pueden actuar en células vecinas. Por lo tanto, las citocinas pueden regular la inflamación en una forma localizada o sistémica.

Metaloproteinasas Las metaloproteinasas son una superfamilia de proteinasas (enzimas) clasificadas en familias y subfamilias como se describe en, por ejemplo, N. M. Hooper FEBS Letters 354:1-6, 1994. Los ejemplos de las metaloproteinasas incluyen las metaloproteinasas de matriz (MMP, por sus siglas en inglés) tal como las colagenasas (MMP1, MMP8, MMP13) , las gelatinasas (M P2, M P9) , las estromelisinas (MMP3, MMP10, MMP II), matrilisina (MMP7), metaloelastasa ( MP12), enamelisina (MMP19) , las MT-MMP (MMP1 , MMP15, MMP16, MMP17); la familia de reprolisina o adamalisina o MDC que incluye las secretasas y desintegrasas tales como las enzimas que convierten TNF (ADAM10 y TACE) / la familia astacina que incluye enzimas tales como proteinasa que procesa procolágeno (PCP) ; y otras metaloproteinasas tales como agrecanasa, la familia de enzimas que convierten endotelina y la familia de enzimas que convierten angiotensina . De manera colectiva, se sabe que las metaloproteinasas escinden un amplio rango de sustratos de matriz tales como colágeno, proteoglicano y fibronectina . Las metaloproteinasas están involucradas en el procesado, o secreción, de mediadores celulares biológicamente importantes, tales como el factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) ; y el procesado de proteolisis post traduccional, o desintegración de proteínas de membrana biológicamente importantes, tal como el receptor IgE de baja afinidad CD23 (véase, por ejemplo, N. M. Hooper et al., Biochem. J. 321:265279, 1997).

No es sorprendente, sin embargo, que se crea que las metaloproteinasas son importantes en muchos procesos fisiológicos de enfermedades que involucran la remodelación de tejidos (por ejemplo, desarrollo embrionario, formación ósea, remodelación uterina durante la menstruación, etc.).

Además, la inhibición de la actividad de una o más metaloproteinasas podría ser beneficioso para estas enfermedades o afecciones, por ejemplo: varias enfermedades inflamatorias y alérgicas tales como inflamación de una articulación (especialmente artritis reumatoide, osteoartritis y gota) , inflamación del tracto gastrointestinal (especialmente la enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa y gastritis) , inflamación de la piel (especialmente psoriasis, eccema, dermatitis) ; para la metástasis o invasión tumoral; para enfermedades asociadas a la degradación descontrolada de la matriz extracelular tal como osteoartritis; para enfermedades resortivas oseas (tales como osteoporosis y enfermedad de Paget) ; para enfermedades asociadas a angiogénesis anormal; la remodelación mejorada de colágeno asociada a diabetes, enfermedad periodontológica (tal como gingivitis) , ulceración de la córnea, ulceración de la piel, afecciones postoperatorias (tal como anastomosis colónica) y la cura de lesiones dérmicas; enfermedades desmielinizantes del sitema nervioso central y periférico (tal como esclerosis múltiple) ; enfermedad de Alzheimer; remodelación de la matriz extracelular observada en enfermedades cardiovasculares tal como restenosis y aterosclerosis, asma, rinitis y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) .

La MMP12, también conocido como macrófago elastasa o metaloelastasa, fue clonada inicialmente en ratones (Shapiro et ál., Journal of Biological Chemistry 267: 4664, 1992) y también fue clonada en seres humanos por el mismo grupo en 1995. La MMP12 se expresa preferentemente en macrófagos activados y se ha demostrado que es secretada por macrófagos alveolares en fumadores (Shapiro et ál, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268: 23824) asi como en células espumosas en lesiones ateroescleróticas (Matsumoto et ál, Am. J. Pathol. 153: 109, 1998) . Un modelo de ratón de EPOC está basado en someter a los ratones a prueba con humo de cigarros durante seis meses, dos cigarros al día, seis días a la semana. Los ratones de tipo salvaje desarrollaron enfisema pulmonar después de este tratamiento. Cuando se sometieron a prueba los ratones con MMP12 inactivada en este modelo, no desarrollaron un enfisema significativo, lo cual indica de manera contundente que la MMP12 es una enzima clave en la patogénesis de EPOC. El papel de la MMP tal como la MMP12 en EPOC (enfisema y bronquitis) se discute en Anderson y Shinagawa, 1999, Current Opinión in Anti-inflammatory and I munomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29-38. Se descubrió recientemente que el fumar aumenta la infiltración de macrófagos y la expresión de MMP-12 derivada de macrófagos en placas de las arterias carótidas humanas (Matetzky S, Fishbein M C et ál . , Circulation 102: (18), 36-39 Suppl . S, 31 de octubre de 2000) .

La MMP9 (gelatinasa B, colagenasa 92 kDa Tipo IV; gelatinasa kDa 92) es una proteína secretada que fue purificada por primera vez, luego clonada y secuenciada, en 1989 (S. M. Wilhelm et ál., J. Biol. Chem. 264 (29): 17213-17221, 1989; errata publicada en J. Biol. Chem. 265 (36): 22570, 1990) (por una reseña de la información y referencias de detalladas de esta proteasas véase T. H. Vu & Z. Werb (1998) (En: Matrix Metalloproteinases, 1998, editada por W. C. Parks & R. P. Mecham, páginas 115-148, Academic Press. ISBN 0-12-545090-7) . La expresión de MMP9 está restringida normalmente a unos pocos tipos de células, incluyendo trofoblastos , osteoclastos , neutrófilos y macrófagos (Vu & Werb, supra) . Sin embargo, la expresión se puede inducir en estas mismas células y en otros tipos de células por medio de varios mediadores, incluyendo la exposición de las células a factores de crecimiento o citocinas. Estos son los mismos mediadores que a veces se involucran en el inicio de la respuesta inflamatoria. Al igual que con otras MMP secretadas, la MMP9 se libera como una proenzima inactiva, que se escinde subsiguientemente para formar una enzima activa enzimáticamente . Las proteasas necesarias para esta activación in vivo son desconocidas. El balance de la MMP9 activa comparado con la enzima inactiva se regula adicionalmente in vivo mediante la interacción con TIMP-1 (inhibidor de tejidos de metaloproteasas 1), una proteina de origen natural. El TIMP-1 se une a la región del extremo C de MMP9, lo que conlleva a la inhibición del dominio catalítico de MMP9. El balance de la expresión inducida de ProMMP9, la escisión de proMMP9 a MMP9 activa y la presencia de TIMP-1 se combinan para determinar la cantidad de MMP9 catalíticamente activa que está presente en un sitio local. La MMP9 proteolíticamente activa ataca los sustratos que incluyen gelatina, elastina y colágenos naturales Tipo IV y Tipo V; no tiene actividad contra colágeno natural Tipo I, proteoglicanos o lamininas. Ha habido un conjunto creciente de datos que indican el papel de la MMP9 en varios procesos fisiológicos y patológicos. El papel fisiológico incluye la invasión de trofoblastos embrionarios a través del epitelio uterino en las primeras etapas de la implantación embrionaria; algún papel en el crecimiento y desarrollo de los huesos; y la migración de células inflamatorias desde la vasculatura hacia los tejidos.

La liberación de MMP9, medida utilizando un inmunoensayo de enzimas, fue significativamente mejorada en fluidos y en sobrenadantes AM de asmáticos sin tratamiento comparados con aquellos de otras poblaciones (Am. J. Resp.

Cell & Mol. Biol, 5:583-591, 1997) . También, la expresión aumentada de MMP9 se ha observado en otras afecciones patológicas, lo cual involucra a la MMP9 en procesos de enfermedades como EPOC, artritis, metástasis de tumores, enfermedad de -Alzheimer, esclerosis múltiple y ruptura de placas en aterosclerosis que lleva a afecciones coronarias agudas tal como infarto de miocardio (véase también WO07087637A3, incorporada a la presente mediante esta referencia) .

Recientemente, se ha demostrado que los niveles de MMP-9 tienen un aumento significativo en los pacientes con asma estable y aún mayor en pacientes con asma aguda en comparación con sujetos de control saludables. La MMP-9 juega un papel fundamental en la infiltración de células inflamatorias de las vías respiratorias y la inducción de la hiperreactividad de las vías respiratorias lo que indica que la MMP-9 puede tener un papel importante en la inducción y el mantenimiento del asma (Vignola et ál . , Sputum metalloproteinase-9/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis, TAm J Respir Crit Care Med 158:1945-1950, 1998; Hoshino et ál . , Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999; Simpson et ál., Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J Respir Crit Care Med 172:559-565,2005; Lee et ál., A muríne odel of toluene diisocyanate-índuced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001; y Lee et ál., Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003;111:1278-1284).

Inhibidores de MMP: Se conoce un número de inhibidores de metaloproteinasa (véanse, por ejemplo, las reseñas de los inhibidores de MMP de Beckett R. P. y hittaker M . , 1998, Exp. Opin. Ther. Patents, 8 (3) : 259-282; y de Whittaker M. et ál, 1999, Chemical Reviews 99 (9) : 2735-2776) . El documento WO 02/074767 describe derivados de hidantoina de fórmula que son útiles como inhibidores de MMP, particularmente como inhibidores potentes de MMP12. La solicitud de patente estadounidense N° de serie 11/721,590 (publicada como 20080032997) describe un grupo adicional de derivados de hidantoina que son inhibidores de metaloproteinasa y son de particular interés para inhibir las MMP tal como MMP12 y MMP9. Se describen derivados de triazolona novedosos para inhibir MMP tal como MMP12 y MMP9 en la solicitud de patente estadounidense N° de serie 10/593543 (publicada como 20070219217) . Se describen inhibidores adicionales de MMP12 y MMP9 en 11/509,490 (publicada como 20060287338) (véase también 10/831265 (publicada como 20040259896) ) .

De manera adicional, se observó que dos compuestos, 4- (4-fenoxifenilsulfonil)butan-l, 2-ditiol (1) y 5- (4-fenoxifenilsulfonil ) pentan-1 , 2-ditiol (2), se unian selectivamente e inhibían potentemente a MMP-2 y MMP-9 (Bernardo, et ál. (2002) J. Biol. Chem. 277:11201-11207). Estos dos compuestos podrían tener un uso clínico significativo para inhibir la MMP-2 y MMP-9 y por consiguiente disminuir la inflamación. De manera adicional, se observó que el uso de determinados antibióticos de tetraciclina (por ejemplo, minociclina y doxociclina) y a niveles subantibióticos inhibe efectivamente la actividad de la MMP. Determinados aspectos de la invención incluyen el uso de fluido de la invención en combinación con niveles subantibióticos útiles para inhibir la MMP.

Métodos de tratamiento El término "tratar" se refiere a, e incluye, revertir, aliviar, inhibir el avance de o prevenir una enfermedad, trastorno o afección o uno o más síntomas de estas; y "tratamiento" y "terapéuticamente" se refieren al acto de tratar, como se define en la presente.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es cualquier cantidad de cualquiera de los compuestos usados en el transcurso de la puesta en práctica de la invención proporcionada en la presente, que es suficiente para revertir, aliviar, inhibir el avance de o prevenir una enfermedad, trastorno o afección, o uno o más síntomas de estos .

Determinadas modalidades de la presente se refieren a composiciones y métodos terapéuticos para el tratamiento de un sujeto mediante la prevención o alivio de al menos un síntoma asociado a la exposición a una neurotoxina o agente neurotóxico. Por ejemplo, las composiciones y/o métodos terapéuticos descritos en la presente podrían ser útiles para el tratamiento o prevención de una o más afecciones o enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en esclerosis múltiple (EM) , enfermedad de Parkinson, amiloidosis (por ejemplo enfermedad de Alzheimer) , esclerosis lateral amiotrófica (ELA) , enfermedades priónicas y demencia asociada a VIH.

Muchas afecciones o enfermedades asociadas a la inflamación se han 'tratado con esferoides, metotrexato, fármacos inmunosupresores incluyendo ciclofosfamida, ciclosporina, azatioprina y leflunomida, agentes antiinflamatorios no esteroideos tales como aspirina, acetaminofeno e inhibidores de COX-2, agentes de oro y tratamientos contra la malaria. Éstos fármacos tienen una variedad de desventajas y reacciones adversas incluyendo reacciones en el sitio de inyección, sarpullido, infecciones de las vías respiratorias superiores, trastornos autoinmunes y un aumento en la susceptibilidad a infecciones. Además, muchos fármacos antiinflamatorios requieren la administración intravenosa (IV) o subcutánea (SC) a diferencia de vías dérmicas tópicas u orales más convenientes y aceptables. Por consiguiente, aún existe una necesidad de desarrollar medicamentos y métodos de tratamiento novedosos para afecciones y enfermedades relacionadas con la inflamación.

Terapia de combinación: Aspectos adicionales proporcionan los métodos de la invención descritos en la presente, que también comprenden una terapia de combinación, donde se administra al menos un agente terapéutico adicional al paciente. En determinados aspectos, al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste en cualquiera de eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347) , antiglutamatérgicos, inhibidores de monoamino oxidasa (selegilina, rasagilina) , promitocondriales (coenzima Q10, creatina), bloqueadores del canal de calcio ( isradipina) , alfa sinucleína y/o factores de crecimiento (GDNF) .

Actividad antiinflamatoria de los fluidos y soluciones enriquecidos con gas y generados electrocinéticamente : Conforme a algunos aspectos de la presente invención, los fluidos y/o soluciones enriquecidos con gas descritos en la presente tienen propiedades y efectos antiinflamatorios y se pueden usar como agentes antiinflamatorios para el tratamiento de sujetos que sufren enfermedades o trastornos asociados con la neurodegeneracion inflamatoria. Los resultados previos mostraron que el fluido (agua) enriquecido con oxígeno de la invención afectó la regulación por disminución de citocinas particulares, especialmente IL-6, IL-8 e IL-?ß en perfiles de citocina en linfocitos estimulados de donantes de sangre sanos.

Se cree que la producción aumentada de citocinas proinflamatorias está involucrada en la patogénesis de numerosas enfermedades inflamatorias y autoinmunes. La secreción de TNFOÍ es un evento primario en el inicio de la cascada inflamatoria (Brennan F. M . , et ál. Lancet, 1989, 2:244-7; Haworth C, et. al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579) y contribuye directamente al inicio y mantenimiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes . Otras citocinas proinflamatorias también juegan un papel, incluyendo la interleucina 1ß (IL-?ß), IL-6, IL-8, IL-12 óxido nítrico, IFN-? y GM-CSF, mientras que las citocinas antiinflamatorias tales como IL-10 podrían reducir la enfermedad. Las células del sistema inmunitario, en particular los macrofagos, secretan muchas de estas citocinas en respuesta a los estímulos de activación.

Una variedad de tipos celulares están involucrados en el proceso inflamatorio. La sobreproducción de TNFa por monocitos, macrofagos y otras células inmunes es un elemento clave en la patogénesis de una gran cantidad de enfermedades. Los macrofagos, y los linfocitos T en particular, juegan un papel fundamental en el inicio y mantenimiento de la respuesta inmunitaria. Una vez activados por estímulos patológicos o inmunogénicos, los macrofagos responden mediante la liberación de un hospedador de citocinas, incluyendo TNF-OÍ, IL-?ß, IL-8, IL-12, óxido nítrico (ON) , IL-6, GM-CSF, G-CSF, M-CSF y otros. Los linfocitos T liberan IL-2, IL-4, INF-? y otras citocinas inflamatorias. Estas citocinas activan otras células inmunitarias y algunas también pueden actuar como agentes citotóxicos independientes. La liberación excesiva de macrofagos y mediadores inflamatorios derivados de linfocitos T puede tener como resultado particularmente al daño de células 'normales y tejidos circundantes.

Se cree que las citocinas proinflamatorias estén involucradas en el VIH-SIDA y otras infecciones virales incluyendo citomegalovirus, virus de la gripe y la familia de virus del herpes. TNFa mejora la actividad basal del estimulador/promotor temprano inmediato del megalovirus himano y podría jugar un papel en la reactivación de la infección de HCMV latente en células premonocíticas (Prosch S., et ál. Virology 1995, 208:197-206).

De manera adicional, un número de citocinas inflamatorias contribuyen a la mortalidad en pacientes que sufren de sepsis o shock endotóxico. Por ejemplo, TNF-a e IL- 1ß tienen un papel central bien establecido en la sepsis, shock séptico y shock endotóxico. Los niveles aumentados de estas citocinas están asociados a fiebre, hipotensión y shock (Smith J. W. et ál. J. Clin. Oncol. 1992, 10:11411152; Chapman P. B., et. ál . J. Clin. Oncol. 1987, 5:1942-1951) junto con la inducción de la expresión génica de fosfolipasa A2 (Gronich J. , et ál . J. Clin. Invest. 1994, 93:1224-1233) y sintasa de ON.

La inducción de ON de células de músculo liso media la presión arterial promedio disminuida y la resistencia vascular sistémica durante el shock séptico, lo que sugiere un papel fundamental del ON. Por lo tanto, las terapias que apuntan a los efectos de regulación por disminución sobre IL-8, IL-?ß y ON podrían ser beneficiosas en el tratamiento de enfermedades o trastornos inflamatorios, incluyendo sepsis, shock séptico y choque endotóxico.

La sobreproducción de TNFa contribuye a las características clínicas de numerosas enfermedades autoinmunes tales como diabetes y artritis reumatoide. El lupus eritematoso sistémico (LES) también es provocado por niveles aumentados de IL-?ß y TNFa. Dentro de los pacientes con lupus, los niveles de proteína C reactiva, IL-lbeta y TNFa en suero eran mayores que en los controles, lo que sugiere que una respuesta inflamatoria aumentada juega un papel en la enfermedad (Liou L. B. Clin. Exp. Rheumatol . 2001, 19:515-523). Un estudio de pacientes con una forma de LES, lupus eritematoso neuropsiquiátrico (LESNP) , mostró que la cantidad de células mononucleares de sangre periférica expresan ARNm para TNFa así como el nivel de fluido cerebroespinal de metabolitos ON se correlacionaba con la gravedad de la enfermedad LESNP (Svenungsson E., et al. Ann. Rheum. Dis. 2001, 60:372-9).

IL-1 y TNFa juegan un papel fundamental en varias respuestas agudas así como crónicas en modelos animales. De manera adicional, IL-11, IFNa e IFN3 también pueden regular por aumento las reacciones inflamatorias. Por el contrario, algunas citocinas pueden estar involucradas en la regulación por disminución de las respuestas inflamatorias (es decir, IL-4, IL-10, IL-13, entre otras) . Como se establece en el Ejemplo 1, las células puestas en contacto con el fluido enriquecido con gas de la invención mostró un aumento en los niveles de IFN-? con el antigeno T3 en comparación con el medio de cultivo de control con antigeno T3, mientras que IL-8 era menor en el medio de cultivo enriquecido con gas de la invención con antigeno T3 que en el medio de cultivo de control con el antigeno T3. Además, los niveles de IL-6, IL-8 y TNF-OÍ eran menores en el medio enriquecido con gas de la invención con PHA que en el medio de control con PHA, mientras que los niveles de IL-?ß eran menores en el fluido enriquecido con gas de la invención con PHA en comparación con el medio de control con PHA. Solo en el medio enriquecido con gas de la invención los niveles de IFN-? eran más altos que en el medio de control. Estos resultados son coherentes con un microambiente antiinflamatorio.

El ON se reconoce como un mediador y regulador de las respuestas inflamatorias. Posee propiedades citotóxicas hacia los patógenos pero también puede tener efectos perjudiciales en los tejidos propios del sujeto. (Korhonen et ál., Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4(4) : 471-9, 2005). El ON reacciona con la ciclasa guanilato soluble para formar monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) que media muchos de los efectos de ON. El ON también puede interactuar con el oxígeno molecular y el anión de superóxido para producir especies de oxígeno reactivo que pueden modificar varias funciones celulares. Estos efectos indirectos del ON tienen un papel significativo en la inflamación, donde el ON se produce en altas cantidades por la sintasa de ON inducible (iNOS) y las especies de oxígeno reactivo se sintetizan por células inflamatorias activadas.

El ON se puede producir por queratinocitos, fibroblastos, células endoteliales y posiblemente otras. Algunas de las acciones vasculares de ON incluyen vasodilatación, inhibición de adhesión plaquetaria al endotelio vascular, inhibición de adhesión de leucocitos al endotelio vascular y depuración de superóxidos. (Shah et él., Env. Health Persp. v. 106 (5): 1139-1143.) Además, se ha demostrado que la inhibición de la síntesis del ON demora la contracción de heridas, altera la organización de colágeno y altera el espesor de la neoepidermis . (Amadeu y Costa, J. Cutan. Pathol. 33: 465-473, 2006.) La migración de mastocitos y antiogénesis en heridas también se ve afectada por la inhibición de ON. (Idem) Sin apegarse a ninguna teoría particular de mecanismo, en determinadas modalidades los fluidos enriquecidos con gas de la invención pueden modular la producción ON localizada y/o celular o degradación, consistente con el espectro de los efectos de cicatrización ilustrados en la sección de Ejemplos descritos en la presente. Debido a vías variables de regulación, en determinadas modalidades, el fluido enriquecido con gas de la invención puede aumentar la producción de ON y/o retrasar la degradación del ON, mientras que en otras modalidades, el fluido enriquecido con gas de la invención puede disminuir la producción de ON y/o acelerar la degradación del ON.

Específicamente, las heridas tratadas con solución salina enriquecida con oxígeno mostraron un aumento en la cicatrización en los días 4 a 11 y entre los días 3 y 11, la nueva epidermis en las heridas tratadas con solución salida enriquecida con oxígeno migraron de dos a cuatro veces tan rápido como la epidermis de heridas tratadas con la solución salina normal, como se establece en el Ejemplo 9 en la presente. El estudio también mostró que entre 15 y 22 días, las heridas tratadas con la solución salina enriquecida con oxígeno se diferenciaban a una velocidad más rápida según se evidencia por la formación más temprana de capas de epidermis más maduras. En todas las etapas, el engrosamiento que se produce en la epidermis asociado con la curación normal no ocurrió dentro de las heridas tratadas con la solución salina enriquecida con oxigeno.

Por lo tanto, de acuerdo con este espectro de efectos cicatrizantes, pero sin apegarse a ninguna teoría particular, se cree que la solución salina enriquecida con oxígeno puede modular el nivel localizado y/o celular de ON dentro de las heridas. El ON modula los factores de crecimiento, la acumulación de colágeno, la inflamación, la migración de mastocitos, el engrosamiento epidérmico y la neovascularización en la cicatrización. Además, se produce óxido nítrico por una enzima inducible que es regulada por oxígeno .

En el caso de la migración de mastocitos, también se produjeron diferencias en la migración temprana y tardía para la solución enriquecida con oxígeno. Esto es consistente con lo que se conoce en la técnica con respecto a la inhibición de la síntesis de ON (Amadeu and Costa, J. Cutan Pathol 33: 465-473, 2006).

En las primeras dos fases del proceso inflamatorio, el cuerpo extraño se destruye, por ejemplo, si el cuerpo extraño es un organismo o el tejido alrededor de este se suelta, por ejemplo, si es una astilla. En la fase de curación, la inflamación comienza a disminuir, los vasos sanguíneos individuales y los patrones vasculares se vuelven normales otra vez y comienza la reparación de la herida. Los tres eventos principales del proceso de reparación son (1) formación del nuevo tejido conector por fibroblastos en proliferación, (2) regeneración de epitelio y (3) extensión de nuevos capilares.

Aún antes de que la inflamación disminuya, los fibroblastos comienzan a moverse al área lesionada desde el tejido normal circundante, donde generalmente existe un estado latente. Migran por un movimiento ameboideo a través de hebras de fibrina y se distribuyen a través del área de curación. Una vez que están fijados en posición en el tejido lesionado, comienzan a sintetizar colágeno y secretar esta proteina, que se dispone a si misma en fibras. Las fibras se orientan con sus ejes longitudinales en la dirección de mayor tensión. A medida que los manojos de colágeno crecen en firmeza, los fibroblastos gradualmente se degeneran y se unen cerca de' los manojos y el área lesionada se transforma en tejido cicatrizal.

De forma simultánea con la formación de tejido cicatrizal, las células de la epidermis intacta en el borde de la herida comienzan a proliferar y se mueven, como una sola lámina, hacia el centro del área lesionada. A medida que la inflamación disminuye, surge una necesidad por un suministro directo de sangre y se produce angiogénesis en el sitio de la herida.

La inflamación es un proceso complejo que implica múltiples tipos celulares. Por ejemplo, los mastocitos liberan mediadores que desencadenan una fase temprana de vasodilatación, acompañada por la separación de células endoteliales y la exposición de fibras de colágeno en la capa subendotelial . Las fibras en los huecos intercelulares que se forman en los vasos sanguíneos atrapan plaquetas y desencadenan la liberación de mediadores de estas células.

Además de las plaquetas, las fibras de colágeno expuestas también interactúan con proteínas del plasma que se filtran a través de los poros de la pared de vasos dilatados, incluyendo el factor de desencadenamiento de la cascada de coagulación, vasodiltación aumentada, permeabilidad de vasos sanguíneos aumentada y quimiotaxis .

Además, la cascada de complemento se puede activar por diversos estímulos: los vasos sanguíneos lesionados, las enzimas proteolíticas liberadas por las células dañadas, los componentes de membrana de cualquiera de las bacterias que participan y los complejos antígeno-anticuerpo . Algunos de los componentes de complemento activados actúan como factores quimiotácticos, responsables del aflujo de leucocitos al área inflamada, mientras que otros facilitan la fagocitosis y participan en la lisis celular.

Además, se cree que los fluidos o soluciones enriquecidos con gas de la invención también pueden regular al menos una citocina involucrada en al menos un aspecto de la inflamación, la o las citocias incluyen, a modo no taxativo FAM (factor de activación de macrófagos) , FIM (factor de inhibición de migración de macrófagos), FQM (factor quimiotáctico de macrófagos), FIML (factor de inhibición de migración de leucocitos) FLH (factores de liberación de histamina) , FT (factores de transferencia), interleucinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-ß, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, etc.), TNF-OÍ, TNF-3 , interferones ( I FN-OÍ , I FN-ß , IFN-?, IFN-?, IFN-d, etc.), G-CSF (factor de estimulación de la colonia de granulocitos) , GM-CSF (CSF de granulocito-macrófago) , M-CSF (CSF macrófago) , multi-CSF (IL-3), factor de crecimiento de fibroblastos (aFGF, bFGF) , FCE (factor de crecimiento epidérmico), NGF (factor de crecimiento nervioso), FCDP (factor de crecimiento derivado de plaquetas), FCEV (factor de crecimiento endotelial vascular) , factores de crecimiento transformantes (TGF- , TGF-ß, etc.), NAP-2 (proteína 2 activadora de neutrófilos) , PF-4 (factor de plaquetas 4), tromoglobulina, MCP-1 (proteína quimioatrayente de monocitos 1), MCP-3, ???-?a, ???-1ß-+ (proteínas inflamatorias de macrófago) , RA TES (quimiocina supuestamente secretada y expresada con T normal regulada tras activación) , HSP (proteínas de shock térmico) , GRP (proteínas reguladas por gluocsa), ubiquitina y otras.

Por lo tanto, en algunas modalidades, las composiciones terapéuticas y/o los fluidos enriquecidos con gas pueden aumentar la producción y/o secreción de moléculas o citocinas antiin.flamatoiras o disminuir la degradación de moléculas o citocinas antiinflamatorias, aliviando o previniendo así al menos un síntoma de la inflamación y/o neurodegeneración inflamatoria. En otras modalidades, las composiciones terapéuticas y/o los fluidos enriquecidos con gas de la presente invención pueden disminuir la producción y/o secreción de moléculas o citocinas proinflamatoiras o aumentar la degradación de moléculas o citocinas proinflamatorias, aliviando o previniendo así al menos un síntoma de la. inflamación y/o neurodegeneración inflamatoria.

Los estudios previos han mostrado un papel crucial de los anticuerpos anti-MOG en el aumento de la desmielinización y el desmejoramiento de la EAE (encefalomielitis autoinmune experimental), un sistema de modelo animal para el trastorno autoinmune humano de artritis reumatoide. (Linington, et ál . 1992. J. Neuroimmunol . 40:219-224) . Además, los anticuerpos contra MOG están implicados en la patogéneis de la esclerosis múltiple. (Berger et ál. N. Engl. J. Med. 10 de julio de 2003; 349(2): 139-45).

Como se establece en los experimentos previos, el fluido enriquecido con gas de la presente invención amplifica la respuesta de linfocitos a un antigeno para el cual se habla sensibilizado previamente a un animal. Tal como se indica en los experimentos previos, la proliferación de linfocitos era mayor para la respuesta a la prueba de MOG cuando se cultivaron en fluido reconstituido con el fluido enriquecido con gas que comprende electrones solvatados de la invención, en comparación con fluido presurizado y oxigenado (recipiente de presión) o el fluido desionizado de control.

Interacciones moleculares pertinentes de ejemplo: De manera convencional, se cree que las propiedades cuánticas pertenecen a partículas elementales de menos de 10" 10 metros, mientras que el mundo macroscópico de nuestra vida diaria se conoce como clásico, en cuanto a que se comporta de acuerdo con las leyes de movimiento de Newton.

Recientemente, se describieron las moléculas como que forman grupos que aumentan su tamaño con la dilución. Estos grupos miden varios micrómetros de diámetro y se ha informado que aumentan su tamaño de manera no lineal con la dilución. Se ha planteado que los dominios coherentes cuánticos que miden 100 nanómetros de diámetro se originan en agua pura y las vibraciones colectivas de moléculas de agua en el dominio coherente pueden eventualmente engancharse en fase a fluctuaciones de campo electromagnético, proporcionando oscilaciones estables en el agua, suministrando una forma de "memoria" en la forma de excitación de oscilaciones coherentes duraderas especificas para sustancias disueltas en el agua que cambian la estructura colectiva del agua, que pueden determinar a su vez las oscilaciones coherentes especificas que desarrollan. Mientras que estas oscilaciones se estabilizan por medio de una fase de acoplamiento de un campo magnético, el agua, luego de ser diluida, puede contener aún oscilaciones coherentes "originales". Mientras un grupo de moléculas aumenta su tamaño, su firma electromagnética se amplifica, en forma correspondiente, reforzando las oscilaciones coherentes transportadas por el agua.

A pesar de las variaciones en el tamaño del grupo de las moléculas disueltas y la estructura microscópica detallada del agua, puede existir no obstante una especificidad de oscilaciones coherentes. Un modelo para considerar cambios en las propiedades del agua se basa en las consideraciones implicadas en la cristalización.

Un grupo de agua protonada simplificada que forma una jaula en nanoescala se muestra en la solicitud de patente anterior del solicitante: WO 2009/055729. Un grupo de agua protonada tiene normalmente la forma de H+(H20)n. Algunos de los grupos de agua protonada tienen origen natural, tal como en la ionosfera. Sin limitarse a cualquier teoría particular y de acuerdo con aspectos particulares, son posibles otros tipos de grupos o estructuras de agua (grupos, nanojaulas, etc.), que incluyen estructuras que comprenden oxígeno y electrones estabilizados impartidos a los materiales de salida de la invención. Los átomos de oxígeno se pueden capturar en las estructuras resultantes. La química de la nanojaula semi enlazada permite que el oxígeno y/o los electrones estabilizados permanezcan disueltos durante períodos extendidos de tiempo. Otros átomos o moléculas, tales como compuestos medicinales, se pueden enjaular con fines de administración sostenida. La química específica del material de solución y los compuestos disueltos depende de las interacciones de esos materiales.

Se ha demostrado mediante experimentos que los fluidos procesados por el dispositivo de mezcla presentan características estructurales diferentes que son consistentes con un análisis del fluido en el contexto de una estructura de grupo. Véase, por ejemplo, WO 2009/055729.

Las nanoestructuras estabilizadas por carga (por-ejemplo, nanoestructuras que contienen oxígeno estabilizado por carga) : Tal como se describió anteriormente en la Solicitud WO 2009/055729 de los solicitantes, "Efecto de doble capa", "Tiempo de permanencia", "Velocidad de infusión" y "Mediciones del tamaño de burbujas", el dispositivo de mezcla electrocinético crea, en cuestión de milisegundos, una interacción dinámica de fluidos no lineales única del primer material y del segundo material con turbulencia dinámica que proporciona una mezcla compleja en contacto con un área de superficie efectivamente enorme (que incluye aquellos del dispositivo y de las burbujas de gas excepcionalmente pequeñas de menos de 100 nm) que proporciona los efectos electrocinéticos novedosos descritos en la presente. Además, se demostraron los efectos electrocinéticos localizados según su elemento (voltaje/corriente) usando un dispositivo de mezcla especialmente diseñado que comprende elementos de rotor y estator aislados.

Como se reconoce en la técnica, se sabe que las redistribuciones de carga y/o los electrones solvatados son altamente inestables en solución acuosa. De acuerdo con aspectos particulares, los efectos electrocinéticos de los solicitantes (por ejemplo, redistribuciones de carga, que incluyen, en aspectos particulares, electrones solvatados) se encuentran sorpresivamente estabilizados dentro del material de salida (por ejemplo, soluciones salinas, soluciones iónicas) . De hecho, como se describió en la presente, la estabilidad de las propiedades y la actividad biológica de los fluidos electrocinéticos de la invención (por ejemplo, RNS-60 o Solas) se pueden mantener durante meses en un recipiente cerrado hermético al gas, que indica la participación del gas disuelto (por ejemplo, oxigeno) para ayudar a generar y/o mantener, y/o mediar las propiedades y actividades de las soluciones de la invención. De manera significativa, las redistribuciones de carga y/o electrones solvatados están configurados de manera estable en los fluidos acuosos iónicos electrocinéticos de la invención en una cantidad suficiente como para proporcionar, tras el contacto con una célula viva (por ejemplo, célula de mamífero) por el fluido, la modulación de al menos uno de los potenciales de la membrana celular y de las conductividades de la membrana celular (véase, por ejemplo, Ejemplo práctico 23 de fijación de membrana celular de WO 2009/055729 y tal como se dispone en la presente) .

Tal como se describe en la presente en "Interacciones moleculares", para explicar la estabilidad y compatibilidad biológica de los fluidos electrocinéticos de la invención (por ejemplo, soluciones salinas electrocinéticas) , los solicitantes han planteado que las interacciones entre las moléculas de agua y las moléculas de las sustancias (por ejemplo, oxígeno) disueltas en el agua cambian la estructura colectiva del agua y proporcionan grupos de jaula de nanoescala, que incluyen nanoestructuras que comprenden oxigeno y/o electrones estabilizados impartidos a los materiales de salida de la invención. Sin limitarse al mecanismo, la configuración de las nanoestructuras en aspectos particulares es tal que: comprende (al menos para la formación y/o estabilidad y/o actividad biológica) gas disuelto (por ejemplo, oxigeno) ; permite que los fluidos electrocinéticos (por ejemplo, RNS-60 o fluidos de solución salina Solas) modulen (por ejemplo, impartan o reciban) cargas y/o efectos de carga tras el contacto con una membrana celular o constituyente relacionado con la misma y, en aspectos particulares, proporciona la estabilización (por ejemplo, arrastre, alojamiento, trampa) de electrones solvatados de una forma biológicamente relevante .

De acuerdo con aspectos particulares y tal como respalda la presente descripción, en soluciones iónicas o salinas (por ejemplo, solución salina estándar, NaCl) , las nanoestructuras de la invención comprenden nanoestructuras estabilizadas por carga (por ejemplo, diámetro promedio menor a 100 nm) que pueden comprender al menos una molécula de gas disuelto (por ejemplo, oxigeno) dentro de la capa de hidratación estabilizada por carga. De acuerdo con aspectos adicionales, la capa de hidratación estabilizada por carga puede comprender una jaula o hueco que aloja al menos una molécula de gas disuelto (por ejemplo, oxigeno) . De acuerdo con aspectos adicionales, en virtud de la disposición de capas de hidratación estabilizadas por carga adecuadas, la nanoestructura estabilizada por carga y/o nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxígeno pueden comprender adicionalmente un electrón solvatado (por ejemplo, electrón solvatado estabilizado) .

Sin limitarse al mecanismo o teoría particular, luego de la presente fecha de prioridad, se han planteado microburbu as estabilizadas por carga estabilizadas por iones en líquido acuoso en equilibrio con gas ambiente (atmosférico) (Bunkin et ál . Journal of Experimental and Theoretical Physics, 104:486-498, 2007; la cual se incorpora en su totalidad a la presente mediante esta referencia) . De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, los fluidos electrocinéticos novedosos de los solicitantes comprenden una forma biológicamente activa novedosa de nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxígeno y pueden comprender adicionalmente conjuntos, grupos o asociaciones novedosas de dichas estructuras.

De acuerdo con el modelo de microburbuj as estabilizadas por carga, el orden molecular a corta distancia de la estructura del agua se destruye por la presencia de una molécula de gas (por ejemplo, una molécula de gas disuelto inicialmente ligada a un ion de no adsorción proporciona un defecto de orden a corta distancia) , que proporciona condensación de gotas iónicas, donde el defecto está rodeado por primeras y segundas esferas de coordinación de moléculas de agua gue se rellenan de manera alterna por iones de adsorción (por ejemplo, adquisición de una "capa de análisis de iones Na+ para formar una doble capa eléctrica) y por iones de no adsorción (por ejemplo, iones Cl~ que ocupan la segunda esfera de coordinación) que ocupan seis y 12 lugares, respectivamente, en las esferas de coordinación. En soluciones iónicas no saturadas (por ejemplo, soluciones salinas no saturadas) , estos "núcleos" hidratados permanecen estables hasta que las primeras y segundas esferas se rellenan con seis iones de adsorción y cinco de no adsorción, respectivamente, y luego se someten a explosión de Coulomb creando un vacio interno que contiene la molécula de gas, donde los iones de adsorción (por ejemplo, iones Na+) se adsorben a la superficie por el vacio resultante, mientras que los iones de no adsorción (o alguna porción de los mismos) se propagan a la solución (Bunkin et ál . supra) . En este modelo, se evita que el vacio en la nanoestructura colapse por la repulsión de Coulomb entre los iones (por ejemplo, iones Na+) adsorbidos a su superficie. Se ha planteado que la estabilidad de las nanoestructuras que contienen el vacio se debe a la adsorción selectiva de iones disueltos con cargas similares en la superficie del vacio/burbuja y equilibrio difusivo entre el gas disuelto y el gas dentro de la burbuja, donde la presión electroestática negativa externa ejercida por la capa eléctrica doble proporciona una compensación estable para la tensión de la superficie y la presión del gas dentro de la burbuja se equilibra por la presión del ambiente. De acuerdo con el modelo, la formación de dichas microburbuj as requiere un componente iónico y, en determinados aspectos, las asociaciones mediadas por colisión entre partículas pueden proporcionar la formación de grupos de mayor orden (conjuntos) (Idem) .

El modelo de microburbuj as estabilizadas por carga sugiere que las partículas pueden ser microburbuj as de gas, pero contempla únicamente la formación espontánea de dichas estructuras en solución iónica en equilibrio con aire ambiente, no se caracteriza y no se hace mención alguna en cuanto a si el oxígeno es capaz de formar dichas estructuras, y asimismo tampoco hace mención alguna en cuanto a si los electrones solvatados se pueden asociar y/o estabilizar por dichas estructuras.

De acuerdo con aspectos particulares, los fluidos electrocinéticos de la invención que comprenden nanoestructuras estabilizadas por carga y/o nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno son novedosos y fundamentalmente diferentes a las estructuras atmosféricas y no electrocinéticas de microburbuj as estabilizadas por carga planteadas de acuerdo con el modelo de microburbuj as . De manera significativa, esta conclusión es inevitable y deriva, al menos en parte, del hecho de que las soluciones salinas de control no tienen las propiedades biológicas descritas en la presente, mientras que las nanoestrcuturas estabilizadas por carga de los Solicitantes proporcionan una forma biológicamente activa y novedosa de nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno.

De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, el dispositivo y los métodos electrocinéticos novedosos de los solicitantes proporcionan fluidos alterados electrocinéticamente novedosos que comprenden cantidades significativas de nanoestructuras estabilizadas por carga en exceso de cualquier cantidad que pueda o no ocurrir espontáneamente en fluidos iónicos en equilibrio con aire o en cualquier fluido generado de forma no electrocinética . En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga comprenden nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno. En aspectos adicionales, las nanoestructuras estabilizadas por carga son todas, o sustancialmente todas, nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno o las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno la especie principal de nanoestructura estabilizada por carga que contiene oxígeno en el fluido electrocinético .

De acuerdo con otros aspectos adicionales, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno pueden comprender o alojar un electrón solvatado y, por lo tanto, proporcionan un portador de electrones solvatados estabilizados novedoso. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno proporcionan un tipo novedoso de electruro (o electruro invertido) que, en contraste con los electruros de soluto convencional que tienen un único catión orgánicamente coordinado, tiene en cambio una pluralidad de cationes formados de manera estable alrededor de un vacío o un vacío que contiene un átomo de oxígeno, donde los iones de sodio formados se coordinan por capas de hidratación de agua, en vez de por moléculas orgánicas. De acuerdo con aspectos particulares, un electrón solvatado se puede ubicar por la capa de hidratación de moléculas de agua o se puede ubicar preferentemente dentro del vacio de nanoestructuras distribuido sobre todos .los cationes. En determinados aspectos, las nanoestructuras de la invención proporcionan una estructura de "super electruro" novedosa en solución que proporciona no solo la distribución/estabilización del electrón solvatado sobre cationes de sodio arreglados de manera múltiple, sino también la asociación o asociación parcial del electrón solvatado con la o las moléculas de oxigeno enjauladas en el vacio (el electrón solvatado se distribuye sobre un conjunto de átomos de sodio y al menos un átomo de oxigeno) . De acuerdo con aspectos particulares, por lo tanto, los "electrones solvatados" como se describen en la presente en asociación con los fluidos electrocinéticos de la invención, no se pueden disolver en el modelo tradicional que comprende hidratación directa por moléculas de agua. De manera alternativa, en analogía limitada con sales de electruro secas, los electrones solvatados en los fluidos electrocinéticos de la invención se pueden distribuir sobre nanoestructuras estabilizadas por carga múltiples para proporcionar una "pegamento de red" para estabilizar conjuntos de mayor orden en solución acuosa.

En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno son capaces de interactuar con membranas celulares o constituyentes de ellas o proteínas, etc., para mediar actividades biológicas. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno que alojan un electrón solvatado son capaces de interactuar con membranas celulares o constituyentes de ellas o proteínas, etc., para mediar actividades biológicas.

En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxígeno interactúan con membranas celulares o constituyentes de ellas o proteínas, etc., como una carga y/o donor del efecto de carga (administración), y/o como una carga y/o recipiente del efecto de carga para mediar actividades biológicas. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga de la invención y/o las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxígeno que alojan un electrón solvatado interactúan con membranas celulares como una carga y/o donor del efecto de carga, y/o como una carga y/o recipiente del efecto de carga para mediar actividades biológicas .

En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga ' de la invención y/o las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno son consistentes con y explican la estabilidad y propiedades biológicas observadas en los fluidos electrocinéticos de la invención, y proporcionan adicionalmente un electruro novedoso (o electruro invertido) que proporciona los electrones solvatados estabilizados en soluciones iónicas acuosas (por ejemplo, soluciones salinas, NaCl, etc.) .

En aspectos particulares, las nanoestructuras que contienen oxigeno estabilizado por carga comprenden sustancialmente, tienen la forma de o pueden dar lugar a nanoburbujas estabilizadas por carga que contienen oxigeno. En aspectos particulares, los grupos estabilizados por carga que contienen oxigeno proporcionan la formación de conjuntos relativamente mayores de nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno y/o nanoburbujas estabilizadas por carga que contienen oxigeno o conjuntos de ellas. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno pueden proporcionar la formación de nanoburbujas hidrofóbicas tras el contacto con una superficie hidrofóbica.

En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno comprenden sustancialmente al menos una molécula de oxigeno. En determinados aspectos, las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxígeno comprenden sustancialmente al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 50, al menos 100 o más moléculas de oxígeno. En aspectos particulares, las nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxígeno comprenden o dan lugar a nanoburbujas (por ejemplo, nanoburbujas hidrofóbicas ) de alrededor de 20 nm x 1.5 nm, comprenden alrededor de 12 moléculas de oxígeno (por ejemplo, basado en el tamaño de una molécula de oxígeno (aprox. 0.3 nm por 0.4 nm) , suposición de un gas ideal y aplicación de n=PV/RT, donde P= 1 atm, R= 0.082D057D1. atm/mol . K, T= 295K V= pr2h= .7xl0"22 L, donde r= lOxlO'9 m, h= 1.5xl0"9 m y n= 1.95xl0"22 moles) .

En determinados aspectos, el porcentaje de moléculas de oxígeno presentes en el fluido que están en dichas nanoestructuras o conjuntos de ellas que tienen una configuración estabilizada por carga en el fluido acuoso iónico es una cantidad porcentual seleccionada del grupo que consiste en mayor que: 0.1%, 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y mayor que 95%. De preferencia, este porcentaje es mayor que alrededor de 5%, mayor que alrededor de 10%, mayor que alrededor de 15% o mayor que alrededor de 20%. En aspectos adicionales, el tamaño sustancial de las nanoestructuras estabilizadas por carga gue contienen oxigeno o conjuntos de ellas que tienen una configuración estabilizada por carga en el fluido acuoso iónico es un tamaño seleccionado del grupo que consiste en menor que: 100 nm, 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 10 nm, 5 nm, 4 nm, 3 nm, 2 nm y 1 nm. De preferencia, el tamaño es menor que alrededor de 50 nm, menor que alrededor de 40 nm, menor que alrededor de 30 nm, menor que alrededor de 20 nm o menor que alrededor de 10 nm.

En determinados aspectos, los fluidos electrocinéticos de la invención comprenden electrones solvatados. En aspectos adicionales, los fluidos electrocinéticos de la invención comprenden nanoestructuras estabilizadas por carga y/o nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno y/o conjuntos de ellas, que comprenden al menos uno de: electrón/es solvatado/s y distribuciones de carga únicas (distribución de carga polar, simétrica, asimétrica) . En determinados aspectos, las nanoestructuras estabilizadas por carga y/o nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno y/o conjuntos de ellas tienen propiedades paramagnéticas .

En contraste, con relación a los fluidos electrocinéticos de la invención, los fluidos oxigenados de control de recipiente de presión (fluidos no electrocinéticos) y similares no comprenden dichas nanoestructuras biológicamente activas estabilizadas por carga y/o nanoestructuras estabilizadas por carga que contienen oxigeno biológicamente activas, generadas en forma electrocinética, y/o conjuntos de ellas, capaces de modular al menos uno de potenciales de membrana celular y conductividad de membrana celular.

Sistemas para realizar fluidos enriquecidos con gas El sistema y los métodos tal como se describen en la solicitud de patente WO 2009/055729 de los solicitantes permiten enriquecer el gas (por ejemplo, oxigeno) de forma estable a una concentración alta con una mínima pérdida pasiva. Estos sistemas y métodos pueden ser usados efectivamente para enriquecer una amplia variedad de gases a porcentajes aumentados en una amplia variedad de fluidos. Únicamente a modo de ejemplo, el agua desionizada a temperatura ambiente que tiene típicamente niveles de alrededor de 2-3 ppm (partes por millón) de oxígeno disuelto puede alcanzar niveles de oxígeno disuelto que oscilan desde al menos alrededor de 5 ppm, al menos alrededor de 10 ppm, al menos alrededor de 15 ppm, al menos alrededor de 20 ppm, al menos alrededor de 25 ppm, al menos alrededor de 30 ppm, al menos alrededor de 35 ppm, al menos alrededor de 40 ppm, al menos alrededor de 45 ppm, al menos alrededor de 50 ppm, al menos alrededor de 55 ppm, al menos alrededor de 60 ppm, al menos alrededor de 65 ppm, al menos alrededor de 70 ppm, al menos alrededor de 75 ppm, al menos alrededor de 80 ppm, al menos alrededor de 85 ppm, al menos alrededor de 90 ppm, al menos alrededor de 95 ppm, al menos alrededor de 100 ppm o cualquier valor mayor que o entre estos mediante los sistemas y/o métodos descritos. De acuerdo con una modalidad particular de ejemplo, el agua enriquecida con oxigeno se puede generar con niveles de alrededor de 30-60 ppm de oxigeno disuelto.

La Tabla 3 ilustra varias medidas de presión parcial tomadas de una herida en cicatrización, tratada con una solución salina enriquecida con oxigeno (Tabla 3) , y de muestras de la solución salina enriquecida con gas de la presente invención.

TABLA 3 MEDIDAS DE OXÍGENO EN TEJIDOS Sonda Z082BO Aire de entrada: 171 mmHg 23°C Columna Presión parcial (mmHg) Bl 32-36 B2 169-200 B3 20-180* B4 40-60 ^profundidad de herida mínima, mayoría > 150, ocasionalmente 20 s Vías y formas de administración En modalidades de ejemplo particulares, el fluido enriquecido con gas de la presente invención puede funcionar como una composición terapéutica sola o en combinación con otro agente terapéutico de modo que la composición terapéutica evite o mejore al menos un síntoma de la inflamación. Las composiciones terapéuticas de la presente invención incluyen composiciones que son capaces de administrarse a un sujeto que las necesita. En determinadas modalidades, la formulación de la composición terapéutica puede comprender también al menos un agente adicional seleccionado de un grupo que consiste de: portadores, adyuvantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, edulcorantes, saborizantes, perfumes y agentes enlazantes.

Tal como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" y "portador" se refieren en general a un material de relleno no tóxico sólido inerte, semisólido o liquido, diluyente, material de encapsulamiento o auxiliar de formulación de cualquier tipo. Algunos ejemplos no limitativos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables son azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras supositorias ; aceites tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles tales como propilenglicol; ésteres tales como etil oleato y etil laurato; agar; agentes amortiguadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua sin pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol de etilo y soluciones amortiguadores de fosfato; así como también otros lubricantes compatibles no tóxicos tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio; así como también agentes colorantes; agentes de liberación; agentes de recubrimiento; agentes edulcorantes, saborizantes y aromatizantes y conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, según el juicio del formulador. En aspectos particulares, dichos portadores y excipientes pueden ser fluidos o soluciones enriquecidas con gas de la presente invención .

Los portadores farmacéuticamente aceptables descritos en la presente, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, excipientes o diluyentes, son bien . conocidos para los expertos en la técnica. Típicamente, el portador farmacéuticamente aceptable es químicamente inerte para los agentes terapéuticos y no tiene efectos colaterales perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden incluir polímeros y matrices de polímeros, nanopartículas, microburbuj as y similares.

Además de los fluidos enriquecidos con gas terapéuticos de la presente invención, la composición terapéutica puede comprender adicionalmente diluyentes inertes tales como, agua enriquecida sin gas adicional u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes tales como alcohol de etilo, alcohol de isopropilo, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol , 1 , 3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, de maní, de maíz, de germen, de oliva, de ricino y de sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurilico, polietilenglicoles y ásteres de ácidos grasos de sorbitán y mezclas de ellos. Como lo observan los expertos en la técnica, se puede obtener una formulación novedosa y mejorada de una composición terapéutica particular, un fluido terapéutico enriquecido con gas novedoso y un método novedoso de administración del fluido terapéutico enriquecido con gas novedoso al reemplazar uno o más diluyentes inertes con un fluido enriquecido con gas de composición idéntica, similar o diferente. Por ejemplo, el agua convencional se puede reemplazar o suplementar por un fluido enriquecido con gas producido por la mezcla de oxigeno en agua o agua desionizada para proporcionar fluido enriquecido con gas.

En determinadas modalidades, el fluido enriquecido con gas de la invención se puede combinar con uno o más agentes terapéuticos y/o se puede usar solo. En modalidades particulares, la incorporación del fluido enriquecido con gas puede incluir el reemplazo de una o más soluciones conocidas en la técnica, tales como agua desionizada, solución salina y similares con uno o más fluidos enriquecidos con gas, proporcionando asi una composición' terapéutica mejorada para la administración al sujeto.

Determinadas modalidades proporcionan composiciones terapéuticas que comprenden un fluido enriquecido con gas de la presente invención, una composición farmacéutica u otro agente terapéutico o una sal farmacéuticamente aceptable o solvato del mismo y al menos un portador o diluyente farmacéutico. Estas composiciones farmacéuticas se pueden usar en la profilaxis y el tratamiento de las enfermedades o afecciones anteriores y en terapias como se mencionó anteriormente. De preferencia, el portador debe ser farmacéuticamente aceptable y deber ser compatible con, es decir, no debe tener un efecto perjudicial sobre los otros ingredientes en la composición. El portador debe ser un sólido o liquido y se formula preferentemente como una formulación de dosis unitaria, por ejemplo, un comprimido que puede contener desde 0.05 a 95% en peso del ingrediente activo .

Las vías de administración posibles incluyen la oral, sublingual, bucal, parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intraarterial , intraperitoneal, intracisternal, intravesical , intratecal o intravenosa) , rectal, tópica incluyendo transdérmica, intravaginal , intraocular, intraóptica, intranasal, por inhalación e inyección o inserción de dispositivos o materiales implantables .

Vías de administración Los medios de administración más adecuados para un sujeto particular dependerán de la naturaleza y gravedad de la enfermedad o afección que está siendo tratada o la naturaleza de la terapia que está siendo utilizada, así como también de la naturaleza de la composición terapéutica o agente terapéutico adicional. En determinadas modalidades, se prefiere la administración oral o tópica.

Las formulaciones adecuadas para administración oral se pueden proporcionar como unidades separadas, tales como comprimidos, cápsulas, obleas, jarabes, elíxires, goma de mascar, formulaciones "piruleta", microemulsiones, soluciones, suspensiones, grageas o ampollas recubiertas en gel, que contiene cada uno una cantidad predeterminada del compuesto activo como polvos o gránulos, como soluciones o suspensiones en líquidos acuosos o no acuosos, o como emulsiones de aceite en agua o agua en aceite.

Las formulaciones adecuadas adicionales para administración¦ oral se pueden proporcionar para incluir polvos o nieblas de finas partículas que se pueden generar por varios tipos de aerosoles, atomizadores, nebulizadores o insufladores presurizados de dosis fija. En particular, se pueden disolver o suspender polvos u otros compuestos de agentes terapéuticos en un fluido enriquecido con gas de la presente invención.

Las formulaciones adecuadas para métodos transmucosales, tal como por administración sublingual o bucal incluyen grageas, parches, comprimidos y similares que comprenden el compuesto activo y, normalmente, una base saborizante, tal como azúcar y acacia o tragacanto, y pastillas que comprenden el compuesto activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o acacia sacarosa.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral normalmente comprenden soluciones acuosas estériles que contienen una concentración predeterminada del fluido enriquecido con gas activo y posiblemente otro agente terapéutico. La solución es preferentemente isotónica con la sangre del recipiente pretendido. Las formulaciones adicionales adecuadas para la administración parenteral incluyen formulaciones que contienen co-solventes fisiológicamente adecuados y/o agentes complejantes, tales como tensioactivos y ciclodextrinas . Las emulsiones de aceite en agua pueden ser adecuadas también para formulaciones para administración parenteral del fluido enriquecido con gas. Aunque dichas soluciones se administran de preferencia intravenosamente, se pueden administrar también por inyección subcutánea o intramuscular.

Las formulaciones adecuadas para administración uretral, rectal o vaginal incluyen geles, cremas, lociones, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsiones, materiales sólidos solubles, duchas y similares. Las formulaciones se proporcionan preferentemente como supositorios de dosis unitarias que comprenden el ingrediente activo en uno o más portadores sólidos que forman la base del supositorio, por ejemplo, manteca de cacao. De manera alternativa, se pueden formular lavados colónicos con los fluidos enriquecidos con gas de la presente invención para administración colónica o rectal.

Las formulaciones adecuadas para aplicación tópica, intraocular, intraótica o intranasal incluyen ungüentos, cremas, pastas, lociones, pastas, geles (tales como hidrogeles) , atomizadores, polvos y gránulos dispersables, emulsiones, atomizadores o aerosoles que usan propelentes de flujo (tales como atomizadores liposomales, gotas nasales, atomizadores nasales y similares) y aceites. Los portadores adecuados para dichas formulaciones incluyen vaselina, lanolina, polietilenglicoles , alcoholes y combinaciones de ellos. La administración nasal o intranasal puede incluir dosis medidas de cualquiera de estas formulaciones u otras. Asimismo, la administración intraótica o intraocular puede incluir gotas, ungüentos, fluidos para la irritación y similares .

Las formulaciones de la invención se pueden preparar por cualquier método adecuado, comúnmente al mezclar de manera uniforme y homogénea el fluido enriquecido con gas opcionalmente con un compuesto activo con líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, en las proporciones requeridas y luego, en caso de que fuera necesario, moldeando la mezcla resultante en la forma deseada .

Por ejemplo, se puede preparar un comprimido mediante compresión de una mezcla homogénea que comprende un polvo o gránulos del ingrediente activo y uno o más ingredientes opcionales, tal como un aglutinante, lubricante, diluyente inerte o agente de dispersión activos de superficie o mediante moldeo de una mezcla homogénea del ingrediente activo en polvo y un fluido enriquecido con gas de la presente invención.

Las formulaciones adecuadas para administración por inhalación incluyen polvos o nieblas de partículas finas que se pueden generar por varios tipos de aerosoles, atomizadores, nebulizadores o aislantes presurizados de dosis fija. En particular, se pueden disolver o suspender polvos u otros compuestos de agentes terapéuticos en un fluido enriquecido con gas de la presente invención.

Para la administración pulmonar por la boca, el tamaño de partículas del polvo o gota se encuentra normalmente en el rango de 0.5-10 uM, preferentemente 1-5 ?, para asegurar la administración al árbol bronquial. Para la administración nasal, se prefiere un tamaño de partículas en el rango de 10-500 uM para asegurar la retención en la cavidad nasal.

Los inhaladores de dosis fija son dispensadores de aerosol presurizado, que contienen típicamente una suspensión o formulación de solución de un agente terapéutico en un propelente líquido. En determinadas modalidades, tal como se describe en la presente, los fluidos enriquecidos con gas de la presente invención se pueden usar además de o en lugar del propelente líquido estándar. Durante su uso, estos dispositivos descargan la formulación a través de una válvula adaptada para administrar un volumen medido, típicamente desde 10 a 150 i , para producir un atomizador de partículas finas que contiene el agente terapéutico y el fluido enriquecido con gas. Los propelentes adecuados incluyen determinados compuestos de clorofluorocarbono, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de estos.

La formulación puede contener adicionalmente uno o más co-solventes, por ejemplo, tensioactivos de etanol, tal como ácido oleico o trioleato de sorbitán, antioxidantes y agentes saborizantes adecuados. Los nebulizadores son dispositivos comercialmente disponibles que transforman soluciones o suspensiones del ingrediente activo en una niebla de aerosol terapéutica por medio de aceleración de un gas comprimido (típicamente aire u oxígeno) a través de un orificio Venturi angosto o por medio de agitación ultrasónica. Las formulaciones adecuadas para su uso en nebulizadores consisten en otro agente terapéutico en un fluido enriquecido con gas y comprenden hasta 40% p/p de la formulación, preferentemente menos de 20% p/p. Además, se pueden usar otros portadores, tal como agua destilada, agua estéril o una solución de alcohol acuosa diluida, que se hizo isotónica preferentemente con fluidos corporales por la adición de sales, tal como cloruro de sodio. Aditivos opcionales incluyen conservantes, en especial si la formulación no se prepara de manera estéril y pueden incluir benzoato de hidroximetilo, antioxidantes, agentes saborizantes, aceites volátiles, agentes tamponantes y tensioactivos .

Las formulaciones adecuadas para administración por insuflación incluyen polvos finamente triturados que se pueden administrar por medio de un insuflador o llevándose a la cavidad nasal en forma de rapé. En el insuflador, el polvo está contenido en cápsulas o cartuchos, normalmente de gelatina o plástico, que se perforan o abren en el lugar y el polvo se administra por aire emitido a través del dispositivo tras inhalación o por medio de una bomba operada manualmente. El polvo empleado en el insuflador consiste solamente en el ingrediente activo o en una mezcla de polvo que comprende el ingrediente activo, un diluyente en polvo adecuado, tal como lactosa, y un tensioactivo opcional. El ingrediente activo comprende normalmente desde 0.1 a 100 p/p de la formulación.

Además de los ingredientes específicamente mencionados anteriormente, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes conocidos por los expertos en la técnica, considerando los tipos de formulación en cuestión. Por ejemplo, las formulaciones adecuadas para administración oral pueden incluir agentes saborizantes y las formulaciones adecuadas para administración intranasal pueden incluir aromatizantes.

Las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar por cualquier método convencional adecuado para su uso junto con fármacos farmacéuticos, como agentes terapéuticos individuales o en combinación con agentes terapéuticos .

La dosificación administrada variará, por supuesto, dependiendo de factores conocidos, tales como las características farmacodinámicas del agente particular y su modo y vía de administración; la edad, salud y el peso de quien la recibe; la naturaleza y extensión de los síntomas; el tipo de tratamiento concomitante; la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado. Se espera que una dosificación diaria de ingrediente activo sea de 0.001 a 1000 miligramos (mg) por kilogramo (kg) de peso corporal, con la dosis preferida de 0.1 a alrededor de 30 mg/kg. De acuerdo con determinados aspectos, la dosificación diaria del ingrediente activo puede ser de .001 litros a 10 litros, con la dosis preferida de alrededor de .01 litros a 1 litro.

Las formas de dosificación (composiciones adecuadas para la administración) contienen desde alrededor de 1 mg a alrededor de 500 mg del ingrediente activo por unidad. En estas composiciones farmacéuticas, el ingrediente activo estará comúnmente presente en una cantidad de alrededor de 0.5-95% en peso basada en el peso total de la composición.

Ungüentos, pastas, espumas, oclusiones, cremas y geles pueden contener también excipientes, tales como almidón, tragacanto, derivados de celulosa, siliconas, bentonitas, ácido de sílice y talco o mezclas de estos. Polvos y atomizadores pueden contener también excipientes tales como lactosa, talco, ácido de sílice, hidróxido de aluminio y silicatos de calcio o mezclas de estas sustancias. Las soluciones de metales antimicrobianos nanocristalinos se pueden convertir también en aerosoles o atomizadores por cualquiera de los medios conocidos usados comúnmente para realizar composiciones farmacéuticas en aerosol. En general, dichos métodos comprenden presurizar o proporcionar un medio para presurizar un recipiente de la solución, usualmente con un gas portador inerte y para pasar el gas presurizado a través de un pequeño orificio. Los atomizadores pueden contener adicionalmente propelentes habituales, tales como nitrógeno, dióxido de carbono y otros gases inertes. Además, las microesferas o nanoparticulas se pueden usar con las composiciones o fluidos terapéuticos enriquecidos con gas de la presente invención en cualquiera de las vías requeridas para administrar los compuestos terapéuticos a un sujeto.

Las formulaciones de uso por inyección se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitaria o de dosis múltiple, tales como ampollas y frascos, y se pueden almacenar en una condición secada por congelamiento (liofilizada) que requiere únicamente la adición del excipiente liquido estéril o fluido enriquecido con gas, inmediatamente antes de su uso. Las soluciones y suspensiones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles. Los expertos en la técnica conocen los requisitos para portadores farmacéuticos eficaces para las composiciones inyectables. Véase, por ejemplo, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Filadelfia, Pa., Banker and Chalmers, Eds . , 238-250 (1982) y ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4ta ed. , 622-630 (1986) .

Las formulaciones adecuadas para la administración tópica incluyen grageas que comprenden un fluido enriquecido con gas de la invención y, opcionalmente, un compuesto terapéutico adicional y un sabor, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden un fluido enriquecido con gas y un agente terapéutico adicional opcional en una base inerte, tales como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden un fluido enriquecido con gas y un agente terapéutico adicional opcional en un portador liquido adecuado; asi como cremas, emulsiones, geles y similares.

Adicionalmente, las formulaciones adecuadas para administración rectal se pueden presentar como supositorios al mezclar una variedad de bases, tales como bases emulsionantes o bases solubles en agua. Las formulaciones adecuadas para administración vaginal se pueden presentar como óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o fórmulas atomizadoras que contienen, además del ingrediente activo, portadores tales como los que se conocen en la técnica como adecuados.

Portadores farmacéuticamente adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, texto de referencia estándar en esta área.

La dosis administrada al sujeto, en especial un animal, en particular un humano, en el contexto de la presente invención debería ser suficiente para ocasionar una respuesta terapéutica en el animal por un marco de tiempo razonable. Un experto en la técnica reconocerá que la dosificación dependerá de una variedad de factores que incluyen la condición del animal, el peso corporal del animal, así como también la afección que se trata. Una dosis adecuada es aquella que da como resultado una concentración de la composición terapéutica en un sujeto que se sabe que afecta la respuesta deseada.

El tamaño de la dosis se determinará también por la vía, el tiempo y la frecuencia de administración así como por la existencia, naturaleza y extensión de cualquier efecto colateral adverso que pueda acompañar la administración de la composición terapéutica y el efecto fisiológico deseado.

Se apreciará que los compuestos de la combinación se pueden administrar: (1) simultáneamente por combinación de los compuestos en una co-formulación o (2) en forma alternada, es decir, mediante la administración de los compuestos en serie, secuencialmente, en paralelo o simultáneamente en formulaciones farmacéuticas separadas. En terapias de administración alternada, el retraso en la administración del segundo y, opcionalmente, un tercer ingrediente activo, no debería ser tal como para perder el beneficio de un efecto terapéutico sinérgico de la combinación de los ingredientes activos. De acuerdo con determinadas modalidades por el método de administración (1) o (2), idealmente la combinación debería administrarse para alcanzar los resultados más eficaces. En determinadas modalidades por cualquiera de los métodos de administración (1) o (2), idealmente la combinación debería administrarse para alcanzar concentraciones en plasma pico de cada uno de los ingredientes activos. Puede ser posible un régimen de una pildora diaria por administración de una co-formulación de combinación para algunos pacientes que esperan ser expuestos a una neurotoxina. De acuerdo con determinadas modalidades, las concentraciones en plasma pico efectivas de los ingredientes activos de la combinación estarán en el rango de aproximadamente 0.001 a 100 uM. Se pueden alcanzar concentraciones en plasma pico óptimas por un régimen de formulación y dosificación prescritas para un paciente particular. También se entenderá que los fluidos de la invención y cualquiera de eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgico, inhibidores de monoamina oxidasa (selegilina, rasagilina) , promitocondriales (coenzima Q10, creatina) , bloqueadores de los canales de calcio (isradipina) , alfa sinucleina y/o factores de crecimiento (GDNF) o los derivados fisiológicamente funcionales de cualquiera de estos, ya sean presentados de forma simultánea o secuencial, pueden ser administrados individualmente, en múltiples dosis o en cualquier combinación de estos. En general, durante la terapia de administración alternada (2), se administra en serie una dosificación eficaz de cada compuesto, donde en la terapia de co-formulación (1) se administran a la vez dosificaciones eficaces de dos o más compuestos.

Las combinaciones de la invención se pueden presentar convenientemente como una formulación farmacéutica en una forma de dosificación unitaria. Una formulación de dosificación unitaria conveniente contiene los ingredientes activos en cualquier cantidad desde 1 mg a lg cada uno, por ejemplo, de modo no taxativo, 10 mg a 300 mg. Los efectos sinérgicos del fluido de la invención en combinación con cualquiera de eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgicos, inhibidores de monoamina oxidasa (selegilina, rasagilina), promitocondriales (coenzima Q10, creatina) , bloqueadores de los canales de calcio (isradipina), alfa sinucleina y/o factores de crecimiento (GDNF) pueden ser realizados sobre una amplia relación, por ejemplo 1:50 a 50:1 (fluido de la invención: eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgicos , inhibidores de monoamina oxidasa (selegilina, rasagilina) , promitocondriales (coenzima Q10, creatina) , bloqueadores de los canales de calcio ( isradipina) , alfa sinucleina, y/o factores de crecimiento (GDNF) ) . En una modalidad, la relación puede oscilar desde alrededor de 1:10 a 10:1. En otra modalidad, la relación peso/peso del fluido de la invención con cualquiera de eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgicos, inhibidores de monoamina oxidasa (selegilina, rasagilina) , promitocondriales (coenzima Q10, creatina) , bloqueadores de los canales de calcio (isradipina) , alfa sinucleina y/o factores de crecimiento (GDNF) en una forma de dosificación de combinación coformulada, tal como una pildora, comprimido, comprimido ovalado o cápsula será de alrededor de 1, es decir, una cantidad aproximadamente igual del fluido de la invención y cualquiera de eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgicos, inhibidores de monoamina oxidasa (selegilina, rasagilina) , promitocondriales (coenzima Q10, creatina) , bloqueadores de los canales de calcio (isradipina) , alfa sinucleina y/o factores de crecimiento (GDNF) . En otras coformulaciones de ejemplo, puede que haya más o menos fluido de la invención y cualquiera de eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgicos, inhibidores de monoamina oxidasa (selegilina, rasagilina) , promitocondriales (coenzima Q10, creatina) , bloqueadores de los canales de calcio ( isradipina) , alfa sinucleina y/o factores de crecimiento (GDNF) . En una modalidad, se utilizará cada compuesto en la combinación en una cantidad en la cual presenta actividad antiinflamatoria cuando se usa solo. Otras relaciones y cantidades de los compuestos de dichas combinaciones están contempladas dentro del alcance de la invención.

Una forma de dosificación unitaria puede además comprender fluido de la invención y cualquiera de eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgicos, inhibidores de monoamina oxidasa (selegilina, rasagilina), promitocondriales (coenzima Q10, creatina) , bloqueadores de los canales de calcio (isradipina), alfa sinucleina y/o factores de crecimiento (GDNF) , o derivados fisiológicamente funcionales de cualquiera de estos, y un portador farmacéuticamente aceptable .

Los expertos en la técnica observarán que la cantidad de ingredientes activos en las combinaciones de la invención requerida para su uso en el tratamiento variará según una variedad de factores, que incluyen la naturaleza de la afección que está siendo tratada y la edad y condición del paciente, y se encontrará finalmente a discreción del médico tratante. Los factores a considerar incluyen la vía de administración y naturaleza de la formulación, el peso corporal del animal, la edad y la condición general y la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratar.

También es posible combinar cualesquiera dos ingredientes activos en una forma de dosificación unitaria para administración simultánea o secuencial con un tercer ingrediente activo. La combinación de tres partes se puede administrar simultánea . o secuencialmente . Cuando se administra secuencialmente, la combinación se puede administrar en dos o tres administraciones. De acuerdo con determinadas modalidades, la combinación de tres partes del fluido de la invención y cualquiera de eritropoyetina, antiapoptó'ticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgicos , inhibidores de monoamina oxidasa (selegilina, rasagilina) , promitocondriales (coenzima Q10, creatina) , bloqueadores de los canales de calcio ( isradipina) , alfa sinucleina y/o factores de crecimiento (GDNF) pueden administrarse en cualquier orden.

Agentes neurotóxicos : Los agentes neurotóxicos son toxinas que actúan específicamente sobre las neuronas, su sinapsis o 'el sistema nervioso en su totalidad. Son sustancias que causan daño a las estructuras del cerebro, que a su vez conlleva a una enfermedad crónica. Las neurotoxinas incluyen neurotoxinas adrenérgicas, neurotoxinas colinérgicas, neurotoxinas dopaminérgicas, excitotoxinas y otras neurotoxinas. Los ejemplos de neurotoxinas adrenérgicas incluyen clorhidrato de N- (2-cloroetil) -N-etil-2-bromobencilamina . Ejemplos de neurotoxinas colinérgicas incluyen clorhidrato de mostaza de acetiletilcolina . Ejemplos de neurotoxinas dopaminérgicas incluyen HBr 6-hidroxidopamina (6-OHDA), clorhidrato de 1-metil-4- (2-metilfenil) -1, 2, 3, 6-tetrahidro-piridina, perclorato de l-metil-4-fenil-2, 3-dihidropiridinio, N-metil-4-fenil-l, 2, 5, 6tetrahidropiridina HC1 (MPTP) , yoduro de 1-metil-4-fenilpiridinio (MPP+) , paraquat y rotenona. Los ejemplos de excitotoxinas incluyen NMDA y ácido kaínico.

Se ha demostrado que MPTP, MPP+, paraquat, rotenona y 6-OHDA inducen síntomas similares a la EP en modelos animales. (Véase, K. Ossowska, et ál . , (2006). "Degeneration of dopaminergic mesocortical neurons and activation of compensatory processes induced by a long-term paraquat administration in rats : Implications for Parkinson's disease". Neuroscience 141 (4): 2155-2165; y Caboni P, et ál., (2004) . "Rotenone, deguelin, their metabolites, and the rat model of Parkinson's disease". Chem Res Toxicol 17 (11): 1540-8; Simón et ál . , Exp Brain Res, 1974, 20: 375-384; Langston et ál., Science, 1983, 219: 979-980; Tanner, Occup Med, 1992, 7: 503-513; Liou et ál., Neurology, 1997, 48: 1583-1588) .

Neuroprotector La neuroprotección dentro del sistema nervioso protege a las neuronas de la apoptosis o la degeneración, por ejemplo, luego de una lesión cerebral o como resultado de enfermedades crónicas neurodegenerativas. El propósito del "efecto neuroprotector" es prevenir y tratar las complicaciones que pueden tener como resultado un daño en el sistema nervioso central (SNC) . La neuroprotección se puede estimar por parámetros de supervivencia celular o demora de muerte celular, detención o enlentecimiento de la progresión de la enfermedad, inicio de la enfermedad y demora de la mortalidad de la enfermedad.

Los Ejemplos, tal como se describen en la presente, muestran que los . fluidos acuosos alterados electrocinéticamente tienen propiedades neuroprotectoras , donde se demuestra que los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente protegen las neurocélulas de los síntomas de la EP inducidos por MPTP. De acuerdo con determinadas modalidades, los fluidos acuosos alterados electrocinéticamente tienen una utilidad considerable al proteger contra y/o al reducir los efectos relacionados al estar expuestos a las neurotoxinas .

Los agentes neuroprotectores incluyen, de modo no taxativo, eritropoyetina, antiapoptóticos (TCH346, CEP-1347), antiglutamatérgicos, inhibidores de monoamina oxidasa (selegilina, rasagilina) , promitocondriales (coenzima Q10, creatina) , bloqueadores de los canales de calcio ( isradipina) , alfa sinucleina y/o factores de crecimiento (GDNF) .

Los siguientes ejemplos pretenden ser únicamente ilustrativos y no limitativos en ningún sentido.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Tamaño de microburbuj as Se llevaron a cabo experimentos con un fluido enriquecido con gas usando el difusor de la presente invención para determinar un limite de tamaño de microburbuj as de gas. Se estableció el limite de tamaño de las microburbuj as al pasar el fluido enriquecido con gas a través de filtros de 0.22 y 0.1 mieras. Al llevar a cabo estos análisis, un volumen de fluidos pasó a través del difusor de la presente invención y generó un fluido enriquecido con gas. Se drenaron sesenta mililitros de este fluido a una jeringa de 60 mi. Luego se midió el nivel de oxigeno disuelto del fluido dentro de la jeringa mediante Titulación de Winkler. Se inyectó el fluido dentro de la jeringa a través de un filtro Millipore Millex GP50 de 0.22 mieras y dentro de un vaso de precipitación de 50 mi. Luego se midió la velocidad de oxigeno disuelto del material en el vaso de precipitación de 50 mi. El experimento se realizó tres veces para lograr los resultados ilustrados en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4 Como se puede observar, los niveles de oxigeno disuelto que se midieron dentro de la jeringa y los niveles de oxigeno disuelto dentro del vaso de precipitación de 50 mi no cambiaron en forma considerable al pasar el material propagado a través de un filtro de 0.22 mieras, lo que implica que las microburbuj as del gas disuelto dentro del fluido no son más grandes que 0.22 mieras.

Se llevó a cabo un segundo análisis en el cual se enriqueció un lote de solución salina con el difusor de la presente invención y se recogió una muestra de la solución de salida en estado sin filtración. El nivel de oxigeno disuelto de la muestra sin filtrar fue de 44.7 ppm. Se usó un filtro de 0.1 mieras para filtrar la solución enriquecida con oxigeno del difusor de la presente invención y se tomaron dos muestras adicionales. Para la primera muestra, el nivel de oxigeno disuelto fue de 43.4 ppm. Para la segunda muestra, el nivel de oxígeno disuelto fue de 41.4 ppm. Finalmente, se eliminó el filtro y se tomó una muestra final a partir de la solución sin filtrar. En este caso, la muestra final tuvo un nivel de oxígeno de 45.4 ppm. Estos resultados eran consistentes con aquellos en los cuales se usó el filtro Millipore de 0.22 mieras. De este modo, la mayoría de burbujas o microburbujas de gas dentro de la solución salina son de aproximadamente menos de 0.1 mieras de tamaño.

EJEMPLO 2 (Análisis de fijación de membrana llevado a cabo en células Calu-3 perfundidas con fluidos generados electrocinéticamente de la invención (RNS-60 y Solas) revelaron que (i) la exposición a KNS-60 y Solas tuvo como resultado aumentos en la conductancia de células enteras, (ii) la exposición de células a RNS-60 produjo un aumento en una conductancia no lineal, evidente en tiempos de incubación de 15 minutos y (iii) la exposición de células a RNS-60 produjo un efecto de la solución salina RNS-60 en canales permeables al calcio.) Visión general. En este Ejemplo, los estudios de fijación de membrana fueron llevados a cabo para confirmar adicionalmente las utilidades, tal como se describe en la presente, de los fluidos salinos generados electrocinéticamente de la invención (RNS-60 y Solas) , que incluyen la utilidad para modular corrientes de células enteras. Se llevaron a cabo dos conjuntos de experimentos.

El resumen de los datos de la primera serie de experimentos indica que la conductancia de células completa (relación corriente/voltaje) obtenida con solución salina Solas es altamente lineal para ambos tiempos de incubación (15 minutos, 2 horas) y para todos los protocolos de voltaje. Sin embargo, es evidente que una incubación mayor (2 horas) con Solas aumentó la conductancia de células enteras. La exposición de 'células a RNS-60 produjo un aumento en una conductancia no lineal, como se muestra en las corrientes delta (resta Rev-Sol), que es únicamente evidente en un tiempo de incubación de 15 minutos. El efecto del RNS-60 sobre esta corriente no lineal desaparece y, en cambio, es altamente lineal en el tiempo de incubación de dos horas. La contribución de la conductancia de células enteras no lineales, como se observó previamente, era sensible al voltaje aunque estaba presente en todos los protocolos de voltaj e .

El resumen de los datos de la segunda serie de experimentos indicó que hay un efecto de la solución salina RNS-60 en una corriente no lineal, que se hizo evidente en calcio elevado en la solución externa. La contribución de la conductancia de células enteras no lineales, aunque sensibles al voltaje, estaba presente en ambos protocolos de voltaje e indica un efecto de solución salina RNS-60 en canales permeables al calcio.

Primera serie de experimentos (aumento de conductancia y activación de una conductancia regulada por voltaje no lineal) Materiales y métodos: Se usó la linea epitelial bronquial Calu-3 en los estudios de fijación de membranas. Las células epiteliales bronquiales Calu-3 (ATCC #HTB-55) se cultivaron en una mezcla 1:1 de medio Ham F12 y DMEM que se suplementaron con 10% de FBS en cubreobjetos de vidrio hasta el momento de los experimentos. En resumen, se usó un dispositivo de pinzamiento de voltaje de célula entera para medir los efectos en las células Calu-3 expuestas a los fluidos generados electrocinéticamente de la invención (por ejemplo, RNS-60, solución salina normal tratada electrocinéticamente que comprende 60 ppm de oxigeno disuelto, a veces denominado "fármaco" en este Ejemplo) .

Se utilizaron las técnicas de fijación de membranas para evaluar los efectos del material de ensayo (RNS-60) sobre la polaridad de membrana celular epitelial y actividad de canal iónico. Específicamente, se realizó el pinzamiento de voltaje de célula completa en la linea epitelial bronquial Calu-3 en una solución de baño que consiste en: NaCl 135 mM, KC1 de 5mM, CaCl2 1.2mM, MgC12 0.8mM y HEPES lOmM (pH ajustado a 7.4 con N-metil D-Glucamina) . Se midieron las corrientes básales y luego se perfundió RNS-60 sobre las células .

Más específicamente, se recogieron las pipetas de patch del vidrio de borosilicato (Garner Glass Co, Claremont, CA) con un extractor vertical Narishige PB-7 de dos etapas y luego se pulieron al fuego a una resistencia entre 6-12 Mohms con un microforge Narishige MF-9 (Narishige International USA, East Meado , NY) . Las pipetas se rellenaron con una solución intracelular que contiene (en mM) : KC1 135, NaCl 10, EGTA 5, Hepes 10, el pH se ajustó a 7.4 con NMDG (N-Metil-D-glucamina) .

Las células Calu-3 cultivadas se colocaron en una cámara que contiene la siguiente solución extracelular (en mM) : NaCl 135, KC1 5, CaC12 1.2, MgC12 0.5 y Hepes 10 (ácido libre), el pH se ajustó a 7.4 con MDG.

Se observaron las células usando el objetivo 40X DIC de un microscopio Olympus 1X71 (Olympus Inc., Tokio, Japón) . Luego de que se estableció un sello de alta resistencia (gigaseal) enlazado a la célula, se aplicó una succión suave para entrar y para lograr la configuración de la célula entera. Inmediatamente después de entrar, la célula se pinzó por voltaje a -120, -60, -40 y 0 mV y se estimuló con etapas de voltaje entre ±100 mV (500 ms/etapa) . Luego de recoger las corrientes de célula completa en la condición de control, se perfundió la misma célula a través del baño con el fluido de prueba que comprende los mismos solutos extracelulares y pH que para el fluido de control anterior, y se registraron las corrientes de células completas en potenciales de retención diferentes con los mismos protocolos .

Se adquirieron los datos electrofisiológicos con un amplificador Axon Patch 200B, se pasaron por un filtro de paso bajo a 10 kHz y se digitalizaron con un Digidata 1400A (Axon Instruments, Union City, CA) . Se usó el software pCLAMP 10.0 (Axon Instruments) para obtener y analizar los datos. Las relaciones corriente (I) - voltaje (V) (conductancia de células enteras) se obtuvieron al graficar el valor de corriente real a alrededor de 400 msegundos en la etapa en función del potencial de retención (V) . La inclinación de la relación I/V es la conductancia de células enteras.

Fármacos y químicos . Las células se estimularon con un cóctel estimulador de AMPc que contiene 8-Br-AMPc (500 mM) , IB MX ( isobutil-l-metilxantina, 200 mM) y forscolina (10 mM) cada vez que asi se indicaba. Se usó el análogo de AMPc 8-Br-AMPc (Sigma Chem. Co . ) de un valor de 25 mM en solución de H20. Se usaron Forscolina (Sigma) e IBMX (Sigma) de una solución de DMSO que contiene ambos Forscolina 10 mM y solución madre IBMX 200 mM. Los datos obtenidos se expresan como el promedio ± corriente de células enteras SEM para 5-9 células .

Resultados : Las Figuras 1 A-C muestran los resultados de una serie de experimentos de fijación de membranas que evaluaron los efectos del fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, RNS-60 y Solas) en la polaridad de la membrana celular epitelial y la actividad del canal iónico en dos puntos de tiempo (15 minutos (paneles izquierdos) y 2 horas (paneles derechos) ) y en diferentes protocolos de voltaje (A, a partir de cero mV; B, a partir de -60 mV y C, a partir de -120 mV) . Los resultados indican que RNS-60 (círculos con relleno) tiene un efecto mayor en la conductancia de células enteras que Solas (círculos sin relleno) . Se observaron resultados similares en los experimentos con los tres protocolos de voltaje y en ambos puntos de tiempo de incubación, el de 15 minutos y el de dos horas.

Las Figuras 2 A-C muestran las gráficas que son el resultado de la resta entre los datos actuales de Solas y los datos actuales de RNS-60 en tres protocolos de voltaje ("corrientes Delta") (A, a partir de cero mV; B, a partir de -60 mV y C, a partir de -120 mV) y los dos puntos de tiempo (15 minutos (circuios sin relleno) y 2 horas (circuios con relleno) ) . Estos datos indicaron que en el punto de tiempo de 15 minutos con RNS-60 hay un componente dependiente del voltaje no lineal que se encuentra ausente en el punto de tiempo de 2 horas.

Asi como en experimentos previos, los datos con solución salina "Normal" dieron una conductancia independiente del tiempo y muy consistente que fue usada como referencia. Los presentes resultados se . obtuvieron emparejando grupos con solución salina Solas o RNS-60 e indican que la exposición de células Calu-3 a la solución salina RNS-60 en condiciones básales (sin AMPc o cualquier otro estimulo) produce efecto/s dependiente/s del tiempo, consistentes con la activación de una conductancia regulada por voltaje en tiempos de incubación más cortos (15 minutos) . Este fenómeno no fue tan. evidente en el punto de tiempo de dos horas. Como se describe en otra parte de la presente, el componente lineal es más evidente cuando se aumenta la conductancia por estimulo con el "cóctel" AMPc. No obstante, el tiempo de incubación de dos horas mostró conductancia lineal más alta para ambos RNS-60 y la solución salina Solas y, en este caso, la solución salina RNS-60 duplicó la conductancia de células enteras en comparación con Solas sola. Esta evidencia indica que al menos dos contribuciones a la conductancia de células enteras son afectadas por la solución salina RNS-60, a saber la activación de una conductancia regulada por voltaje no lineal y una conductancia lineal, que es más evidente en tiempos de incubación más largos.

Segunda serie de experimentos (efecto en canales permeables¦ al calcio) Métodos para la segunda serie de experimentos: Véase anteriormente para métodos generales de fijación de membranas. En la segunda serie de experimentos siguiente, se llevaron a cabo aún más estudios adicionales de fijación de membranas para confirmar además la utilidad de los fluidos de solución salina generada electrocinéticamente de la invención (RNS-60 y Solas) para modular corrientes de células enteras, usando células Calu-3 en condiciones básales, con protocolos de potenciales de retención desde cero mV o -120 mV.

La conductancia de células enteras en cada caso se obtuvo de las relaciones corriente/voltaje obtenidas de células incubadas durante 15 minutos con cualquiera de las soluciones salinas. Se fijaron las células en solución salina normal luego del periodo de incubación (implica una solución externa de NaCl elevado, mientras que la solución interna contiene KC1 elevado) para determinar si hay un aporte de los canales permeables al calcio a la conductancia de células enteras y si esta parte de la conductancia de células enteras se encuentra afectada por incubación con solución salina RNS-60. Luego se reemplazó la solución salina externa con una solución donde se reemplazó el NaCl por CsCl para determinar si hay un cambio en la conductancia al reemplazar el catión externo principal. En estas condiciones, luego se expuso la misma célula a concentraciones de calcio en aumento, de modo que se haga más evidente una etapa de ingreso de calcio.

Resultados : Las Figuras 3 A-D muestran los resultados de una serie de experimentos de. fijación de membranas que evaluaron los efectos del fluido generado electrocinéticamente (por ejemplo, Solas (paneles A y B) y RNS-60 (paneles C y D) ) sobre la polaridad de membrana celular epitelial y la actividad del canal iónico usando diferentes soluciones salinas externas y en diferentes protocolos de voltaje (paneles A y C, a partir de cero mV y los paneles B y D, a partir de -120 mV) . En estos experimentos se usó un punto de tiempo de 15 minutos. Para Solas (paneles A y B) los resultados indican que: 1) el uso de CsCl (cuadrados) en vez de NaCl como la solución externa, aumentó la conductancia de células enteras con un comportamiento lineal en comparación con el control (rombos) y 2) el CaCl2, tanto en CaCl2 20 mM (circuios) como en CaCl2 40 mM (triángulos) , aumentó la conductancia de células enteras de una forma no lineal. Para RNS-60 (paneles C y D) los resultados indican que: 1) el uso de CsCl (cuadrados) en vez de NaCl como la solución externa tuvo poco efecto en conductancia de células enteras en comparación con el control (rombos) y 2) CaCl2 40 mM (triángulos) aumentó la conductancia de células enteras de una forma no lineal.

Las Figuras 4 A-D muestran las gráficas que son el resultado de la resta entre los datos actuales de CsCl (mostrados en la Figura 3) y los datos actuales de CaCl2 20 mM (rombos) y CaCl2 40 mM (cuadrados) en dos protocolos de voltaje (paneles A y C a partir de cero mV; B y D a partir de -120 mV) para Solas (paneles A y B) y RNS-60 (paneles C y D) . Los resultados indican que ambas soluciones, Solas y RNS-60, activaron una conductancia de células enteras no lineales inducida por calcio. El efecto fue mayor con RNS-60 (lo que indica una respuesta a la dosificación) y con RNS-60 solo aumentó en concentraciones de calcio mayores. Además, la conductancia dependiente de calcio no lineal a concentraciones de calcio mayores aumentó también por el protocolo del voltaje.

Los datos de esta segunda serie de experimentos indican adicionalmente un efecto de solución salina RNS-60 y solución salina Solas para los datos de conductancia de células enteras obtenidos en células Calu-3. Los datos indican que la incubación de 15 minutos con cualquiera de las soluciones salinas produce un efecto distintivo en la conductancia de células enteras, que es más evidente con RNS-60 y cuando se aumenta el calcio externo, y que indica adicionalmente que la solución salina RNS-60 aumenta un componente no lineal dependiente de calcio de la conductancia de células enteras.

La evidencia acumulada sugiere la activación por solución salina Revalesio de canales iónicos, que hacen contribuciones diferentes a la conductancia de células básales.

Junto con los otros datos de los solicitantes (por ejemplo, los datos de otros Ejemplos prácticos de los solicitantes) , los aspectos particulares de la presente invención proporcionan composiciones y métodos para modular la transducción de señal intracelular, que incluye la modulación de al menos uno de estructura de membrana, potencial de membrana o conductividad de membrana, proteinas o receptores de membrana, canales iónicos, componentes lipidos o componentes intracelulares, que son intercambiables por la célula (por ejemplo, sendas de señalización, tales como sistemas de señalización celular dependiente de calcio, que comprenden el uso de soluciones de la invención generadas electrocinéticamente para impartir cambios electroquímicos y/o conformacionales en estructuras de membranas (por ejemplo, membrana y/o proteínas de membrana, receptores u otros componentes de membranas) que incluyen, pero de forma no taxativa, los GPCR y/o las proteínas g.. De acuerdo con aspectos adicionales, estos efectos modulan la expresión génica y pueden persistir, según, por ejemplo, las semividas de los componentes de mensajería individuales, etc.

EJEMPLO 3 (Se demostró que el fluido electrocinético de la invención es considerablemente eficaz en forma dependiente de la dosis en un modelo de MBP de esclerosis múltiple (EM) de encefalomielitis alérgica (autoinmune) experimental (EAE) aguda en ratas, reconocido en la técnica.) Visión general: En este EJEMPLO práctico, el fluido electrocinético de la invención RNS-60 se evaluó a dos dosis, en ambos regímenes de administración profiláctico y terapéutico, en un modelo inducido por Proteína Básica de Mielina MBP de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) aguda en ratas, reconocido en la técnica. El fluido electrocinético de la invención RNS-60 demostró ser considerablemente eficaz en cuanto a la forma en que se respondió a la dosis. Ambos regímenes de dosificación con RNS-60, el terapéutico (administración diaria de RNS-60 que comienza junto con la inyección de MBP) y el propfiláctico (administración diaria de RNS-60 que comienza siete días antes de la inyección de MBP) mostraron una disminución marcada, así como un comienzo retardado (en los grupos de dosis altas) de puntuación clínica. De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, las composiciones electrocinéticas de la invención son sustancialmente útiles para tratar, incluso aliviar y prevenir, los síntomas de EAE en modelos de EM humana en ratas reconocido en la técnica. De acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención, por lo tanto, las composiciones electrocinéticas de la invención son sustancialmente. útiles para tratar, incluyendo aliviar y prevenir, los síntomas de EM en mamíferos que padecen la enfermedad (preferentemente seres humanos) . En aún otros aspectos adicionales, las composiciones electrocinéticas de la invención atraviesan la barrera hematoencefálica (BHE) y asi proporcionan un método novedoso para tratar afecciones inflamatorias del sistema nervioso central .

Esclerosis múltiple (EM) La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) , y es una de las enfermedades neurológicas incapacitantes más comunes en adultos jóvenes. Las características principales de esta enfermedad son las áreas focales de desmielinización y de inflamación. El curso de la enfermedad es impredecible y dura toda la vida, y es más común que afecte a mujeres que a hombres. La etiología de la enfermedad aparenta depender de factores genéticos y ambientales. En la periferia, el antígeno se encuentra unido por células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) a través de MHC II. Las células ThO se unen al antígeno y se someten a activación y diferenciación. Las moléculas de adhesión y las metaloproteasas de matriz (MMP) ¦ayudan a las células Thl a unirse y penetrar la barrera hematoencefálica . Luego de cruzar la barrera hematoencefálica en el SNC, las células Thl se vinculan a los complejos del antígeno MHC y producen citocinas pro-inflamatorias que causan daño en el SNC. El sistema inmunológico reconoce como extrañas a las proteínas de mielina y comienza a atacar.

Históricamente, se consideraba que las células Thl jugaban un papel predominante en la patología de la enfermedad, pero datos recientes indican que una cascada proinflamatoria de células Thl7, IL-6 y TGF-ß juega un papel crítico en la patogénesis de EAE y EM.

Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) , también denominada encefalomielitis alérgica experimental, es un modelo de animal no humano de esclerosis múltiple (EM) . Aunque no es EM, las diferentes formas y etapas de EAE se asemejan bastante a las formas y etapas varias de la EM en un gran número de formas. Más específicamente, la EAE es una enfermedad autoinmunitaria demielinizante e inflamatoria adquirida crónica recurrente o aguda. Se inyecta a los animales con el total o con partes de varias proteínas (por ejemplo, de proteína básica de la mielina (MBP) , de proteína del proteolípido (PLP) y de glicoproteína oligodendrocitaria de la mielina (MOG) ) que conforman la mielina, la vaina aislante que envuelve las células nerviosas (neuronas), para inducir una respuesta autoinmunitaria contra la mielina propia del animal que se asemeja mucho al EM en los humanos. Se ha inducido la EAE en varias especies ' de animales diferentes que incluye ratones, ratas, conejillos de indias, conejos, macacos, monos rhesus y titíes. Los ratones y ratas son las especies más comúnmente utilizadas por varias razones que incluyen el número de herramientas inmunológicas, la disponibilidad, la esperanza de vida y la fecundidad de los animales, y la semejanza de la enfermedad inducida a EM. La EAE aguda del modelo en ratas tiene un componente inflamatorio fuerte y es por lo tanto un modelo apropiado en el cual se puede investigar el potencial terapéutico de un agente que se dirige a eventos inmunológicos en la EM.

EAE inducida por MBP El MBP en ratas Lewis luego de una dosis tendrá como resultado una recaída que se caracteriza principalmente por parálisis en las patas traseras. Se inyecta MBP a las ratas Lewis en el día 0. La enfermedad se desarrolla entre los días 12-16, con una recuperación total de la enfermedad entre los días 18-21. El modelo es autolimitante y no muestra demielini ación.

Materiales y métodos: Producción y caracterización del fluido de prueba (RNS-60) . Los solicitantes prepararon RNS-60 esterilizado por filtro según los métodos descritos en US2008/0219088 (publicada el 11 de setiembre de 2008), US2008/0281001 (publicada el 11 de noviembre de 2008) y WO2008/052143 (publicada el 02 de mayo de 2008), todos los cuales se incorporan en su totalidad en la presente mediante esta referencia y particularmente para todos los aspectos que se relacionan con el aparato y/o los métodos para preparar los fluidos electrocinéticos de la invención de los solicitantes. El contenido del oxigeno disuelto (OD) del RNS-60 utilizado fue de 59 ppm, tal como se determinó por el ensayo de Titulación de Winkler (Y.C. Wong y C.T. Wong. New Way Chemistry for Hong Kong A-Level Volumen 4, Página 248. 0 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater - 20a Edición ISBN 0-87553-235-7) . El fluido de RNS-60 se etiquetó con un número de objeto de ensayo (TI, por sus siglas en inglés), fecha de recepción, condiciones de almacenamiento y fecha de vencimiento. Las condiciones de almacenamiento y manipulación del RNS-60 fueron acordes a las especificaciones de los solicitantes para asegurar la estabilidad en la instalación de prueba durante los ensayos. El fluido se mantuvo refrigerado a 2-8°C cuando no estaba en uso. Los viales que contenían fluido fueron utilizados como recipientes de un solo uso.

Vehículo de control de fluido. El vehículo de control de fluido fue solución salina normal' para inyección (0.9%) de Hospira.

Dexametasona. La dexametasona se compró en Sigma (Cat. No. D1756; Lot No. 25 096K1805) . Para su administración, se diluyó la dexametasona (polvo blanco) en etanol para alcanzar una concentración de 1 mg/ml y luego se diluyó otra vez en agua destilada para alcanzar una concentración de dosis de 0.1 mg/ml.

Objetos de Inducción de EAE: Agente antigénico de MBP. El MBP era proteina básica de mielina de un conejillo de indias (Des-Gly-77, Des-His-78)-MBP (68-84); Cat . No. H-6875; proporcionado por MD Bioscience) . Se disolvió el MBP en suero fisiológico a una concentración de 2 mg/ml; Agente sensibilizante CFA. El adyuvante completo de Freund (CFA) provino de MD Biosciences, Departamento de Diagnósticos Mor ell GmbH (Cat. No. IMAD-4) . La suspensión de CFA, gue contenia Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra destruidas por calor, a una concentración de 4 mg/ml, fue utilizada tal cual se suministró y Emulsión MBP/CFA (agentes Antigénicos/Sensibilizantes) . Antes de las inoculaciones únicas llevadas a cabo en el dia de estudio 0, se mezcló un volumen de solución de MBP con un volumen igual de 4 mg/ml de CFA al emplear dos jeringas conectadas por un conector Luer para mezclar minuciosamente la mezcla emulsionante para igualar un volumen de dosis total de 100 µ?/animal. La dosis fue administrada en inyecciones bilaterales subcutáneas (SC) 2x 50 µ? en las regiones intraplantares de la pata.

Animales de prueba, ratas. Se obtuvieron sesenta (60) ratas hembras Lewis (de 6-7 semanas de edad al inicio del estudio) de Harían Laboratories Israel, Ltd. La variación del peso de los animales al momento del inicio del tratamiento no debería exceder el 20% del peso promedio. Se examina el estado de salud de los animales utilizados en este estudio al momento de su llegada. Solo se utilizaron en el estudio y se aclimataron a condiciones de laboratorio los animales con buen estado de salud. Antes de entrar en el estudio los animales se aclimataron por al menos 5 días. Durante la aclimatación y durante la duración del estudio, los animales se alojaron dentro de una instalación de roedores de acceso limitado y se mantuvieron en grupos de un máximo de 5 ratas en jaulas de polipropileno equipadas con bases sólidas y rellenas con viruta de madera estériles como material para su lecho. Se proporcionó a los animales ad libitum un alimento comercial para roedores y tenían acceso libre a agua potable, la cual se suministraba a cada jaula a través de botellas de polietileno con tubos de acero inoxidable para sorber. Se incluyó un análisis feedlot del lote de alimento utilizado en el estudio en los archivos con los datos del estudio. Se monitoreó el agua periódicamente. Las condiciones ambientales controladas automáticamente se establecieron para mantener una temperatura a 20-24°C con una humedad relativa (HR) de 30-70% en un ciclo de 12:12 horas de luz : oscuridad y 15-30 cambios de aire/hora en el cuarto de estudio. La temperatura y la HR se monitorearon a diario. El ciclo ligero se monitoreó mediante el reloj de control. Se utilizaron marcas en las colas de los animales como una forma de identificación animal única. Este número también aparece en una tarjeta para la jaula, visible en frente de cada jaula. La tarjeta de la jaula además contenia los números de estudio y grupo, vía de administración, género, raza y otros detalles pertinentes sobre el grupo de tratamiento.

TABLA 5. Constitución de grupos de prueba y niveles de dosis, listado de los 6 grupos experimentales que comprenden el estud Procedimientos de prueba y principios del modelo de EAE aguda en ratones. La encefalomielitis alérgica experimental (EAE ) es una enfermedad autoinmune desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) que imita muchas de las características clínicas y patológicas de la esclerosis múltiple (EM) . El modelo agudo en ratas consiste en un periodo de sensibilización, inducido por la inyección subcutánea (SC) única de la proteina básica de mielina (MBP) emulsionada en adyuvante completo de Freund (CFA) en el día 0 del estudio.

Una representación esquemática de la inducción de EAE y los regímenes de tratamiento se muestran en la FIGURA 6.

Inducción de EAE: MBP/CF A. Tal como se muestra en la descripción esquemática en la FIGURA 6) , todos los animales fueron sometidos en el día 0 de estudio (comienzo de estudio) a una inyección de inoculación única que consiste de una mezcla emulsionante homogénea de MBP y CFA (inoculación emulsionante encefalitogénica de MBP/CFA (100 yg de MBP/200 ]iq de CFA) se inyectó a un volumen de dosis total de 100 µ?/animal y se administró en 2 x 50 µ? en inyecciones bilaterales subcutáneas (SC) en las regiones intraplantares de la pata.

Tratamiento : Regímenes de tratamiento y procedimiento. Todos los compuestos fueron preparados cada día desde el principio por una persona diferente a la que calificaba a los animales. La persona que calificaba a los animales recibía viales marcados solamente con los números de grupo y no estaba al tanto del tratamiento .

Vía de administración: (i) R S-60 (IV) (ii) Controles de vehículos: (IV), y (iii) controles positivos: (IP) .

Niveles de dosis y volúmenes de dosificación: (i) RNS-60: Dosis baja de 2 mi por 350g, dosis alta de 4 mi por 350g, (ii) Controles de vehículos: 0 y (iii) Control positivo (Dexametasona) : 1 mg/kg.

Cuidado suplementario . A menos que se determine durante el curso del estudio, una vez que se esperaron y/o observaron los efectos experimentales de la EAE (aproximadamente 8-12 días luego de la inoculación encefalitogénica única) , o cuando los animales mostraron una disminución en el peso corporal mayor de 15% en comparación con su determinación previa o una disminución mayor de 20% de la medida de su peso corporal inicial, se llevaron a cabo cuidados suplementarios de acuerdo a cada caso.

Alimento y agua. Sé coloca una fuente de agua adicional que consiste de astillas de madera o alimento harinoso para roedores embebidos en agua potable en la base de la jaula y en frente de los animales que se arrastran/no móviles .

Deshidratación. Se puede someter a los animales a terapia de fluido suplementario subcutáneao (SC) con una solución de dextrosa 5% al menos dos veces al día y hasta 2 ml/animal/día hasta que el peso corporal vuelva a estar dentro del 10% de la determinación inicial.

Orina. Se palpa el abdomen de los animales para asistir con la eliminación de la orina y para observar si los animales pueden vaciar sus vejigas.

Otros cuidados especiales . Se limpiaron las áreas perianales de los animales y patas traseras cuando fue necesario con una gasa húmeda.

OBSERVACIONES Y EXÁMENES: Señales clínicas . Durante el estudio completo de 21 días se llevaron a cabo exámenes y se registraron al menos una vez al día además de las puntuaciones clínicas y de la evaluación de la EAE (véase más adelante) . Las observaciones incluían cambios en la piel, pelaje, ojos, membranas mucosas, ocurrencia de secreciones y excreciones (por ejemplo, diarrea) y actividad autónoma (por ejemplo, lagrimeo, salivación, piloerección, tamaño de la pupila, patrón respiratorio inusual), marcha, postura y respuesta a la manipulación, así como la presencia de comportamiento inusual, temblores, convulsiones, sueño y coma.

Pesos corporales . La pérdida de peso corporal puede ser la primera señal del comienzo de la enfermedad, mientras que aumento de peso marcado suele acompañar la remisión de los síntomas de EAE. Por lo tanto, la determinación de los pesos corporales individuales de los animales se realizó poco antes de la inducción de EAE durante el dia 0 del estudio (comienzo del estudio) y de ahí en más, a diario durante el trascurso del período total de observación de 21 días.

Puntuación clínica y evaluaciones de EAE. Al inicio, se examinaron todos los animales para determinar señales de respuesta neurológica y síntomas antes de la inducción de EAE (día 0 del estudio) y luego fueron examinadas a diario a lo largo del trascurso del período total de observación de 21 días. Para evitar una parcialización del experimento, las reacciones de EAE se determinan a ciegas tanto como sea posible por un miembro del personal que no está al tanto del tratamiento específico aplicado. Las reacciones de EAE se puntuaron y se registraron según una escala convencional de 0-5, reconocida en la técnica y clásica, en orden ascendente de gravedad tal como se muestra en la Tabla 6 a continuación: TABLA 6. Se puntuaron y registraron las reacciones de EAE de acuerdo con la escala convencional 0-5, reconocida técnica, en orden ascendiente de gravedad.

Valor Signos/Síntomas 0 Sin anomalías 0.5 Debilidad en la mitad distal de la cola 1 Debilidad en la mitad proximal de la cola 1.5 Debilidad en la pata trasera, una pata 2 Debilidad en la pata trasera, dos patas 2.5 Parálisis en la pata delantera, una pata 3 Parálisis en la pata delantera, dos patas 4 Parálisis total 5 Muerte Muestras de sangre. En el día de la finalización del estudio (día 21) , se sacó una muestra de sangre a todos los animales una hora luego de la inyección. Las muestras se recogieron en los días 0 de estudio (solo los grupos profilácticos), 7, 14 y 21. Se recogió plasma en matraces heparinizados y se mantuvieron a -20°C. Se almacenó un volumen de 300 µ? para el análisis de conteo de sangre, y se almacenaron y se utilizaron 100 µ? para análisis de citocina adicionales a través de Tecnología Lumiñex. Se analizaron los conteos de sangre en los días 0, 7, 14 y 21.

Recolección de tejido. Al finalizar el estudio, los animales fueron perfundidos con PFA al 4%. Se recogieron los cerebros y espinas dorsales y se mantuvieron en PFA al 4%.

Valoración humana. Los animales que se encontraban en condiciones moribundas y/o los animales que padecían dolor grave o que mostraban signos de aflicción grave fueron sacrificados humanamente.

ESTADÍSTICAS/ EVALUACIÓN DE DATOS: La evaluación se basó principalmente en los cambios registrados de forma relativa en síntomas neurológicos y en los pesos corporales, expresados como valores absolutos, cambio de porcentaje (%) y valores de grupo promedio obtenidos en todos los grupos de tratamiento en función de aquellos del vehículo de control. Se realizó un análisis de los datos por métodos estadísticos apropiados para determinar el significado de los efectos del tratamiento.

DECLARACIÓN DE CUIDADO Y USO ANIMAL: Este estudio fue realizado luego de la aprobación de un formulario de solicitud presentado ante el correspondiente Comité de Conducta Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, cuyas reglas y normas establecidas el estudio cumplió.

RESULTADOS : Los resultados del estudio se muestran en la FIGURA 5, donde el tiempo (días luego de la inyección de MBP) se muestra en el eje X y las "puntuaciones clínicas" (véase anteriormente en "materiales y métodos") se muestran en el eje Y.

La Figura 5 muestra que el fluido electrocinético de la presente invención (RNS-60) fue sustancialmente eficaz en el modelo en ratas reconocido en la técnica de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) de esclerosis múltiple (EM) (véase anteriormente en "materiales y métodos") .

De forma especifica, comparando con el vehículo de control (rombos con relleno) por un período de 17 días, ambos regímenes de dosificación con RNS-60, el terapéutico (administración diaria de RNS-60 que comienza junto con la inyección de MBP) y el profiláctico (administración diaria de RNS-60 que comienza siete días antes de la inyección de MBP) mostraron una disminución marcada, así como un comienzo retardado (en los grupos de dosis altas) de puntuación clínica .

La puntuación clínica del grupo terapéutico de la dosis baja (una inyección de un ce a diario) de RNS-60 fue de aproximadamente la mitad (1/2) que la del grupo de vehículo de control, mientras que la puntuación clínica del grupo terapéutico de la dosis alta (una inyección de dos ce a diario) de RNS-60 no solo fue aproximadamente de un quinto (1/5) a un décimo (1/10) de la del grupo del vehículo de control, pero además demostró un comienzo retardado.

La puntuación clínica del grupo profiláctico de la dosis baja (una inyección de un ce a diario) de RNS-60 fue de aproximadamente de un tercio (1/3) que la del grupo de vehículo de control, mientras que la puntuación clínica del grupo profiláctico de la dosis alta (una inyección de dos ce a diario) de RNS-60 no solo fue de cero (no se detectó puntuación clínica) a lo largo del día 16, lo cual demuestra un comienzo retardado considerable, pero al observarse en el día 17 este era menos de un décimo (1/10) que la del vehículo de control en el mismo punto de tiempo.

De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, por lo tanto, las composiciones electrocinéticas de la invención son sustancialmente útiles para tratar, e incluso aliviar y prevenir, los síntomas de E7AE en modelos de EM humana en ratas reconocido en la técnica.

EJEMPLO 4 (Se demostró que el fluido electrocinético es eficaz para mantener el peso de las ratas en un modelo de MBP de esclerosis múltiple (EM) de encefalomielitis alérgica (autoinmune) experimental (EAE) aguda en ratas, reconocido en la técnica.) Visión general: En el presente EJEMPLO se describe el cambio de peso de las ratas sometidas al experimento descrito en el Ejemplo 7. La pérdida de peso corporal puede ser el primer signo del comienzo de la enfermedad, mientras que una repentina tendencia marcada de aumento de peso suele acompañar la remisión de los síntomas de EAE. Por lo tanto, la determinación de los pesos corporales individuales de los animales se realizó poco después de la inducción de EAE durante el día 0 del estudio (comienzo del estudio) y a diario durante el trascurso del plazo de observación de 21 días. Se demostró que el efecto del fluido electrocinético RNS-60 sobre el peso corporal era eficaz para mantener el peso de las ratas sometidas al modelo de EAE en ratas (Figura 7) .

Datos de peso corporal: La Figura 7 muestra el peso corporal en gramos (panel A) y como porcentaje (panel B) en base a 100 gramos. Luego de una leve reducción del peso corporal promedio de los animales tratados en este ejemplo, el peso corporal promedio empezó a aumentar hasta el fin del estudio. Al finalizar el estudio, el aumento del peso corporal promedio fue del 20% en los animales tratados con el vehículo (Grupo 1F) . Durante el trascurso del estudio, el grupo de tratamiento con dexametasona (Grupo 2F) , que se administró a partir del día 0 del estudio, tuvo una pérdida de peso corporal promedio del 10%. Luego de la finalización del estudio, los animales tratados con dexametasona perdieron 2% del peso corporal promedio. El grupo profiláctico tratado con dosis baja (Grupo 3F) exhibió una pérdida de peso corporal promedio de hasta el 4% en los días de estudio 1-3 y luego aumentó 23% del peso corporal promedio para el día de la finalización del estudio. El grupo profiláctico tratado con dosis elevada (Grupo 4F) exhibió una pérdida de peso corporal promedio de hasta el 5% en los días de estudio 1-3 y luego aumentó 28% del peso corporal promedio para el día del fin del estudio. El grupo terapéutico tratado con dosis baja (Grupo 5F) exhibió una pérdida de peso corporal promedio de hasta el 4% en los días de estudio 1-3 y luego aumentó 21% del peso corporal promedio para el día de la finalización del estudio. El grupo terapéutico tratado con dosis elevada (Grupo 6F) exhibió una pérdida de peso corporal promedio de hasta el 4% en los días de estudio 1-3 y luego aumentó 19% del peso corporal, promedio para el día del fin del estudio.

Por lo tanto, se demostró que el fluido electrocinético RNS-60 de la invención era eficaz para mantener el peso de las ratas sometidas al modelo de EAE en ratas .

Por consiguiente, de acuerdo con aspectos particulares de la presente invención las composiciones electrocinéticas de la invención son sustancialmente útiles para tratar, incluyendo aliviar y prevenir, los síntomas de EAE en modelos de EM humana en ratas reconocidos en la técnica .

EJEMPLO 5 (Se demostró que el fluido electrocinético de la invención tiene poco efecto sobre el nivel de leucocitos, neutrófilos y linfocitos en las muestras de sangre tomadas de ratas sometidas al modelo de MBP de esclerosis múltiple (EM) de encefalomielitis alérgica (autoinmune) experimental (EAE) aguda en ratas reconocido en la técnica.) Visión general: En el presente EJEMPLO práctico se describe el nivel de leucocitos, neutrófilos y linfocitos en muestras de sangre tomadas de ratas durante el experimento, tal como se demostró en el Ejemplo 7. Para determinar si el cambio en los niveles de citocina se debía a un cambio global en los •leucocitos, los solicitantes tomaron muestras de sangre de ratas sometidas al experimento con EAE, durante el trascurso del experimento.

Nivel de leucocitos, neutrófilos y linfocitos: Las Figuras 8 A-D muestran los niveles de leucocitos, neutrófilos y linfocitos en las muestras de sangre que se recolectaron durante el trascurso del experimento con EAE.

Se contaron los leucocitos (WBC) , neutrófilos y linfocitos una hora después de la administración del objeto de ensayo en los días 0 (panel A) , 7 (panel B) , 14 (panel C) y 21 (panel D) del estudio. El máximo conteo de WBC una hora después de que los animales fueron tratados con el vehículo el día 7 del estudio fue de 8.23±0.36 puntos. El tratamiento con dexametasona redujo significativamente el conteo promedio de WBC en función del vehículo a 2.46+0.38 puntos (p<0.05) . El tratamiento terapéutico con el objeto de ensayo en una dosis baja (Grupo 5F) aumentó significativamente el conteo promedio de WBC en función del vehículo a 9.59±0.46 puntos (p<0.1). El tratamiento terapéutico con el objeto de ensayo en una dosis elevada (Grupo 6F) aumentó significativamente el conteo promedio de WBC en función del vehículo a 10.84±0.88 puntos (p<0.05) .

El máximo conteo de WBC una hora después de que los animales fueron tratados con el vehículo el día 14 del estudio fue de 6.34±0.28 puntos. El tratamiento con dexametasona redujo significativamente el conteo promedio de WBC en función del vehículo a 3.79+0.69 puntos (p<0.05). El tratamiento profiláctico con el objeto de ensayo en la dosis elevada (Grupo 4F) aumentó significativamente el conteo promedio de WBC en función del vehículo a 7.8310.51 puntos (p<0.05). El tratamiento terapéutico con el objeto de ensayo en la dosis baja (Grupo 5F) aumentó significativamente el conteo promedio de BC en función del vehículo a 7.6510.52 puntos (p<0.05). El tratamiento terapéutico con el objeto de ensayo en la dosis elevada (Grupo 6F) aumentó significativamente el conteo promedio de WBC en función del vehículo a 8.05+0.43 puntos (p<0.05). El máximo conteo de WBC una hora después de que los animales fueron tratados con el vehículo el día 21 del estudio fue de 9.0910.75 puntos. El tratamiento con dexametasona redujo significativamente el conteo promedio de WBC en función del vehículo a 5.1210.57 puntos (p<0.05 ) .

El máximo conteo de neutrófilos una hora después de que los animales fueron tratados con el vehículo el día 7 del estudio fue de 26.2011.62 puntos. El tratamiento con dexametasona aumentó significativamente el conteo promedio de neutrófilos en función del vehículo a 65.3814.62 puntos (p<0.05). El tratamiento profiláctico con el objeto de ensayo en la dosis elevada (Grupo 4F) aumentó significativamente el conteo promedio de neutrófilos en función del vehículo a 31.90+0.96 puntos (p<0.05). El tratamiento terapéutico con el objeto de ensayo en la dosis elevada (Grupo 6F) aumentó significativamente · el conteo promedio de neutrófilos en función del vehículo a 33.90+2.79 puntos (p<0.05).

El máximo conteo de neutrófilos una hora después de que los animales fueron tratados con el vehículo el día 14 del estudio fue de 33.0012.58 puntos. El tratamiento con dexametasona aumentó significativamente el conteo promedio de neutrófilos en función del vehículo a 73.10±3.15 puntos (p<0.05) .

El máximo conteo de neutrófilos una hora después de que los animales fueron tratados con el vehículo el día 21 del estudio fue de 41.40±2.32 puntos. El tratamiento con dexametasona aumentó significativamente el conteo promedio de neutrófilos en función del vehículo a 89.33±1.97 puntos (p<0.05). El tratamiento terapéutico con el objeto de ensayo en la dosis elevada (Grupo 6F) redujo significativamente el conteo promedio de neutrófilos en función del vehículo a 34.60±3.08 puntos (p<0.1).

El máximo conteo de linfocitos una hora después de que los animales fueron tratados con el vehículo el día 7 del estudio fue de 73.20+1.95 puntos. El tratamiento con dexametasona redujo significativamente el conteo promedio de linfocitos en función del vehículo a 30.63±1.31 puntos (p<0.05). El tratamiento profiláctico con el objeto de ensayo en la dosis elevada (Grupo 4F) redujo significativamente el conteo promedio de linfocitos en función del vehículo a 68.30+1.42 puntos (p<0.1). El tratamiento terapéutico con el objeto de ensayo en la dosis elevada (Grupo 6F) redujo significativamente el conteo promedio de linfocitos en función del vehículo a 64.80±3.00 puntos (p<0.05).

El máximo conteo de linfocitos una hora después de que los animales fueron tratados con el vehículo el día 14 del estudio fue de 66.1012.53 puntos. El tratamiento con dexametasona redujo significativamente el conteo promedio de linfocitos en función del vehículo a 26.80±3.23 puntos (p<0.05) .

El máximo conteo de linfocitos una hora después de que los animales fueron -tratados con el vehículo el día 21 del estudio fue de 57.50+2.09 puntos. El tratamiento con dexametasona redujo significativamente el conteo promedio de linfocitos en función del vehículo a 10.11±2.08 puntos (p<0.05) . El tratamiento terapéutico con el objeto de ensayo en la dosis elevada (Grupo 6F) aumentó significativamente el conteo promedio de linfocitos en función del vehículo a 66.20+2.74 puntos (p<0.05).

Por lo tanto, la administración profiláctica y terapéutica del fluido electrocinético RNS-60 de la invención en la dosis elevada aumentó significativamente el conteo de neutrófilos y redujo significativamente el conteo de linfocitos en función del vehículo en el día 7 del estudio. La administración profiláctica del fluido electrocinético RNS-60 de la invención en la dosis elevada y su administración terapéutica en ambas dosis aumentaron significativamente el conteo de WBC en función del vehículo en el día 14 del estudio. La administración terapéutica del objeto de ensayo RNS-60 en la dosis elevada redujo significativamente el conteo de neutrófilos y aumentó el conteo de linfocitos en función del vehículo en el día 21 del estudio. Por lo tanto, se descubrió que el fluido electrocinético RNS-60 de la invención tiene poco efecto sobre los niveles globales de WBC, neutrófilos y linfocitos.

EJEMPLO 6 (Se demostró que el fluido electrocinético de la invención afecta el nivel de determinadas citocinas en las muestras de sangre tomadas de ratas sometidas al modelo de MBP de esclerosis múltiple (EM) de encefalomielitis alérgica (autoinmune) experimental (EAE) aguda en ratas reconocido en la técnica.) Visión general: En el presente EJEMPLO práctico se describe el nivel de citocinas tal como fueron encontradas en muestras de sangre tomadas de ratas durante el experimento, tal como se demostró en el Ejemplo 7. Se evaluó el fluido electrocinético RNS-60 de la invención en los regímenes de administración terapéutica, tal como se describió en el Ejemplo 7. Se demostró que el fluido electrocinético RNS-60 de la invención afecta el nivel de determinadas citocinas en las muestras de sangre tomadas de ratas sometidas al modelo de EAE en ratas.

Se ha demostrado que determinadas citocinas cumplen una función en la esclerosis múltiple. Particularmente, se ha demostrado que se encuentran niveles elevados de interleucina 17 (IL-17) , también conocida como CTLA-8 o IL-17A, en el sistema nervioso central en EAE aguda y crónica (Hofstetter, H. H., et ál., Cellular Immunology (2005), 237:123-130). La IL-17 es una citocina proinflamatoria que estimula la secreción de una amplia variedad de otras citocinas a partir de diversas células no inmunitarias . La IL-17 es capaz de inducir la secreción de IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1 y G-CSF por células adherentes como fibroblastos, queratinocitos, células epiteliales y endoteliales, y también es capaz de inducir la expresión superficial de ICAM-1, la proliferación de los linfocitos T y el crecimiento y diferenciación de los progenitores humanos CD34+ en neutrófilos cuando se encuentran en cocultivo en presencia de fibroblastos irradiados (Fossiez et ál . , 1998, Int .Rev. Immunol . 16, 541-551) . La IL-17 es producida en forma predominante por los linfocitos T de memoria activados y actúa al unirse a un receptor de superficie celular distribuido en forma ubicua (IL-17R) (Yao et ál, 1997, Cytokine, 9, 794-800) . Se ha identificado una cantidad de homólogos de IL-17 que presentan roles tanto similares como diferentes en la regulación de las respuestas inflamatorias. Véase referencia a las familias de citocinas IL-17/receptores en Dumont, 2003, Expert Opin. Ther. Patents, 13,287-303.

La IL-17 puede contribuir a una cantidad de enfermedades mediadas por respuestas inmunitarias anormales, tales como artritis reumatoide e inflamación de las vías respiratorias, asi como rechazo a trasplante de órganos e inmunidad antitumoral. Los inhibidores de la actividad de IL-17 son conocidos en la técnica, por ejemplo, se empleó una proteina de fusión IL-17R:Fc para demostrar el rol de la IL-17 en la artritis inducida por colágeno (Lubberts et ál., J.Immunol. 2001,167, 1004-1013) y se han utilizado anticuerpos policlonales neutralizantes para reducir la formación de adhesiones peritoneales (Chung et ál., 2002, J.Exp.Med., 195, 1471-1478). Los anticuerpos monoclonales neutralizantes se encuentran disponibles comercialmente (R&D Systems UK) .

Por lo tanto, de acuerdo con el rol que desempeña la IL-17 en la patogénesis de EM, los solicitantes examinaron el efecto que tiene el fluido electrocinético RNS-60 de la invención sobre los niveles de IL-17 en las muestras de sangre tomadas de ratas en el estudio de EAE.

Datos de citocina: Se analizaron los niveles de diversas citocinas en la sangre durante el estudio. A grandes rasgos: se extrajo sangre de todos los animales una hora después de la inyección y se recolectó el plasma en viales heparinizados . Se analizaron muestras de 100 µ? para determinar las citocinas inflamatorias mediante tecnología Luminex (con el kit de ensayo de citocinas en ratas Procarta PC4127 de Panomics) que permite la medida de múltiples citocinas de la misma muestra en forma simultánea. Debido a la distribución no gaussiana de los datos y a ocasionales resultados por debajo del umbral de detección del ensayo, se adaptó el modelo no paramétrico de regresión Cox para datos censurados para comparar los diferentes fluidos. Tal como se muestra en las Figuras 9 A-H, los niveles de ILla, ILlb e IL17 se redujeron en forma muy notoria con ambas dosis de tratamiento terapéutico (elevada y baja) de RNS60. La manifestación clínica de EAE inducido por MBP comenzó alrededor del día 10 y alcanzó un pico alrededor del día 18. Por lo tanto, se considera que el día 7 (justo antes de la manifestación de la enfermedad) y el día 18 (cercano al pico de la enfermedad) son los puntos de tiempo más importantes para el análisis de citocina. En las Figuras 9 A-H se presentan los niveles sistémicos de ILla, ILlb e IL17 de 10 animales/grupos en los días 7 y 18.

La IL-1 es una de las principales citocinas proinflamatorias y es un mediador anterior de las respuestas inmunitarias innatas. La IL-1 induce la producción en forma directa o indirecta de diversos factores de crecimiento y tróficos, mediadores inflamatorios, moléculas de adhesión y otras citocinas, asi como también por medio de un bucle de retroalimentación positiva (A. Basu et ál . , The type 1 interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and the induction of múltiple proinfla matory mediators in response to brain injury, /. Neurosci. 22 (2002), págs . 6071-6082; P.N. Moynagh, The interleukin-1 signaling pathway in astrocytes: a key contributor to inflammation in the brain, J. Anat. 207 (2005), págs. 265-269) . Estos incluyen moduladores importantes tales como NGF, ICAM 1, IL6, TNFa, CSF, etc. La progresión de EM involucra la activación de' linfocitos T reactivos ante el antigeno en la periferia, seguida de la invasión en el SNC . La IL-1 es crucial en el desarrollo de EM no solo debido a que participa en la activación de linfocitos T específicos para mielina, sino porque también representa el mediador principal de la activación de macrófagos en la periferia [R. Furlan et ál . , HSV-l-mediated IL-1 receptor antagonist gene therapy ameliorates MOG (35-55) -induced experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice, Gene Ther. 14 (2007), págs . 93-98]. Se ha demostrado en modelos de EAE para EM que tanto IL-? e IL-?ß son mediadores del proceso inflamatorio. Los niveles periféricos de IL-?ß se relacionan con el curso clínico y se ha demostrado la reactividad de IL-?ß durante EAE en macrófagos que se infiltran en el SNC y en células microgliales residentes (C.A. Jacobs et ál . , Experimental autoimmune encephalomyelitis is exacerbated by IL-1 alpha and suppressed by soluble IL-1 receptor, J. I munol . 146 (1991), págs. 2983-2989) . Por lo tanto, la IL-1 es un objetivo terapéutico adecuado en EAE y EM. Se ha encontrado un mecanismo de inhibición no selectivo de IL-1 en agentes terapéuticos existentes para EM; es decir interferón beta, glucocorticoides antiinflamatorios, inmunosupresores, atorvastatina y ácidos grasos de omega 3 poliinsaturados [F.L. Sciacca et ál., Induction of IL-1 receptor antagonist by interferón beta: implication for the treatment of múltiple sclerosis, J. Neurovirol . 6 (Suppl. 2) (2000), págs. S33-S37. ; R. Pannu et ál . , Attenuation of acute inflammatory response by atorvastatin after . spinal cord injury in rats, J. Neurosci. Res. 79 (2005), págs. 340-350; A.P. Simopoulos, Omega-3 fatty acids in inflammation and autoimmune diseases, J. Am. Coll. Nutr. 21 (2002), págs. 495-505]. Tal como se demuestra en la Figura 9 C-F, la administración intravenosa de RNS60 disminuye eficazmente los niveles sistémicos tanto de ILl como de ???? . En el caso de ILla, el tratamiento con RNS60 disminuyó el nivel en sangre en forma significativa en comparación con el grupo tratado con el vehículo, y fue tan eficaz como la dexametasona en este punto del tiempo. Sin embargo, en el día 18 el tratamiento no tiene efecto significativo sobre el nivel sistémico de ILla. También se redujeron significativamente los niveles .sistémicos de ??-?ß luego de 7 días de tratamiento intravenoso con RNS60, a los niveles comparables a los de los grupos de tratamiento con dexametasona, sin señales de efectos secundarios tóxicos. Aunque se notó la misma tendencia el día 18, las diferencias no fueron estadísticamente significativas cuando se compararon con el grupo de control. Además, la IL-17 es una citocina efectora crucial con efectos proinflamatorios potentes. Induce la expresión de otras citocinas proinflamatorias tales como el factor a de necrosis tumoral y quemocinas, atrae leucocitos neutrófilos y mejora la maduración de células dendríticas (Kolls JK, Linden A. Interleukin-17 family members and inflammation. Immunity. octubre 2004; 21 (4 ): 467-76) . Se considera que las células que producen IL-17 son mediadores inflamatorios esenciales en las enfermedades autoinmunes, tales como artritis inducida por colágeno, colitis, psoriasis y EAE. Los linfocitos T cooperadores 17 en EAE son células CD4+ y se encuentran presentes tanto en la periferia inmunitaria como en el sistema nervioso central inflamado en EAE. Además, la neutralización de IL-17 mejora la enfermedad clínica, un descubrimiento que se compara con la severidad reducida de EAE en animales con deficiencia de IL-17 (Gold y Lühder, Interleukin-17—Extended Features of a Key Player in Múltiple Sclerosis Am J Pathol. enero 2008, 116, 172(1). 8-10.). El tratamiento intravenoso con RNS60 durante 7 días causó una reducción significativa en los niveles de IL17 en sangre, nuevamente a un nivel similar al de los animales tratados con dexametasona . Este continuó incluso luego de 18 días de tratamiento, aunque los resultados no fueron estadísticamente significativos. Cabe destacar que RNS60 es eficaz no solo para disminuir los niveles de IL1, sino en la combinación de las dos citocinas clave en EAE, IL1 e IL17, sin efectos secundarios notorios incluso luego de 21 días de inyecciones intravenosas .

Además de IL1 e IL17, RIS60 modula una variedad de otras moléculas que desempeñan un rol importante en la inflamación del sistema nervioso. Estas incluyen Rantes, KC, FCN e ICAM (no se muestran los datos) .

Por lo tanto, el fluido electrocinético RNS-60 de la invención tenía un efecto significativo sobre los niveles de IL-17 en las muestras de sangre tomadas, de ratas en el estudio de EAE. Adicionalmente, dado que la IL-17 estimula la secreción de IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1 y G-CSF, parece probable que el fluido electrocinético RNS-60 de la invención tuviera un efecto significativo sobre el nivel de estas citocinas en la sangre. De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, por lo tanto, las composiciones electrocinéticas de la invención son sustancialmente útiles para tratar, incluyendo aliviar y prevenir, los síntomas de EAE en modelos de EM humana en ratas reconocido en la técnica .

EJEMPLO 7 (Se demostró que el fluido electrocinético de la invención (por ejemplo, RNS60) inhibe la expresión tanto de iNOS como de TI-2/3 en forma dependiente de la dosis en células microgliales . ) Visión general: De acuerdo con aspectos particulares tal como se describen en la presente, los fluidos electrocinéticos de la invención son sustancialmente · útiles para tratar la enfermedad de Parkinson (EP) .

La enfermedad de Parkinson (EP) es uno de los trastornos neurodegenerativos más devastadores en los seres humanos. La EP puede aparecer a cualquier edad, pero es poco común en personas menores de 30 años. Clínicamente, la EP se caracteriza por temblores, bradiquinesia, rigidez e inestabilidad postural. Patológicamente es indicada mediante gliosis y la degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas asociadas con la presencia de inclusiones intracitoplasmáticas (cuerpos de Lewy) en la parte compacta de la sustancia negra (SNpc, por sus siglas en inglés) . Se ha informado que las neuronas que mueren exhiben, en el cerebro con EP luego de la muerte, características morfológicas de apoptosis que incluyen reducción del tamaño celular, condensación de la cromatina y fragmentación del ADN. Por lo tanto, es de vital importancia el desarrollo de enfoques terapéuticos neuroprotectores eficaces para detener el progreso de la enfermedad. El modelo de MPTP de ratón es sustancialmente útil' para analizar y validar enfoques terapéuticos contra EP.

La activación microglial desempeña un rol importante en la patogénesis de la enfermedad de Parkinson (EP) así como en la de otros trastornos neurodegenerativos. Se modelan características particulares de la EP en animales intoxicados con l-metil-4-fenil-1 , 2, 3, 6-tetrahidropiridina (MPTP) . El efecto neurotóxico de MPTP depende de su conversión a MPP+. En las células gliales, la monoamino oxidasa B (MAO-B) convierte MPTP en MPP+, que luego activa las células gliales, y recientemente se ha demostrado que MPP+ induce la expresión de moléculas proinflamatorias en microglia. Adicionalmente, la MPP+ causa apoptosis de neuronas dopaminérgicas .

En el presente EJEMPLO práctico, se confirmó la capacidad de RNS60 para modular la expresión de moléculas proinflamatorias en células microgliales estimuladas con MPP+ .

Materiales y métodos: A grandes rasgos: se incubaron las células microgliales BV-2 de ratón con diferentes concentraciones de RNS60 y solución salina normal (NS) durante 1 hora, y luego se estimularon con MPP+ 2 µ? en condiciones libres de suero. Luego de 6 horas, se aisló el ARN total y se midieron el ARNm de iNOS e IL-?ß mediante RT-PCR semicuantitativa . Los datos son representativos de los tres experimentos independientes.

RESULTADOS : Tal como se demostró mediante análisis RT-PCR semicuantitativo en la Figura 10, la MPP+ sola indujo la expresión del ARNm de óxido nítrico sintasa (iNOS) e interleucina-?ß (IL-?ß) inducible en células microgliales BV-2 de ratón. La RNS60 inhibió significativamente la expresión tanto de iNOS como de IL-?ß en forma dependiente de la dosis en células microgliales (Figura 10). Por el contrario, en condiciones experimentales similares, el control de solución salina normal (NS) no tuvo efecto sobre la expresión de estos dos genes proinflamatorios (Figura 10), lo que indica la especificidad del efecto.

La Figura 10 muestra particularmente que el fluido electrocinético de la invención (RNS-60) , pero no el control de solución salina normal (NS) , atenúa la expresión inducida por MPP+ de óxido nítrico sintasa (iNOS) e interleucina-?ß (IL-?ß) inducibles en células microgliales de ratón. Se estimularon las células microgliales BV-2 preincubadas con diferentes concentraciones de RNS60 y solución salina normal (NS) en un medio libre de suero durante 1 hora con MPP+ (una toxina parkinsoniana) . Luego de 6 horas de estimulación, se aisló el ARN total y se analizó la expresión del ARNm de iNOS e IL-?ß mediante RT-PCR semicuantitativa . Los resultados representan tres experimentos independientes.

Por consiguiente, de acuerdo con aspectos particulares, debido a que MPP+ es una toxina parkinsoniana estos resultados indican que RNS60 tiene un efecto protector en un modelo de enfermedad de Parkinson inducido por MPTP en ratones reconocido en la técnica.

De acuerdo con aspectos particulares, los fluidos electrocinéticos de la invención son sustancialmente útiles para tratar la enfermedad de Parkinson (EP) .

EJEMPLO 8 (Se demostró que el fluido electrocinético de la invención (por ejemplo, RNS60) protege las neuronas y las neuronas primarias humanas de toxicidad causada por ß amiloides . ) Visión general: De acuerdo con aspectos particulares tal como se describen en la presente, los fluidos electrocinéticos de la invención son sustancialmente útiles para tratar la enfermedad de Alzheimer (EA) .

. La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo que resulta en la muerte neuronal progresiva y la pérdida de memoria. El aumento de tinción TUNEL en cerebros con EA luego de la muerte indica que las neuronas en los cerebros de pacientes con EA mueren por apoptosis. Los péptidos ß amiloides fibrilares participan en la fisiopatologia de la EA. Desde el punto de vista neuropatológico, la enfermedad se caracteriza por ovillos neurofibrilares y placas neuríticas compuestos de agregados de proteína amiloide (?ß) , un fragmento proteolítico de 40-43 aminoácidos derivado de una proteína precursora amiloidea y tau fosforilado. Se ha observado que la sobreexpresión intracelular de los péptidos ?ß en ratones causa segmentación de la cromatina, condensación y aumento de la tinción TUNEL.

Además, los cultivos celulares han demostrado que los péptidos ?ß son apoptóticos y citotóxicos para las células neuronales y se ha demostrado que los péptidos fibrilares ?ß1-42 son capaces de inducir la apoptosis en células neuronales.

De manera adicional, cada día se dedican más estudios a la caracterización del vinculo entre inflamación y ??, y se ha encontrado activación glial extendida alrededor de placas y ovillos.

En este EJEMPLO, se confirmó el efecto de RNS60 para bloquear la apoptosis inducida por ?ß(1-42) en neuronas SHSY5Y humanas y en neúronas primarias humanas.

Materiales y métodos: Se detectó ADN fragmentado de las neuronas SHS5Y humanas in situ por la unión mediada por desoxinucleotidiltransferasa (TdT) de extremos 3' OH de los fragmentos de ADN generados en respuesta a ?ß1-42 fibrilares con un kit comercialmente disponible (TdT FragEL™) de Calbiochem. A grandes rasgos: se trataron los cubreobjetos con 20 yg/mL de proteinasa K durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego se lavaron antes de la tinción con TdT. Se aislaron las neuronas tal como se describió anteriormente y se cultivaron (1,2).

RESULTADOS ; Tal como se demostró en las Figuras 11A y B, los péptidos ?ß1-42 indujeron en forma marcada la formación de cuerpos apoptóticos en las células neuronales. Además se observó pérdida de procesamiento neuronal luego del tratamiento con ?ß1-42 (2a fila, Figura HA) . Por el contrario, los péptidos inversos ?ß42-1 no pudieron inducir apoptosis neuronal y pérdida de procesos (3a fila, Figura 11A) . Resulta significativo que RNS60 en diferentes concentraciones bloqueó la apoptosis inducida por ?ß(1-42) y preservó los procesos en las células neuronales (4a, 5a y 6a filas, Figuras 11 A y B) . Por el contrario, el fluido salino normal de control (NS) no tuvo efecto sobre la apoptosis y la pérdida de procesos inducidas por ?ß (1-42) (7a y 8a filas, Figura 11 A) .

En particular, la Figura 11A muestra que RNS60, y no el control de solución salina (NS) , elimina la apoptosis de células neuronales SHSY5Y humanas mediada por ?ß (1-42) fibrilar. Después de la diferenciación, las células SHSY5Y se incubaron con diferentes concentraciones de RNS60 o NS durante 1 hora, seguida de agresión con péptidos fibrilares ?ß(1-42) 1 uM. Después de 18 horas de tratamiento, se monitoreó la apoptosis mediante TUNEL (Calbiochem) . También se incubaron péptidos ?ß(42-1) como control. Los resultados representan tres experimentos independientes.

De manera adicional, las 2a y 3a filas de la Figura 11B muestran que RNS60 elimina la apoptosis mediada por ?ß(1-42) fibrilar de neuronas primarias humanas. Se incubaron las neuronas con RNS60 durante 1 hora, seguida de agresión con péptidos ?ß(1-42) fibrilares 1 uM. Después de 18 horas de tratamiento, se monitoreó la apoptosis mediante TUNEL (Calbiochem) . También se incubaron péptidos ?ß(42-1) como control. Los resultados representan tres experimentos independientes.

Estos resultados indican que el reactivo etiológico de EA (?ß1-42 fibrilar) induce la apoptosis en neuronas mediante una vía sensible a la RNS60 y que la RNS60 puede inhibir fuertemente la apoptosis inducida en forma fibrilar tanto en las neuronas cultivadas como en las primarias.

De acuerdo con aspectos particulares, los' fluido electrocinéticos de la invención son sustancialmente útiles para tratar la enfermedad de Alzheimer (EA) y en aspectos preferidos, para prevenir o enlentecer el progreso de EA.

EJEMPLO 9 (Se demostró que el fluido electrocinético de la invención es sustancialmente eficaz para suprimir la puntuación clínica en forma dependiente de la dosis en un modelo MOG de esclerosis múltiple (EM) en ratones, reconocido en la técnica . ) Visión general: En el presente EJEMPLO práctico, el fluido electrocinético RNS-60 de la invención fue evaluado en dos dosis, en regímenes de administración terapéutica, en un modelo MOG de encefalomielitis alérgica experimental (EAE) de esclerosis múltiple en ratones, reconocido en la técnica.

Materiales y métodos: La encefalomielitis alérgica experimental (EAE) es una enfermedad autoinmunitaria desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) que imita muchas de las características clínicas y patológicas de la esclerosis múltiple (EM) . El modelo murino MOG consiste en un período de sensibilización, inducido por una única inyección subcutánea (SC) de MOG emulsionante en adyuvante completo de Freund (CFA) en el día 0 del estudio (200 iq MOG / 300 \iq CFA inyectados en un volumen total de dosis de 200 µ?/animal administrado como inyecciones bilaterales subcutáneas de 2 X 100 µ? sobre la región paralumbar) ; seguida por inmunoestimulación intraperitoneal (IP) complementaria con toxina pertussis (PT) a 20 µg/kg (aproximadamente 400 ng/ratón) mediante inyección intraperitoneal (IP) una vez en el momento de inducción de EAE en el día 0 del estudio y nuevamente, 48 horas después, en el día 2 del estudio (Gilgun-Sherki Y. et ál., Neurosciences Research 47:201-207, 2003) . Luego los animales fueron tratados con infusión intravenosa de RNS60 tal como se indica en la Figura 12. Los animales utilizados fueron hembras de ratón C57BL/6J de Harían Laboratories Israel, Ltd. (10 animales/grupo), adultos jóvenes de 8-9 semanas de edad al inicio del estudio.

Se examinaron todos los animales para determinar señales de respuesta neurológica y síntomas antes de la inducción de EAE (día 0 del estudio) y luego fueron examinadas diariamente a lo largo del trascurso del período de observación de 35 días. Se evaluaron y registraron las reacciones de EAE de acuerdo con la escala 0-15 reconocida en la técnica en orden ascendiente de severidad. Se determinó la puntuación clínica mediante la suma de la puntuación de cada sección (véase, por ejemplo, eaver et ál., FASEB 2005; The FASEB Journal express article 10.1096/fj .04-2030fj e . publicado en línea el 4 de agosto de 2005) .

RESULTADOS: La Figura 12 muestra que RNS60, pero no el control con Vehículo (Vehículo) , es sustancialmente eficaz para suprimir la puntuación clínica en una forma dependiente de la dosis en un modelo MOG de esclerosis múltiple (EM) en ratones reconocido en la técnica. Tanto la administración terapéutica diaria de dosis alta y baja de RNS-60, como la administración de dosis alta de RNS-60 cada tres días (la administración de RNS-60 en todos los casos comenzó de manera concomitante con la aparición de los primeros signos clínicos), mostraron una disminución marcada de la puntuación clínica (rombos sin relleno = control con vehículo; cuadrados sin relleno = control positivo con dexametasona; "x" claras = administración diaria de dosis baja (0.09 mi de RNS60) a partir de la aparición de signos clínicos; "x" oscuras = administración de dosis alta (0.2 mi de RNS60) cada tres días a partir de la aparición de signos clínicos y triángulos sin relleno = administración diaria de dosis alta (0.2 mi de RNS60) a partir de la aparición de signos clínicos) .

En comparación con el modelo MBP de ejemplo antemencionado en la presente, este modelo MOG de ratones es conocido en la técnica por su capacidad para imitar el daño axonal característico de la EM, el cual el modelo MBP no muestra, y extiende la eficacia terapéutica observada a largos períodos de tiempo (28-30 días en comparación con 21 días con el modelo MBP) . De acuerdo con aspectos adicionales, RNS60, pero no el control del Vehículo (Vehículo) , es sustancialmente eficaz para reducir el daño axonal en este modelo MOG de ratones.

De acuerdo con aspectos particulares de la presente invención, las composiciones electrocinéticas de la invención son sustancialmente útiles para tratar, incluyendo aliviar y prevenir, los síntomas en un modelo de EM humana en ratones reconocido en la técnica. De acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención, las composiciones electrocinéticas de la invención son sustancialmente útiles para tratar, incluyendo aliviar y prevenir, los síntomas de EM en mamíferos que padecen la enfermedad (preferentemente, seres humanos) .

En aún otros aspectos adicionales, las composiciones electrocinéticas de la invención atraviesan _ la barrera hematoencefálica (BHE) y asi proporcionan un método novedoso para tratar afecciones inflamatorias del sistema nervioso central.

EJEMPLO 10 (RNS60, pero no solución salina normal (NS) , atenuó la activación de NFKB en linfocitos T cebados con MBP) .

Visión general. .La NF-?? cinasa es una cinasa ampliamente reconocida en la técnica como mediadora de respuestas inflamatorias en afecciones y trastornos mediados por inflamación.

Este ejemplo muestra que RNS60, pero no la solución salina normal (NS) , atenuó la activación de NFKB en linfocitos T cebados con MBP. Por lo tanto, de acuerdo con aspectos particulares, los presentes fluidos generados electrocinéticamente son sustancialmente útiles para tratar la inflamación y afecciones y enfermedades mediadas por inflamación, incluyendo de modo no taxativo, diabetes y trastornos metabólicos relacionados, resistencia a la insulina, enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, E.M., enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, etc.), asma, fibrosis cistica, enfermedad vascular/coronaria, degeneración retinal y/o macular, trastornos digestivos (por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, etc.).

Métodos . Para los experimentos mostrados en la Figuras 13 A y 13 B, los linfocitos T aislados de los ratones inmunizados con MBP se volvieron a cebar con MBP y luego de 24 horas las células recibieron diferentes concentraciones de RNS60 y NS . Luego de 2 horas de tratamiento, se monitoreó la actividad de unión a ADN de NF-?? en extractos nucleares mediante ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) .

Para los experimentos mostrados en la Figura 13 C, los linfocitos T aislados de los ratones inmunizados con MBP se transíectaron con PBIIX-Luc, una construcción indicadora dependiente de NF-?? seguido por un nuevo cebado con MBP. Luego de 24 horas de cebado con MBP, se trataron las células con concentraciones diferentes de RNS60 y NS durante 2 horas, seguidas de ensayo de actividad de luciferasa en extractos celulares totales mediante un kit de ensayo de luciferasa (Promega) . En otros casos, los linfocitos T cebados con MBP se estimularon también con PMA 30 nM durante 1 hora. En estos casos se agregó PMA luego de 1 hora de tratamiento previo con RNS60 y NS . Los resultados son el promedio + SD de tres experimentos diferentes.

Resultados . Las Figuras 13 A-C muestran que RNS60, pero no la solución salina normal (NS), atenuó la activación de NF-?? en linfocitos T cebados con MBP. Específicamente, las Figuras 13 A y 13 B muestran que RNS60 (véanse las tres líneas centrales de las Figuras 13 A y 124 B) , pero no NS (véase la línea que se encuentra más a la derecha de las Figuras 13 A y 13 B) , atenuó la activación de NF-?? en linfocitos T cebados con MBP en forma dependiente de la dosis .

Asimismo, la gráfica de barras de la Figura 13 C muestra que RNS60 (véanse la segunda, tercera y cuarta barras de las Figuras 13 A y 13 B) , pero no NS (véase la quinta barra de las Figuras 13 A y 13 B) , atenuó la activación de NF-?? en linfocitos T cebados con MBP y, por lo tanto, también atenuó la actividad de luciferasa de la construcción indicadora dependiente de NF-?? transfectado (PBIIX-Luc) en extractos celulares totales, en forma dependiente de la dosis .

Por lo tanto, de acuerdo con aspectos particulares, los fluidos generados electrocinéticamente que se describen son sustancialmente útiles para tratar la inflamación y afecciones y enfermedades mediadas por inflamación, incluyendo de modo no taxativo, diabetes y trastornos metabólicos relacionados, resistencia a la insulina, enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, E.M., enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, etc.), asma, fibrosis cistica, enfermedad vascular/coronaria, degeneración retinal y/o macular, trastornos digestivos (por ejemplo, enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa, _ enfermedad de Crohn, etc.) .

EJEMPLO 11 (RNS60, pero no la solución salina normal (NS) , atenuó los signos patológicos de enfermedad de Parkinson inducidos por MPTP en ratones.) Visión general: Es posible inducir a los ratones a que exhiban signos patológicos de la enfermedad de Parkinson (EP) (por ejemplo, reducción en el tiempo de movimiento, reducción en la distancia de movimiento, menor capacidad de equilibrio sobre un eje rotatorio, temblores y pérdida de la estereotipia de patrones de comportamiento dependientes del cuerpo estriado y del alzado en dos patas (movimientos verticales) ) mediante el tratamiento con l-metil-4-fenil-1, 2, 3, 6-tetrahidropiridina (MPTP) . El efecto neurotóxico de MPTP depende de su conversión a MPP+. En las células gliales, la monoamino oxidasa B (MAO-B) convierte MPTP en MPP+, que luego activa las células gliales, y recientemente se ha demostrado que MPP+ induce la expresión de moléculas proinflamatorias en microglia. Adicionalmente, se ha demostrado que MPP+ causa apoptosis de neuronas dopaminérgicas .

En el presente EJEMPLO práctico se confirmó la capacidad de RNS60 para reducir los síntomas patológicos de EP (por ejemplo, mejora en los movimientos coordinados, prevención de la pérdida de comportamientos dependientes del cuerpo estriado y rescate de las neuronas dopaminérgicas) en ratones tratados con MPTP.

Materiales y métodos: A grandes rasgos: los ratones C57BL/ 6 recibieron cuatro inyecciones intraperitoneales de MPTP-HCl (18 mg/kg de base libre) en solución salina en intervalos de 2 horas. Los animales de control recibieron el mismo volumen de solución salina. El tratamiento con RNS60 o solución salina normal (NS) comenzó 1 día después de la intoxicación con MPTP. Se midió la actividad motriz 7 días después de las inyecciones de MPTP con un monitor de actividad infrarrojo Digiscan asistido por computadora (Figuras 14 y 15) . Los datos se presentan como promedio ± SEM. Los valores de P fueron calculados por A OVA. * = P < .05, ** = P < .01, *** = P < .001, ns = no significativo.

El cuerpo estriado fue diseccionado 7 días después de la intoxicación con MPTP para los experimentos que confirmaron que el tratamiento con RNS60 rescata las neuronas dopaminérgicas en ratones intoxicados con MPTP (Figura 16) . Se detectó la presencia de neuronas dopaminérgicas en la parte compacta de la sustancia negra mediante inmunotinción de tirosina hidroxilasa, la enzima limitante involucrada en la síntesis de dopamina, con un anticuerpo. En el Panel A se muestra el cuerpo estriado del ratón de control = ratón de control sano no intoxicado con MPTP. En el Panel B se muestra el cuerpo estriado de MPTP = ratón sometido a prueba con MPTP. El Panel C muestra el cuerpo estriado de MPTP + RNS60 = ratón sometido a prueba de MPTP que fue tratado con RNS60.

RESULTADOS: Tal como lo demuestra el análisis locomotor en las Figuras 14 y 15, los síntomas de tipo EP inducidos en los sujetos por MPP+ sola, que incluyen la reducción del tiempo de movimiento (Figura 14A) , de la distancia (Figura 14B) , de la capacidad del ratón para mantener el equilibrio sobre un eje rotatorio (Figura 14C) , la pérdida de estereotipia de patrones de comportamiento dependientes del cuerpo estriado (acicalamiento) (Figura 15A) y del alzado en dos patas (movimientos verticales) (Figura 15B) . Resulta significativo que RNS60 alivió en forma sustancial estos síntomas y en algunos experimentos de movimiento coordinado, el comportamiento de los ratones fue similar al de los ratones de control. Por el contrario, ratones previamente tratados con el control de solución salina normal (NS) y luego inducidos con MPP+ en condiciones experimentales similares presentaron síntomas similares a los que fueron tratados únicamente con MPP+ (Figuras 14 y 15) . Por lo tanto, estos datos indican que RNS60 tenía un efecto protector específico sobre los ratones intoxicados con MPP+.

Las Figuras 14 y 15, por consiguiente, muestran que el fluido electrocinético de la invención (RNS-60) , pero no el control de solución salina normal (NS), mejora los movimientos coordinados y previene la pérdida de comportamientos dependientes del cuerpo estriado de los ratones en un modelo de EP en ratones.

Además, la inmunotinción en la parte compacta de la sustancia negra, la parte del cerebro afectada predominantemente en EP, reveló un notorio rescate de neuronas dopaminérgicas en ratones tratados con RNS60 (Figura 16) , lo que confirma la actividad neuroprotectora del tratamiento. Tal como se puede observar en la Figura 16, la intoxicación con MPP+ llevó a la pérdida de neuronas positivas para tirosina hidroxilasa (TH) y el tratamiento previo con RNS60 protegió las neuronas positivas para TH en la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) .

Adicionalmente, la cuantificación de la inmunotinción de TH del cuerpo estriado de todos los grupos de ratones (n=6 por grupo) se llevará a cabo tal como se describió anteriormente (1, 2) . Se obtendrán las medidas de densidad óptica mediante análisis de imagen digital (Scion) . Básicamente, la densidad óptica de TH del cuerpo estriado refleja las inervaciones de la fibra dopaminérgica .

Por consiguiente, de acuerdo con aspectos particulares, debido a que MPP+ es una neurotoxina, estos resultados indican que RNS60 tiene un efecto protector de neurotoxinas. Por consiguiente, de acuerdo con aspectos particulares, debido a que MPP+ es una neurotoxina dopaminérgica, estos resultados indican que RNS60 tiene un efecto protector de neurotoxinas dopaminérgicas .

De acuerdo con aspectos particulares, los fluidos electrocinéticos de la invención son sustancialmente útiles para prevenir síntomas neurotóxicos ocasionados por la exposición a una neurotoxina.

Referencias citadas en la sección que antecede: 1. Ghosh, A. , Roy, A., Liu, X., Kordower, J.H., Mufson, E.J., Mosely, R.L., Ghosh, S., Gendelman, H.E. y Pahan, K. 2007. Selective inhibition of NF-kB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson' s disease. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 104: 18754-18759. 2. Ghosh, A., Roy, A., Matras, J., Brahmachari, S., Gendelman, H.E. y Pahan, K. 2009. Simvastatin inhibits the activation of p21ms and prevents the loss of dopaminergic neurons in a mouse model of Parkinson' s disease. J. Neurosci. 29: 13543 - 13556 EJEMPLO 12 (RNS60, pero no la solución salina normal (NS) , elimina la expresión de iNOS microglial inducida por MPTP in vivo en Ja parte compacta de la sustancia negra (SNpc).) Visión general: De acuerdo con aspectos particulares tal como se describen en la presente, los fluidos electrocinéticos de la invención son sustancialmente útiles para proteger las neuronas de neurotoxinas .

Es posible inducir la exhibición de signos patológicos de la enfermedad de Parkinson (EP) en ratones al tratarlos con l-metil-4-fenil-1 , 2, 3, 6-tetrahidropiridina (MPTP) . El efecto neurotóxico de MPTP depende de su conversión a MPP+. En las células gliales, la monoamino oxidasa B (MAO-B) convierte MPTP en MPP+, que luego activa las células gliales, y recientemente se ha demostrado que MPP+ induce la expresión de moléculas proinflamatorias en microglia. Adicionalmente, la MPP+ causa la apoptosis de las neuronas dopaminérgicas .

En los EJEMPLOS prácticos 7 y 11 se expuso la capacidad de RNS60 para inhibir la expresión inducida por MPP+ de óxido nitroso sintasa (iNOS) e IL-?ß inducibles en células microgliales y para proteger las neuronas dopaminérgicas del cuerpo estriado y mejorar las actividades motrices en el modelo MPTP de EP en ratones. Se llevan a cabo experimentos adicionales para a) evaluar el efecto de RIS60 sobre iNOS microglial in vivo en la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) de ratones intoxicados con MPTP.

Materiales y métodos: Los ratones machos C57BL/6 (n=3 en cada grupo) que reciben RIS60 o IS (300 µ?/d/ratón vía inyección intraperitoneal ) un día antes de la intoxicación con MPTP recibirán cuatro inyecciones de MPTP en intervalos de 2 horas. El tratamiento con RIS60/IS continuará y 1 día después de la intoxicación con MPTP se matan los ratones. Luego sus cerebros se fijan, incrustan y procesan para inmunotinción con iNOS tal como se describió previamente (1, 2) . A grandes rasgos: se someten las secciones ventrales del mesencéfalo de todos los grupos de ratones (solución salina, MPTP, MPTP-RIS60-300 µ?, MPTP-IS-300 µ?) a inmunomarcado doble de flotación libre con anticuerpos contra iNOS y CDllb (para microglia) tal como se describió (1-3).

Las células positivas para CDllb, positivas para iNOS y las células positivas para ambas CDllb y iNOS se contarán mediante el software "Microsuite Biological Suite" en un microscopio fluorescente Olympus 1X81 para determinar si la activación microglial y la expresión de iNOS se reducen en SNpc de ratones intoxicados con MPTP tratados con RIS60 en comparación con los ratones MPTP de control y ratones MPTP tratados con IS (vehículo) . Se utilizan seis secciones negras aisladas de cada cerebro de cada uno de los tres animales para determinar el efecto de RIS60 sobre los niveles de proteína de CDllb e iNOS en la SNpc de ratones tratados con MPTP.

RESULTADOS : De acuerdo con determinadas modalidades, RNS60, pero no la solución salina normal (NS) , elimina la expresión de iNOS microglial inducida por MPTP in vivo en la parte compacta de la sustancia negra (SNpc) .) Por lo tanto, estos experimentos in vivo confirman los resultados observados en el Ejemplo 7, donde la PCR semicuantitavia mostró que RNS60, pero no la solución salina normal, elimina la expresión de iNOS inducida por MPTP en células microgliales de ratón.

Referencias citadas en la sección que antecede: 1. Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J.H., Mufson, E.J., Mosely, R.L., Ghosh, S., Gendelman, H.E. y Pahan, K. 2007. Selective inhibition of NF-kB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's disease. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 104: 18754-18759. 2. Ghosh, A., Roy, A., Matras, J., Brahmachari, S., Gendelman, H.E. y Pahan, K. 2009. Simvastatin inhibits the activation of p21ras and prevents the loss of dopaminergic neurons in a mouse model of Parkinson's disease. J. Neurosci . 29: 13543 - 13556 3. Roy, A. y Pahan, K. 2010. Prospects of statins in Parkinson's disease. Neuroscientist 16:000-000.

EJEMPLO 13 (RNS60, pero no la solución salina normal (NS) , indujo la activación de la fosforilación de Akt en neuronas primarias y en astrocitos.) Visión general. La Akt es una serina/treonina proteina cinasa que desempeña un rol fundamental en múltiples procesos celulares que incluyen el metabolismo de la glucosa, proliferación celular, apoptosis, transcripción y migración celular. Es conocido que Akt regula la supervivencia celular. Particularmente, se ha demostrado que la Akt fosforilada inhibe la apoptosis mediante la inactivación de BAD (una proteina proapoptótica) . (Véase, Song G, et a'J . , (2005). "The activation of .Akt/PKB signaling pathway and cell survival". J. Cell. Mol. Med. 9 (1) : 59-71.) La fosforilación de Akt, tal como es reconocida en la técnica, es de gran importancia en la protección de células, que incluyen neuronas, de estímulos tóxicos y proapoptóticos .

En el presente EJEMPLO práctico, se confirma la capacidad de RNS60 para inducir la fosforilación de Akt en neuronas primarias y astrocitos. Además, se demostró el rol de Akt en la capacidad de R S60 para interrumpir la apoptosis .

Materiales y métodos: Se aislaron las neuronas tal como se describió anteriormente y se cultivaron (1,2). Se aislaron y se cultivaron los astrocitos tal como se describió anteriormente. Las neuronas o astrocitos fueron tratados con RIS60 o IS (usado como control) al 10% durante 0', 15', 30', 60', 90', 120' y 180', y se monitoreó la activación de Akt por western blot de extractos celulares con anticuerpos contra fosfo-Akt y Akt normal (señalización celular) . Se detectó Akt total mediante anticuerpos contra Akt normal. Las neuronas o astrocitos fueron tratados con diferentes dosis de RIS60 (2%, 5%, 10% y 20%) . Se utilizaron diferentes dosis de IS como control. Se monitoreó la activación de Akt tal como se describe anteriormente.

La Figura 17 A muestra los resultados de un experimento en el que se analizan los efectos de RNS60 en comparación con el control de solución salina normal (NS) sobre la inducción de la fosforilación de Akt en neuronas primarias. Se monitoreó la fosforilación de Akt mediante inmunofluorescencia de doble marcado con anticuerpos contra ß-tubulina y fosfo-Akt. Se utilizaron beta-tubulina como marcador para neuronas y tinción con DAPI para visualizar los núcleos de las células. En los paneles B y C se muestra que la fosforilación con Akt fue inducida por RNS60 al 10%, mientras que el control de solución salina ("NS") no tuvo efecto .

La Figura 17B muestra los resultados de un experimento para evaluar los efectos de la inhibición de Akt en neuronas primarias en presencia o ausencia de RNS60. Se modificó la ?ß1-42 fibrilar (Bachem Biosciences) a la forma fibrilar tal como se describe previamente (1, 3) . Se inhibió la función de Akt fosforilada en neuronas mediante Aktl (un inhibidor especifico de Akt obtenido de Calbiochem) . Las neuronas que se incubaron previamente con diferentes concentraciones de Aktl durante 30 minutos fueron tratadas con RNS60. Después de 1 hora de incubación, las células se sometieron a prueba con Abl-42 fibrilar. Luego de 12 horas, se monitoreó la apoptosis neuronal mediante TUNEL y luego de 24 horas se analizó la muerte celular por liberación de MTT y LDH, tal como se describió anteriormente (1, 2). Los resultados (Figura 17B) mostraron que el inhibidor de Akt, Aktl, detuvo el efecto protector de RNS60 sobre las neuronas sometidas a prueba con Ab fibrilar.

Los resultados confirmaron, por consiguiente, que RNS60 requiere Akt para proteger neuronas de la toxicidad con Ab. La Figura 18 muestra los resultados de transcurso de tiempo (0 minutos, 15 minutos, 60 minutos y 120 minutos) en el que se analizan los efectos de RNS60 en comparación con el control de solución salina normal (NS) sobre la inducción de la fosforilación de Akt en neuronas primarias. La gráfica representa la relación entre la cantidad de Akt fosforilada y la cantidad total de Akt presente en astrocitos cuando se tratan con RNS60 o solución salina normal. Tal como se puede observar en la figura 18, la RNS60. induce un aumento de cuatro veces de la fosforilación de Akt en astrocitos, en comparación con los efectos de solución salina normal (NS) . Por lo tanto, la RNS60 induce específicamente la fosforilación de Akt.

De acuerdo con aspectos particulares tal como se describen en la presente, y sin verse limitados por mecanismo particular alguno, los fluidos electrocinéticos de la invención son sustancialmente útiles para proteger las neuronas de neurotoxinas al prevenir la exposición inducida por apoptosis a toxinas.

Referencias citadas en la sección que antecede: 1. Jana, A. y Pahan, K. 2004. Fibrillar amyloid-ß peptides kill human primary neurons via NADPH oxidase-mediated activation of neutral sphingomyelinase : Implications for Alzheimer's disease. J. Biol. Chem. 279: 51451-51459. 2. Jana, A. y Pahan, K. 2004. HIV-1 gpl20 induces apoptosis in human primary neurons through redox-regulated activation of neutral sphingomyelinase. J. Neurosci . 24: 9531-9540.

EJEMPLO 14 (RNS60, pero no la solución salina normal (NS) , atenuó la fosforilación de Tau inducida por el péptido ?ß1-42 fibrilar en neuronas primarias . ) Visión general. La hiperfosforilación de Tau es una característica distintiva de los ovillos en tejido cerebral y neuronal, y puede ocasionar una de varias enfermedades que en conjunto se conocen como taupatías. Las taupatías incluyen, de modo no taxativo, enfermedad de Alzheimer, demencia con granos argirófilos, demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva, degeneración corticobasal, degeneración lobular frontotemporal (enfermedad de Pick) y demencia pugilistica (DP) (también conocida como demencia del boxeador o encefalopatía traumática crónica) .

Las Figuras 19 A-B muestran los resultados de un experimento que analiza los efectos de RNS60 sobre la fosforilación de tau mediada por ?ß(1-42) fibrilar en neuronas primarias, en comparación con el control de solución salina normal. La fosforilación de tau se monitoreó mediante inmunofluorescencia de doble marcado con anticuerpos contra ß-tubulina y fosfo-tau. Se utilizaron beta-tubulina como marcador para neuronas y tinción con DAPI para visualizar los núcleos de las células. El tercer y cuarto panel desde la parte superior en la columna etiquetada " (p) -Tau" muestra que la fosforilación de Tau fue inhibida mediante RNS60 en forma dependiente de la dosis, mientras que el control de solución salina normal ("NS") no tuvo efecto, incluso a la dosis elevada de 10% (véase el panel inferior de la columna etiquetada "(p)-Tau") .

EJEMPLO 15 (El efecto protector de RNS60 en presencia de una neurotoxina fue bloqueado por un inhibidor de Akt.) Visión general. La Akt es una serina/treonina proteína cinasa que desempeña un rol fundamental en múltiples procesos celulares que incluyen el metabolismo de la glucosa, proliferación celular, apoptosis, transcripción y migración celular. En particular, es conocido que Akt regula la supervivencia celular. Particularmente, se ha demostrado que la Akt fosforilada inhibe la apoptosis mediante la inactivación de BAD (una proteína proapoptótica) . (Véase, Song G, et ál . , (2005). "The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival". J. Cell. Mol. Med. 9 (1): 59-71.) La fosforilación de Akt, tal como es reconocida en la técnica, es de gran importancia en la protección de células, que incluyen neuronas, de estímulos tóxicos y proapoptóticos .

Los EJEMPLOS prácticos 13 y 14 muestran que a) la Akt se fosforiló en presencia de RNS60 en neuronas primarias y b) RNS60 atenuó la fosforilación de Tau inducida por péptidos ?ß1-42 fibrilares en neuronas primarias. Los experimentos descritos en este EJEMPLO práctico confirmaron que el efecto protector de RNS60 en presencia de una neurotoxina podría ser bloqueado por un inhibidor de Akt. Por lo tanto, este EJEMPLO confirmó que RNS60 requiere Akt para proteger las neuronas de la toxicidad con ?ß .

Se aislaron y se cultivaron las neuronas o astrocitos tal como se describió anteriormente (1, 2) . Las neuronas o astrocitos fueron tratados con RIS60 o IS (usado como control) al 10% durante 0', 15', 30', 60', 90', 120' y 180', y se monitoreó la activación de Akt por western blot de extractos celulares con anticuerpos contra fosfo-Akt y Akt normal (señalización celular) . Se detectó la. Akt total mediante anticuerpos contra Akt normal. Las neuronas o astrocitos fueron tratados con dosis en aumento de RNS60 (2%, 5%, 10% y 20%) . Se utilizaron diferentes dosis de NS como control. Se monitoreó la activación de Akt tal como se describió anteriormente.

Se modificó la ?ß1-42 fibrilar (Bachem Biosciences) a la forma fibrilar tal como se describe previamente (1, 3). Se inhibió la función de Akt fosforilada en neuronas mediante Aktl (un inhibidor especifico de Akt obtenido de Calbiochem) .

Las neuronas que . se incubaron previamente con diferentes concentraciones de Aktl durante 30 minutos fueron tratadas con RNS60. Después de 1 hora de incubación, las células se sometieron a prueba con ?ß1-42 fibrilar. Luego de 12 horas, se monitoreó la apoptosis neuronal mediante TUNEL y luego de 24 horas se analizó la muerte celular por liberación de MTT y LDH, tal como se describió anteriormente (1, 2) .

Los resultados mostraron que el inhibidor de Akt, Aktl, detuvo el efecto protector de RNS60 sobre las neuronas sometidas a prueba con ?ß fibrilar. Por lo tanto, los resultados confirmaron que RNS60 requiere Akt para proteger las neuronas de la toxicidad con ?ß .

Referencias citadas en la sección que antecede: 1. Jana, A. y Pahan, K. 2004. Fibrillar amyloid-ß peptides kill human primary neurons via NADPH oxidase-mediated activation of neutral sphingomyelinase : Implications for Alzheimer's disease. J. Biol. Chem. 279: 51451-51459. 2. Jana, A. y Pahan, K. 2004. HIV-1 gpl20 induces apoptosis in human primary ' neurons through redox-regulated activation of neutral sphingomyelinase. J. Neurosci. 24: 9531-9540. 3. Jana, M. y Pahan, K. 2008. Fibrillar amyloid-ß peptides actívate microglia via toll-like receptor 2: Implications for Alzheimer's disease. J. Immunol . 181: 7254-7262.

EJEMPLO 16 (El efecto protector de RNS60 en presencia de una neurotoxina fue bloqueado por un inhibidor de PI-3 cinasa.) Visión general. La PI3 cinasa desempeña un rol fundamental en múltiples procesos celulares que incluyen crecimiento, proliferación, diferenciación, movilidad y supervivencia celular, y tráfico intracelular .

Adicionalmente, las PI 3 cinasas son un componente fundamental de la vía de señalización de la insulina. En particular, se sabe que la PI-3 fosforila, y por lo tanto, activa, Akt, la que es de gran importancia en la protección de células, que incluyen neuronas, de estímulos tóxicos y proapoptóticos .

Los EJEMPLOS prácticos 13 y 15 antemencionados en la presente muestran que: a) la Akt se fosforiló en presencia de RNS60 en neuronas primarias y b) la protección mediada por RNS60 de una neurotoxina podría ser bloqueada por un inhibidor de Akt. Además, este EJEMPLO demuestra que la protección mediada por RNS60 de apoptosis inducida por neurotoxinas requiere la vía de la PI-3 cinasa.

La Figura 20 muestra los resultados de un experimento que evalúa los efectos de RNS60 sobre neuronas primarias humanas que han sido tratadas con un inhibidor de PI-3 cinasa. Se aislaron y se cultivaron las neuronas primarias humanas tal como se describió anteriormente (1, 2). Se modificó la ?ß1-42 fibrilar (Bachem Biosciences) a la forma fibrilar tal como se describe previamente (1, 3) . Se inhibió la función de PI-3 cinasa en neuronas mediante LY294002 (un inhibidor específico de PI-3 cinasa obtenido de Enogene) .

Las neuronas preincubadas con 2 µp? de LY294002 fueron tratadas con RNS60. Después de 1 hora de incubación, las células se sometieron a prueba con ?ß1-42 fibrilar. Luego de 12 horas, se monitoreó la apoptosis neuronal mediante TUNEL y luego de 24 horas se analizó la muerte celular por liberación de MTT y LDH, tal como se describió anteriormente (1, 2) .

Los resultados mostraron que el inhibidor de PI-3 cinasa, LY294002, detuvo el efecto protector de RNS60 sobre las neuronas sometidas a prueba con ?ß fibrilar. Por lo tanto, los resultados demostraron que RNS60 requiere PI-3 cinasa para proteger las neuronas de la toxicidad con ?ß .

Por consiguiente, de acuerdo con determinadas modalidades y tal como se representa en forma esquemática en la Figura 21, RNS60 activa la PI-3 cinasa en neuronas por medio de efectos de membrana (por ejemplo, por modulación de uno o varios canales iónicos) , que a su vez fosforilan y activan Akt . Luego la Akt fosforilada bloquea la apoptosis de neuronas mediada por neurotoxinas .

Incorporación mediante referencia . Todas las patentes estadounidenses, publicaciones de solicitudes de patente estadounidense, solicitudes de patente estadounidense, patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones que no son patentes a las que se hace referencia en esta memoria descriptiva y/o enumeradas en la hoja de datos de la solicitud, se incorporan en la presente mediante esta referencia en su totalidad.

Se debería entender que los dibujos y la descripción detallada en la presente deben ser considerados en forma ilustrativa y no restrictiva, y con ellos no se pretende limitar la invención a las formas y ejemplos particulares descritos. Por el contrario, la invención incluye cualquier modificación, cambio, rearreglo, sustitución, alternativa, elección de diseño y modalidad adicional aparente para los expertos en la técnica, sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención, como se define por las siguientes reivindicaciones. Por lo tanto, se pretende que las siguientes reivindicaciones se interpreten de forma que abarquen todas dichas modificaciones, cambios, rearreglos, sustituciones, alternativas, elecciones de diseño y modalidades.

Las modalidades descritas anteriormente describen diferentes componentes contenidos en, o conectados con, otros componentes diferentes. Se debe entender que dichas construcciones descritas son meros ejemplos y que de hecho puede implementarse cualquier otra construcción que alcance la misma funcionalidad. En un sentido conceptual, cualquier arreglo de componentes para alcanzar la misma funcionalidad es efectivamente "asociado" de modo que se logre la funcionalidad deseada. En consecuencia, dos componentes cualesquiera de la presente combinados para alcanzar una funcionalidad particular pueden ser considerados "asociados" entre si de modo que se logre la funcionalidad deseada, independientemente de construcciones o componentes intermedios. Asimismo, dos componentes cualquiera asi asociados pueden también ser considerados "conectados de manera operativa" o "acoplados de manera operativa" entre si para lograr la funcionalidad deseada.

Aunque se mostraron y describieron modalidades particulares de la presente invención, será evidente para los expertos en la técnica que, con los contenidos de la presente como base, es posible hacer cambios y modificaciones sin apartarse de la invención y sus aspectos más amplios y, por lo tanto, quedan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas todos" dichos cambios y las modificaciones como si estuvieran contenidas por el verdadero espíritu y alcance de la presente invención. Además, se entiende que la invención se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas. Los expertos en la técnica entenderán · que, en general, los términos usados en la presente, y en especial en las reivindicaciones adjuntas (por ejemplo, cuerpos de las reivindicaciones adjuntas) , se utilizan generalmente como términos "abiertos" (por ejemplo, el término "que incluye" debería interpretarse como "que incluye, de modo no taxativo", el término "que tiene" debería interpretarse como "que tiene al menos", el término "incluye" debería interpretarse como "incluye, pero no se limita a", etc.). De manera adicional, aquellos que conocen la técnica entenderán que si se pretende mencionar un número específico en la descripción de una reivindicación, dicha intención se hará explícita en la descripción contenida en la reivindicación, y en ausencia de tal descripción, no se encuentra presente tal intención. Por ejemplo, para entenderlo mejor, las siguientes reivindicaciones adjuntas pueden contener el uso de las frases "al menos uno" y "uno o más" para introducir descripciones de las reivindicaciones. Sin embargo, no debería interpretarse que el uso de estas frases implica que la introducción de una descripción de un reivindicación mediante los artículos indefinidos "un/a" o "uno" limita cualquier reivindicación particular que contenga dicha descripción de reivindicaciones así introducida a invenciones que contienen únicamente dicha descripción, aún cuando la misma reivindicación incluya las frases introductorias "una o más" o "al menos una" y artículos indefinidos tales como "un/a" o "uno" (por ejemplo, "un/a" y/o "uno" debería entenderse, generalmente, que significan "al menos uno" o "uno o más") . Esto también se aplica para el caso de artículos definidos usados para introducir descripciones de reivindicaciones. Adicionalmente, incluso si se menciona explícitamente un número específico de una descripción introducida en un reivindicación, los expertos en la técnica reconocerán que generalmente se debe interpretar que significa al menos el número mencionado (por ejemplo, la simple mención de "dos descripciones" sin otros modificadores generalmente significa ai menos dos descripciones o dos o más descripciones) . Por consiguiente, la invención no se limita excepto por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (56)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un método para proteger de o reducir la neurotoxicidad de la exposición a un agente neurotóxico caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras con carga estabilizada que contienen oxigeno y que tienen, sustancialmente, un diámetro promedio menor de alrededor de 100 nanómetros y están configuradas de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar protección contra el agente neurotóxico, donde se logra un método para proteger contra o reducir la neurotoxicidad de la exposición a un agente neurotóxico.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende proteger contra o reducir la pérdida de coordinación motriz en un sujeto expuesto a la neurotoxina .

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se logra proteger o reducir la apoptosis neuronal mediada por neurotoxinas .

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende activar o inducir al menos una de fosforilación de PI-3 cinasa y de Akt en neuronas del suj eto .

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las nanoestructuras con carga estabilizada que contienen oxigeno están configuradas de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proporcionar, tras el contacto de una célula viva por el fluido, la modulación de al menos uno de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la administración del fluido comprende administrar el fluido antes de la exposición al agente neurotóxico.

7. El fluido electrocinético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las nanoestructuras con carga estabilizada que contienen oxigeno son la principal especie de nanoestructuras con carga estabilizada que contienen gas en el fluido.

8. El fluido electrocinético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el porcentaje de moléculas de oxígeno disuelto presentes en el fluido como las nanoestructuras con carga estabilizada que contienen oxígeno es un porcentaje seleccionado del grupo que consiste de mayor que: 0.01%, 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95%.

9. El fluido electrocinético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el oxígeno disuelto total está sustancialmente presente en las nanoestructuras de carga estabilizada que contienen oxígeno.

10. El fluido electrocinético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las nanoestructuras con carga estabilizada que contienen oxígeno tienen sustancialmente un diámetro promedio menor que un tamaño seleccionado del grupo que consiste de: 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 10 nm y menor que 5 nm.

11. El fluido electrocinético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la solución acuosa iónica comprende una solución salina.

12. El fluido electrocinético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido está superoxigenado .

13. El fluido electrocinético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido comprende una forma de electrones solvatados.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la alteración del fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados inducidos de forma hidrodinámica.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la exposición a los efectos electrocinéticos localizados comprende la exposición a al menos uno de pulsos de voltaje y pulsos de corriente.

16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la exposición del fluido a efectos electrocinéticos localizados inducidos de forma hidrodinámica comprende la exposición del fluido a características estructurales que inducen efectos electrocinéticos de un dispositivo usado para generar el fluido.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido acuoso alterado electrocinéticamente modula los niveles localizados o celulares del óxido nítrico.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido acuoso alterado electrocinéticamente promueve una disminución localizada en el sitio de administración de al menos una citocina seleccionada del grupo que consiste de: IL-lbeta, IL-8, TNF-alfa y TNF-beta.

19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende adicionalmente una terapia de combinación, donde se administra al paciente al menos un agente terapéutico adicional.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de: neurotoxinas adrenérgicas, neurotoxinas colinérgicas, neurotoxinas dopaminérgicas , excitotoxinas y agentes quimioterapéuticos .

21. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la modulación de al menos uno del potencial de la membrana celular y de la conductividad de la membrana celular comprende modular al menos una de la estructura o la función de la membrana celular que comprende la modulación de al menos uno de una conformación, una actividad de unión al ligando o una actividad catalítica de una proteína asociada a una membrana.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la proteína asociada a una membrana comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste de receptores, receptores transmembrana, proteínas del canal iónico, proteínas de unión intracelular, proteínas de adhesión celular e integrinas.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el receptor transmembrana comprende un receptor acoplado a proteína G (GPCR) .

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el receptor acoplado a proteína G (GPCR) interactúa con una subunidad de la proteína G.

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la subunidad de la proteína G comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste de G s, GOÍÍ, Goíq y G i2.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque al menos una subunidad ex de la proteína G es G q.

27. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la modulación de la conductividad de membrana celular comprende modular la conductancia de la célula completa.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la modulación de la conductancia de célula completa comprende modular al menos una contribución dependiente del voltaje en la conductancia de célula completa .

29. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la modulación de al menos uno de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular comprende modular la transduc.ción de señal intracelular que comprende la modulación de una vía o sistema de mensajero celular dependiente de calcio.

30. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la modulación de al menos uno de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular comprende modular la transducción de señal intracelular que comprende la modulación de la actividad de fosfolipasa C.

31. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la modulación de al menos uno de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular comprende modular la transducción de señal intracelular que comprende la modulación de la actividad de adenilato ciclasa (AC) .

32. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la modulación de al menos uno de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular comprende modular la transducción de señal intracelular asociada a al menos una afección o síntoma seleccionado del grupo que consiste de: inflamación crónica en el sistema nervioso central y el cerebro, e inflamación aguda en el sistema nervioso central y el cerebro.

33. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la administración a una red o capa celular y comprende adicionalmente la modulación de una unión intracelular en la misma.

34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la unión intracelular comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste de uniones herméticas, uniones de hendidura, adherinas de zona y desmasomas .

35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque la red o capas celulares comprenden al menos uno seleccionado del grupo que consiste de uniones herméticas de células endoteliales y astrocito endotelial en los vasos del SNC, uniones herméticas o barrera hematoencefálica, uniones de tipo epitelio pulmonar, uniones de tipo epitelio bronquial y uniones de tipo epitelio intestinal .

36. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido acuoso alterado electrocinéticamente está oxigenado y donde el oxigeno en el fluido está presente en una cantidad de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm o al menos 60 ppm de oxigeno a presión atmosférica .

37. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la cantidad de oxigeno presente en las nanoestructuras del fluido alterado electrocinéticamente, con carga estabilizada y que contienen oxigeno, es de al menos 8 ppm, al menos 15 ppm, al menos 20 ppm, al menos 25 ppm, al menos 30 ppm, al menos 40 ppm, al menos 50 ppm o al menos 60 ppm de oxigeno a presión atmosférica.

38. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido acuoso alterado electrocinéticamente comprende al menos uno de una forma de electrones solvatados y especies de oxigeno cargadas o modificadas electrocinéticamente .

39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque los electrones solvatados o especies de oxigeno cargadas o modificadas electrocinéticamente están presentes en una cantidad de al menos 0.01 ppm, al menos 0.1 ppm, al menos 0.5 ppm, al menos 1 ppm, al menos 3 ppm, al menos 5 ppm, al menos 7 ppm, al menos 10 ppm, al menos 15 ppm o al menos 20 ppm.

40. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el fluido acuoso oxigenado alterado electrocinéticamente comprende electrones solvatados estabilizados, al menos en parte, por oxigeno molecular.

41. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la capacidad de modular de al menos uno de potencial de membrana celular y conductividad de membrana celular persiste durante al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos 6, al menos 12 meses o periodos más prolongados, en un recipiente cerrado hermético al gas.

42. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la proteina asociada con una membrana comprende CCR3.

43. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento comprende la administración por al menos una vía entre via tópica, inhalación, via intranasal, via oral y via intravenosa.

44. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las nanoestructuras con carga estabilizada que contienen oxigeno del fluido alterado electrocinéticamente comprenden al menos una sal o ión de las Tablas 1 y 2 descritas en la presente.

45. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una cantidad de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras con carga estabilizada que contienen oxigeno, que sustancialmente tienen un diámetro promedio menor de alrededor de 100 nanómetros y que están configuradas de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para proteger contra o reducir la neurotoxicidad de la exposición a un agente neurotóxico.

46. Un método para preservar o mejorar la coordinación motriz de un sujeto que padece una afección o enfermedad neurodegenerativa, caracterizado porque comprende administrar al sujeto que padece una afección o enfermedad neurodegenerativa distinguida por la pérdida de coordinación motriz, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fluido acuoso alterado electrocinéticamente que comprende una solución acuosa iónica de nanoestructuras con carga estabilizada que contienen oxigeno, que sustancialmente tienen un diámetro promedio menor de alrededor de 100 nanómetros y que están configuradas de forma estable en el fluido acuoso iónico en una cantidad suficiente para lograr la preservación o mejora de la coordinación motriz en el sujeto, donde se logra un método para preservar o mejorar la coordinación motriz en un sujeto que padece una afección o enfermedad neurodegenerativa.

47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende la activación o inducción de al menos una de fosforilación de PI-3 cinasa y de Akt .

48. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la afección o enfermedad neurodegenerativa comprende al menos una afección o enfermedad neurodegenerativa inflamatoria seleccionada del grupo que consiste de esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrópica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, isquemia cerebral/apoplejía isquémica, traumatismo de cráneo, lesión de la médula espinal, enfermedad de Huntington, migraña, angiopatia amiloide cerebral, afección neurodegenerativa inflamatoria relacionada con el SIDA, deterioro cognitivo relacionado con la edad, deterioro cognitivo leve y enfermedades priónicas en un mamífero.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la afección o enfermedad neurodegenerativa inflamatoria comprende al menos una de esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson.

50. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende adicionalmente una inhibición o reducción sinérgica o no sinérgica de la inflamación para tratar de forma simultánea o accesoria al sujeto con otro agente antiinflamatorio.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque dicho otro agente antiinflamatorio comprende un esteroide o esteroide glucocorticoide .

52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el esteroide glucocortidoide comprende budesonida o un derivado activo de esta.

53. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque comprende adicionalmente una terapia de combinación, donde se administra al paciente al menos un agente terapéutico adicional .

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque al menos un agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de: acetato de glatirámero, interferón-ß, mitoxantrona, natalizumab, inhibidores de MMP incluido el inhibidor de MMP-9 y MMP-2, agonistas de ß2 de acción corta, agonistas de ß? de acción prolongada, anticolinérgicos , corticosteroides, corticosteroides sistémicos, estabilizadores de mastocitos, modificadores de leucotrieno, metilxantinas, agonistas de 2, albuterol, levalbuterol, pirbuterol, artformoterol, formoterol, salmeterol; anticolinérgicos incluyendo ipratropio y tiotropio; corticosteroides incluyendo beclometasona, budesonida, flunisolida, fluticasona, mometasona, triamcinolona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona; modificadores de leucotrieno incluyendo montelukast, zafirlukast y zileutón; estabilizadores de mastocitos incluyendo cromolín y nedocromil; metilxantinas incluyendo teofilina; combinaciones de fármacos incluyendo ipratropio y albuterol, fluticasona y salmeterol, budesonida y formoterol; antihistamínicos incluyendo hidroxizina, difenihidramina, loratadina, cetirizina e hidrocortisona; fármacos moduladores del sistema inmunitario incluyendo tacrolimus y pimecrolimus ; ciclosporina, azatioprina, micofenolato mofetil y combinaciones de estos.

55. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque al menos un agente terapéutico adicional es un antagonista de TSLP y/o de TSLPR.

56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el antagonista de TSLP y/o de TSLPR se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos neutralizantes específicos para TSLP y el receptor de TSLP, moléculas solubles del receptor de TSLP y proteínas de fusión del receptor de TSLP, que incluyen polipéptidos o moléculas Fe de inmunoglobulina TSLPR que codifican los componentes de más de una cadena receptora.