KR20130113314A - 신경독성제로부터 보호하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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KR20130113314A
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리차드 엘. 왓슨
안토니 비. 우드
그레고리 제이. 아르참보
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Abstract

본원에 제공된 바와 같은 동전기적으로 변경된 수성 유체를 신경독성제에 대한 신경보호를 제공하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 신경독성제에의 노출로 인한 신경독성으로부터 보호하거나 상기 신경독성을 감소시키기 위한 방법, 바람직하게는 신경독소에 노출된 대상체에서의 운동 협응의 상실로부터 보호하거나 상기 상실을 감소시키기 위한 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 신경독소-매개된 뉴런 아팝토시스를 보호 또는 감소시키고/거나 뉴런에서 PI-3 키나제 및 Akt 인산화 중 하나 이상을 활성화 또는 유도하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 유체의 투여가 신경독성제에 대한 노출 전 유체의 투여를 포함한다. 추가로, 본원에 제공된 바와 같은 동전기적으로 변경된 수성 유체를 신경퇴행성 상태 또는 질환을 갖는 대상체에서 운동 협응을 보존하거나 개선하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성 상태 또는 질환을 갖는 대상체에서 운동 협응을 보존하거나 개선하는 방법이 제공된다.

Description

신경독성제로부터 보호하기 위한 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR PROTECTING AGAINST NEUROTOXIC AGENTS}
특정 측면은 일반적으로 본원에 제공된 바와 같은 동전기적으로 변경된 수성 유체를 투여하는 것을 포함하는, 신경독성제에의 노출로 인한 신경독성으로부터 보호하거나 상기 신경독성을 감소시키기 위한 방법에 관한 것이고, 바람직하게는 신경독소에 노출된 대상체에서의 운동 협응의 상실로부터 보호하거나 상기 상실을 감소시키기 위한 방법이 제공된다. 특정 측면은 신경독소-매개된 뉴런 아팝토시스를 보호 또는 감소시키고/거나 뉴런에서 PI-3 키나제 및 Akt 인산화 중 하나 이상을 활성화 또는 유도시키는 방법에 관한 것이다. 특정 측면은 일반적으로 본원에 제공된 바와 같은 동전기적으로 변경된 수성 유체를 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성 상태 또는 질환을 갖는 대상체에서 운동 협응을 보존하거나 개선하는 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 발명의 명칭이 "신경퇴행성 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법 (COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES)"인 2010년 4월 30일자로 출원된 미국 특허출원 제12/771,476호, 발명의 명칭이 "신경독성제의 신경독성으로부터 보호하고 신경퇴행성 상태 또는 질환과 관련된 운동 협응을 개선하기 위한 방법 및 조성물 (METHODS AND COMPOSITIONS FOR PROTECTING AGAINST NEUROTOXICITY OF A NEUROTOXIC AGENT, AND IMPROVING MOTOR COORDINATION ASSOCIATED WITH A NEURODEGENERATIVE CONDITION OR DISEASE)"인 2010년 11월 15일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/413,899호 및 동일한 발명의 명칭인 2011년 3월 18일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/454,409호의 이익을 주장하며, 상기 문헌 모두는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 배경
신경퇴행성 질환은 뉴런 또는 이의 수초의 악화로 유형화되는 질환 군이다. 이러한 뉴런의 파괴는 결국 기능장애 및 불능을 유도한다. 종종 염증은 신경퇴행성 질환의 성분인 것으로 밝혀져 있으며 신경퇴행의 병인에 추가된다 (문헌 [Minagar, et al. (2002) J. Neurological Sci. 202:13-23]; [Antel and Owens (1999) J. Neuroimmunol. 100: 181-189]; [Elliott (2001) Mol. Brain. Res. 95:172-178]; [Nakamura (2002) Biol. Pharm. Bull. 25:945-953]; [Whitton PS. (2007) Br J Pharmacol. 150:963-76]). 집합적으로, 이들 질환은 기술-인식된 염증성 신경퇴행성 질환을 포함한다. 신경염증은 일부 신경퇴행성 장애에서 뉴런의 임의의 상당한 상실 전에 수년간 발생할 수 있다 (문헌 [Tansey et. al., Fron Bioscience 13:709-717, 2008]). 대식세포, 호중구, T 세포, 성상교세포 및 미세교세포를 포함한 다수의 상이한 유형의 면역 세포는 다발성 경화증 (M.S.), 파킨슨 질환, 아밀로이드증 (예, 알츠하이머 질환), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 프리온 질환 및 HIV-관련 치매와 같은 면역 관련 질환의 병리학에 기여할 수 있다. 보다 구체적으로, 조사 그룹은 다발성 경화증에서 미엘린에 대한 손상이 염증 반응에 의해 매개된다는 것을 주목하였고 (문헌 [Ruffini et. al. (2004) Am J Pathol 164:1519-1522]), 백혈구가 중추신경계 (CNS)에 침투할 때 다발성 경화증의 병인이 악화된다는 것을 주목하였다 (문헌 [Dos Santos et. al. (2008) J Neuroinflammation 5:49]). 한 조사 그룹은 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)의 동물 모델을 통해 중추신경계 염증 및 다발성 경화증에서의 그의 효과를 시험하기 위한 유전 모델을 개발하였다. 또한, 전-염증성 시토킨 (구체적으로 TNF-알파)는 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환 및 근위축성 측삭 경화증 (ALS)에서 상승하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Greig et al (2006) Ann NY Acad of Sci 1035:290-315]). 따라서, 이들 염증성 신경퇴행성 질환은 항-염증성 약물에 의해 효과적으로 치료될 수 있다.
염증성 신경퇴행성 질환은 포유동물에서의 다발성 경화증 (MS), 파킨슨 질환, 아밀로이드증 (예, 알츠하이머 질환), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), HIV-관련 치매, 뇌졸중/뇌 허혈, 두부 외상, 척수 손상, 헌팅톤 질환, 편두통, 뇌 아밀로이드 맥관병증, AIDS, 나이 관련 인지 저하, 경도 인지 장애 및 프리온 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
다발성 경화증 (MS)은 전세계적으로 대략 1,100,000명의 사람들에게 영향을 주는, 특히 젊은 성인에게 영향을 주는 중추신경계 (CNS)의 만성 염증성 신경퇴행성 질환이다 (문헌 [Pugliatti et al. (2002) Clin. Neurol. Neuros. 104:182-191]). 다발성 경화증은 병리학적으로 신경 조직의 탈수초화를 특징으로 하며, 이는 임상적으로 질환 상태의 양성에서 만성-진행성 패턴의 범위에 이르는 다수의 질환 형태 중 하나를 초래한다. 보다 구체적으로, 다발성 경화증의 5가지 주요 형태는 하기와 기재된다: 1) 양성 다발성 경화증; 2) 재발-완화형 다발성 경화증 (RRMS); 3) 2차 진행성 다발성 경화증 (SPMS); 4) 1차 진행성 다발성 경화증 (PPMS); 및 5) 진행성-재발형 다발성 경화증 (PRMS). 만성 진행성 다발성 경화증은 SPMS, PPMS 및 PRMS를 집합적으로 지칭하는데 사용되는 용어이다. 다발성 경화증의 재발형은 중첩 재발을 갖는 SPMS, RRMS 및 PRMS이다.
질환 과정 전체에 걸쳐 축색돌기를 둘러싼 수초의 진행성 파괴가 존재한다. 무손상 미엘린은 축색돌기 완전성 보존에 필수적이기 때문에 (문헌 [Dubois-Dalcq et al., Neuron. 48, 9-12 (2005)]), 전신적 파괴는 결국, 임상적으로, 무감각 및 통증, 협응 및 균형 문제, 실명, 및 일반적인 인지 장애를 포함한 다양한 신경학적 기능장애를 유도한다. 흥미롭게도, 다발성 경화증 진행은 환자마다 상당히 상이할 수 있는데, 일부 환자는 질환을 가지고 수십년 살아온 후에도 약간의 불능을 가지는 반면, 다른 환자는 진단받은 후 단지 몇년간만 휠체어에 의존하게 된다.
다발성 경화증의 원인은 현재 알려지지 않았지만, 질환 과정 및 탈수초화 발생 메카니즘을 설명하기 위해 유전적 증거, 분자 기초 및 면역학 인자를 조사하는 연구가 시작되고 있다. 유전적 분석에서, 일부 보고는 관련 개체들이 정상 집단과 비교하여 보다 높은 MS 발병률을 가짐을 나타냈다 (MS의 0.1％ 유병률): 일란성 쌍둥이는 다른 쌍둥이가 MS를 갖는 경우 질환을 발생시킬 가능성이 30％이고, 이란성 쌍둥이 및 형제는 또다른 형제가 MS에 의해 영향받는 경우 1-2％의 가능성을 갖는다. 여러 그룹은 이러한 유전가능성을 담당하는 유전자를 발견하기 위해 연계 및 연관 연구를 이용하였으며, MS에 의해 영향받을 상대적 위험이 인간 백혈구 항원 (HLA)-DR2 대립유전자의 주 조직적합 복합제 (MHC) 부류 II 대립유전자를 갖는 경우보다 3-4배 더 높다는 것을 발견하였다. MS와 연관되지만 훨씬 낮은 위험성을 갖는 다른 유전자가 확인되었다. MS 감수성과 MHC 부류 II 사이의 관계는 MS 병인에 있어서 CD4+ T-세포의 역할을 강력하게 시사한다 (문헌 [Oksenberg et al., JAMA 270:2363-2369 (1993)]; [Olerup et al., Tissue Antigens 38:1-3 (1991)]).
또한, 건강한 개체와 비교하여 MS에 걸린 MS 환자에서 차별적으로 발현되는 유전자의 확인이 시도되었다. 유전자 마이크로어레이는 1) MS 플라크 유형 (급성 대 만성) 및 플라크 영역 (활성 대 불활성)으로부터의 전사를 조사하고 (Lock and Heller (2003)); 2) RRMS 환자 대 인터페론-β 치료를 받은 환자 및 받지않은 환자의 대조군에서의 말초 혈액 단핵구 (PBMC)를 비교하고 (Sturzebecher et al. (2003)); 3) MS의 동물 모델인 마우스에서 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)의 단계에서 CNS 세포를 조사하는데 (Lock et al. (2002)) 사용되었다. 항-염증성, 항-아팝토시스성 유전자가 하향조절되고 전-염증성 증식 유전자가 상향조절된다는 발견을 포함하여 이들 실험이 발견한 것들 다수가 예상되었다. 놀라운 결과는 오스테오폰틴 (Chabas et al. 2001) 및 TRAIL (Wandinger et al. 2003)과 같은, 치료적 적용을 위한 잠재적인 신규 표적의 확인을 포함한다. 그러나, MS 환자와 건강한 개체 사이의 발현을 비교하는 경우 차별적인 조절을 갖는 다수의 유전자는 MS 발달에 있어서 미지의 유의성을 갖는데, 이는 MS 감수성 및/또는 진행에 영향을 줄 수 있는 임의의 유전자가 여전히 알려지지 않았기 때문이다.
추가의 조사는, 자가반응성 CD4+ T-세포에 의해 개시된 염증 반응이 미엘린에 대한 손상을 매개할 수 있다고 결정하였다 (문헌 [Bruck et al., J. Neurol. Sci. 206:181-185 (2003)]). 일반적으로, MS 에피소드 동안 수초 및 축색돌기에게 일어나는 손상의 다수는, 전-염증성 (예, Th1 및 Th17) 시토킨의 분비를 포함한 염증 반응을 생성하는 자가반응성 T 세포 반응을 통해 일어난다고 생각된다 (문헌 [Prat et al., J. Rehabil. Res. Dev. 39:187-199 (2002); Hemmer et al., Nat. Rev. Neurosci. 3:291-301 (2002)]).
현재 MS에 대해 이용가능한 치료제는 글라티라머 아세테이트, 인터페론-β, 나탈리주맙 및 미톡산트론을 포함한다. 일반적으로, 이들 약물은 비특이적 방식으로 면역계를 억제하며 질환의 전체적 진행을 단지 약간만 제한한다 (문헌 [Lubetzki et al. (2005), Curr. Opin. Neurol. 18:237-244]). 따라서, MS를 더 잘 치료하기 위한 치료적 전략을 개발할 필요가 있다.
글라티라머 아세테이트는 랜덤 중합체로서 글루탐산, 리신, 알라닌 및 티로신으로 구성된다. 글라티라머 아세테이트는 제한된 효과 및 유의한 부작용, 예를 들어 주사 부위의 혹, 오한, 열, 동통, 숨참, 빠른 심장박동 및 불안증을 갖는다. 1차 진행성 MS를 갖는 943명의 환자를 이용한 중요 임상 연구에서, 글라티라머 아세테이트는 장애 및 질환의 진행을 중단시키지 못했다 (문헌 [Wolinsky, et al (2007) Ann Neurol 61:13-24]).
인터페론-β는 섬유아세포 및 내재적 면역 반응의 일부에 의해 생성된 천연 발생 단백질이다. MS에 대한 약물로서, 인터페론-β는 MS 에피소드의 비율을 감소시키는데 약 18-38％ 유효하다. 부작용은 경도인 독감-유사 증상 및 주사 부위에서의 반응 및 보다 중증 (예, 우울증, 발작 및 간 문제)을 포함한다.
미톡산트론은 MS에 대한 치료제이다. 이는 DNA 복구 및 합성을 방해함으로써 암-작용과 싸우는데 사용하기 위한 화학요법 치료제로서 개발되었으며, 암 세포에 특이적인 것은 아니다. 미톡산트론의 부작용은 꽤 심각할 수 있으며, 오심, 구토, 탈모, 심장 손상 및 면역저하를 포함한다.
나탈리주맙은 세포 접착 분자인 알파4-인테그린을 표적으로 하는 인간화 모노클로날 항체이다. 나탈리주맙은 염증을 일으키는 면역 세포가 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 교차하지 못하게 함으로써 작용하는 것으로 생각된다. 부작용은 피로, 두통, 오심, 감기 및 알레르기 반응을 포함한다.
파킨슨 질환
또다른 염증성 신경퇴행 질환인 파킨슨 질환 (PD)은 근경직 및 느린 신체적 움직임을 비롯한 운동 장애를 특징으로 한다. PD는 두번째로 가장 흔한 신경퇴행성 장애로 미국에서만 100만명에 이르는 사람들에게 영향을 준다. PD 유병률은 일반 미국인구 중 0.3％에서 65세 이상의 사람 중 1％-2％ 및 85세 이상의 개인 중 4％-5％로 연령에 따라 증가한다. 전반적으로 증가하는 예상 수명에 따라, 미국 및 다른 국가에서의 PD 환자 수는 2030년까지 두배일 것으로 예상된다.
PD는 미진, 경직, 서동 (느린 움직임), 보행 장애 및 자세 변화를 포함하는 운동 증상을 특징으로 하는 진행성 질환이다. 질환은 또한 비-운동 증상, 예컨대 인지 결함, 우울증 및 수면 장애를 포함한다. 알츠하이머 질환처럼, PD는 단백질성병증이다. 미스폴딩된 α-시뉴클레인 (α-synuclein)이 뉴런 내부에 축적되어, PD의 신경병리학적 특징 중 하나인 소위 루이체 (Lewy body)를 형성한다. 초기에는 흑색질 중 도파민성 뉴런의 상실에 의해서만 야기되는 것으로 생각되었던 PD는, 최근에 뇌 미세교세포를 활성화시키고 뉴런 세포 사멸의 진행에 관여하는 염증성 성분을 갖는 것으로 인식되었다. 파킨슨 질환의 감지된 병리생리학적 원인은 뇌간에 위치한 기저핵 (basal nuclei)인, 흑색질의 치밀부를 포함하는 기저 신경절 (basal ganglia)에서의 도파민 생성 세포의 진행성 파괴이다. 도파민성 뉴런의 상실은 상대적으로 과량인 아세틸콜린을 생성한다 (문헌 [Jellinger, K. A., Post Mortem Studies in Parkinson's Disease--Is It Possible to Detect Brain Areas For Specific Symptoms?, J Neural Transm 56 (Supp); 1-29:1999]). 또한, 파킨슨 질환에 대한 최근의 조사는, 시토킨 및 HLA-DR 항원의 증가된 발현으로 인해 면역 반응이 뉴런 손상에 기여하는 것 같음을 관찰하였다 (문헌 [Czlonkowska et. al. (2002) Med Sci Monit 8:RA165-77]).
초기 단계에서의 유효한 치료제는 PD 환자 관리시 충족되지 않은 임상적 필요를 나타낸다. 레보도파 (L-DOPA)는 PD의 가장 효능있는 약리학적 치료제이만, 통상 심각한 부작용으로 인해 질환 경과 말기에 처방된다. 도파민 수용체 효능제 및 모노아민 옥시다제 유형 B 억제제는 효능과 부작용의 발생 및 중증도 사이에 역 상관관계를 보여주었고, 코엔자임 Q10, 토코페롤 (비타민 E), 아만티딘 및 베타-차단제를 포함한 다른 치료제 옵션을 개발하려는 시도는 유익성을 입증하는데 실패하거나 전체적인 위험 대 유익성 평가에 대한 충분한 데이터를 산출하는데 실패하였다. 특히 신경보호는 PD 치료에 있어서 중요한, 그러나 파악하기 어려운 목표였다.
아밀로이드증은, 특정 단백질이 변경된 구조를 갖고 특정 조직에서 각 구조물 (building up)에 결합하여 정상 조직의 기능을 차단하는 경향이 있는 경우 발생한다. 이들 변경된 구조화 단백질은 아밀로이드라 칭해진다. 종종 아밀로이드증은 2가지 카테고리, 즉 1차 또는 2차로 나뉜다. 1차 아밀로이드증은 부적절한 면역 세포 기능을 갖는 병으로부터 발생한다. 2차 아밀로이드증은 통상 몇몇 다른 만성 감염성 또는 염증성 질환의 합병증으로부터 발생한다. 이들의 예로는 알츠하이머 질환 및 류마티스 관절염이 포함된다. 2차 아밀로이드증의 근원적인 문제가 염증이기 때문에, 염증을 치료하는 것이 유익할 것이다.
알츠하이머 질환은 염증성 신경퇴행성 질환의 또다른 유형이다. 이 질환은 학습 및 기억 손상의 증가에 의해 예시되지만, 변경된 인지 능력을 나타내는 다른 방식으로 표출될 수 있다. 질환에 걸쳐, 대뇌 피질에서 뉴런 및 시냅스의 진행성 상실은 신경 조직의 총체적 위축을 유도한다. 알츠하이머의 원인이 알려지지 않았지만, 대다수는 염증이 중요한 역할을 하는 것으로 믿고 있고, 임상 연구는 염증이 질환의 병인에 상당히 기여함을 보여주었다 (문헌 [Akiyama, et. al. (2000) Neurobiol Aging. 21:383-421]).
근위축성 측삭 경화증에서, 염증과 질환 사이의 관계가 제시되었다 (문헌 [Centonze, et. al. (2007) Trends Pharm Sci 28:180-7]). 또한, TNF-알파 mRNA는 근위축성 측삭 경화증에 대한 트랜스제닉 마우스 모델의 척수에서 발현되는 것으로 밝혀졌다. 흥미롭게도, 전사체는 ALS 의해 야기된 사망시까지 운동 곤란 발증 전에 일찍 검출되었다 (문헌 [Elliot (2001) Brain Res Mol Brain Res 95:172-8)]).
신경독소
신경독소는 뉴런, 시냅스 또는 신경계에 대해 전체로서 특이적으로 작용하는 독소이다. 이들은 뇌 구조에 손상을 일으켜 만성 질환을 유도하는 물질이다. 신경독소는, 예를 들어 아드레날린성 신경독소, 콜린성 신경독소, 도파민성 신경독소, 흥분독소 및 다른 신경독소를 포함한다. 아드레날린성 신경독소의 예는 N-(2-클로로에틸)-N-에틸-2-브로모벤질아민 히드로클로라이드를 포함한다. 콜린성 신경독소의 예는 아세틸에틸콜린 머스타드 히드로클로라이드를 포함한다. 도파민성 신경독소의 예는 6-히드록시도파민 HBr (6-OHDA), 1-메틸-4-(2-메틸페닐)-1,2,3,6-테트라히드로-피리딘 히드로클로라이드, 1-메틸-4-페닐-2,3-디히드로피리디늄 퍼클로레이트, N-메틸-4-페닐-1,2,5,6-테트라히드로피리딘 HCl (MPTP), 1-메틸-4-페닐피리디늄 아이오다이드 (MPP+), 파라콰트 및 로테논을 포함한다. 흥분독소의 예는 NMDA 및 카인산을 포함한다.
MPTP, MPP+, 파라콰트, 로테논 및 6-OHDA는 동물 모델에서 PD 유사 증상을 유도하는 것으로 나타났다 (문헌 [K. Ossowska, et al., (2006). "Degeneration of dopaminergic mesocortical neurons and activation of compensatory processes induced by a long-term paraquat administration in rats: Implications for Parkinson's disease". Neuroscience 141 (4): 2155-2165; and Caboni P, et al., (2004). "Rotenone, deguelin, their metabolites, and the rat model of Parkinson's disease". Chem Res Toxicol 17 (11): 1540-8; Simon et al., Exp Brain Res, 1974, 20: 375-384; Langston et al., Science, 1983, 219: 979-980; Tanner, Occup Med, 1992, 7: 503-513; Liou et al., Neurology, 1997, 48: 1583-1588] 참조).
발명의 개요
특정 측면은 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이며 이온성 수성 유체에 안정하게 배열된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 이온성 수용액을 포함하는 치료 유효량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를, 신경독성제로부터의 신경보호를 제공하기에 충분한 양으로 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경독성제에의 노출로 인한 신경독성으로부터 보호하거나 상기 신경독성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 상기 방법은 신경독소에 노출된 대상체에서의 운동 협응의 상실로부터 보호하거나 상기 상실을 감소시키는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 신경독소-매개된 뉴런 아팝토시스의 보호 또는 감소가 제공되고/거나 뉴런 (예, 대상체의 뉴런)에서 PI-3 키나제 및 Akt 인산화 중 하나 이상을 활성화시키거나 유도하는 것이 제공된다.
특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 이온성 수성 유체에 의한 생존 세포 접촉시 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절을 제공하기에 충분한 양으로 상기 유체에 안정하게 배열된다.
특정 실시양태에서, 유체의 투여는 신경독성제에의 노출 전 유체의 투여를 포함한다.
특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 유체 중 주요한 전하-안정화된 가스-함유 나노구조체 종이다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체로서 유체 중에 존재하는 용존 산소 분자의 백분율은 0.01％, 0.1％, 1％, 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 및 95％ 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율이다. 특정 측면에서, 전체 용존 산소는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체에 실질적으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 평균 직경은 실질적으로 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 10 nm 및 5 nm 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 크기 미만이다.
특정 측면에서, 이온성 수용액은 염수 용액을 포함하고/거나 슈퍼산소화된다. 특정 측면에서, 유체는 용매화 전자의 형태를 포함한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 변경은 수력학적으로 유도된 국부화 동전기적 효과에 대한 유체의 노출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 국부화 동전기적 효과에 대한 노출은 전압 펄스 및 전류 펄스 중 하나 이상에 대한 노출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 수력학적으로 유도된 국부화 동전기적 효과에 대한 유체의 노출은 유체를 생성하는데 사용된 장치의 구조적 특징을 유도하는 동전기적 효과에 대한 유체의 노출을 포함한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 산화질소의 국부화 수준 또는 세포 수준을 조절한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 IL-1베타, IL-8, TNF-알파 및 TNF-베타로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시토킨의 투여 부위에서 국부화 감소를 촉진한다.
상기 방법의 특정 측면은 하나 이상의 추가 치료제가 환자에게 투여되는 조합 요법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가 치료제는 아드레날린성 신경독소, 콜린성 신경독소, 도파민성 신경독소, 흥분독소 및 화학치료제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 측면에서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절은, 막 관련 단백질의 형태, 리간드 결합 활성 또는 촉매 활성 중 하나 이상의 조절을 포함하는 세포막 구조 또는 기능 중 하나 이상의 조절을 포함한다. 특정 측면에서, 막 관련 단백질은 수용체, 횡단막 수용체, 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 접착 단백질 및 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 특정 측면에서, 횡단막 수용체는 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)를 포함한다. 특정 측면에서, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)는 G 단백질 α 서브유닛과 상호작용한다. 특정 측면에서, G 단백질 α 서브유닛은 Gαs, Gαi, Gαq 및 Gα12로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 특정 측면에서, 하나 이상의 G 단백질 α 서브유닛은 Gαq이다.
특정 측면에서, 세포막 전도성의 조절은 전세포 전도도 (conductance)의 조절을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전세포 전도도의 조절은 전세포 전도도의 하나 이상의 전압-의존성 기여의 조절을 포함한다.
특정 측면에서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절은 칼슘 의존성 세포 메세징 경로 또는 시스템의 조절을 포함하는 세포내 신호 전달의 조절을 포함한다. 특정 측면에서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절은 포스포리파제 C 활성의 조절을 포함하는 세포내 신호 전달의 조절을 포함한다. 특정 측면에서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절은 아데닐레이트 사이클라제 (AC) 활성의 조절을 포함하는 세포내 신호 전달의 조절을 포함한다. 특정 측면에서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절은 중추 신경 및 뇌의 만성 염증, 및 중추 신경 및 뇌의 급성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태 또는 증상과 관련된 세포내 신호 전달의 조절을 포함한다.
상기 방법의 특정 측면은 세포망 또는 세포층에의 투여를 포함하고, 그 내부의 세포간 연접의 조절을 추가로 포함한다. 특정 측면에서, 세포내 연접은 밀착 연접, 갭 연접, 접착대 (zona adherin) 및 데스모좀 (desmosome)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포망 또는 세포층은 CNS 혈관에서의 내피 세포 및 내피-성상교세포 밀착 연접, 혈액-뇌척수액 밀착 연접 또는 장벽, 폐 상피-유형 연접, 기관지 상피-유형 연접 및 장 상피-유형 연접으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 산소화되고, 유체 중의 산소는 대기압에서 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상 또는 60 ppm 이상의 산소의 양으로 존재한다. 특정 측면에서, 동전기적으로-변경된 유체의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체 중에 존재하는 산소의 양은 대기압에서 산소 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상 또는 60 ppm 이상이다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 용매화 전자의 형태 또는 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용매화 전자의 형태 또는 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종은 0.01 ppm 이상, 0.1 ppm 이상, 0.5 ppm 이상, 1 ppm 이상, 3 ppm 이상, 5 ppm 이상, 7 ppm 이상, 10 ppm 이상, 15 ppm 이상 또는 20 ppm 이상의 양으로 존재한다. 특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체는 산소 분자에 의해 적어도 부분적으로 안정화된 용매화 전자를 포함한다.
특정 측면에서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절 능력은 밀폐된 가스-조밀 용기에서 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상 또는 이보다 긴 기간 동안 지속된다.
특정 측면에서, 막 관련 단백질은 CCR3을 포함한다.
특정 측면에서, 치료 또는 투여는 국소, 흡입, 비내, 구강 및 정맥 중 하나 이상에 의한 투여를 포함한다.
특정 측면에서, 동전기적으로-변경된 유체의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 본원에 개시된 표 1 및 2에서의 하나 이상의 염 또는 이온을 포함한다.
추가의 측면은 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이며 이온성 수성 유체에 안정하게 배열된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 이온성 수용액을 포함하는 동전기적으로 변경된 수성 유체를, 신경독성제에의 노출로 인한 신경독성으로부터 보호하거나 상기 신경독성을 감소시키기에 충분한 양으로 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또다른 추가의 측면은 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이며 이온성 수성 유체에 안정하게 배열된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 이온성 수용액을 포함하는 치료 유효량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를, 운동 협응의 상실을 특징으로 하는 신경퇴행성 상태 또는 질환을 갖는 대상체에서의 운동 협응을 보존하거나 개선하기에 충분한 양으로 상기 신경퇴행성 상태 또는 질환을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성 상태 또는 질환을 갖는 대상체에서의 운동 협응을 보존하거나 개선하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, PI-3 키나제 및 Akt 인산화 중 하나 이상의 활성화 또는 유도를 제공한다.
특정 측면에서, 신경퇴행성 상태 또는 질환은 포유동물에서의 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 뇌졸중/뇌 허혈, 두부 외상, 척수 손상, 헌팅톤 질환, 편두통, 뇌 아밀로이드 맥관병증, AIDS 관련 염증성 신경퇴행성 상태, 나이 관련 인지 저하, 경도 인지 장애 및 프리온 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염증성 신경퇴행성 상태 또는 질환을 포함한다. 바람직하게는, 염증성 신경퇴행성 상태 또는 질환은 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환 중 하나 이상을 포함한다.
상기 방법의 특정 측면은 대상체를 또다른 소염제, 예를 들어 스테로이드 또는 글루코코르티코이드 스테로이드를 포함하는 다른 소염제로 동시에 또는 보조적으로 치료하는 것에 의한 염증의 상승작용적 또는 비상승작용적 억제 또는 감소를 포함한다. 특정 측면에서, 글루코코르티코이드 스테로이드는 부데소니드 또는 이의 활성 유도체를 포함한다.
상기 방법의 특정 측면은 하나 이상의 추가 치료제가 환자에게 투여되는 조합 요법을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가 치료제는 글라티라머 아세테이트, 인터페론-β, 미톡산트론, 나탈리주맙, MMP-9 및 MMP-2의 억제제를 포함한 MMP의 억제제, 단기작용성 β2-효능제, 장기작용성 β2-효능제, 항콜린제, 코르티코스테로이드, 전신성 코르티코스테로이드, 비만 세포 안정화제, 류코트리엔 변형제, 메틸크산틴, β2-효능제, 알부테롤, 레발부테롤, 퍼부테롤, 아트포모테롤, 포모테롤, 살메테롤, 이프라트로피움 및 티오트로피움을 포함한 항콜린제; 베클로메타손, 부데소니드, 플루니솔리드, 플루티카손, 모메타손, 트리암시놀론, 메티프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손을 포함한 코르티코스테로이드; 몬텔루카스트, 자피를루카스트 및 질류톤을 포함한 류코트리엔 변형제; 크로몰린 및 네도클로밀을 포함한 비만 세포 안정화제; 테오필린을 포함한 메틸크산틴; 이프라트로피움과 알부테롤, 플루티카손과 살메테롤, 부데소니드와 포모테롤을 포함한 조합 약물; 히드록시진, 디펜히드라민, 로라타딘, 세티리진 및 히드로코르티손을 포함한 항히스타민; 타크로리무스 및 피메크로리무스를 포함한 면역계 조절 약물; 시클로스포린; 아자티오프린; 미코페놀라테모페틸; 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 추가 치료제는 TSLP 및/또는 TSLPR 길항제이다. 특정 측면에서, TSLP 및/또는 TSLPR 길항제는 TSLP 및 TSLP 수용체에 특이적인 중화 항체, 가용성 TSLP 수용체 분자, 및 1개 초과의 수용체 쇄 성분을 코딩하는 TSLPR-이뮤노글로불린 Fc 분자 또는 폴리펩티드를 포함한 TSLP 수용체 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 측면에서, 동전기적으로-변경된 유체의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 본원에 개시된 표 1 및 2에서의 하나 이상의 염 또는 이온을 포함한다.
도 1a 내지 1c는 두 시점 (15분 (좌측 패널) 및 2시간 (우측 패널)) 및 다른 전압 프로토콜에서 상피 세포막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 동전기적으로 생성된 유체 (예, RNS-60 및 솔라스 (Solas))의 효과를 평가한 일련의 패치 클램핑 실험의 결과를 입증한다.
도 2a 내지 2c는, 도 1a 내지 1c에 관한 실험과 관련하여, 3가지 전압 프로토콜 (A. 0 mV부터 단계화; B. -60 mV부터 단계화; C. -120 mV부터 단계화) 및 두 시점 (15분 (개방 원형) 및 2시간 (폐쇄 원형))에서 솔라스 전류 데이터를 RNS-60 전류 데이터로부터 차감하여 생성된 그래프를 도시한다.
도 3a 내지 3d는 다른 전압 프로토콜 (패널 A. 및 C.는 0 mV부터의 단계화를 도시함; 패널 B. 및 D.는 -120 mV로부터의 단계화를 도시함)에서 다른 외부 염 용액을 사용하여 상피 세포막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 동전기적으로 생성된 유체 (예, 솔라스 (패널 A. 및 B.) 및 RNS-60 (패널 C. 및 D.))의 효과를 평가한 일련의 패치 클램핑 실험의 결과를 입증한다.
도 4a 내지 4d는, 도 3a 내지 3d에 관한 실험과 관련하여, 솔라스 (패널 A. 및 B.) 및 레베라 (Revera) 60 (패널 C. 및 D.)에 대한 두 전압 프로토콜 (패널 A. 및 C. 0 mV부터 단계화; B. 및 D. -120 mV부터 단계화)에서 CsCl 전류 데이터 (도 3에 도시됨)을 20 mM CaCl2 (마름모형) 및 40 mM CaCl2 (채워진 사각형)에서 차감하여 생성된 그래프를 도시한다.
도 5는 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)가 다발성 경화증 (MS)의 기술-인식된 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE) 래트 모델에서 실질적으로 효능이 있음을 도시한다.
도 6은 도 7에 도시된 실험에서 사용된 EAE 유도 및 치료 계획의 개략도를 도시한다.
도 7a는 도 5 및 6에 도시된 실험에서 사용된 EAE 치료 계획에 제공된 동물의 체중 (g)의 그래프 표시이다. 도 7b는 EAE 치료 계획에 제공된 동물의 계산된 체중 변화율 (％)을 도시한다.
도 8a 내지 8d는 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)가, 도 5 및 6에 도시된 실험에서 사용된 EAE 치료 계획 동안의 비히클 대조군과 비교할 경우, 전체 백혈구 세포 (WBC), 호중구 및 림프구 수준에 거의 영향을 주지 않음을 도시한다. 패널 A, B, C 및 D는 각각 0, 7, 14 및 21일 연구에서의 결과를 도시한다.
도 9a 내지 9h (9a 내지 9d)는 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)가, 도 5 및 6에 도시된 실험에서 사용된 EAE 치료 계획이 개시된 후 7일 (A-D) 및 18일 (E-H)에 시토킨 수준에 대해 갖는 효과를 도시한다. 패널 A 및 E는 치료 후 IL-17의 수준을 도시한다. 패널 B 및 F는 치료 후 IL-1α의 수준을 도시한다. 패널 C 및 G는 치료 후 IL-1β의 수준을 도시한다. 패널 D 및 H는 치료 후 IL-4의 수준을 도시한다.
도 10은 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)가, 대조군인 표준 염수 (NS)와 달리, 활성화된 마우스 미세교세포 (BV-2 미세교세포)에서 유도성 산화질소 신타제 (iNOS) 및 인터류킨-1β (IL-1β)의 MPP+-유도된 발현을 약화시킴을 도시한다.
도 11a 및 11b는 RNS60이 표준 염수 (NS) 대조군과 달리 인간 SHSY5Y 뉴런 세포의 섬유성 Aβ(1-42)-매개 아팝토시스를 억제하고 (도 11a) 및 1차 인간 뉴런을 억제함을 도시한다 (도 11b). 분화 후, SHSY5Y 세포를 1시간 동안 상이한 농도의 RNS60 또는 NS와 함께 인큐베이션한 후 1 μM 섬유성 Aβ(1-42) 펩티드로 손상시켰다. 처리 18시간 후, 아팝토시스를 TUNEL (칼바이오켐 (Calbiochem))에 의해 모니터링하였다. Aβ(1-42) 펩티드를 또한 대존군으로서 인큐베이션하였다. 각 도면의 결과는 3개의 독립적인 실험을 표시한다. DAPI 염색을 사용하여 세포의 핵을 가시화하였다.
도 12는 RNS60이 비히클 대조군 (비히클)과 달리 다발성 경화증 (MS)의 기술-인식된 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE) 마우스 MOG 모델에서 투여량-반응성 방식으로 임상 점수를 억제하는데 실질적으로 효능있음을 도시한다. RNS-60의 고용량 및 저용량 치료적 일일 투여 둘 다 뿐만 아니라 3일 마다의 RNS-60의 고용량 투여 (모든 경우에서의 RNS-60의 투여는 제1 임상 징후와 동반하여 시작함)는 임상 점수의 현저한 감소를 나타냈다 (개방 마름모형 = 비히클 대조군; 개방 사각형 = 덱사메타손 양성 대조군; 희미한 "x" = 임상 징후의 개시로부터 저용량 (0.09 ml RNS60) 일일 투여; 짙은 "x" = 임상 징후의 개시로부터 3일 마다 고용량 (0.2 ml RNS60) 투여; 및 개방 삼각형 = 임상 징후의 개시로부터 고용량 (0.2 ml RNS60) 일일 투여).
도 13a 내지 13c는 MBP-프라이밍 T 세포에서 NFκB의 활성화에 대한 RNS60의 효과를 조사한 2개의 겔 쉬프트 실험 (패널 A 및 B) 및 루시퍼라제 활성 (리포터 유전자) 검정 (패널 C)의 결과를 도시한다.
도 14a 내지 14c는 PD의 마우스 모델에서 마우스의 협응 운동을 점수화한 그래프 표시이며, 여기서 RNS60으로 전처리될 경우 마우스의 협응 운동이 개선된다. 패널 A 및 B는 각각 전체 운동 시간 및 거리를 도시한다. 패널 C는 회전 막대 상에서 균형을 유지하는 마우스의 능력을 도시한다.
도 15a 및 15b는 PD의 마우스 모델에서 마우스의 선조체-의존성 거동을 점수화한 그래프 표시이며, 여기서 RNS60 처리는 선조체-의존성 거동, 상동 (그루밍 (grooming), 패널 A) 및 레어링 (rearing) (수직 운동, 패널 B)을 방지한다.
도 16a 내지 16c는 흑색질 치밀부에서 항-티로신 히드록실라제 항체 (여기서, 티로신 히드록실라제는 도파민 합성에 관여하는 속도-제산 효소임)에 의한 면역염색을 도시한다. 패널 A는 흑색질 치밀부에서 항-티로신 히드록실라제 항체의 표준 염색을 도시한다. 패널 B는 흑색질 치밀부의 염색이 대략 3분의 1로 감소한, 흑색질 치밀부에 대해 갖는 MPTP의 효과를 도시한다. 패널 C는 MPTP로 중독된 마우스에서 RNS60 처리가 도파민성 뉴런을 구조함을 도시한다.
도 17a 및 17b는 인간 뉴런에서 포스포-Akt의 면역형광 분석을 도시한다. 도 17a의 좌측, 중앙 및 우측 패널은 1차 뉴런에서의 Akt 인산화에 대한, 각각 대조군, RNS60 (RIS60; 10％) 및 등장성 염수 (10％)의 효과를 조사한 실험으로부터의 결과를 도시한다. Akt 인산화는 β-튜불린 및 포스포-Akt에 대한 항체를 사용하는 이중-표지 면역형광에 의해 모니터링하였다. 베타-튜불린은 뉴런에 대한 마커로서 사용하였고, DAPI 염색은 세포 핵을 가시화하는데 사용하였다. 도 17b는 RNS60이 인간 1차 뉴런의 섬유성 Aβ(1-42)-매개 아팝토시스를 억제하고 이러한 RNS60-매개 억제가 특이적 Akt 억제제인 AktI에 의해 차단될 수 있음을 도시한다. 30분 동안 상이한 농도의 AktI로 예비인큐베이션한 뉴런을 RNS60으로 처리하였다. 인큐베이션 1시간 후, 세포를 섬유성 Aβ1-42로 접종시켰다. 12시간 후, 뉴런 아팝토시스를 TUNEL로 모니터링하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. DAPI 염색을 사용하여 세포 핵을 가시화하였다.
도 18은 RNS60 또는 표준 염수로 처리할 경우 성상교세포에 존재하는 Akt 총량에 대한 인산화 Akt의 양의 비를 나타내는 그래프이다.
도 19a 내지 19b는 1차 뉴런에서 섬유성 Aβ(1-42)-매개 tau 인산화에 대한 RNS60의 효과를 조사한 실험으로부터의 결과를 도시한다. tau 인산화는 β-튜불린 및 포스포-tau에 대한 항체를 사용하는 이중-표지 면역형광에 의해 모니터링하였다. 베타-튜불린은 뉴런에 대한 마커로서 사용하였고, DAPI 염색은 세포 핵을 가시화하는데 사용하였다.
도 20은 RNS60이 인간 1차 뉴런의 섬유성 Aβ(1-42)-매개 아팝토시스를 억제하고 이러한 RNS60-매개 억제가 PI-3 키나제 억제제 (LY)에 의해 차단될 수 있음을 도시한다. 30분 동안 상이한 농도의 PI-3 키나제 억제제 (LY)로 예비인큐베이션한 뉴런을 RNS60으로 처리하였다. 인큐베이션 1시간 후, 세포를 섬유성 Aβ1-42로 접종시켰다. 12시간 후, 뉴런 아팝토시스를 TUNEL로 모니터링하였다.
도 21은, 특정 측면에 따르면, 뉴런에서 섬유성 Aβ1-42-매개 아팝토시스의 RNS60-매개 억제 효과에 대한 신호 경로의 개략도이다. 메카니즘에 얽매이지 않으면서, 개략적인 경로는 PI-3 키나제의 RNS60-매개 활성화, 이어서 인산화를 통한 Akt의 활성화를 도시한다. 추가 측면에 따르면, 인산화된 Akt는 아팝토시스의 억제를 매개한다.
발명의 상세한 설명
본원에 개시된 특정 실시양태는 신규의 동전기적으로-생성된 유체를 포함하는 치료적 조성물을 부위와 접촉시키거나 대상체에 투여함으로써 염증성 신경퇴행성 질환 및/또는 다발성 경화증의 하나 이상의 증상을 치료하기 위한 조성물 및 방법의 제공에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 동전기적으로-생성된 유체는 산소-농축수를 포함하는 동전기적으로-생성된 가스-농축 유체를 포함한다.
신경보호 조성물 및 방법
본원의 특정 실시양태는 신경독소 또는 신경독성제에 대한 노출과 관련된 하나 이상의 증상을 예방 또는 완화함으로써 대상체를 치료하기 위한 치료적 조성물 및 방법에 관한 것이다.
파킨슨 질환 및 상태
본원의 특정 실시양태는 파킨슨 질환 및/또는 관련 상태 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방 또는 완화함으로써 대상체를 치료하기 위한 치료적 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본원의 추가 실시양태는 운동 증상 (예, 미진, 경직, 서동 (느린 움직임) 및 보행 장애) 및 비-운동 증상 (예, 예컨대 인지 결함, 우울증 및 수면 장애)의 증상을 완화하는 것을 비롯하여, 파킨슨 질환 및/또는 관련 상태와 관련된 합병증을 예방 또는 완화하기 위한 치료적 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.
동전기적으로-생성된 유체:
본원에 개시된 "동전기적으로 생성된 유체"는 본원 실시예의 목적을 위해 본원에 상세하게 기재된 예시적인 혼합 장치에 의해 생성된 본 출원인의 발명의 동전기적으로-생성된 유체를 지칭한다 (또한 둘 다 그 전문이 본원에 참고로 포함된 US200802190088 및 WO2008/052143 참조). 본원에 개시 및 제시된 데이터에 의해 입증된 바와 같은 동전기적 유체는 종래 기술의 산소화된 비-동전기적 유체 (예, 가압 용기 산소화 유체 등)를 비롯하여, 종래 기술의 비-동전기적 유체에 비해 신규하고 근본적으로 구별되는 유체를 나타낸다. 본원의 다양한 측면에서 개시된 바와 같이, 동전기적으로-생성된 유체는 독특하고 신규한 물리적 및 생물학적 성질을 가지며, 이러한 성질에는 하기가 포함되나 그에 제한되지 않는다:
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이며 이온성 수성 유체에 안정하게 배열된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 이온성 수용액을, 이온성 수성 유체에 의한 생존 세포 접촉시 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절을 제공하기에 충분한 양으로 포함한다.
특정 측면에서, 동전기적으로-생성된 유체는 수력학적으로-유도된 국부화 (예, 전체 유체 부피에 대하여 비-균일한) 동전기적 효과 (예, 전압/전류 펄스), 예컨대 본원에 기재된 바와 같은 장치 특징-국부화 효과의 존재 하에 생성된 유체를 지칭한다. 특정 측면에서, 상기 수력학적으로-유도된 국부화 동전기적 효과는 본원에 개시 및 논의된 바와 같은 표면-관련 이중층 및/또는 스트리밍 전류 효과와 조합된다.
특정 측면에서, 투여되는 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체는 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절을 제공하기에 충분한 양으로 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 동전기적으로-변경된 유체는 슈퍼산소화된 것이다 (예, 표준 염수 중 각각 20 ppm, 40 ppm 및 60 ppm 용존 산소를 포함하는 RNS-20, RNS-40 및 RNS-60). 특정 실시양태에서, 동전기적으로-변경된 유체는 슈퍼산소화되지 않은 것이다 (예, 표준 염수 중 10 ppm, 예를 들어 주변 수준의 용존 산소를 포함하는 RNS-10 또는 솔라스). 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체의 염도, 멸균성, pH 등은 유체의 동력학적 생성시에 확립되고, 멸균성 유체는 적절한 경로에 의해 투여된다. 별법으로, 유체의 염도, 멸균성, pH 등 중 하나는 (예, 멸균 염수 또는 적절한 희석제를 사용하여) 적절히 조정되어 유체의 투여 전에 투여 경로와 생리학적으로 상용성이 된다. 바람직하게는, 유체의 염도, 멸균성, pH 등 중 하나 이상을 조정하는데 사용되는 희석제 및/또는 염수 용액 및/또는 완충 조성물은 또한 동전기적 유체이거나 다르게는 그와 상용성이다.
특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체는 염수, 예를 들어, 하나 이상의 용해된 염(들); 예, 알칼리 금속 기재 염 (Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+ 등), 알칼리 토금속 기재 염 (예, Mg++, Ca++) 등, 또는 전이 금속 기재 양이온 (예, Cr, Fe, Co, Ni, Cu, Zn 등)을 포함하며, 각각의 경우에 F-, Cl-, Br-, I-, PO4 -, SO4 - 및 질소-기재 음이온을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 음이온 성분과 함께 포함한다. 특정 측면은 혼합염 기재의 동전기적 유체 (예, Na+, K+, Ca++, Mg++, 전이 금속 이온(들) 등)를 다양한 조합 및 농도로 포함하며, 임의로는 반대이온의 혼합물과 함께 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체는 표준 염수 (예, 대략 0.9％ NaCl 또는 약 0.15 M NaCl)를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체는 0.0002 M 이상, 0.0003 M 이상, 0.001 M 이상, 0.005 M 이상, 0.01 M 이상, 0.015 M 이상, 0.1 M 이상, 0.15 M 이상 또는 0.2 M 이상의 농도의 염수를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체의 전도도는 10 μS/cm 이상, 40 μS/cm 이상, 80 μS/cm 이상, 100 μS/cm 이상, 150 μS/cm 이상, 200 μS/cm 이상, 300 μS/cm 이상, 500 μS/cm 이상, 1 mS/cm 이상, 5 mS/cm 이상, 10 mS/cm, 40 mS/cm 이상, 80 mS/cm 이상, 100 mS/cm 이상, 150 mS/cm 이상, 200 mS/cm 이상, 300 mS/cm 이상 또는 500 mS/cm 이상이다. 특정 측면에서, 임의의 염이 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체를 제조하는데 사용될 수 있되, 단 그들은 본원에 개시된 바와 같은 생물학적으로 활성인 염-안정화된 나노구조체 (예, 염-안정화된 산소-함유 나노구조체)를 형성한다.
특정 측면에 따라, 본 발명의 전하-안정화된 가스-함유 나노구조체를 포함하는 유체의 생물학적 효과는 유체의 이온성 성분을 변경하고/거나 유체의 가스 성분을 변경함으로써 조절 (예, 증가, 감소, 조율 등)될 수 있다.
특정 측면에 따라, 본 발명의 전하-안정화된 가스-함유 나노구조체를 포함하는 유체의 생물학적 효과는 유체의 가스 성분을 변경함으로써 조절 (예, 증가, 감소, 조율 등)될 수 있다. 바람직한 측면에서, 산소가 본 발명의 동전기적 유체를 제조하는데 사용된다. 추가의 측면에서, 질소, 산소, 아르곤, 이산화탄소, 네온, 헬륨, 크립톤, 수소 및 크세논으로부터 선택된 하나 이상의 다른 가스와 산소의 혼합물의 사용된다. 상기 기재된 바와 같이, 이온은 예를 들어 가스 구성성분(들)을 변화시킴에 따라 달라질 수 있다.
본원에 개시된 교시 및 검정 시스템 (예, 세포-기재 시토킨 검정, 패치-클램프 검정 등) 하에서, 당업자는 적절한 염 및 그의 농도를 용이하게 선택하여 본원에 개시된 생물학적 활성을 달성할 수 있을 것이다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

본 개시내용은 당뇨병 또는 당뇨병 관련 장애를 치료하는데 유용한 가스-농축 이온성 수용액, 수성 염수 용액 (예, 임의의 생리학적 상용성 염수 용액을 포함한, 본원에 개시되고 당업계에 인식되는 표준 수성 염수 용액 및 기타 염수 용액), 세포 배양 배지 (예, 최소 배지 및 기타 배양 배지)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 배지는 성장에 필수적인 영양소만을 함유하는 경우 "최소"라 칭해진다. 원색 숙주 세포의 경우, 최소 배지는 전형적으로 탄소, 질소, 인, 망간 및 미량의 철 및 칼슘 공급원을 포함한다 (문헌 [Gunsalus and Stanter, The Bacteria, V. 1, Ch. 1 Acad. Press Inc., N.Y. (1960)]). 대부분의 최소 배지는 탄소 공급원으로서 글루코스를 사용하고, 질소 공급원으로서 암모니아를 사용하고, 인 공급원으로서 오르토포스페이트 (예, PO4)를 사용한다. 배지 성분은, 표적 단백질 생성을 억제함없이 최적의 성장을 조장하기 위해, 성장하는 특정 원핵 또는 진핵 유기체(들)에 따라 달라지거나 보충될 수 있다 (문헌 [Thompson et al., Biotech . and Bioeng. 27: 818-824 (1985)]).
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 내부에 용해된 리포터 용질 (예, 트레할로스)의 13C-NMR 라인-폭을 조절하는데 적합하다. NMR 라인-폭 효과는, 예를 들어 본원 특정 실시예에 기재된 바와 같이 시험 유체에서 용질 '텀블링 (tumbling)'을 측정하는 간접적인 방법에 존재한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 하기 중 하나 이상을 특징으로 한다: -0.14V, -0.47V, -1.02V 및 -1.36V 중 임의의 하나의 구별되는 네모파 전압전류법 (square wave voltametry) 피크 차이; -0.9 볼트의 전기분해 자동분석 (polarographic) 피크; 및 -0.19 및 -0.3 볼트의 전기분해 자동분석 피크의 부재 (이들은 본원 특정 실시예에 개시된 바와 같은 동전기적으로 생성된 유체에 고유함).
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 세포막 전도성 (예, 본원에 개시된 패치 클램프 연구에서의 척도로서 전압-의존성 기여의 전세포 전도도)을 변경하는데 적합하다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 산소화되며, 유체 중의 산소는 대기압에서 15 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상 또는 60 ppm 이상 용존 산소의 양으로 존재한다. 특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 대기압 또는 대략적으로 주변 산소 수준에서 15 ppm 미만, 10 ppm 미만의 용존 산소를 갖는다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 산소화되며, 유체 중의 산소는 대략 8 ppm 내지 대략 15 ppm의 양으로 존재하고, 이 경우 때때로 본원에서 "솔라스"로 지칭된다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 용매화 전자 (예, 산소 분자에 의해 안정화됨) 및 동전기적으로 변형되고/거나 하전된 산소 종 중 하나 이상을 포함하며, 특정 실시양태에서 용매화 전자 및/또는 동전기적으로 변형되거나 하전된 산소 종은 0.01 ppm 이상, 0.1 ppm 이상, 0.5 ppm 이상, 1 ppm 이상, 3 ppm 이상, 5 ppm 이상, 7 ppm 이상, 10 ppm 이상, 15 ppm 이상 또는 20 ppm 이상의 양으로 존재한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 세포내 신호 전달을 조절하는데 충분하도록 세포막 구조 또는 기능을 변경 (예, 막 관련 단백질의 형태, 리간드 결합 활성 또는 촉매 활성을 변경)하는데 적합하며, 특정 측면에서 막 관련 단백질은 수용체, 횡단막 수용체 (예, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), TSLP 수용체, 베타 2 아드레날린성 수용체, 브래디키닌 수용체 등), 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 접착 단백질 및 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 특정 측면에서, 효과를 나타내는 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)는 G 단백질 α 서브유닛 (예, Gαs, Gαi, Gαq 및 Gα12)과 상호작용한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 칼슘 의존성 세포 메시징 경로 또는 시스템의 조절 (예, 포스포리파제 C 활성의 조절 또는 아데닐레이트 사이클라제 (AC) 활성의 조절)을 포함하는 세포내 신호 전달의 조절에 적합하다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 본원의 실시예 및 그외의 부분에 기재된 다양한 생물학적 활성 (예, 시토킨, 수용체, 효소 및 다른 단백질 및 세포내 신호전달 경로의 조절)을 특징으로 한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제 (anti-apoptotic) (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제(antiglutamatergic), 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알 (promitochondrial) (코엔자임 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라피딘), 알파-시뉴클레인 및 성장 인자 (GDNF) 중 어느 하나와 상승작용을 나타낸다. 특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 본원 실시예에 개시된 바와 같이 기관지 상피 세포 (BEC)에서 DEP-유도된 TSLP 수용체 발현을 감소시킨다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 본원 실시예에 개시된 바와 같이 기관지 상피 세포 (BEC)에서 DEP-유도된 세포 표면-결합 MMP9 수준을 억제한다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 생물학적 효과는 디프테리아 독소에 의해 억제되며, 이는 베타 차단, GPCR 차단 및 Ca 채널 차단이 본원 실시예에 개시된 바와 같이 동전기적으로 변경된 수성 유체의 활성 (예, 조절 T 세포 기능)에 영향을 줌을 나타낸다.
특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 물리적 및 생물학적 효과 (예, 세포내 신호 전달을 조절하는데 충분하도록 세포막 구조 또는 기능을 변경하는 능력)는 밀폐 용기 (예, 밀폐된 가스-조밀 용기)에서 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상 또는 이보다 긴 기간 동안 지속된다.
따라서, 추가의 측면은 상기 동전기적으로-생성된 용액, 및 상대 운동으로 이격된 두 표면 사이에 유체 물질의 유동을 제공하는 단계; 및 혼합 부피 내 및 혼합 부피에 걸쳐 유동 유체 물질의 단일 통과의 체류 시간이 0.06초 초과 또는 0.1초 초과인 혼합 부피를 한정하는 단계; 및 상기 물질 내에 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상 또는 60 ppm 이상의 산소를 용해시키기에 적합한 상태 하에서 혼합 부피 내의 유동 유체 물질 내에 산소 (O2)를 도입하는 단계; 및 유체 또는 용액을 변경하는 단계를 포함하는, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액의 생성 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 산소는 100 밀리초 미만, 200 밀리초 미만, 300 밀리초 미만 또는 400 밀리초 미만으로 물질 내에 주입된다. 특정 실시양태에서, 표면적 대 부피의 비는 12 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상 또는 50 이상이다.
추가의 측면은, 혼합 부피를 한정하는 이격된 두 표면 사이에 유체 물질의 유동을 제공하는 단계; 및 상기 물질 내에 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상 또는 60 ppm 이상의 산소를 주입하기에 적합한 상태 하에서, 100 밀리초 미만, 200 밀리초 미만, 300 밀리초 미만 또는 400 밀리초 미만으로, 혼합 부피 내의 유동 물질 내에 산소를 도입하는 단계를 포함하는, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액의 생성 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 혼합 부피 내의 유동 물질의 체류 시간은 0.06초 초과 또는 0.1초 초과이다. 특정 실시양태에서, 표면적 대 부피의 비는 12 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상 또는 50 이상이다.
추가의 실시양태는, 제1 물질 및 제2 물질을 혼합함으로써 산출 혼합물을 생성하기 위한 혼합 장치의 사용을 포함하며, 상기 장치는 제1 물질의 공급원으로부터 제1 물질을 수령하도록 배열된 제1 챔버; 고정자; 회전 축을 갖고, 고정자 내부에 배치되며, 내부 회전 축 주위에서 회전하도록 배열된 회전자 (회전자 및 고정자 중 하나는 다수의 쓰루-홀 (through-hole)을 가짐); 회전자와 고정자 사이에 한정되고, 제1 챔버와 유체 연락되며, 제1 물질을 수령하도록 배열된 혼합 챔버 (제2 물질은 회전자 및 고정자 중 하나에 형성된 다수의 쓰루-홀을 통해 혼합 챔버에 제공됨); 혼합 챔버와 유체 연락되며 산출 물질을 수령하도록 배열된 제2 챔버; 및 제1 챔버의 내부에 수용되고, 제1 챔버로부터 혼합 챔버로 제1 물질을 펌핑하도록 배열된 제1 내부 펌프를 포함하는 것인, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액의 생성 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 제1 내부 펌프는 원주 속도가 제1 물질 내에 부여되도록 배열된 후 혼합 챔버에 도입된다.
추가의 실시양태는, 제1 물질 및 제2 물질을 혼합함으로써 산출 혼합물을 생성하기 위한 혼합 장치의 사용을 포함하며, 상기 장치는 고정자; 회전 축을 갖고, 고정자 내부에 배치되며, 내부 회전 축 주위에서 회전하도록 배열된 회전자; 회전자와 고정자 사이에 한정되고, 제1 물질이 도입되는 개방형 제1 단부를 가지며 산출 물질이 배출되는 개방형 제2 단부를 갖는 혼합 챔버 (제2 물질은 회전자 및 고정자 중 하나를 통해 혼합 챔버에 도입됨); 혼합 챔버의 개방형 제1 단부의 적어도 대다수의 부분과 연락되는 제1 챔버; 및 혼합 챔버의 개방형 제2 단부와 연락되는 제2 챔버를 포함하는 것인, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액의 생성 방법을 제공한다.
추가의 측면은 상기 방법 중 임의의 방법에 따라 제조된 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 제공한다. 특정 측면에서, 투여된 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체는 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절을 제공하기에 충분한 양으로 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 동전기적으로-변경된 유체는 슈퍼산소화된 것이다 (예, 표준 염수 중 각각 20 ppm, 40 ppm 및 60 ppm 용존 산소를 포함하는 RNS-20, RNS-40 및 RNS-60). 특정 실시양태에서, 동전기적으로-변경된 유체는 슈퍼산소화되지 않은 것이다 (예, 표준 염수 중 10 ppm, 예를 들어 주변 수준의 용존 산소를 포함하는 RNS-10 또는 솔라스). 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체의 염도, 멸균성, pH 등은 유체의 동전기적 생성시에 확립되고, 멸균 유체는 적절한 경로에 의해 투여된다. 별법으로, 상기 유체의 염도, 멸균성, pH 등 중 하나 이상은 (예, 멸균 염수 또는 적절한 희석제를 사용하여) 적절히 조정되어 유체의 투여 전에 투여 경로와 생리학적으로 상용성이 된다. 바람직하게는, 유체의 염도, 멸균성, pH 등 중 하나 이상을 조정하는데 사용되는 희석제 및/또는 염수 용액 및/또는 완충 조성물은 또한 동전기적 유체이거나 다르게는 그와 상용성이다.
본 개시내용은, 본원에 논의된 바와 같은 가스-농축 이온성 수용액, 수성 염수 용액 (예, 임의의 생리학적 상용성 염수 용액을 포함한, 본원에 논의되고 당업계에 인식되는 표준 수성 염수 용액 및 기타 염수 용액), 세포 배양 배지 (예, 최소 배지 및 기타 배양 배지)를 포함하나 이에 제한되지 않는 신규 가스-농축 유체를 기재한다.
신경독소:
"독성제" 또는 "신경독성제" (신경독소)는 그의 화학 작용을 통해 신경계 성분의 활성을 해치거나, 손상시키거나, 억제하는 물질을 의미한다. 신경병증을 야기하는 신경독성제의 목록은 길다 (하기 표 3에 제공된 예시적인 신경독성제의 목록 참조). 상기 신경독성제로는 신생물제, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시스플라틴, 탁솔, 또는 디데옥시-화합물, 예를 들어 디데옥시이노신; 알콜; 금속; 직업적 또는 환경적 노출과 관련된 산업 독소; 식품 또는 의약품에서의 오염물; 또는 과량의 비타민 또는 치료 약물, 예를 들어 항생제, 예컨대 페니실린 또는 클로람페니콜, 또는 메가-용량의 비타민 A, D 또는 B6가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
신경독성은, 신경 조직에 대한 손상을 야기하는 방식으로 신경계의 정상 활성을 변경시키는 천연 또는 인공 독소 물질에의 노출시 발생할 수 있으며, 결국 뉴런을 파괴하거나 죽일 수 있다. 신경독성은 화학요법, 방사선 치료, 약물 요법, 특정 약물 남용 및 기관 이식에 사용된 물질에의 노출 뿐만 아니라 중금속, 특정 식품 및 식품 첨가물, 농약, 산업용 및/또는 세정 용매, 화장품, 및 일부 천연 발생 물질에의 노출로부터 발생할 수 있다. 증상은 노출 후 즉시 나타날 수 있거나 지연될 수 있다. 이에는 사지 무력증 또는 무감각, 기억, 시력 및/또는 지능의 상실, 통제불능의 강박관념 및/또는 충동적 거동, 망상, 두통, 인지 및 거동 문제 및 성 기능장애가 포함될 수 있다. 특정 장애를 가진 개체가 특히 신경독소에 취약할 수 있다.
특정 실시양태에 따라, 본원에 개시된 조성물은 본원에 논의된 각종 작용제에의 노출로 인해 야기된 신경독성을 예방하거나 완화하는데 사용된다.
특정 독소는 말초 신경병증을 야기할 수 있다. 납 독성은 운동 신경독성과 관련된다. 비소 및 수은은 감각 신경병증을 야기한다. 탈륨은 감각 및 자율 신경병증을 야기할 수 있다. 여러 유기 용매 및 살충제가 또한 다발성신경병증을 야기할 수 있다. 알콜은 신경에 직접적으로 독성이 있으며, 알콜 남용은 신경병증의 주요 원인이다. 대상 방법은 특정 실시양태에서 보다 광범위한 해독 프로그램의 일부로서 사용될 수 있다.
추가의 또다른 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 약물에 의해 야기된 신경병증의 치료에 사용될 수 있다. 여러 약물이 신경병증을 야기하는 것으로 알려져 있다. 이에는, 특히, 암에서의 빈크리스틴 및 시스플라티눔, 신우신염에 사용되는 니트로푸란토인, 심부정맥에서의 아미오다론, 알콜중독에서의 디술푸람, AIDS에서의 ddC 및 ddI, 및 나병을 치료하는데 사용되는 답손이 포함된다. 상기와 같이, 대상 방법은 특정 실시양태에서 보다 광범위한 해독 프로그램의 일부로서 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 하나 이상의 다른 치료제가 대상 화합물과 함께 투여되는 병용 요법을 제공한다. 이러한 병용 치료는 개별 치료 성분의 동시, 순차 또는 별개 투여의 방식으로 수행될 수 있다. 이에 따라 병용 투여는, 동일한 제약 제제의 일부로서의 투여, 개별 제약 제제의 동시 투여, 뿐만 아니라 같은 날 다른 시간에, 인접하는 날에 또는 다르게는 단일 치료 계획의 일부로서 별개 제약 제제의 투여를 포함한다. 예를 들어, 대상 방법은 다른 신경보호제와 함께 수행될 수 있다. 본원에 기재된 투여량은 치료 조성물 중 상기 추가의 성분을 보충하도록 조정될 것이다. 치료된 환자의 경과는 통상적인 방법에 의해 모니터링될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 대상 방법은 성장 및/또는 영양 인자의 투여와 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 영양 인자, 예컨대 아교세포주-유래 신경영양 인자, 신경 성장 인자, 섬모 신경영양 인자, 신경초종 (schwanoma)-유래 성장 인자, 아교 성장 인자, 선조체-유래 신경영양 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 산란 인자 (HGF-SF)를 포함할 수 있다. 항미토겐성 작용제 (Antimitogenic agent), 예를 들어 시토신, 아라비노시드, 5-플루오로우라실, 히드록시우레아 및 메토트렉세이트가 사용될 수 있다.
예를 들어, 적합하게는 신경보호되는 본 발명의 투여 조성물의 치료 유효량 및/또는 예방 유효량은 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여량은 주치의의 판단시 환자의 요건, 치료될 상태의 중증도, CNS에 대한 추가 퇴행의 위험, 및 특정 신경독소에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효한 영양량 또는 투여량 및/또는 예방 유효량 또는 투여량을 결정하는데 있어서, 하기하는 다수의 인자가 주치의에 의해 고려된다: 퇴행성 상태의 특정 원인 및 그의 재발 또는 악화 가능성; 특정 신경독성제의 약동학 특성; 목적하는 치료 시간 추이; 포유동물의 종; 그의 크기, 연령 및 일반 건강; 개별 환자의 반응; 투여되는 특정 화합물; 투여되는 제제의 생체이용률 특성; 선택되는 투여 계획; 동시 치료의 종류; 및 다른 관련 환경 (이에 제한되지 않음).
치료는 최적의 투여량 미만인 보다 적은 투여량으로 개시될 수 있다. 이후, 투여량은 환경 하의 최적 효과가 도달될 때까지 적은 증분으로 증가될 수 있다. 편의상, 전체 일일 투여랑은 필요에 따라 하루 동안 일정 부분으로 나누어 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료 유효한 영양량 및 예방 유효한 신경보호량의 치료 조성물은 상기 논의된 바와 같은 기타 인자 및 투여 경로에 따라 달라질 것으로 예상된다.
동물, 예를 들어 개, 설치류에서 뉴런 (예, 도파민성 뉴런 및 운동 뉴런 등)의 퇴행을 예방 또는 치료하는데 유효한 조성물은 인간에서의 장애를 치료하는데 또한 유용할 수 있다. 인간에서 상기 장애를 치료하는 당업자는, 동물 연구에서 수득한 데이터로부터, 인간에 대한 화합물의 정확한 투여량 및 투여 경로에 관하여 지침을 얻을 것이다. 일반적으로, 인간에서의 투여량 및 투여 경로의 결정은 동물에서의 투여를 결정하는데 사용된 것과 유사할 것으로 예상된다.
뉴런 (예, 도파민성 뉴런 및/또는 운동 뉴런 등)의 퇴행으로 표시되는 장애의 예방적 치료를 필요로 하는 환자의 확인은 당업자의 능력 및 지식 내에 있다. 위험에 처해 있으며 대상 방법에 의해 치료될 수 있는 환자를 확인하기 위한 특정 방법, 예컨대 특정 질환 상태 발달의 가족력 및 대상 환자에서 그 질환 상태 발달과 관련된 위험 인자의 존재는 의학 분야에서 이해되고 있다. 환경적 (예, 화학적) 노출의 위험. 당업계에의 숙련된 임상의는 상기 후보 환자를, 예를 들어 임상 시험, 신체 검사, 의료 역사/가족력, 일/직업 등을 이용하여 용이하게 확인할 수 있다.
군인들을 임의의 종류의 위협으로부터 보호하고 그들의 전투력을 보존하는 것은 군대의 주요 관심사였다. 신경 가스 (예, 사린, 소만 또는 Vx)는 상기한 하나의 위협이다. 신경 작용제 (신경 가스라고도 알려짐)의 한 부류는, 신경전달물질인 아세틸콜린의 활성을 정상으로 낮추는 효소인 아세틸콜린스테라제를 차단하는 인-함유 유기 화학물질 (오르가노포스페이트)이다. 신경 작용제의 두가지 주된 부류, G 작용제 (예, GA, 타분 또는 에틸 N,N-디메틸포스포아미도시아니데이트; GB, 사린 또는 O-이소프로필 메틸포스포노플루오리데이트; GD, 소만 또는 O-피나콜릴 메틸포스포노플루오리데이트; GF, 시클로사린 또는 시클로헥실 메틸포스포노플루오리데이트; GV, P-[2-(디메틸아미노)에틸]-N,N-디메틸포스폰아미딕 플루오라이드)) 및 V 작용제 (VE, S-(디에틸아미노)에틸 O-에틸 에틸포스포노티오에이트; VG, 아미톤 또는 테트람 또는 O,O-디에틸-S-[2-(디에틸아미노)에틸]포스포로티오에이트; VM, 포스포노티오산, 메틸-, S-(2-(디에틸아미노)에틸) O-에틸 에스테르); VX, O-에틸-S-[2(디이소프로필아미노)에틸]메틸포스포노티올레이트)가 존재한다. 제3 군의 작용제인 노비촉 (Novichok) 작용제는 콜린스테라제 효소를 억제하여 아세틸콜린의 정상적 파괴를 방지하는 오르가노포스페이트 화합물이다.
살충제인 오르가노포스페이트, 예컨대 디클로르보스, 말라티온 및 파라티온은 신경 작용제이다.
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특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 화학요법 유도된 신경독성의 예방 또는 완화에 사용될 수 있다 (예를 들어, 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 제7,129,250호 (2004/0220202로서 공개됨) 및 특히 예시적인 신경독소에 대한 그의 교시 참조).
예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 항암제, 예컨대 항암 약물, 시토킨 및/또는 보충적 강화제(들)과 함께 사용될 수 있다. 암 치료에서 칵테일의 사용은 일상적이다. 본 실시양태에서, 통상적인 투여 비히클 (예, 구강으로 이용가능하거나 주사가능한 용액 등)은 본 발명의 조성물 및 항암 약물 및/또는 보충적 강화제 모두를 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물 뿐만 아니라 다른 화합물을 포함하는 칵테일은 본 발명의 범위 내에 있다.
항-신생물 특성을 갖는 화합물로는 하기가 포함되나, 이에 제한되지 않는다: 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 히드로클로라이드; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스펄린; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 비칼루타미드; 비산트렌 히드로클로라이드; 비스나피드 디메실레이트; 비젤레신; 블레오마이신 술페이트; 브레퀴나르 나트륨; 브로피리민; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세미드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 히드로클로라이드; 카르젤레신; 세데핀골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 시클로포스파미드; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 히드로클로라이드; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 히드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로르니틴 히드로클로라이드; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 히드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 히드로클로라이드; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 나트륨; 에타니다졸; 에티오다이즈드 오일 I 131; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 히드로클로라이드; 파자라빈; 펜레티니드; 플록스우리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 나트륨; 젬시타빈; 젬시타빈 히드로클로라이드; 금 Au 198; 히드록시우레아; 이다루비신 히드로클로라이드; 이포스파미드; 이모포신; 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-Ia; 인터페론 감마-Ib; 이프로플라틴; 이리노테칸 히드로클로라이드; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤리드 아세테이트; 리아로졸 히드로클로라이드; 로메트렉솔 나트륨; 로무스틴; 로속산트론 히드로클로라이드; 마소프로콜; 메이탄신; 메콜레타민 히드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜파란; 메노가릴; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메토프린; 메투레데파; 미틴도미드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미톡산트론 히드로클로라이드; 미코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페플로마이신 술페이트; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포술판; 피록산트론 히드로클로라이드; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 히드로클로라이드; 푸로마이신; 푸로마이신 히드로클로라이드; 피라조푸린; 리보프린; 로글레티미드; 사핀골; 사핀골 히드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 나트륨; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 히드로클로라이드; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 스트론튬 클로라이드 Sr 89; 술로페누르; 탈리소마이신; 탁산; 탁소이드; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔록산트론 히드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토포테칸 히드로클로라이드; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트리프토렐린; 투불로졸 히드로클로라이드; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티드; 베르테포르핀; 빈블라스틴 술페이트; 빈크리스틴 술페이트; 빈데신; 빈데신 술페이트; 비네피딘 술페이트; 빈글리시네이트 술페이트; 빈레우로신 술페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 술페이트; 빈졸리딘 술페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 히드로클로라이드.
다른 항-신생물 화합물로는 하기가 포함된다: 20epi-1,25 디히드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴리드; 혈관형성 억제제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 항-등축화 형태형성 단백질-1 ; 안티안드로겐, 전립선 암종; 안티에스트로겐; 안티네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 아피디콜린 글리시네이트; 아팝토시스 유전자 조절제; 아팝토시스 조절제; 아푸린산; 아라-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 데아미나제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 박카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; BCR/ABL 길항제; 벤조클로린스; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 억제제; 비칼루타미드; 비산트렌; 비사지리디닐스퍼민; 비스나피드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 술폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄프토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르복사미드-아미노-트리아졸; 카르복시아미도트리아졸; 카레스트 M3; CARN 700; 연골 유래 억제제; 카르젤레신; 카세인 키나제 억제제 (ICOS); 카스타노스퍼민; 세크로핀 B; 세트로렐릭스; 클로린스; 클로로퀴녹살린 술폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레타스타틴 A4; 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌; 크람베스시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 시클로펜탄트라퀴논; 시클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 옥포스페이트; 세포용해 인자; 시토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 데히드로디데민 B; 데스로렐린; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디데민 B; 디독스; 디에틸노르스퍼민; 디히드로-5-아자시티딘; 디히드로탁솔, 9-; 디옥사마이신; 디페닐 스피로무스틴; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 두오카르마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에드레콜로맙; 에플로미틴; 엘레멘; 에미테프티르; 에피루비신; 에프리스테리드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 효능제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포시드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티니드; 필그라스팀; 피나스테리드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루니신 히드로클로라이드; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 나트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라니타제 억제제; 젬시타빈; 글루타치온 억제제; 헵술팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비스아세트아미드; 히페리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모포신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극제 펩티트; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 효능제; 인터페론; 인터류킨; 이오벤구안; 아이오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이리노테칸; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키놀리드; 카할랄리드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오티드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 술페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤리드+에스트로겐+프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친지성 이당 펩티드; 친지성 백금 화합물; 리소클리나미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로속산트론; 로바스타틴; 록소리빈; 루르토테칸; 루테튬 텍사피린; 리소필린; 용균 펩티드; 메이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트릴리신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미스매칭된 이중 가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나피드; 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포린; 미톡산트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 모노클로날 항체, 인간 융모막 성선자극호르몬; 모노포스포릴 지질 A+미오박테리움 세포 벽 sk; 모피다몰; 다중 약물 내성 유전자 억제제; 다중 종양 억제제 1-기재 요법; 머스타드 항암제; 미카페록시드 B; 미코박테리아 세포 벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록손+펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 산화질소 조절제; 니트록시드 항산화제; 니트룰린; 06-벤질구아닌; 옥트레오티드; 오키세논; 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 구강 시토칸 유도제; 오르미아플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤리프틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리술페이트 나트륨; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 페릴릴 알콜; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 히드로클로라이드; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화제 억제제; 백금 착체; 백금 화합물; 백금-트리아민 착체; 포르피머 나트륨; 포르피로마이신; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아좀 억제제; 단백질 A-기재 면역 조절제; 단백질 키나제 C 억제제; 단백질 키나제 C 억제제, 마이크로알갈; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 억제제; 푸르푸린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 접합체; raf 길항제; 랄티트렉세드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 탈메틸화 레텔리프틴; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나미드; 로글레티미드; 로히투킨; 로무르티드; 로퀴니멕스; 루비기논 B 1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 모방체; 세무스틴; 세네신 유래 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오티드; 신호 전달 억제제; 신호 전달 조절제; 단일쇄 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 나트륨 보로카프테이트; 나트륨 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포스산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰기스타틴 1; 스쿠알아민; 줄기 세포 억제제; 줄기 세포 분할 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 술피노신; 슈퍼활성 혈관작용성 장 펩티드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스와인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메트아이오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 나트륨; 테가푸르; 텔루라피릴륨; 텔로머라제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로미드; 테니포시드; 테트라클로로데카옥시드; 테트라조민; 탈리블라스틴; 탈리도미드; 티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 모방체; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 효능제; 티모트리난; 티로이드 자극 호르몬; 틴 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 디클로라이드; 토포테칸; 톱센틴; 토레미펜; 전능성 줄기 세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트리프토렐린; 트로피세트론; 투로스테리드; 티로신 키나제 억제제; 티르포스틴; UBC 억제제; 우베니멕스; 요생식동-유래 성장 억제성 인자; 우로키나제 수용체 길항제; 바프레오티드; 바리올린 B; 벡터 시스템, 적혈구 유전자 요법; 벨라레솔; 베라민; 베르딘스; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈잘틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코르브; 지노스타틴 스티말라머.
항암 보충 강화제로는 하기가 포함되나, 이에 제한되지 않는다: 트리사이클릭 항-우울성 약물 (예, 이미프라민, 데시프라민, 아미트립틸린, 클로미프라민, 트리미프라민, 독세핀, 노르트립틸린, 프로트립틸린, 아목사핀 및 마프로틸린); 비-트리사이클릭 항-우울성 약물 (예, 세르트랄린, 트라조돈 및 시탈로프람); Ca++ 길항제 (예, 예라파밀, 니페디핀, 니트렌디핀 및 카로베린); 칼모듈린 억제제 (예, 페닐아민, 트리플루오로페라진 및 클로미프라민); 암포테리신 B; 트리파라놀 유사체 (예, 타목시펜); 항부정맥 약물 (예, 퀴니딘); 항고혈압 약물 (예, 레세르핀); 티올 고갈제 (예, 부티오닌 및 술폭시민) 및 다중 약물 내성 환원제, 예컨대 크레마포르 EL.
염증
염증은 특히 미생물 기원의 외부 물질이 대상체에 침투하는 것에 대한 방어적 반응으로서 일어날 수 있다. 추가로, 기계적 외상, 독소 및 신생물형성이 염증 반응을 유도할 수 있다. 백혈구의 축적 및 이후 활성화는 대부분의 염증 형태의 병인에서 중요한 사건이다. 염증 결핍은 숙주와 타협하여, 숙주가 악화되는 감염 또는 외상에 영향받기 쉽도록 둘 수 있다. 과도한 염증, 예컨대 장기간의 염증 반응은 당뇨병, 동맥경화증, 백내장, 만성 피부 장애, 재관류 손상 및 암을 포함한 (이에 제한되지 않음) 염증성 질환, 및 감염성 수막염에서와 같은 감염후 증후군, 류마티스 열, 및 류마티스 질환, 예컨대 전신성 홍반성 루프스 및 류마티스 관절염을 유도한다. 이들 질환은 매년 전세계 수백만의 사람들에게 영향을 주며, 증가된 사망률 및 이환률을 유도한다. 이들 다양한 질환에서 염증 반응의 공통성은 인간 질환의 예방 또는 치료에 있어서 염증 반응의 조절이 주요한 요소이도록 만든다.
전-염증성 시토킨의 과생성은 수많은 염증성 및 자가면역 질환의 병인과 관련되어 왔다. TNFα의 분비는 염증성 캐스캐이드의 개시에 있어서 1차적 사건이고 (문헌 [Brennan F. M., et. al. Lancet, 1989, 2:244-7; Haworth C, et. al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579]), 이들 질환의 개시 및 유지에 직접 기여한다. 인터류킨 1β (IL-1β), IL-6, IL-8, IL-12 산화질소 (NO), IFN-γ, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 IL-10을 포함한 다른 시토킨도 또한 역할을 할 수 있다. 이들 시토킨 중 어떤 시토킨 (예, IL-8)은 염증 반응을 증가 또는 악화시킬 수 있는 반면, 다른 시토킨 (예, IL-10)은 염증 반응을 감소 또는 완화시킬 수 있다.
면역계 세포, 특히 대식세포는 자극 활성화에 대한 반응으로 다수의 상기 시토킨을 분비한다. 시토킨의 표적 세포는 임의의 신체 구획에 국부화될 수 있으며, 장거리 메카니즘을 통해 작용할 수 있거나 이웃 세포에 대해 작용할 수 있다. 따라서, 시토킨은 국부화 방식 또는 전신적 방식으로 염증을 조절할 수 있다.
메탈로프로테이나제
메탈로프로테이나제는, 예를 들어 문헌 [N. M. Hooper FEBS Letters 354:1-6, 1994]에 기재된 바와 같은 부류 및 하위부류로 분류된 프로테이나제 (효소)의 상위부류이다. 메탈로프로테이나제의 예로는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 예컨대 콜라게나제 (MMP1, MMP8, MMP13), 젤라티나제 (MMP2, MMP9), 스트로멜리신 (MMP3, MMP10, MMP II), 매트릴리신 (MMP7), 메탈로엘라스타제 (MMP12), 에나멜리신 (MMP19), MT-MMP (MMP14, MMP15, MMP16, MMP17); 세크레타제 및 쉐다제, 예컨대 TNF 전환 효소 (ADAM10 및 TACE)를 포함하는 레프롤리신 또는 아다말리신 또는 MDC 부류; 프로콜라겐 프로세싱 프로테이나제 (PCP)와 같은 효소를 포함하는 아스타신 부류; 및 다른 메탈로프로테이나제, 예컨대 어그리캐나제, 엔도텔린 전환 효소 부류 및 안지오텐신 전환 효소 부류가 포함된다. 집합적으로, 메탈로프로테이나제는 광범위한 매트릭스 물질, 예컨대 콜라겐, 프로테오글리칸 및 피브로넥틴을 절단하는 것으로 알려져 있다. 메탈로프로테이나제는 생물학적 중요 세포 매개자, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF)의 프로세싱 또는 분비; 및 생물학적 중요 막 단백질, 예컨대 저친화성 IgE 수용체 CD23의 번역후 단백질분해 프로세싱 또는 쉐딩에 연루된다 (예를 들어, 문헌 [N. M. Hooper et al., Biochem. J. 321:265-279, 1997] 참조).
따라서, 놀랍지 않게도, 메탈로프로테이나제는 조직 리모델링 (예, 배아 발달, 뼈 형성, 월경기간 동안의 자궁 리모델링 등)과 연관된 다수의 생리학적 질환 과정에서 중요하다고 생각된다. 또한, 하나 이상의 메탈로프로테이나제의 활성 억제는 이들 질환 또는 상태, 예를 들어 다양한 염증 및 알레르기 질환, 예컨대 관절 염증 (특히 류마티스 관절염, 골관절염 및 통풍), 위장관 염증 (특히 염증성 장질환, 궤양성 대장염 및 위염), 피부 염증 (특히 건선, 습진, 피부염); 종양 전이 또는 침투; 세포외 매트릭스의 비제어 분해와 관련된 질환, 예컨대 골관절염; 뼈 재흡수 질환 (예컨대 골다공증 및 파제트 질환); 이상 혈관형성과 관련된 질환; 당뇨병과 관련된 증진된 콜라겐 리모델링, 치주 질환 (예컨대 치은염), 각막 궤양, 피부 궤양, 수술후 상태 (예컨대 대장 문합) 및 피부 상처 치유; 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환 (예컨대 다발성 경화증); 알츠하이머 질환; 재협착 및 아테롬성동맥경화증과 같은 심혈관 질환에서 관찰된 세포외 매트릭스 리모델링; 천식; 비염; 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPED)에서 이익이 될 수 있다.
대식세포 엘라스타제 또는 메탈로엘라스타제로도 알려진 MMP12는 마우스에서 최초로 클로닝되었고 (문헌 [Shapiro et al., Journal of Biological Chemistry 267: 4664, 1992]), 1995년에 동일한 그룹에 의해 사람에서 클로닝되었다. MMP12는 활성화된 대식세포에서 우선적으로 발현되고, 흡연자의 치조 대식세포로부터 분비되는 것으로 나타났을 뿐만 아니라 (문헌 [Shapiro et al, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268: 23824]) 아테롬성동맥경화증 병변에서의 발포 세포에서도 분비되는 것으로 나타났다 (문헌 [Matsumoto et al, Am. J. Pathol. 153: 109, 1998]). COPD의 마우스 모델은 6개월 동안 1주일에 6일씩 하루에 2개 담배의 담배 연기를 받은 마우스를 기재로 한다. 야생형 마우스는 상기 처리 후 폐 기종이 발생하였다. MMP12 넉-아웃 마우스를 상기 모델에서 시험하였을 때, 그들은 유의한 기종을 발생하지 않았는데, 이는 MMP12가 COPD 병인에서 핵심 효소임을 강력하게 나타낸다. COPD (기종 및 기관지염)에서 MMP12과 같은 MMP의 역할은 문헌 [Anderson and Shinagawa, 1999, Current Opinion in Anti-inflammatory and Immunomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29-38]에서 논의되어 있다. 최근에 흡연은 인간 경동맥 플라크에서 대식세포 침윤 및 대식세포-유래 MMP-12 발현을 증가시킨다고 발견되었다 (문헌 [Matetzky S, Fishbein M C et al., Circulation 102:(18), 36-39 Suppl. S, Oct. 31, 2000]).
MMP9-(젤라티나제 B; 92 kDa-유형IV 콜라게나제; 92 kDa 젤라티나제)는 1989년에 최초로 정제된 다음 클로닝 및 서열분석된 분비 단백질이다 (문헌 [S. M. Wilhelm et al., J. Biol. Chem. 264 (29): 17213-17221, 1989; published erratum in J. Biol. Chem. 265 (36): 22570, 1990]) (상기 단백질에 대한 상세한 정보 및 참조의 검토를 위해 문헌 [T. H. Vu & Z. Werb (1998) (In: Matrix Metalloproteinases, 1998, edited by W. C. Parks & R. P. Mecham, pp. 115-148, Academic Press. ISBN 0-12-545090-7)] 참조). MMP9의 발현은 통상 영양아층, 파골세포, 호중구 및 대식세포를 포함한 몇몇 세포 유형으로 제한된다 (상기 Vu ＆ Werb 문헌 참조). 그러나, 발현은 이들 동일 세포 및 다른 세포 유형에서, 성장 인자 또는 시토킨에 대한 세포의 노출을 포함한 여러 매개자에 의해 유도될 수 있다. 이들은 염증 반응을 개시하는데 종종 관여하는 동일한 매개자이다. 다른 분비 MMP와 마찬가지로, MMP9는 비활성 예비효소로서 방출된 이후 절단되어 효소적으로 활성인 효소를 형성한다. 생체내에서 이러한 활성화에 요구되는 프로테아제는 알려지지 않았다. 활성 MMP9 대 비활성 효소의 균형은, 천연-발생 단백질인 TIMP-1 (메탈로프로테이나제-1의 조직 억제제)과의 상호작용에 의해 생체내에서 추가로 조절된다. TIMP-1은 MMP9의 C-말단 영역에 결합하여 MMP9의 촉매 도메인을 억제한다. 유도된 예비 MMP9 발현의 균형, 예비 MM9에서 활성 MMP9로의 절단 및 TIMP-1의 존재를 조합하여 국소 부위에 존재하는 촉매적으로 활성인 MMP9의 양을 결정한다. 단백질분해적으로 활성인 MMP9는, 젤라틴, 엘라스틴 및 천연 유형 IV 및 유형 V 콜라겐을 포함하는 물질을 공격하는데; 천연 유형 I 콜라겐, 프로테오글리칸 또는 라미닌에 대한 활성은 갖지 않는다. 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 MMP9의 역할과 관련된 데이터가 증가해왔다. 생리학적 역할은 배아 착상의 초기 단계에서 자궁 상피를 통한 배아 영양아층의 침투; 뼈의 성장 및 발달에서의 일부 역할; 및 혈관에서 조직으로의 염증성 세포의 이동을 포함한다.
효소 면역검정을 사용하여 측정된 MMP9 방출은, 다른 집단의 경우에 비해 비처리된 천식환자의 유체 및 AU 상등액에서 유의하게 증가하였다 (문헌 [Am. J. Resp. Cell & Mol. Biol., 5:583-591, 1997]). 또한, 증가된 MMP9 발현은 다른 특정 병리학적 상태에서 관찰되어, COPD, 관절염, 종양 전이, 알츠하이머 질환, 다발성 경화증, 및 심근 경색과 같은 급성 관상동맥 상태를 유발하는 아테롬성동맥경화증에서의 플라크 파열과 같은 질환 과정에 MMP9를 연관시켰다 (또한 본원에 참조로 포함된 WO07087637A3 참조).
최근에, MMP-9의 수준은 건강한 대조군 대상체에 비해 안정한 천식 환자에서 유의하게 증가하고 급성 천식 환자에서 보다 더 높다고 입증되었다. MMP-9는 기도 염증성 세포의 침윤 및 기도 과민성의 유도에 중요한 역할을 하며, 이는 MMP-9가 천식을 유도 및 유지하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다 (문헌 [Vignola et al., Sputum metalloproteinase-9/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis, Am J Respir Crit Care Med 158:1945-1950, 1998]; [Hoshino et al., Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999]; [Simpson et al., Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J Respir Crit Care Med 172:559-565, 2005]; [Lee et al., A murine model of toluene diisocyanate-induced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001]; 및 [Lee et al., Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003;111:1278-1284] 참조).
MMP 억제제:
다수의 메탈로프로테이나제 억제제가 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Beckett R. P. and Whittaker M., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents, 8(3):259-282]; 및 [Whittaker M. et al, 1999, Chemical Reviews 99(9):2735-2776]에 의한 MMP 억제제의 개관 참조). WO 02/074767은 MMP 억제제로서, 특히 효능있는 MMP12 억제제로서 유용한 화학식의 히단토인 유도체를 개시한다. 미국 특허 출원 일련번호 제11/721,590호 (20080032997로 공개됨)는, 메탈로프로테이나제의 억제제이며 MMP12 및 MMP9와 같은 MMP를 억제하는데 특히 관심이 있는 추가의 히단토인 유도체 군을 개시한다. MMP12 및 MMP9와 같은 MMP를 억제하기 위한 신규 트리아졸론 유도체는 미국 특허 출원 일련번호 제10/593543호 (20070219217로 공개됨)에 개시되어 있다. 추가의 MMP12 및 MMP9 억제제는 동 제11/509,490호 (20060287338로 공개됨)에 개시되어 있다 (또한 동 제10/831265호 (20040259896로 공개됨) 참조).
추가로, 2개의 화합물 4-(4-페녹시페닐술포닐)부탄-1,2-디티올 (1) 및 5-(4-페녹시페닐술포닐)펜탄-1,2-디티올 (2)은 MMP-2 및 MMP-9에 선택적으로 결합하여 이들을 강력하게 억제하는 것으로 나타났다 (문헌 [Bernardo, et. al (2002) J. Biol. Chem. 277:11201-11207] 참조). 상기 두 화합물은 임상에서 MMP-2 및 MMP-9를 억제하여 염증을 감소시키는데 유의한 용도를 가질 수 있다. 또한, 특정 테트라사이클린 항생제 (예, 미노사이클린 및 독시사이클린)을 보충적-항생제 수준으로 사용하는 것이 MMP 활성을 유효하게 억제한다고 나타났다. 본 발명의 특정 측면은 MMP를 억제하는데 유용한 보충적-항생제 수준과 조합하여 본 발명의 유체를 사용하는 것을 포함한다.
치료 방법
용어 "치료하는"은 질환, 장애, 상태 또는 이들의 하나 이상의 증상의 진행을 되돌리거나, 완화하거나, 억제하거나, 또는 질환, 장애, 상태 또는 이들의 하나 이상의 증상을 예방하는 것을 지칭 및 포함하고; "치료" 및 "치료적으로"는 본원에 정의된 바와 같은 치료의 행위를 지칭한다.
"치료 유효량"은 질환, 장애, 상태 또는 이들의 하나 이상의 증상의 진행을 되돌리거나, 완화하거나, 억제하거나, 또는 질환, 장애, 상태 또는 이들의 하나 이상의 증상을 예방하는데 충분한, 본원에 제공된 발명의 실시 과정에서 이용되는 임의의 화합물의 임의의 양이다.
본원에서 특정 실시양태는 신경독소에의 노출과 관련된 하나 이상의 증상을 예방하거나 완화하는, 대상체를 위한 치료 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 개시된 치료 조성물 및/또는 방법은 다발성 경화증 (MS), 파킨슨 질환, 아밀로이드증 (예, 알츠하이머 질환), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 프리온 질환 및 HIV-관련 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태 또는 질환을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
염증과 관련된 다수의 상태 또는 질환은 스테로이드, 메토트렉세이트, 시클로포스파미드, 시클로스포린, 아자티오프린 및 레플루노미드를 포함한 면역억제 약물, 비스테로이드성 소염제, 예컨대 아스피린, 아세트아미노펜 및 COX-2 억제제, 금 제제 및 항말라리아 치료제로 치료될 수 있다. 이들 약물은 주사 부위 반응, 발진, 상부 호흡기 감염, 자가면역 장애 및 감염에 대한 감수성 증가를 포함한 각종 단점 및 해로운 반응을 갖는다. 또한, 다수의 항염증성 제약 약물은 보다 편리하고 수월한 구강 또는 국소 피부 경로가 아닌, 정맥 (IV) 또는 피하 (SC) 투여를 필요로 한다. 따라서, 염증 관련 상태 및 질환을 위한 신규 약제 및 치료 방법의 개발에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
조합 요법:
추가의 측면은, 하나 이상의 추가 치료제가 환자에게 투여되는 조합 요법을 추가로 포함하는, 본원에 개시된 본 발명 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 하나 이상의 추가 치료제는 임의의 에리스로포이에틴, 항아팝토시스제 (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알 (코엔자임 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라피딘), 알파-시뉴클레인 및/또는 성장 인자 (GDNF)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
동전기적으로-생성된 가스-농축 유체 및 용액의 항-염증 활성
본 발명의 특정 측면에 따라, 본원에 개시된 가스-농축 유체 및/또는 용액은 항-염증 성질 및 효과를 가지며, 염증성 신경퇴행 관련 질환 또는 장애에 걸린 대상체의 치료를 위한 소염제로서 사용될 수 있다. 이전의 결과는 본 발명의 산소-농축 유체 (물)이 건강한 혈액 공여자로부터의 자극된 림프구에서 시토킨 프로파일 중 특정 시토킨, 특히 IL-6, IL-8 및 IL-1β의 하향조절에 영향을 준다는 것을 나타냈다.
전-염증성 시토킨의 생성 증가는 수많은 염증성 및 자가면역 질환의 병인과 연관된다. TNFα의 분비는 염증성 캐스캐이드의 개시에 있어서 1차적 사건이고 (문헌 [Brennan F. M., et. al. Lancet, 1989, 2:244-7; Haworth C, et. al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579]), 염증성 및 자가면역 질환의 개시 및 유지에 직접 기여한다. 인터류킨 1β (IL-1β), IL-6, IL-8, IL-12 산화질소 (NO), IFN-γ 및 GM-CSF를 포함한 다른 전-염증성 시토킨도 또한 역할을 할 수 있지만, IL-10과 같은 항염증성 시토킨은 질환을 감소시킬 수 있다. 면역계 세포, 특히 대식세포는 자극 활성화에 대한 반응으로 다수의 상기 시토킨을 분비한다.
다양한 세포 유형이 염증 과정에 관여한다. 단핵구, 대식세포 및 다른 면역 세포에 의한 TNFα의 과생성은 다수의 질환의 병인에서 핵심 요소이다. 특히 대식세포 및 T-세포는 면역 반응의 개시 및 유지에 중요한 역할을 한다. 대식세포는, 병리학적 또는 면역학적 자극에 의해 일단 활성화되면, TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-12, 산화질소 (NO), IL-6, GM-CSF, G-CSF, M-CSF 및 기타를 포함한 시토킨의 숙주를 방출시킴으로써 반응한다. T-세포는 IL-2, IL-4, INF-γ 및 다른 염증성 시토킨을 방출한다. 이들 시토킨은 다른 면역 세포를 활성화시키고, 일부는 또한 독립적인 세포독성제로서 작용할 수 있다. 대식세포 및 T-세포 유래된 염증 매개자의 과도한 방출은 특히 정상 세포 및 주위 조직의 손상을 유도할 수 있다.
전-염증성 시토킨은 HIV-AIDS, 및 사이토메갈로바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 헤르페스류의 바이러스를 포함한 다른 바이러스 감염과 연관되어 왔다. TNFα는 인간 사이토메갈로바이러스의 주요한 중간체적 초기 증진제/프로모터의 기본 활성을 증진시키고, 예비단핵구 세포에서의 잠재성 HCMV 감염의 재활성화에 역할을 할 수 있다 (문헌 [Prosch S., et. al. Virology 1995, 208:197-206]).
추가로, 다수의 염증성 시토킨은 패혈증 또는 내독성 쇼크에 걸린 환자의 사망률에 기여한다. 예를 들어, TNFα 및 IL-1β는 패혈증, 패혈성 쇼크 및 내독성 쇼크에서 널리 확립된 중요한 역할을 한다. 이들 시토킨 수준의 증가는 열, 저혈압 및 쇼크 (문헌 [Smith J. W. et. al. J. Clin. Oncol. 1992, 10:1141-1152; Chapman P. B., et. al. J. Clin. Oncol. 1987, 5:1942-1951])와 함께 포스포리파제 A2에 대한 유전자 발현의 유도 (문헌 [Gronich J., et. al. J. Clin. Invest. 1994, 93:1224-1233]) 및 NO 신타제와 관련된다.
평활근 세포로부터 NO의 유도는 패혈성 쇼크 동안 감소된 평균 동맥압 및 전신성 혈관 내성을 매개하며, 이는 NO에 대한 근본적인 역할을 시사한다. 따라서, IL-8, IL-1β 및 NO에 대한 하향조절 효과를 표적으로 하는 요법은 패혈증, 패혈성 쇼크 및 내독성 쇼크를 포함한 염증성 질환 또는 장애의 치료에서 유익할 수 있다.
TNFα의 과생성은 당뇨병 및 류마티스 관절염과 같은 수많은 자가면역 질환의 임상 특징에 기여한다. 전신성 홍반성 루프스 (SLE)는 또한 증가된 IL-1β 및 TNFα 수준에 의해 촉진된다. 루푸스 환자 내에서, 혈청 C-반응성 단백질, IL-1β 및 TNFα 수준은 대조군에서보다 높았으며, 이는 증가된 염증 반응이 질환에서 역할을 함을 시사한다 (문헌 [Liou L. B. Clin. Exp. Rheumatol. 2001, 19:515-523]). SLE의 한 형태인 신경정신성 홍반성 루프스 (NPLE)를 갖는 환자의 연구는 TNFα에 대한 mRNA를 발현하는 말초 혈액 단핵구 세포 수 및 NO 대사물질의 뇌척수액 수준이 NPLE 질환 중증도와 상관관계가 있음을 나타냈다 (문헌 [Svenungsson E., et al. Ann. Rheum. Dis. 2001, 60:372-9]).
IL-1 및 TNFα은 동물 모델에서 다양한 급성 및 만성 반응에 중요한 역할을 한다. 추가로, IL-11, IFNα 및 IFNβ도 또한 염증 반응을 상향조절할 수 있다. 반대로, 여러 시토킨은 염증 반응의 하향조절에 관여할 수 있다 (즉, 특히 IL-4, IL-10, IL-13). 실시예 1에 설명된 바와 같이, 본 발명의 가스-농축 유체와 접촉한 세포는 T3 항원을 갖는 대조군 배양 배지에서보다 T3 항원에 의해 IFN-γ 수준의 증가를 나타낸 반면, IL-8은 T3 항원을 갖는 대조군 배양 배지에서보다 T3 항원을 갖는 본 발명의 가스-농축 배양 배지에서 더 낮았다. 추가로, IL-6, IL-8 및 TNF-α 수준은 PHA를 갖는 대조군 배지에서보다 PHA를 갖는 본 발명의 가스-농축 배지에서 더 낮은 반면, IL-1β 수준은 PHA를 갖는 대조군 배지와 비교시 PHA를 갖는 본 발명의 가스-농축 유체에서 더 낮았다. 본 발명의 가스-농축 배지 단독에서는, IFN-γ 수준이 대조군 배지에서보다 높았다. 이들 결과는 항-염증성 마이크로환경과 일치한다.
NO는 염증 반응의 매개지 및 조절자로서 인식된다. NO는 병원균에 대한 세포독성 성질을 갖지만, 또한 대상체 자신의 조직에 대해 유해한 효과를 가질 수도 있다 (문헌 [Korhonen et al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4(4): 471-9, 2005]). NO는 가용성 과립구 사이클라제와 반응하여, NO의 다수 효과를 매개하는 사이클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP)를 형성한다. NO는 또한 산소 분자 및 슈퍼옥시드 음이온과 상호작용하여, 다양한 세포 기능을 변형시킬 수 있는 반응성 산소 종을 생성할 수 있다. 이러한 NO의 간접적 효과는 염증에서 중요한 역할을 하며, 여기서 NO는 유도성 NO 신타제 (iNOS)에 의해 다량으로 생성되고, 반응성 산소 종은 활성화된 염증 세포에 의해 합성된다.
NO는 케라틴형성세포, 섬유아세포, 내피 세포 및 가능하다면 기타에 의해 생성될 수 있다. NO의 일부 혈관 작용은 혈관확장, 혈관 내피세포에의 혈소판 부착 억제, 혈관 내피세포에의 백혈구 부착 억제 및 슈퍼옥시드 제거를 포함한다 (문헌 [Shah et al., Env. Health Persp. v. 106 (5): 1139-1143]).
또한, NO 합성의 억제는 상처 수축을 지연시키고, 콜라겐 조직을 변경하고 및 신생표피 두께를 변경하는 것으로 나타났다 (문헌 [Amadeu and Costa, J. Cutan. Pathol. 33: 465-473, 2006]). 상처에서의 비만 세포 이동 및 혈관형성도 또한 NO의 억제에 의해 영향을 받는다. (Id.) 임의의 특정 메카니즘 이론에 얽매이지 않으면서, 특정 실시양태에서 본 발명의 가스-농축 유체는 국부화 및/또는 세포성 NO 생성 또는 분해를 조절할 수 있으며, 이는 본원에 개시된 실시예 부문에 예시된 상처 치유 효과의 스펙트럼과 일치한다. 다양한 조절 경로로 인해, 특정 실시양태에서 본 발명의 가스-농축 유체는 NO 생성을 증가시키고/거나 NO 분해를 늦출 수 있는 반면, 다른 특정 실시양태에서 본 발명의 가스-농축 유체는 NO 생성을 감소시키고/거나 NO 분해를 재촉시킬 수 있다.
특히, 산소-농축 염수 용액으로 처리된 상처는 4일에서 11일에 상처 치유의 증가를 나타냈고, 3일에서 11일에는 본원 실시예 9에 설명된 바와 같이 산소-농축 염수 용액으로 처리된 상처에서의 새로운 표피가 표준 염수 용액으로 처리된 상처의 표피에 비해 2배 내지 4배 빨리 이동하였다. 연구는 또한, 15일 내지 22일에는 산소-농축 염수 용액으로 처리된 상처가 보다 성숙한 표피층의 초기 형성에 의해 입증된 바와 같이 보다 신속한 속도로 분화됨을 나타냈다. 모든 단계에서, 표준 치유와 관련하여 표피에서 일어난 비후는 산소-농축 염수 용액으로 처리된 상처 내에서는 일어나지 않았다.
따라서, 이러한 상처 치유 효과의 스펙트럼에 따라, 임의의 특정 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 산소-농축 염수 용액은 상처 내에서 NO의 국부화 및/또는 세포성 수준을 조절할 수 있다고 생각된다. NO는 상처 치유에 있어서 성장 인자, 콜라겐 침착, 염증, 비만 세포 이동, 표피 비후 및 신생혈관형성을 조절한다. 또한, 산화질소는 산소에 의해 조절되는 유도성 효소에 의해 생성된다.
비만 세포 이동의 경우에, 산소-농축 용액의 초기 및 후기 이동에서 차이가 또한 발생하였다. 이는 NO 합성의 억제에 관하여 당업계에 알려진 바와 일치한다 (문헌 [Amadeu and Costa, J. Cutan Pathol 33: 465-473, 2006]).
염증 과정의 첫번째 두 단계에서, 예를 들어 이물질이 유기체라면 이물질이 파괴되거나, 또는 예를 들어 이물질이 파편이라면 그 주위 조직이 느슨해진다. 치유 단계에서, 염증은 침강하기 시작하고; 개체의 혈관 및 혈관 패턴은 다시 한번 정상이 되고; 상처의 복구가 시작된다. 복구 과정에서 3가지 주요 사건은 (1) 섬유아세포의 증식에 의한 새로운 결합 조직의 형성; (2) 상피의 재생; 및 (3) 새로운 모세혈관의 성장이다.
염증이 침강하기 전에도, 섬유아세포는 주위 정상 조직으로부터 손상된 영역으로 이동하기 시작하며, 여기서 통상 휴면 상태로 존재한다. 그들은 섬유소 가닥을 따라 아메바모양의 운동으로 이동하고, 치유 영역 전체에 걸쳐 스스로 분포된다. 손상된 조직 내의 위치로 고정되면, 콜라겐을 합성하고 이 단백질을 분비하기 시작하여, 스스로 섬유 내로 배열된다. 섬유는 가장 큰 응력의 방향으로 그의 세로 축을 따라 배향된다. 콜라겐 다발이 견고하게 성장하면, 섬유아세포는 점차 퇴화되고, 다발에 밀접하게 부착되며, 손상된 영역은 흉터 조직으로 변형된다.
흉터 조직 형성과 동시에, 상처 가장자리의 무손상 표피 세포는 증식하고 한 시트식 손상된 영역의 중앙을 향해 이동하기 시작한다. 염증이 침강함에 따라, 혈액의 직접적인 공급에 대한 필요성이 발생하며, 상처 부위에 혈관형성이 일어난다.
염증은 다수의 세포 유형을 관여시키는 복작한 과정이다. 예를 들어, 비만 세포는 초기 단계의 혈관확장을 일으키는 매개자를 방출하며, 이때 내피 세포의 분리 및 내피하층에서의 콜라겐 섬유의 노출이 수반된다. 혈관에서 형성되는 세포간 갭 사이의 섬유는 혈소판을 가두고, 상기 세포로부터의 매개자 방출을 일으킨다.
혈소판에 추가로, 노출된 콜라겐 섬유소도 또한, 혈액-응고 캐스캐이드, 증가된 혈관확장, 증가된 혈관 투과성 및 주화성의 촉발 인자를 포함한, 팽창된 혈관 벽의 기공을 통해 여과되는 혈장 단백질과 상호작용한다.
추가로, 보체 캐스캐이드는 여러 자극, 즉 손상된 혈관, 손상된 세포에 의해 방출된 단백질분해 효소, 임의의 관여 세균의 막 성분 및 항원-항체 복합체에 의해 활성화될 수 있다. 활성화된 보체 성분의 몇몇은 발적 영역 내로 백혈구를 유입시키는 주화성 인자로서 작용하는 반면, 다른 몇몇은 식세포작용을 촉진하고 세포 용균에 관여한다.
추가로, 본 발명의 가스-농축 유체 또는 용액은 또한 염증의 하나 이상의 측면에 관여하는 하나 이상의 시토킨, 즉 MAF (대식세포 활성화 인자), MMIF (대식세포 이동 억제 인자), MCF (대식세포 주화성 인자), LMIF (백혈구 이동 억제 인자), HRF (히스타민 방출 인자), TF (전달 인자), 인터류킨 (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15 등), TNF-α, TNF-β, 인터페론 (IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-ζ, IFN-δ 등), G-CSF (과립구 콜로니 자극 인자), GM-CSF (과립구-대식세포 CSF), M-CSF (대식세포 CSF), 멀티-CSF (IL-3), 섬유아세포 성장 인자 (aFGF, bFGF), EGF (표피 성장 인자), NGF (신경 성장 인자), PDGF (혈소판-유래 성장 인자), VEGF (혈관 내피 성장 인자), 전환 성장 인자 (TGF-α, TGF-β 등), NAP-2 (호중구-활성화 단백질 2), PF-4 (혈소판 인자 4), 트롬보글로불린, MCP-1 (단핵구 화학주성 단백질 1), MCP-3, MIP-1α, MIP-1β-+ (대식세포 염증성 단백질), RANTES (발현된 표준 T 활성화시 조절되고 가능하게는 분비된 케모카인), HSP (열 충격 단백질), GRP (글루코스 조절 단백질), 유비퀴틴 및 기타를 포함하나 이에 제한되지 않는 시토킨을 조절할 수 있다고 생각된다.
따라서, 특정 실시양태에서, 가스-농축 유체 및/또는 치료 조성물은 항-염증성 분자 또는 시토킨의 생성 및/또는 분비를 증가시키거나 항-염증성 분자 또는 시토킨의 분해를 감소시킴으로써, 염증 및/또는 염증성 신경퇴행의 하나 이상의 증상을 완화 또는 예방할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 가스-농축 유체 및/또는 치료 조성물은 전-염증성 분자 또는 시토킨의 생성 및/또는 분비를 감소시키거나 전-염증성 분자 또는 시토킨의 분해를 증가시킴으로써, 염증 및/또는 염증성 신경퇴행의 하나 이상의 증상을 완화 또는 예방할 수 있다.
이전의 연구는 류마티스 관절염의 인간 자가면역 장애에 대한 동물 모델 시스템인 EAE (실험적 자가면역 뇌척수염)의 악화 및 탈수초화의 증가에 있어서 항-MOG 항체의 중요한 역할을 나타냈다 (문헌 [Linington, et al. 1992. J. Neuroimmunol. 40:219-224]). 추가로, MOG에 대한 항체는 다발성 경화증의 병인에 관련되어 왔다 (문헌 [Berger et al. N. Engl. J. Med. 2003 Jul 10;349(2):139-45]).
이전 실험에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 가스-농축 유체는 사전에 프라이밍된 동물의 항원에 대한 림프구 반응을 증폭시킨다. 이전 실험에 나타낸 바와 같이, 림프구 증식은 가압 산소화 유체 (가압 용기) 또는 대조군 탈이온화 유체와 비교하였을 때, 용매화 전자를 포함하는 본 발명의 가스-농축 유체로 재구성된 유체에서 배양하였을 때 MOG 공격에의 반응에 대해 더 컸다.
예시적인 관련된 분자 상호작용:
일반적으로, 양자 특성은 10-10 미터 미만의 기본 입자에 속하는 것으로 여겨지며, 우리의 일상의 거시적 세계는 뉴턴의 운동 법칙에 따라 행동한다는 점에서 고전적인 것으로 지칭된다.
최근에, 분자는 희석으로 크기가 증가하는 클러스터를 형성하는 것으로 기재되었다. 이들 클러스터는 직경이 수 마이크로미터로 측정되며, 비-선형적 희석으로 크기가 증가하는 것으로 보고되었다. 직경이 100 나노미터로 측정되는 양자 간섭성 도메인은 순수 물에서 발생하는 것으로 가정되며, 간섭성 도메인 중의 물 분자의 집단적 진동은 결국 전자기장 변동에 상 로크(locked)되어, 물에서의 안정된 진동을 제공할 수 있고, '기억'의 형태를 물의 집단적 구조를 변경하는 물 중에 용해된 물질에 특이적인 오래 지속되는 간섭성 진동의 들뜸의 형태로 제공하여, 이어서 발달하는 특이적 간섭성 진동을 결정할 수 있다. 이들 진동이 자기장 상 커플링에 의해 안정화되는 경우, 물은, 희석시 여전히 '시드(seed)' 간섭성 진동을 운반할 수 있다. 분자의 클러스터의 크기가 증가하면서, 그의 전자기장 신호는 상응하여 증폭되어, 물에 의해 운반되는 간섭성 진동을 강화시킨다.
용해된 분자의 클러스터 크기의 변화 및 물의 세밀한 미세 구조에도 불구하고, 간섭성 진동의 특이성은 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다. 물의 특성의 변화를 고려하기 위한 하나의 모델은 결정화에 관여하는 고려 사항을 기반으로 한다.
나노규모 케이지(케이지)를 형성하는 단순화된 양자화된 물 클러스터는 출원인의 이전 특허출원: WO 2009/055729에 나타난다. 양자화된 물 클러스터는 전형적으로 H+(H20)n의 형태를 취한다. 일부 양자화된 물 클러스터는, 예를 들면 전리층에서 자연적으로 발생한다. 임의의 특정 이론에 의해 제한받지 않고, 특정 측면에 따라, 본 발명의 생산 물질에 전달된 산소 및 안정화된 전자를 포함하는 구조를 포함하는 다른 유형의 물 클러스터 또는 구조 (클러스터, 나노케이지 등)가 가능하다. 산소 원자는 생성된 구조 내에 잡힐 수 있다. 반-결합된 나노케이지의 화학은 산소 및/또는 안정화된 전자가 연장된 기간 동안 용해된 채로 남아 있는 것을 가능하게 한다. 다른 원자 또는 분자, 예를 들면 의약용 화합물은, 지속된 전달 목적을 위해 갇힐 수 있다. 용액 물질 및 용해된 화합물의 구체적인 화학은 이들 물질의 상호작용에 의존한다.
혼합 장치에 의해 처리된 유체는 클러스터 구조의 상황상 유체의 분석과 일관된 상이한 구조적 특징을 나타내는 것으로 이전 실험을 통해 나타났다. 예를 들면, WO 2009/055729를 참조한다.
전하-안정화된 나노구조체 (예를 들면, 전하 안정화된 산소-함유 나노구조체):
출원인의 WO 2009/055729, "이중 층 효과," "체류 시간," "주입 속도," 및 "거품 크기 측정치"에 이전에 기재된 바와 같이, 동전기적 혼합 장치는, 약 몇 밀리초 내에, 본원에 기재된 신규한 동전기적 효과를 제공하는 효과적으로 거대한 표면적 (장치의 표면적 및 100 nm 미만의 특별히 작은 가스 거품의 표면적을 포함함)과 접촉하여 복잡한 혼합을 제공하는 복잡한, 동역학적 와류와의 제1 물질 및 제2 물질의 독특한 비-선형 유체 동역학적 상호작용을 생성시킨다. 추가로, 특징-국부화 동전기적 효과 (전압/전류)가 절연성 회전자 및 고정자 특징을 포함하는 특별히 설계된 혼합 장치를 사용하여 입증되었다.
당업계에 인정된 바와 같이, 전하 재분배 및/또는 용매화 전자는 수용액 중에서 매우 불안정하다고 공지되어 있다. 특정 측면에 따라, 출원인의 동전기적 효과 (예를 들면, 특정 측면에서, 용매화 전자를 포함하는 전하 재분배)는 생산 물질 (예를 들면, 염수 용액, 이온성 용액) 내에 놀랍게 안정화되었다. 사실, 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체 (예를 들면, RNS-60 또는 솔라스(Solas))의 특성 및 생물학적 활성의 안정성은 가스가 새지 않는 용기 중에 수개월 동안 유지될 수 있으며, 이는 본 발명의 용액의 특성 및 활성을 생성하고/하거나 유지하고/하거나 매개하는데 도움을 주는데 있어서 용해된 가스 (예를 들면, 산소)의 관여를 나타낸다. 유의하게, 전하 재분배 및/또는 용매화 전자는, 유체에 의한 생존하는 세포 (예를 들면, 포유동물의 세포)와의 접촉시, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절 (예를 들면, WO 2009/055729 및 본원에 기재된 바와 같이 세포 패치 고정 실시예 23을 참조함)을 제공하기 위한 충분한 양으로 본 발명의 동전기적 이온성 수성 유체 중에 안정하게 설정되어 있다.
본원에서 "분자 상호작용" 하에 기재된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체 (예를 들면, 동전기적 염수 용액)의 안정성 및 생물학적 호환성을 설명하기 위해, 출원인은 물 분자 및 물 중에 용해된 물질 (예를 들면, 산소)의 분자 사이의 상호작용은 물의 집단적 구조를 변화시키고, 본 발명의 생산 물질에 전달된 산소 및/또는 안정화된 전자를 포함하는 나노구조체를 포함하는 나노규모 케이지 클러스터를 제공한다는 것을 제안하였다. 기전에 의해 제한되지 않고, 특정 측면에서의 나노구조체의 배열은 이들이: (적어도 형성 및/또는 안정성 및/또는 생물학적 활성을 위해) 용해된 가스 (예를 들면, 산소)를 포함하고; 동전기적 유체 (예를 들면, RNS-60 또는 솔라스 염수 유체)가 세포막 또는 그의 관련된 성분과의 접촉시 전하 및/또는 전하 효과를 조절 (예를 들면, 전달 또는 받음)하는 것을 가능하게 하고; 특정 측면에서 용매화 전자를 생물학적으로-관련된 형태로 안정화 (예를 들면, 운반, 포함, 트래핑(trapping))하기 위한 방식으로 되어있다.
특정 측면에 따라, 그리고 본원의 개시에 의해 지지되는 바와 같이, 이온성 또는 염수 (예를 들면, 표준 염수, NaCl) 용액에서, 본 발명의 나노구조체는 전하-안정화된 수화 껍질 내에 하나 이상의 용해된 가스 분자 (예를 들면, 산소)를 포함할 수 있는 전하 안정화된 나노구조 (예를 들면, 100 nm 미만의 평균 직경)를 포함한다. 추가의 측면에 따라, 전하-안정화된 수화 껍질은 하나 이상의 용해된 가스 분자 (예를 들면, 산소)를 포함하는 케이지 또는 공극을 포함할 수 있다. 추가의 측면에 따라, 적합한 전하-안정화된 수화 껍질의 제공에 의해, 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소를 함유하는 나노-구조체는 추가로 용매화 전자 (예를 들면, 안정화된 용매화 전자)를 포함할 수 있다.
본원의 우선일 후에, 기전 또는 특정 이론에 의해 제한되지 않고, 주위 (대기) 가스와 평형인 수성 액체 중의 이온에 의해 안정화된 전하-안정화된 마이크로버블이 제안되었다 (문헌 [Bunkin et al., Journal of Experimental and Theoretical Physics, 104:486-498, 2007]; 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 본 발명의 특정 측면에 따라, 출원인의 신규한 동전기적 유체는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 신규한, 생물학적으로 활성 형태를 포함하고, 추가로 상기 구조의 신규한 배열, 클러스터 또는 회합을 포함할 수 있다.
전하-안정화된 마이크로버블 모델에 따라, 물 구조의 짧은-범위 분자 질서는 가스 분자의 존재에 의해 파괴되며 (예를 들면, 초기에 비흡착성 이온과 복합체화된 용해된 가스 분자는 짧은-범위 순서 결함을 제공함), 이온성 액적의 응결을 제공하고, 여기서 결함은 물 분자의 제1 및 제2 배위권에 의해 둘러싸이는데, 이는 흡착성 이온 (예를 들면, 전기적 이중 층을 형성하는 Na+ 이온의 '스크리닝 껍질의 획득) 및 비흡착성 이온 (예를 들면, 제2 배위권을 차지하는 Cl- 이온)에 의해 교대로 충전되어 각각 배위권에서 6 및 12 공백을 차지한다. 불충분-포화 이온성 용액 (예를 들면, 불충분포화 염수 용액)에서, 이 수화된 '핵'은 제1 및 제2 배위권이 각각 6개의 흡착성 및 5개의 비흡착성 이온에 의해 충전될 때까지 안정하게 남아있으며, 이어서 쿨롬 폭발을 수행하여 가스 분자를 함유하는 내부적 공극을 생성하고, 여기서 흡착성 이온 (예를 들면, Na+ 이온)은 생성된 공극의 표면에 흡착되며, 비흡착성 이온 (또는 그의 일부)은 용액 내에 확산된다 (상기 문헌 [Bunkin et al.]). 이 모델에서, 나노구조체에서의 공극은 그의 표면에 흡착된 이온 (예를 들면, Na+ 이온) 사이의 쿨롬 반발에 의해 붕괴되는 것이 방지된다. 공극-함유 나노구조의 안정성은 공극/거품 표면 상의 유사 전하를 갖는 용해된 이온의 선택적 흡착 및 용해된 가스 및 거품 내의 가스 사이의 확산성 평형으로 인한 것으로 가정되었으며, 여기서 음성 (생성된 전기적 이중 층에 의해 가해진 외향 정전기 압력은 표면 장력에 대한 안정된 보상을 제공하며, 거품 내의 가스 압력은 주위 압력에 의해 균형을 이룬다. 모델에 따라, 이러한 마이크로버블의 형성은 이온성 성분을 요구하며, 일정 측면에서 입자 사이의 충돌-매개된 회합은 더 큰 순서 클러스터 (배열)의 형성을 제공할 수 있다 (Id).
전하-안정화된 마이크로버블 모델은 입자는 가스 마이크로버블일 수 있으나, 상기 구조의 주위 공기와의 평형인 이온성 용액 중의 자발적 형성만을 고려하고, 산소가 상기 구조를 형성할 수 있는지 여부에 대해서는 비특징화되고, 침묵이며, 마찬가지로 용매화 전자가 상기 구조에 의해 연관되고/되거나 안정화될 수 있는지 여부에 대해 침묵인 것을 제안한다.
특정 측면에 따라, 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체를 포함하는 본 발명의 동전기적 유체는 신규하고, 근본적으로 마이크로버블 모델에 따른 가정된 비-동전기적, 대기 전하-안정화된 마이크로버블 구조와 구분된다. 유의하게, 이 결론은 불가피하며, 이는 적어도 부분적으로, 대조군 염수 용액이 본원에 개시된 생물학적 특성을 갖지 않으며, 반면 출원인의 전하-안정화된 나노구조체는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 신규한, 생물학적으로 활성 형태를 제공하는 사실로부터 유도된다.
본 발명의 특정 측면에 따라, 출원인의 신규한 동전기적 장치 및 방법은 공기와 평형인 이온성 유체 또는 임의의 비-동전기적으로 생성된 유체 중에서 자발적으로 발생하거나 또는 발생하지 않을 수 있는 임의의 양을 초과하는 전하-안정화된 나노구조체의 유의한 양을 포함하는 신규한 동전기적으로-변경된 유체를 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 나노구조체는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체를 포함한다. 추가의 측면에서, 전하-안정화된 나노구조는 모든, 또는 실질적으로 모든 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체이거나, 또는 동전기적 유체에서 주요 전하-안정화된 가스-함유 나노구조체 종인 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체이다.
또다른 추가의 측면에 따라, 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 용매화 전자를 포함하거나 또는 보유할 수 있고, 따라서 신규한 안정화된 용매화 전자 담체를 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 신규한 유형의 일렉트라이드 (또는 반전된 일렉트라이드)를 제공하는데, 이는 단일 유기적으로 배위결합된 양이온을 갖는 종래의 용질 일렉트라이드와 달리, 공극 또는 산소 원자를 함유하는 공극에 대해 안정하게 배열된 복수의 양이온을 가지며, 여기서 배열된 나트륨 이온은 유기 분자보다는 물 수화 껍질에 의해 배위결합된다. 특정 측면에 따라, 용매화 전자는 물 분자의 수화 껍질에 의해 수용될 수 있거나, 또는 바람직하게는 모든 양이온에 걸쳐 분포된 나노구조체 공극 내에 수용될 수 있다. 일정 측면에서, 본 발명의 나노구조체는, 다중 배열된 나트륨 양이온에 걸쳐 용매화 전자의 분배/안정화를 제공할 뿐만 아니라, 공극 내의 갇힌 산소 분자(들)과 용매화 전자의 회합성 또는 부분적 회합-나트륨 원자 및 하나 이상의 산소 원자의 배열에 걸쳐 분포된 용매화 전자를 제공함으로써 용액 중의 신규한 '슈퍼 일렉트라이드' 구조를 제공한다. 따라서, 특정 측면에 따라, 본 발명의 동전기적 유체와 연관되어 본원에 개시된 바와 같은 '용매화 전자'는, 물 분자에 의한 직접적 수화를 포함하는 전통적인 모델에서 용매화되지 않을 수 있다. 별법으로, 건조된 일렉트라이드 염과의 제한적 유사성으로, 본 발명의 동전기적 유체 내의 용매화 전자는 다중 전하-안정화된 나노구조체에 걸쳐 분포되어 수용액에서 더 높은 순서 배열을 안정화시키기 위한 '격자 접착제'를 제공할 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명의 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 세포막 또는 그의 성분, 또는 단백질 등과 상호작용하여, 생물학적 활성을 매개할 수 있다. 특정 측면에서, 용매화 전자를 포함하는 본 발명의 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 세포막 또는 그의 성분, 또는 단백질 등과 상호작용하여, 생물학적 활성을 매개할 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명의 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 전하 및/또는 전하 효과 공여자 (전달) 및/또는 전하 및/또는 전하 효과 수용자로서의 세포막 또는 그의 성분, 또는 단백질 등과 상호작용하여, 생물학적 활성을 매개한다. 특정 측면에서, 용매화 전자를 포함하는 본 발명의 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 전하 및/또는 전하 효과 공여자 및/또는 전하 및/또는 전하 효과 수용자로서의 세포막과 상호작용하여 생물학적 활성을 매개한다.
특정 측면에서, 본 발명의 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 본 발명의 동전기적 유체의 관찰된 안정성 및 생물학적 특성과 일관되고, 이를 설명하며, 수성 이온성 용액 (예를 들면, 염수 용액, NaCl 등) 중의 안정화된 용매화 전자를 제공하는 신규한 일렉트라이드 (또는 반전된 일렉트라이드)를 추가로 제공한다.
특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 실질적으로 전하-안정화된 산소-함유 나노거품을 포함하거나, 그의 형태를 취하거나, 또는 그를 초래할 수 있다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 클러스터는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 상대적으로 더 큰 배열, 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노거품 또는 그의 배열의 형성을 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 소수성 표면과의 접촉시 소수성 나노거품의 형성을 제공할 수 있다.
특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 실질적으로 하나 이상의 산소 분자를 포함한다. 일정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 실질적으로 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 50 이상, 100 이상, 또는 그 초과의 산소 분자를 포함한다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체는 약 20 nm x 1.5 nm의 나노거품 (예를 들면, 소수성 나노거품)을 포함하거나 또는 이를 초래하며, 약 12 산소 분자 (예를 들면, 이상 가스 및 n=PV/RT의 적용, 여기서 P=1 atm이고, R=0.082□057□l.atm/mol.K; T=295K; V=pr2h=4.7x10-22 L, 여기서 r=10x10-9 m, h=1.5x10-9 m, 및 n=1.95x10-22 몰)을 가정하여 산소 분자의 크기 (대략 0.3 nm 곱하기 0.4 nm)를 기반으로 함을 포함한다.
일정 측면에서, 이온성 수성 유체 내에 전하-안정화된 배열을 갖는 이러한 나노구조체 내에 있는 유체 내에 존재하는 산소 분자, 또는 그의 배열의 백분율은: 0.1％, 1％; 2％; 5％; 10％; 15％; 20％; 25％; 30％; 35％; 40％; 45％; 50％; 55％; 60％; 65％; 70％; 75％; 80％; 85％; 90％ 초과; 및 95％ 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율 양이다. 바람직하게는, 이 백분율은 약 5％ 초과, 약 10％ 초과, 약 15％ 초과, 또는 약 20％ 초과이다. 추가의 측면에서, 이온성 수성 유체 내의 전하-안정화된 배열을 갖는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체, 또는 그의 배열의 실질적인 크기는: 100 nm; 90 nm; 80 nm; 70 nm; 60 nm; 50 nm; 40 nm; 30 nm; 20 nm; 10 nm; 5 nm; 4 nm; 3 nm; 2 nm; 및 1 nm 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 크기이다. 바람직하게는, 이 크기는 약 50 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 30 nm 미만, 약 20 nm 미만, 또는 약 10 nm 미만이다.
일정 측면에서, 본 발명의 동전기적 유체는 용매화 전자를 포함한다. 추가의 측면에서, 본 발명의 동전기적 유체는 용매화 전자(들); 및 독특한 전하 분포 (극성, 대칭적, 비대칭적 전하 분포) 중 하나 이상을 포함하는 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체, 및/또는 그의 배열을 포함한다. 일정 측면에서, 전하-안정화된 나노구조체 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체, 및/또는 그의 배열은 상자성 특성을 갖는다.
대조적으로, 본 발명의 동전기적 유체에 비교하여, 대조군 압력 병 산소화된 유체 (비-동전기적 유체) 등은 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상을 조절할 수 있는 상기 동전기적으로 생성된 전하-안정화된 생물학적으로-활성인 나노구조체 및/또는 생물학적으로-활성인 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체 및/또는 그의 배열을 포함하지 않는다.
가스-농축된 유체의 제조를 위한 시스템
출원인의 WO 2009/055729 특허 출원에 이전에 개시된 바와 같은 시스템 및 방법은 가스 (예를 들면, 산소)가 최소 수동적 손실로 고농도에서 안정하게 농축되는 것을 가능하게 한다. 이 시스템 및 방법은 매우 다양한 가스를 고조된 백분율로 매우 다양한 유체로 농축시키기 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 단지 예로서, 전형적으로 약 2-3 ppm (백만분율)의 용존 산소 수준을 갖는 실온에서의 탈이온수는 개시된 시스템 및/또는 방법을 사용하여 약 5 ppm 이상, 약 10 ppm 이상, 약 15 ppm 이상, 약 20 ppm 이상, 약 25 ppm 이상, 약 30 ppm 이상, 약 35 ppm 이상, 약 40 ppm 이상, 약 45 ppm 이상, 약 50 ppm 이상, 약 55 ppm 이상, 약 60 ppm 이상, 약 65 ppm 이상, 약 70 ppm 이상, 약 75 ppm 이상, 약 80 ppm 이상, 약 85 ppm 이상, 약 90 ppm 이상, 약 95 ppm 이상, 약 100 ppm 이상, 또는 임의의 초과 또는 그 사이의 범위의 값의 용존 산소 수준을 달성할 수 있다. 특정 예시적인 실시양태에 따라, 산소-농축된 물은 약 30-60 ppm의 용존 산소 수준으로 생성될 수 있다.
표 3는 산소-농축된 염수 용액으로 처리된 치유 상처에서 취한 다양한 부분적 압력 측정치 (표 3) 및 본 발명의 가스-농축된 산소-농축된 염수 용액의 샘플에서 취한 다양한 부분적 압력 측정치를 나타낸다.
<표 3>
Figure pct00007
투여의 경로 및 형태
특정 예시적인 실시양태에서, 본 발명의 가스-농축된 유체는 치료적 조성물이 염증의 하나 이상의 증상을 예방하거나 또는 경감시키도록 치료적 조성물 단독으로 또는 또다른 치료제와 조합으로 기능할 수 있다. 본 발명의 치료적 조성물은 그를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있는 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료적 조성물 제제는 또한 담체, 아쥬반트, 에멀젼화제, 현탁제, 감미제, 향미제, 화장품, 및 결합제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 제제를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체" 및 "담체"는 일반적으로 임의의 유형의 비-독성, 불활성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 압축 물질 또는 제제 보조제를 지칭한다. 제약상 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 비-제한적 예는 슈가, 예를 들면 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예를 들면 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예를 들면 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예를 들면 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예를 들면 땅콩 오일, 목화씨 오일; 잇꽃 오일; 세삼 오일; 올리브 오일; 옥수수 오일 및 대두 오일; 글리콜; 예를 들면 프로필렌 글리콜; 에스테르, 예를 들면 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제, 예를 들면 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시드; 알긴산; 무-발열물질 물; 등장성 염수; 링거 용액; 에틸 알코올, 및 포스페이트 완충 용액, 및 다른 비-독성 호환가능한 윤활유, 예를 들면 나트륨 라우릴 술페이트 및 마그네슘 스테아레이트이며, 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 화장품 제제, 방부제 및 항산화제는 또한 제제화자의 판단에 따라 조성물에 존재할 수 있다. 특정 측면에서, 상기 담체 및 부형제는 본 발명의 가스-농축된 유체 또는 용액일 수 있다.
본원에 기재된 제약상 허용되는 담체, 예를 들면, 비히클, 아쥬반트, 부형제, 또는 희석제는 당업자에게 공지되어 있다. 전형적으로, 제약상 허용되는 담체는 치료제에 대해 화학적으로 불활성이며, 사용의 조건하에 유해한 부작용 또는 독성이 없다. 제약상 허용되는 담체는 중합체 및 중합체 매트릭스, 나노입자, 마이크로버블 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 치료적 가스-농축된 유체에 추가로, 치료적 조성물은 추가로 불활성 희석제, 예를 들면 추가의 비-가스-농축된 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 에멀젼화제, 예를 들면 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 목화씨, 땅콩(groundnut), 옥수수, 배아, 올리브, 피마자, 및 세삼 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 특정 치료적 조성물의 신규하고 개선된 제제, 신규한 가스-농축된 치료적 유체, 및 신규한 가스-농축된 치료적 유체를 전달하는 신규한 방법은 하나 이상의 불활성 희석제를 동일하거나, 유사하거나, 또는 상이한 조성물의 가스-농축된 유체로 대체함으로써 수득될 수 있다. 예를 들면, 통상의 물은 산소와 물 또는 탈이온수의 혼합에 의해 생성된 가스-농축된 유체에 의해 대체되거나 또는 보충되어 가스-농축된 유체를 제공할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 가스-농축된 유체는 하나 이상의 치료제와 함께 조합되고/되거나 단독으로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 가스-농축된 유체를 도입함은 당업계에 공지된 하나 이상의 용액, 예를 들면 탈이온수, 염수 용액 등을 하나 이상의 가스-농축된 유체로 대체하는 것을 포함할 수 있으며, 따라서 대상체에의 전달을 위한 개선된 치료적 조성물을 제공한다.
특정 실시양태는 본 발명의 가스-농축된 유체, 제약 조성물 또는 다른 치료제 또는 제약상 허용되는 염 또는 그의 용매화물, 및 하나 이상의 제약 담체 또는 희석제를 포함하는 치료적 조성물을 제공한다. 이들 제약 조성물은 상기 질환 또는 상태의 예방 및 치료 및 상기 언급된 바와 같은 요법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 담체는 제약상 허용되어야 하며, 조성물의 다른 성분에 대해 호환가능, 즉 유해한 효과를 가져서는 안된다. 담체는 고체 또는 액체일 수 있으며, 바람직하게는 단위 투여량 제제, 예를 들면, 0.05 내지 95 중량％의 활성 성분을 함유할 수 있는 정제로서 제제화된다.
가능한 투여 경로는 경구 투여, 설하 투여, 구강(buccal) 투여, 비경구 투여 (예를 들면, 피하 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 수조내 투여, 방광내 투여, 경막내 투여, 또는 정맥 투여), 직장 투여, 경피 투여, 질내 투여, 안구내 투여, 귀내(intraotical) 투여, 비내 투여, 흡입을 포함하는 국소 투여, 및 이식할 수 있는 장치 또는 물질의 주사 또는 삽입을 포함한다.
투여 경로
특정 대상체에 대한 투여의 가장 적합한 수단은 치료되는 질환 또는 상태의 본질 및 중증도 또는 사용되는 요법의 본질 및 치료적 조성물 또는 추가의 치료제의 본질에 의존할 것이다. 특정 실시양태에서, 경구 또는 국소 투여가 바람직하다.
구강 투여를 위해 적합한 제제는 별개의 단위, 예를 들면 각각 활성 화합물의 예비결정된 양을 함유하는 정제, 캡슐, 카세제, 시럽, 엘릭시르, 씹는 검, "막대사탕" 제제, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 로젠지, 또는 겔-코팅된 앰퓰; 분말 또는 과립; 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액; 또는 물-중-오일 또는 오일-중-물 에멀젼으로서 제공될 수 있다.
구강 투여를 위해 적합한 추가의 제제는 다양한 유형의 계량된 투여량 압축 에어로졸, 분무기(atomizer), 분무기(nebuliser), 또는 취입기에 의해 생성될 수 있는 미세 입자 먼지 또는 분무를 포함하도록 제공될 수 있다. 특히, 치료제의 분말 또는 다른 화합물은 본 발명의 가스-농축된 유체 중에 용해되거나 또는 현탁될 수 있다.
경점막 방법, 예를 들면 설하 투여 또는 구강 투여에 의한 경점막 방법을 위해 적합한 제제는 활성 화합물 및 전형적으로 향미 베이스, 예를 들면 슈가 및 아카시아 또는 트래거캔스를 포함하는 로젠지 패치, 정제 등, 및 불활성 베이스, 예를 들면 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 아카시아 중의 활성 화합물을 포함하는 파스틸(pastille)을 포함한다.
비경구 투여를 위해 적합한 제제는 전형적으로 활성 가스-농축된 유체 및 가능하게는 또다른 치료제의 예비결정된 농도를 함유하는 멸균된 수용액을 포함하며; 용액은 바람직하게는 대상 수용자의 혈액과 등장성이다. 비경구 투여를 위해 적합한 추가의 제제는 생리학적으로 적합한 공-용매 및/또는 복합화제, 예를 들면 계면활성제 및 시클로덱스트린을 함유하는 제제를 포함한다. 물-중-오일 에멀젼은 또한 가스-농축된 유체의 비경구 투여를 위한 제제에 대해 적합할 수 있다. 비록 상기 용액은 바람직하게는 정맥내로 투여되지만, 이들은 또한 피하 투여 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다.
요도, 직장 또는 질 투여를 위해 적합한 제제는 겔, 크림, 로션, 수성 또는 오일성 현탁액, 분산가능한 분말 또는 과립, 에멀젼, 용해가능한 고체 물질, 세척 등을 포함한다. 제제는 바람직하게는 좌제 기반, 예를 들면, 코코아 버터를 형성하는 하나 이상의 고체 담체 중의 활성 성분을 포함하는 단위-투여 좌제로서 제공된다. 별법으로, 본 발명의 가스-농축된 유체로의 결장 세척은 결장 또는 직장 투여를 위해 제제화될 수 있다.
국소, 안구내, 귀내, 또는 비내 적용을 위해 적합한 제제는 연고, 크림, 페이스트, 로션, 페이스트, 겔 (예를 들면, 히드로겔), 스프레이, 분산가능한 분말 및 과립, 에멀젼, 유동 추진제 (예를 들면, 리포솜 스프레이, 점비제, 코 스프레이 등)을 사용하는 스프레이 또는 에어로졸 및 오일을 포함한다. 상기 제제에 대한 적합한 담체는 바세린(petroleum jelly), 라놀린, 폴리에틸렌글리콜, 알코올, 및 그의 조합을 포함한다. 코 또는 비내 전달은 임의의 이들 제제 또는 다른 제제의 계량된 투여량을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 귀내 또는 안구내 전달은 점적제, 연고, 자극 유체 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 제제는 임의의 적합한 방법, 전형적으로 가스-농축된 유체를 임의로 액체 또는 미세하게 분리된 고체 담체 또는 이들 모두를 갖는 활성 화합물과 요구된 비율로 균일하게 및 친밀하게 혼합하고, 이어서, 필요한 경우, 생성된 혼합물을 원하는 모양으로 형성함으로써 제조될 수 있다.
예를 들면, 정제는 활성 성분의 분말 또는 과립 및 하나 이상의 임의의 성분, 예를 들면, 결합제, 윤활유, 불활성 희석제, 또는 표면 활성 분산제를 포함하는 친밀한 혼합물을 압축시키거나, 또는 본 발명의 분말 활성 성분 및 가스-농축된 유체의 밀접한 혼합물을 성형함으로써 제조될 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해 적합한 제제는 다양한 유형의 계량된 투여량 압축 에어로졸, 분무기(atomizer), 분무기(nebuliser), 또는 취입기에 의해 생성될 수 있는 미세 입자 먼지 또는 분무를 포함한다. 특히, 치료제의 분말 또는 다른 화합물은 본 발명의 가스-농축된 유체 중에 용해되거나 또는 현탁될 수 있다.
구강을 통한 폐 투여를 위해, 분말 또는 액적의 입자 크기는 전형적으로 수지상 기관지에 반드시 전달시키기 위해 0.5-10 μM, 바람직하게는 1-5 μM의 범위이다. 코 투여에 대해, 비강에서의 확실한 보유를 위해 10-500 μM의 범위의 입자 크기가 바람직하다.
계량된 투여량 흡입기는 전형적으로 액화 추진제 중에 치료제의 현탁액 또는 용액 제제를 함유하는 압축 에어로졸 계량기이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 가스-농축된 유체는 표준 액화 추진제에 추가로 또는 표준 액화 추진제 대신 사용될 수 있다. 사용 중, 이들 장치는 계량된 부피를 전달하기 위해 조정된 밸브를 통해, 치료제 및 가스-농축된 유체를 함유하는 미세 입자 스프레이를 생성하기 위해 전형적으로 10 내지 150 μL의 제제를 방출한다. 적합한 추진제는 특정 클로로플루오로카본 화합물, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및 그의 혼합물을 포함한다.
제제는 추가로 하나 이상의 공-용매, 예를 들면, 에탄올 계면활성제, 예를 들면 올레산 또는 소르비탄 트리올레에이트, 항-산화제 및 적합한 향미제를 함유할 수 있다. 분무기는 활성 성분의 용액 또는 현탁액을 좁은 벤투리관 오리피스를 통한 압축된 가스 (전형적으로 공기 또는 산소)의 가속을 통해, 또는 초음파 교반에 의해 치료적 에어로졸 분무로 변환시키는 시판되는 장치이다. 분무기에서 사용하기 위한 적합한 제제는 가스-농축된 유체에서의 또다른 치료제로 이루어지며, 제제의 40％ w/w 이하, 바람직하게는 20％ w/w 미만을 차지한다. 추가로, 다른 담체, 예를 들면, 바람직하게는 염, 예를 들면 염화 나트륨의 첨가에 의해 체액과 등장성으로 만들어진 증류수, 멸균된 물, 또는 희석된 수성 알코올 용액이 이용될 수 있다. 임의의 첨가제는 특별히 제제가 멸균되어 준비되지 않은 경우 방부제를 포함하며, 메틸 히드록시-벤조에이트, 항-산화제, 향미제, 휘발성 오일, 완충제 및 계면활성제를 포함할 수 있다.
흡입을 통한 투여를 위한 적합한 제제는 취입기에 의해 전달될 수 있거나 또는 냄새를 맡는 방식으로 비강 내에 흡입될 수 있는 미세하게 분쇄된 분말을 포함한다. 취입기에서, 분말은 전형적으로 계내(in situ)에서 뚫려있거나 또는 열려있는 젤라틴 또는 플라스틱으로 만들어진 캡슐 또는 카트리지 내에 함유되어 있고, 분말은 흡입시 장치를 통한 흡입된 공기에 의해 또는 수동적으로-작동되는 펌프에 의해 전달된다. 취입기에서 사용된 분말은 활성 성분을 단독으로 또는 활성 성분, 적합한 분말 희석제, 예를 들면 락토스, 및 임의의 계면활성제를 포함하는 분말 혼합물로 이루어진다. 활성 성분은 전형적으로 제제의 0.1 내지 100 w/w를 차지한다.
상기 구체적으로 언급된 성분에 추가로, 본 발명의 제제는 논의되는 제제의 유형을 고려하여 당업자에게 공지된 다른 제제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 구강 투여를 위해 적합한 제제는 향미제를 포함할 수 있으며, 비내 투여를 위해 적합한 제제는 화장품을 포함할 수 있다.
본 발명의 치료적 조성물은 개별 치료제 또는 치료제의 조합으로서 제약 약물과 함께 사용하기 위해 이용될 수 있는 임의의 통상의 방법에 의해 투여될 수 있다.
투여된 투여량은 물론, 알려진 요인, 예를 들면 특정 제제의 약역학적 특징 및 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강 및 몸무게; 증상의 본질 및 정도; 동시 치료의 종류; 치료의 빈도; 및 원하는 효과에 따라 변할 것이다. 활성 성분의 일일 투여량은 체중 킬로그램 (kg) 당 약 0.001 내지 1000 밀리그램 (mg)으로 예상될 수 있으며, 바람직한 투여량은 0.1 내지 약 30 mg/kg이다. 특정 측면에 따라, 활성 성분의 일일 투여량은 .001 리터 내지 10 리터일 수 있으며, 바람직한 투여량은 약 .01 리터 내지 1 리터이다.
투여 형태 (투여를 위해 적합한 조성물)는 단위 당 약 1 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유한다. 이들 제약 조성물에서, 활성 성분은 보통 조성물의 총 중량을 기준으로 약 0.5-95 중량％의 양으로 존재할 것이다.
연고, 페이스트, 발포체, 폐색, 크림 및 겔은 또한 부형제, 예를 들면 전분, 트래거캔스, 셀룰로스 유도체, 실리콘, 벤토나이트, 실리카산, 및 활석, 또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 분말 및 스프레이는 또한 부형제, 예를 들면 락토스, 활석, 실리카산, 알루미늄 히드록시드, 및 칼슘 실리케이트, 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 나노결정 항미생물 금속의 용액은 에어로졸 제약을 제조하는데 통상적으로 사용되는 임의의 공지된 수단에 의해 에어로졸 또는 스프레이로 전활될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 압력을 가하거나 또는 일반적으로 불활성 담체 가스로 용액의 용기에 압력을 가하기 위한 수단을 제공하는 것, 및 작은 오리피스를 통해 압축 가스를 통과시키는 것을 포함한다. 스프레이는 추가로 통상적인 추진제, 예를 들면 질소, 이산화탄소, 및 다른 불활성 가스를 함유할 수 있다. 추가로, 마이크로스피어 또는 나노입자는 대상체에게 치료적 화합물을 투여하기 위해 요구된 임의의 경로로 본 발명의 가스-농축된 치료적 조성물 또는 유체와 함께 사용될 수 있다.
주사-용 제제는 단위-투여량 또는 다중-투여량 동봉된 용기, 예를 들면 앰퓰 및 바이알로 제시될 수 있으며, 사용 바로 전에 멸균된 액체 부형제, 또는 가스-농축된 유체의 첨가만을 요구하는 냉동-건조된 (동결건조된) 상태로 저장될 수 있다. 임시 주사 용액 및 현탁액은 멸균된 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다. 주사가능한 조성물에 대한 효과적인 제약상 담체에 대한 요구사항은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, Eds., 238-250 (1982)] 및 [ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., 622-630 (1986)]을 참조한다.
국소 투여를 위해 적합한 제제는 본 발명의 가스-농축된 유체 및 임의로, 추가의 치료제 및 향미제, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스를 포함하는 로젠지; 불활성 베이스, 예를 들면 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 중의 가스-농축된 유체 및 임의의 추가의 치료제를 포함하는 파스틸; 및 적합한 액체 담체 중의 가스-농축된 유체 및 임의의 추가의 치료제를 포함하는 구강 세척제 또는 구강 세정제; 및 크림, 에멀젼, 겔 등을 포함한다.
추가로, 직장 투여를 위해 적합한 제제는 다양한 베이스, 예를 들면 에멀젼화 베이스 또는 물-가용성 베이스와 혼합함으로써 좌제로서 제시될 수 있다. 질 투여를 위해 적합한 제제는 활성 성분에 추가로, 당업계에 적절한 것으로 알려진 상기 담체를 함유하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 발포체, 또는 스프레이 처방으로서 제시될 수 있다.
적합한 제약상 담체는 이 분야에서 표준 참조 문헌인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company]에 기재되어 있다.
본 발명의 상황에서 대상체, 특별히 동물, 특히 인간에게 투여된 투여량은 합리적인 기간에 걸쳐 동물에서 치료적 반응을 유발하기 위해 충분해야 한다. 당업자는 투여량이 동물의 상태, 동물의 체중, 및 치료되는 상태를 포함하는 다양한 요인에 의존할 것이라는 것을 인정할 것이다. 적합한 투여량은 원하는 반응을 유발하는 것으로 알려진 대상체에서의 치료적 조성물의 농도를 야기하는 투여량이다.
투여량의 크기는 또한 투여의 경로, 시기 및 빈도, 및 치료적 조성물의 투여시 동반될 수 있는 임의의 유해한 부작용의 존재, 본질, 및 정도 및 원하는 생리학적 효과에 의해 결정될 것이다.
조합의 화합물은: (1) 공-제제 중의 화합물의 조합에 의해 동시에 또는 (2) 교대, 즉 화합물을 별도의 제약 제제로 연속으로, 순차적으로, 평행으로 또는 동시에 전달함으로써 투여될 수 있다는 것이 인정될 것이다. 교대 요법에서, 제2, 및 임의로 제3 활성 성분의 투여의 지연은 예를 들면, 활성 성분의 조합의 상승작용적 치료적 효과의 이점을 손실하기 위한 것이어서는 안된다. 특정 실시양태에 따라, 투여 (1) 또는 (2)의 방법 중 하나에 의해, 조합은 이상적으로 가장 효과적인 결과를 달성하기 위해 투여되어야 한다. 특정 실시양태에서 투여 (1) 또는 (2)의 방법 중 하나에 의해, 이상적으로 조합은 각각 활성 성분의 피크 혈장 농도를 달성하기 위해 투여되어야 한다. 조합 공-제제의 투여에 의한 하루-1회 하나의 알약 요법은 신경독소에 노출될 것으로 예상되는 일부 환자에 대해 실현 가능할 수 있다. 특정 실시양태에 따라 조합의 활성 성분의 효과적인 피크 혈장 농도는 대략 0.001 내지 100 μM의 범위일 것이다. 최적 피크 혈장 농도는 특정 환자에 대해 처방된 제제 및 투여 요법에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 유체 및 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제(세포자멸성) (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알스(promitochondrials) (보조효소 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라디핀), 알파-시누클레인, 및/또는 성장 인자 (GDNF) 또는 그의 임의의 생리학적으로 기능적 유도체 중 임의의 하나는, 동시에 제시되거나 또는 순차적으로 제시된 여부에 관계없이 개별적으로, 다수로, 또는 그의 임의의 조합으로 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 일반적으로, 교대 요법 (2) 중, 각각 화합물의 효과적인 투여량은 연속으로 투여되며, 공-제제 요법 (1)에서 2개 이상의 화합물의 효과적인 투여량이 함께 투여된다.
본 발명의 조합은 편리하게 단일 투여량 형태로 제약상 제제로서 제시될 수 있다. 편리한 단일 투여량 제제는 활성 성분을 각각 1 mg 내지 1 g의 임의의 양으로, 예를 들면 10 mg 내지 300 mg의 양으로 함유하지만, 이로 한정되지는 않는다. 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제 (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알스 (보조효소 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라디핀), 알파-시누클레인, 및/또는 성장 인자 (GDNF) 중 임의의 하나와 조합된 본 발명의 유체의 상승작용적 효과는 넓은 비율, 예를 들면 1:50 내지 50:1 (본 발명의 유체: 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제 (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알스 (보조효소 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라디핀), 알파-시누클레인, 및/또는 성장 인자 (GDNF))에 걸쳐 실현될 수 있다. 하나의 실시양태에서 비율은 약 1:10 내지 10:1의 범위일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 동시-제제화된 조합 투여 형태, 예를 들면 알약, 정제, 당의정 또는 캡슐내 본 발명의 유체 대 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제 (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알스 (보조효소 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라디핀), 알파-시누클레인, 및/또는 성장 인자 (GDNF) 중 임의의 하나의 중량/중량 비율은 약 1, 즉 대략 동일한 양의 본 발명의 유체 및 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제 (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알스 (보조효소 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라디핀), 알파-시누클레인, 및/또는 성장 인자 (GDNF) 중 임의의 하나일 것이다. 다른 예시적인 공-제제에서, 더 많거나 또는 더 적은 본 발명의 유체 및 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제 (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알스 (보조효소 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라디핀), 알파-시누클레인, 및/또는 성장 인자 (GDNF) 중 임의의 하나가 있을 수 있다. 하나의 실시양태에서, 각각 화합물은 조합에서 단독으로 사용된 경우 항-염증성 활성을 나타내는 양으로 사용될 것이다. 상기 조합의 화합물의 다른 비율 및 양은 본 발명의 범주 내에 고려된다.
단일 투여 형태는 본 발명의 유체 및 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제 (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알스 (보조효소 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라디핀), 알파-시누클레인, 및/또는 성장 인자 (GDNF), 또는 이들 중 하나의 생리학적으로 기능적 유도체 중 임의의 하나, 및 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
치료에 사용하기 위해 요구되는 본 발명의 조합에서의 활성 성분의 양은 다양한 요인, 예를 들면 치료되는 상태의 본질 및 환자의 연령 및 상태에 따라 달라질 것이며, 궁극적으로 주치의 또는 의사의 재량에 따를 것이라는 것이 당업자에 의해 인정될 것이다. 고려되어야 하는 요인은 투여 경로 및 제제의 본질, 동물의 체중, 연령 및 일반적인 상태 및 치료되어야 하는 질환의 본질 및 중증도를 포함한다.
또한 임의의 2개의 단일 투여량 형태의 활성 성분을 동시 또는 순차적 투여를 위해 제3 활성 성분과 합하는 것이 가능하다. 3-부의 조합은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여된 경우, 조합은 2회 또는 3회의 투여로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에 따라 본 발명의 유체의 3-부의 조합 및 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제 (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알스 (보조효소 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라디핀), 알파-시누클레인, 및/또는 성장 인자 (GDNF) 중 임의의 하나가 임의의 순서로 투여될 수 있다.
신경독성제 :
신경독성제는 특이적으로 뉴런, 그들의 시냅스, 또는 신경계 전체에 활성을 갖는 독소이다. 이들은 뇌의 구조에 손상을 야기하고, 이어서 만성 질환으로 이어지는 물질이다. 신경독소는 아드레날린성 신경독소, 콜린성 신경독소, 도파민성 신경독소, 흥분독소, 및 다른 신경독소를 포함한다. 아드레날린성 신경독소의 예는 N-(2-클로로에틸)-N-에틸-2-브로모벤질아민 히드로클로라이드를 포함한다. 콜린성 신경독소의 예는 아세틸에틸콜린 머스타드 히드로클로라이드를 포함한다. 도파민성 신경독소의 예는 6-히드록시도파민 HBr (6-OHDA), 1-메틸-4-(2-메틸페닐)-1,2,3,6-테트라히드로-피리딘 히드로클로라이드, 1-메틸-4-페닐-2,3-디히드로피리디늄 퍼클로레이트, N-메틸-4-페닐-1,2,5,6테트라히드로피리딘 HCl (MPTP), 1-메틸-4-페닐피리디늄 요오다이드 (MPP+), 파라콰트, 및 로테논을 포함한다. 흥분독소의 예는 NMDA 및 카인산을 포함한다.
MPTP, MPP+, 파라콰트, 로테논 및 6-OHDA는 동물 모델에서 PD 유사 증상을 유도하는 것으로 나타났다. (문헌 [K. Ossowska, et al., (2006). "Degeneration of dopaminergic mesocortical neurons and activation of compensatory processes induced by a long-term paraquat administration in rats: Implications for Parkinson's disease". Neuroscience 141 (4): 2155-2165; and Caboni P, et al., (2004). "Rotenone, deguelin, their metabolites, and the rat model of Parkinson's disease". Chem Res Toxicol 17 (11): 1540-8; Simon et al., Exp Brain Res, 1974, 20: 375-384; Langston et al., Science, 1983, 219: 979-980; Tanner, Occup Med, 1992, 7: 503-513; Liou et al., Neurology, 1997, 48: 1583-1588]을 참조함).
신경보호제
신경계 내의 신경보호는 예를 들면, 뇌 손상 후 또는 만성 신경퇴행성 질환으로 인해 아팝토시스 또는 퇴행으로부터 뉴런을 보호한다. "신경보호제 효과"는 을 중추 신경계 (CNS) 손상을 야기할 수 있는 합병증의 예방 및 치료를 목적으로 한다. 신경보호는 세포 생존 또는 세포 사멸 지연, 질환 진행의 정지 또는 지연, 질환 발병 및 질환 사망률 지연의 파라미터에 의해 추정될 수 있다.
본원에 기재된 실시예는 동전기적으로 변경된 수성 유체는 신경 보호적 특성을 가지는 것을 나타내며, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 MPTP-유도된 PD 증상으로부터 신경세포를 보호하는 것으로 나타났다. 특정 실시양태에 따라, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 신경독소에의 노출에 관련된 효과에 대해 보호하고/하거나 감소시키는 실질적인 이용을 갖는다.
신경보호제 제제는 에리스로포이에틴, 항-아팝토시스제 (TCH346, CEP-1347), 항글루타메이트제, 모노아민 옥시다제 억제제 (셀레길린, 라사길린), 프로미토콘드리알스 (보조효소 Q10, 크레아틴), 칼슘 채널 차단제 (이스라디핀), 알파-시누클레인, 및 성장 인자 (GDNF)를 포함하나 이들로 제한되지는 않는다.
다음 예는 설명적인 의도만 있으며, 임의의 방법으로 제한할 의도는 없다.
실시예
실시예 1
마이크로버블 크기
실험은 가스-농축된 유체로 본 발명의 확산기를 사용함으로써 가스 마이크로버블 크기 제한을 결정하기 위해 수행하였다. 마이크로버블 크기 제한을 0.22 및 0.1 마이크로미터 필터를 통해 가스 농축된 유체를 통과시킴으로써 확립하였다. 이들 시험을 수행하는데 있어서, 유체의 부피는 본 발명의 확산기를 통해 통과되어 가스-농축된 유체를 생성시켰다. 60 밀리리터의 이 유체를 60 ml 주사기에 배출시켰다. 주사기 내의 유체의 용존 산소 수준을 이어서 윙클러(Winkler) 적정에 의해 측정하였다. 주사기 내의 유체를 0.22 마이크로미터 밀리포어 밀렉스(밀리포어 Millex) GP50 필터를 통해 50 ml 비커 내에 주사하였다. 50 ml 비커에서의 물질의 용존 산소 속도를 이어서 측정하였다. 실험을 하기 표 4에 나타낸 결과를 달성하기 위해 3회 수행하였다.
Figure pct00008
나타낸 바와 같이, 주사기 내에 측정된 용존 산소 수준 및 50 ml 비커 내의 용존 산소 수준은 0.22 마이크로미터 필터를 통해 확산된 물질을 통과시킴으로써 유의하게 변하지 않았으며, 이는 유체 내의 용해된 가스의 마이크로버블은 0.22 마이크로미터 이하인 것을 의미하였다.
2차 시험을 수행하였으며, 여기서 염수 용액의 배치가 본 발명의 확산기로 농축되고, 생산 용액의 샘플을 여과되지 않은 상태로 수집하였다. 여과되지 않은 샘플의 용존 산소 수준은 44.7 ppm이었다. 0.1 마이크로미터 필터를 본 발명의 확산기로부터 산소-농축된 용액을 여과시키기 위해 사용하였고, 2개의 추가의 샘플을 채취하였다. 제1 샘플에 대해, 용존 산소 수준은 43.4 ppm이었다. 제2 샘플에 대해, 용존 산소 수준은 41.4 ppm이었다. 최종적으로, 필터를 제거하고, 최종 샘플을 여과되지 않은 용액으로부터 채취하였다. 이 경우에, 최종 샘플은 45.4 ppm의 용존 산소 수준을 가졌다. 이들 결과는 밀리포어 0.22 마이크로미터 필터가 사용된 결과와 일관되었다. 따라서, 염수 용액 내의 가스 버블 또는 마이크로버블의 대부분은 대략 크기가 0.1 마이크로미터 미만이다.
실시예 2
(본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 (RNS-60 및 솔라스)로 관류된 칼루(Calu)-3 세포 상에 수행된 패치 고정 분석은 (i) RNS-60 및 솔라스에의 노출은 전체 세포 전도도의 증가를 야기하였고, (ii) 세포의 RNS-60에의 노출은 15분 인큐베이션 시간에서 명백한 비-선형 전도도의 증가를 생성하였고, (iii) RNS-60에의 세포의 노출은 칼슘 투과성 채널 상에 RNS-60 염수의 효과를 생성하였다는 것을 밝혔다)
개관. 이 실시예에서, 패치 고정 연구는 추가로 본원에 기재된 바와 같은 전세포 전류를 조절하기 위한 이용을 포함하는 본 발명의 동전기적으로 생성된 염수 유체 (RNS-60 및 솔라스)의 이용을 확인하기 위해 수행하였다. 2개 세트의 실험을 수행하였다.
실험의 제1 세트의 데이터의 요약은 솔라스 염수로 수득된 전체 세포 전도도 (전류-대-전압 관계)가 두 인큐베이션 시간 모두 (15분, 2시간) 및 모든 전압 프로토콜에 대해 매우 선형인 것을 나타낸다. 그러나, 솔라스로의 더 긴 인큐베이션 (2시간)은 전체 세포 전도도를 증가시키는 것이 명백하다. RNS-60에의 세포의 노출은 델타 전류 (레브-솔(Rev-Sol) 삭감)에 나타낸 바와 같이 비-선형 전도도의 증가를 생성하였으며, 이는 15분의 인큐베이션 시간에서만 명백하다. 이 비-선형 전류에 대한 RNS-60의 효과는 사라졌으며, 대신 2-시간 인큐베이션 시간에서 매우 선형이다. 이전에 관찰된 바와 같이, 비-선형 전체 세포 전도도의 기여는 비록 모두 전압 프로토콜에서 존재하였지만 전압 민감성이었다.
실험의 제2 세트의 데이터의 요약은 비-선형 전류에 대한 RNS-60 염수의 효과가 있는 것을 나타내며, 이는 외부 용액에서의 고칼슘에서 명백해졌다. 비록 전압 민감성이지만, 비-선형 전체 세포 전도도의 기여는 두 전압 프로토콜 모두에 존재하였으며, 칼슘 투과성 채널에 대한 RNS-60 염수의 효과를 나타낸다.
실험의 제1 세트 (전도도의 증가; 및 비-선형 전압 조절된 전도도의 활성화)
물질 및 방법:
기관지 상피(Bronchial Epithelial) 주 칼루-3을 패치 고정 연구에서 사용하였다. 칼루-3 기관지 상피 세포 (ATCC #HTB-55)를 유리 커버슬립 상에 10% FBS로 보충된 햄스(Ham's) F12 및 DMEM 배지의 1:1 혼합물 중에서 실험의 시간까지 성장시켰다. 간단히, 전체 세포 전압 클램프(clamp) 장치를 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들면, RNS-60; 동전기적으로 처리된 60 ppm 용존 산소를 포함하는 표준 염수; 때때로 이 실시예에서 "약물"이라고 지칭함)에 노출된 칼루-3 세포에 대한 효과를 측정하기 위해 사용하였다.
상피 세포막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 시험 물질 (RNS-60)의 효과를 평가하기 위해 패치 고정 기술을 이용하였다. 구체적으로, 전체 세포 전압 클램프를 135mM NaCl, 5mM KCl, 1.2mM CaCl2, 0.8mM MgCl2, 및 10mM HEPES (pH는 N-메틸 D-글루카민으로 7.4로 조정됨)으로 이루어진 중탕 용액 중의 기관지 상피 주 칼루-3에 대해 수행하였다. 기저 전류를 측정하였고, 그 후 RNS-60을 세포 상에 살포하였다.
더 구체적으로, 패치 피펫을 2-단계 나리시게(Narishige) PB-7 수직 풀러(puller)로 보로실리케이트 유리 (Garner Glass Co, Claremont, CA)로부터 빼내고, 이어서 6 내지 12 Mohms의 저항으로 나리시게 MF-9 마이크로포지(microforge) (Narishige International USA, East Meadow, NY)로 불-연마하였다. 피펫을 (mM 단위): 135 KCl, 10 NaCl, 5 EGTA, 10 Hepes를 함유하는 세포내 용액으로 충전하고, pH를 NMDG (N-메틸-D-글루카민)로 7.4로 조정하였다.
배양된 칼루-3 세포를 다음 세포외 용액 (mM으로): 135 NaCl, 5 KCl, 1.2 CaCl2, 0.5 MgCl2 및 10 Hepes (유리산)를 함유하는 방 중에 놓았고, pH를 NMDG로 7.4로 조정하였다.
세포를 올림푸스(Olympus) IX71 현미경 (Olympus Inc., Tokyo, Japan)의 40X DIC 대물렌즈를 사용하여 보았다. 세포-부착된 기가실(gigaseal)이 확립된 후, 가벼운 흡입을 전세포 배열을 길들이고 획득하기 위해 적용시켰다. 파괴 후 즉시, 세포를 -120, -60, -40 및 0 mV에서 전압 클램핑하였고, ±100 mV 사이의 전압 단계로 자극하였다 (500 ms/단계). 전세포 전류를 대조군 상태에서 수집한 후, 동일한 세포를 중탕을 통해 상기 대조군 유체와 동일한 세포외 용질 및 pH를 포함하는 시험 유체와 함께 살포하고, 상이한 홀딩 포텐셜에서의 전세포 전류를 동일한 프로토콜로 기록하였다.
전기생리학적 데이터를 액손 패치(Axon Patch) 200B 증폭기로 획득하고, 10 kHz에서 저-주파 필터링하고, 1400A 디지데이터(Digidata) (Axon Instruments, Union City, CA)로 디지털화하였다. pCLAMP 10.0 소프트웨어 (Axon Instruments)를 데이터를 획득하고 분석하기 위해 사용하였다.
전류 (I)-대-전압 (V)
관계 (전체 세포 전도도)를 단계 내에 대략 400 msec에서 실제 전류 값 대 홀딩 포텐셜 (V)을 그림으로써 수득하였다. I/V 관계의 기울기는 전체 세포 전도도이다.
약물 및 화학물질. 나타낸 경우, 세포를 8-Br-cAMP (500 mM), IBMX (이소부틸-1-메틸잔티, 200 mM) 및 포스콜린 (10 mM)을 함유하는 cAMP 자극성 칵테일로 자극하였다. cAMP 동족체 8-Br-cAMP (시그마 Chem. Co.)를 H2O 용액 중의 25 mM 스톡으로부터 사용하였다. 포스콜린 (시그마) 및 IBMX (시그마)를 10 mM 포스콜린 및 200 mM IBMX 스톡 용액 둘 다를 함유하는 DMSO 용액으로부터 사용하였다. 수득된 데이터를 5-9 세포에 대해 평균 ± SEM 전체 세포 전류로서 표현하였다.
결과:
도 1a 내지 1c는 2개의 시점 (15분 (좌측 패널) 및 2시간 (우측 패널))에서 및 상이한 전압 프로토콜 (A, 0 mV부터 단계화; B, -60 mV부터 단계화; 및 C, -120 mV부터 단계화)에서의 상피 세포막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들면, RNS-60 및 솔라스)의 효과를 평가한 연속된 패치 클램프 실험의 결과를 나타낸다. 결과는 RNS-60 (검은색 원)은 솔라스 (백색 원)보다 전세포 전도도에 대해 더 큰 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 실험에서 3개의 전압 프로토콜 및 15분 및 2-시간 인큐베이션 시점 둘 다에서 유사한 결과를 나타냈다.
도 2a 내지 2c는 3개의 전압 프로토콜 ("델타 전류") (A, 0 mV부터 단계화; B, -60 mV부터 단계화; 및 C, -120 mV부터 단계화) 및 2개의 시점 (15분 (백색 원) 및 2시간 (검은색 원))에서의 RNS-60 전류 데이터로부터의 솔라스 전류 데이터의 차감으로부터 생성된 그래프를 나타낸다. 이들 데이터는 RNS-60으로의 15분 시점에서, 2시간 시점에서는 없는 비-선형 전압-의존성 성분이 있다는 것을 나타냈다.
이전의 실험에서와 같이, "보통" 염수를 갖는 데이터는 참조로서 사용된 매우 일관되고, 시간-독립적인 전도를 나타냈다. 본 결과는 군을 솔라스 또는 RNS-60 염수 중 하나와 연결시킴으로써 수득하였고, 결과는 기저 상태 (cAMP, 또는 임의의 다른 자극 없음) 하의 RNS-60 염수에의 칼루-3 세포의 노출이 더 짧은 인큐베이션 시간 (15분)에서의 전압-조절된 전도도의 활성화와 일관된 시간-의존성 효과(들)을 생성한다는 것을 나타냈다. 이 현상은 2-시간 인큐베이션 시점에서만큼 명백하지 않았다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 선형 성분은 전도도가 cAMP "칵테일"로의 자극에 의해 증가된 경우 더 명백하다. 그럼에도 불구하고, 2-시간 인큐베이션 시간은 RNS-60 및 솔라스 염수 둘 다에 대해 더 높은 선형 전도도를 나타냈으며, 이 경우, RNS-60 염수는 솔라스 단독에 비교하여 전체 세포 전도도를 2배로 증가시킨다. 이 증거는 전체 세포 전도도에 대한 2 이상의 기여가 RNS-60 염수에 의해 영향을 받는데, 즉 비-선형 전압 조절된 전도도, 및 선형 전도도의 활성화 (더 긴 인큐베이션 시간에서 더 명백함)에 의해 영향을 받음을 나타낸다.
실험의 제2 세트 (칼슘 투과성 채널에 대한 효과)
실험의 제2 세트에 대한 방법:
일반 패치 고정 방법에 대해 상기를 참조한다. 실험의 다음 제2 세트에서, 다시 추가의 패치 고정 연구를 전세포 전류를 조절하기 위한 본 발명의 동전기적으로 생성된 염수 유체 (RNS-60 및 솔라스)의 이용을 추가로 확인하기 위해 기저 상태하에 칼루-3 세포를 사용하여 0 mV 또는 -120 mV 홀딩 포텐셜 중 하나로부터로의 프로토콜 단계화로 수행하였다.
각각 경우에서의 전세포 전도도를 두 염수 중 하나로 15분 동안 인큐베이션된 세포로부터 수득된 전류-대-전압 관계로부터 수득하였다. 전체 세포 전도도에 대한 칼슘 투과성 채널의 기여가 있는지, 그리고 전체 세포 전도도의 이 부분이 RNS-60 염수로의 인큐베이션에 의해 영향을 받는지를 결정하기 위해, 세포를 인큐베이션 기간 후 표준 염수 중에 패치하였다 (고 NaCl 외부 용액을 수반하며, 내부 용액은 고 KCl을 함유함). 외부 염수를 이어서 용액으로 대체하였으며, NaCl을 주 외부 양이온을 대체함으로써 전도도의 변화가가 있는지 결정하기 위해 CsCl으로 대체하였다. 이들 상태하에, 칼슘 진입 단계가 더 명백해 지도록 동일한 세포를 이어서 증가하는 농도의 칼슘에 노출시켰다.
결과:
도 3a 내지 3d는 상이한 외부 염 용액을 사용하고, 상이한 전압 프로토콜 (패널 A 및 C는 0 mV부터의 단계화를 나타내며, 패널 B 및 D는 -120 mV부터의 단계화를 나타냄)에서의 상피 세포막 극성 및 이온 채널 활성 상의 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들면, 솔라스 (패널 A 및 B) 및 RNS-60 (패널 C 및 D))의 효과를 평가하는 연속된 패치 클램프 실험의 결과를 나타낸다. 이들 실험에서 15분의 1개 시점을 사용하였다. 솔라스 (패널 A 및 B)에 대해 결과는: 1) 외부 용액으로서 NaCl 대신 CsCl (정사각형 부호)을 사용하여, 대조군 (다이아몬드 부호)에 비교하여 선형 행동을 갖는 전체 세포 전도도를 증가시키고; 2) 20 mM CaCl2 (원 부호) 및 40 mM CaCl2 (삼각형 부호) 둘 다에서의 CaCl2은 비-선형 방식으로 전체 세포 전도도를 증가시킨 것을 나타낸다. RNS-60 (패널 C 및 D)에 대해, 결과는: 1) 외부 용액으로서 NaCl 대신 CsCl (정사각형 부호)을 사용함은 대조군 (다이아몬드 부호)에 비교하여 전체 세포 전도도에 대해 적은 효과을 가졌고; 2) CaCl2는 40 mM (삼각형 부호)에서 비-선형 방식으로 전체 세포 전도도를 증가시켰음을 나타낸다.
도 4a 내지 4d는 솔라스 (패널 A 및 B) 및 RNS-60 (패널 C 및 D)에 대한 2개 전압 프로토콜 (패널 A 및 C, 0 mV부터의 단계화; 및 B 및 D, -120 mV부터의 단계화)에서의 20 mM CaCl2 (다이아몬드 부호) 및 40 mM CaCl2 (정사각형 부호) 전류 데이터로부터의 CsCl 전류 데이터의 삭감으로부터 생성된 그래프 (도 3에 나타냄)를 나타낸다. 결과는 솔라스 및 RNS-60 용액 둘 다는 칼슘-유도된 비-선형 전체 세포 전도도를 활성화시켰다는 것을 나타낸다. 효과는 RNS-60 (투여량 반응성을 나타냄)으로 더 컸으며, RNS-60은 더 높은 칼슘 농도에서만 증가하였다. 추가로, 더 높은 칼슘 농도에서의 비-선형 칼슘 의존성 전도도는 또한 전압 프로토콜에 의해 증가하였다.
실험의 이 제2 세트의 데이터는 추가로 칼루-3 세포에서 수득한 전체 세포 전도도 데이터에 대한 RNS-60 염수 및 솔라스 염수의 효과를 나타낸다. 데이터는 두 염수 중 하나로의 15-분 인큐베이션은 전체 세포 전도도에 대한 분명한 효과를 나타내며, 이는 RNS-60로 및 외부 칼슘이 증가한 경우 가장 명백한 것을 나타내고, 추가로 RNS-60 염수는 전체 세포 전도도의 칼슘-의존성 비-선형 성분을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
축척된 증거는 이온 채널의 레발레시오(Revalesio) 염수에 의한 활성화를 제시하며, 이는 기저 세포 전도도에 대해 여러 기여를 한다.
출원인의 다른 데이터 (예를 들면, 출원인의 다른 실시예의 데이터)와 함께 고려하여, 본 발명의 특정 측면은 조성물 및 세포내 신호 전달을 조정하는 방법을 제공하며, 방법은 세포 (예를 들면, 신호전달 경로, 예를 들면 칼슘 의존적 세포 신호전달 시스템에 의한 교환 가능한 막 구조, 막 포텐셜 또는 막 전도성, 막 단백질 또는 수용체, 이온 채널, 지질 성분, 또는 세포내 성분 중 하나 이상의 조절을 포함하고, GPCR 및/또는 g-단백질을 포함하나 이들로 제한되지는 않는 막성 구조 (예를 들면, 막 및/또는 막 단백질, 수용체 또는 다른 막 성분)에서 전기화학적 및/또는 구조적 변화를 주기 위한 본 발명의 동전기적으로 생성된 용액의 사용을 포함한다. 추가의 측면에 따라, 이들 효과는 유전자 발현을 조절하고, 예를 들면, 개별 메세징 성분, 등의 반감기에 의존하여 지속될 수 있다.
실시예 3
(본 발명의 동전기적 유체는 다발성 경화증(MS)의 당업계-인정된 급성 실험적 알레르기성 (자가면역성) 뇌척수염 (EAE) 래트 MBP 모델에서의 투여량-반응성 방식으로 실질적으로 효과적인 것으로 나타났다)
개관:
이 실시예에서, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60을 당업계-인정된 마일린 베이직 단백질 (미엘린 베이직 단백질 MBP) 유도된 급성 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE) 래트 모델에서의 예방적 및 치료적 투여 요법 둘 다에서의 2개의 투여량으로 평가하였다. 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 투여량-반응성 방식으로 실질적으로 효과적인 것으로 나타났다. 치료적 (MBP 주사에 부수적으로 따라 개시되는 RNS-60의 일일 투여) 및 예방적 (MBP 주사 7일 전에 개시되는 RNS-60의 일일 투여) RNS-60 투여량 요법 둘 다는 현저한 감소를 나타냈으며, 임상적 점수의 지연된 발병 (고 투여량 군에서)을 나타냈다. 본 발명의 특정 측면에 따라, 따라서, 본 발명의 동전기적 조성물은, 인간 MS의 당업계-인정된 래트 모델에서의 EAE의 증상의 경감 및 예방을 포함하는 치료를 위한 실질적인 이용을 갖는다. 본 발명의 추가의 측면에 따라, 따라서, 본 발명의 동전기적 조성물은 고통받는 포유동물 (바람직하게는 인간)에서 MS의 증상의 경감 및 예방을 포함하는 치료를 위한 실질적인 이용을 갖는다. 또다른 추가의 측면에서, 본 발명의 동전기적 조성물은 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 가로지르며, 따라서 중추 신경계의 염증성 상태를 치료하기 위한 신규한 방법을 제공하였다.
다발성 경화증 (MS). 다발성 경화증 (MS)은 중추 신경계 (CNS)의 탈수초성 질환이며, 젊은 성인에서 가장 흔한 장애를 초래하는 신경계 질환 중 하나이다. 이 질환의 주 특징은 탈수초 및 염증의 중심 부위이다. 질환 경과는 예상불가능하며, 평생이며, 남성보다는 여성에게 더 흔히 영향을 준다. 질환의 병인은 유전적 및 환경적 요인에 의존적인 것으로 나타난다. 주변부에서, 항원은 MCH II에 의한 항원 제시 세포 (APC)에 의해 결합된다. Th0 세포는 항원에 결합하고, 활성화 및 분화를 겪는다. 부착 분자 및 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMP)는 Th1 세포가 혈액 뇌 장벽 (BBB)에 결합하고 관통하는데 도움을 준다. CNS 내로 BBB를 가로지른 후, Th1 세포는 항원-MHC 복합체를 사로잡고, CNS의 손상을 야기하는 전염증성 시토킨을 생성한다. 자가면역성 시스템은 미엘린 단백질을 이물질로 인식하며, 공격을 개시한다. 역사적으로, Th1 세포는 질환의 병리학에서 우세한 역할을 하는 것으로 생각되었지만, 최근 증거는 Th17 세포, IL-6 및 TGF-β의 전염증성 연쇄반응은 EAE 및 MS의 병인론에 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다.
실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE). 또한 실험적 알레르기성 뇌척수염이라고 하는 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE)은 다발성 경화증 (MS)의 비-인간 동물 모델이다. MS는 아니지만, EAE의 상이한 형태 및 단계는 다수의 방식으로 MS의 다양한 형태 및 단계와 매우 근접하게 유사하다. 더 구체적으로, EAE는 급성 또는 만성-재발성, 획득, 염증성 및 탈수초성 자가면역성 질환이다. 동물의 신경 세포 (뉴런)를 둘러싸는 절연 집인 미엘린을 구성하는 다양한 단백질 (예를 들면, 미엘린 베이직 단백질 (MBP), 단백질지질 단백질 (PLP), 및 미엘린 올리고덴드로사이트 글리코단백질 (MOG))의 전체 또는 부분으로 주사하여, 인간의 MS와 밀접하게 유사한 동물의 미엘린에 대한 자가면역성 반응을 유도하였다. EAE는 마우스, 래트, 기니 피그, 토끼, 마카크, 붉은털 원숭이 및 마모셋을 포함하는 다수의 상이한 동물 종에서 유도되었다. 면역학적 도구의 수, 동물의 입수가능성, 수명 및 생산력 및 MS에 대해 유도된 질환의 유사함을 포함하는 다양한 이유 때문에, 마우스 및 래트는 가장 흔히 사용되는 종이다. 급성 래트 EAE 모델은 강한 염증성 성분을 가지며, 따라서 MS에서 면역 사건을 표적하는 제제의 치료적 포텐셜을 조사하기 위한 적절한 모델이다.
MBP-유도된 EAE. 1개 투여량 후의 루이스(Lewis) 래트에서의 MPB는 주로 뒷발 마비에 의해 특징화되는 재발로 이어질 것이다. 루이스 래트는 0일차에 MBP 주사에 적용된다. 질환은 12일차 내지 16일차 사이에 발달하며, 완전한 질환 회복은 18일차 내지 21일차 사이에 발생한다. 모델은 자가 제한적이며, 탈수초를 나타내지 않는다.
물질 및 방법:
시험 유체 (RNS-60)의 생성 및 특징화. 필터 멸균된 RNS-60은 US2008/0219088 (2008년 9월 11일 발행됨), US2008/0281001 (2008년 11월 11일 발행됨) 및 WO2008/052143 (2008년 5월 2일 발행됨)에 기재된 방법에 따라 출원인에 의해 제조되었으며, 상기 문헌 모두는, 특히 출원인의 본 발명의 동전기적 유체를 제조하기 위한 기구 및/또는 방법에 관련된 모든 측면에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함되었다. 사용된 RNS-60의 용존 산소 (DO) 함량은 윙클러 적정 검정 (문헌 [Y.C. Wong ＆ C.T. Wong. New Way Chemistry for Hong Kong A-Level Volume 4, Page 248.] 또는 [Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater - 20th Edition ISBN 0-87553-235-7])에 의해 결정된 바와 같이 59 ppm이었다. RNS-60 유체를 시험 품목 (TI) 수, 수령일, 저장 상태 및 만기일로 표지하였다. RNS-60의 저장 상태 및 처리는 시험 중 시험 기관에서의 안정성을 보장하기 위해 출원인의 명세서에 따른 것이었다. 유체를 사용하지 않을 때 2-8℃에서 냉장시켜 유지하였다. 유체를 함유하는 바이알을 단일 사용 용기로서 사용하였다.
비히클 대조군 유체. 비히클 대조군 유체는 호스피라(Hospira)로부터의 주사 (0.9％)를 위한 표준 염수가었다.
덱사메타손. 덱사메타손을 시그마(Sigma)로부터 구입하였다 (품목 번호 D1756; 로트(Lot) 번호 096K1805). 투여를 위해, 덱사메타손 (백색 분말)을 에탄올 중에 희석하여 1 mg/ml의 농도를 달성하고, 이어서 다시 증류수 중에 희석하여 0.1 mg/ml의 투여량 농도를 달성하였다.
EAE 유도 품목:
MBP 항원 제제. MBP는 기니 피그 (Des-Gly-77, Des-His-78)-MBP (68-84); 품목 번호 H-6875; MD 바이오사이언스(Bioscience)에 의해 제공됨)로부터의 미엘린 베이직 단백질이었다. MBP를 생리학적 염수 중에 2 mg/ml의 농도에서 용해하였다;
CFA 민감제. 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA)는 모웰 다이아그노스틱스 게임베하(Morwell Diagnostics GmbH) (품목 번호 IMAD-4)의 MD 바이오사이언스 부서로부터의 것이었다. 열 사멸된 마이코백티리엄 투버큘로시스(Mycobacterium Tuberculosis) H37 Ra를 함유하는 CFA 현탁액을 공급된 바와 같이 4 mg/ml의 농도에서 사용하였고;
MBP/CFA 에멀졀 (항원/민감제). 연구 0일차에 수행된 단일 접종 전에, MBP 용액의 1개 부피를 동일한 부피의 CFA 4 mg/ml와 루어(Luer) 부품에 의해 연결된 2개의 주사기를 사용함으로써, 에멀젼성 혼합물이 100 μl/동물의 총 투여량 부피와 동일하도록 완전히 혼합시키기 위해 혼합하였다. 투여량을 백서족부(intraplantar) 발 영역 내에 2x 50 μl 피하 투여 (SC) 양쪽 주사로서 전달하였다.
시험 동물; 래트. 육십 (60) 암컷 루이스 래트 (연구 개시에서 6-7주령)를 할란 라보라토리즈 이스라엘, 엘티디.(Harlan Laboratories Israel, Ltd.)로부터 수득하였다. 치료 개시 시간에서의 동물의 중량 변화는 평균 중량의 20％를 초과해서는 안된다. 이 연구에서 사용된 동물의 건강 상태를 그들의 도착 후 검사하였다. 건강이 좋은 동물만을 실험실 상태에 적응시키고, 연구에서 사용하였다. 연구의 진입 전에, 동물을 5일 이상 동안 적응시켰다. 적응 중 및 연구 기간 동안, 동물을 제한된 접근 설치류 기관 내에 보관하고, 최대 5마리의 래트의 군으로 고체 바닥으로 갖추고, 침구 물질로서 멸균된 나무 대팻밥으로 충전된 폴리프로필렌 케이지에서 보관하였다. 동물을 아드 리비툼(ad libitum) 상업적 설치류 식단으로 제공하고, 식수에 접근을 자유롭게 하였으며, 이는 스테인리스 강 시퍼(sipper) 튜브가 있는 폴리에틸렌 병을 통해 각각 케이지에 제공되었다. 연구에서 사용된 식단 배치의 비육장 분석을 연구 데이터가 있는 기록 보관소에 포함하였다. 물을 주기적으로 모니터링하였다. 자동적으로 조절된 환경적 상태를 온도를 20-24℃에서 30-70％의 상대 습도 (RH), 12:12시간 명:암 주기 및 15-30 공기 변화/시간으로 유지하도록 설정하였다. 온도 및 RH를 매일 모니터링하였다. 명 주기를 대조군 시계에 의해 모니터링하였다. 동물에게 꼬리표를 사용하여 독특한 동물 식별을 주었다. 이 수는 또한 각각 케이지의 앞에 보이는 케이지 카드에 나타났다. 케이지 카드 또한 연구 및 군의 수, 투여 경로, 성별, 균주 및 치료 군에 대한 모든 다른 관련된 세부사항을 함유하였다.
Figure pct00009
시험 절차 및 급성 EAE 뮤린 모델의 원칙. 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)은 다발성 경화증 (MS)의 많은 임상적 및 병리학적 특징처럼 보이는 중추 신경계 (CNS) 자가면역성 탈수초성 질환이다. 급성 래트 모델은 연구의 0일차에 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA) 중에 에멀젼화된 미엘린 베이직 단백질 (MBP)의 단일 피하 투여 (SC) 주사에 의해 유도된 민감화 기간으로 이루어진다.
EAE 유도 및 치료 요법의 도식적 묘사가 도 6)에 나타난다.
EAE 유도:
MBP/CF A. 도 6)의 도식적 묘사에 나타낸 바와 같이, 모든 동물을 연구 0일차 (연구 개시)에 MBP 및 CFA의 균질액 에멀젼성 혼합물로 이루어진 단일 접종 주사에 적용시켰다 (MBP/CFA 뇌염유발성 에멀젼성 접종 (100 μg MBP/200 μg CFA)을 100 μl/동물의 총 투여량 부피로 주사하고, 백서족부 발 영역 내에 2 x 50 μl 피하 투여 (SC) 양쪽 주사로 전달되었음).
치료:
치료 요법 및 절차. 모든 화합물을 동물에 점수를 매기는 사람과 다른 사람이 매일 새로 제조하였다. 동물에 점수를 매기는 사람은 군의 수로만 표시된 바이알을 받았으며, 치료는 모르고 있었다.
투여 경로: (i) RNS-60 (IV); (ii) 비히클 대조군: (IV); 및 (iii) 양성 대조군: (IP).
투여량 수준 및 부피 투여량: (i) RNS-60: 350 g에 대해 저 투여량 2 ml; 350 g에 대해 고 투여량 4 ml; (ii) 비히클 대조군: 0; 및 (iii) 양성 대조군 (덱사메타손): 1 mg/kg.
지지 간호. 연구의 경과 중 결정되지 않은 한, EAE 실험적 효과가 예상되고/되거나 관찰된 후 (단일 뇌염유발성 접종 후 대략 8-12일), 또는 동물이 그들의 이전 결정으로부터 15％ 초과의 체중 감소 또는 그들의 초기 체중 측정치의 20％ 초과의 감소를 나타낸 경우, 적절한 지지 간호를 개개의 경우에 따라 수행하였다.
먹이 및 물 공급. 식수에 적신 깨진 펠렛 또는 가루모양의 설치류 식단으로 이루어진 추가의 물 공급원을 케이지 바닥 및 기는/비-이동 동물 앞에 놓았다.
탈수. 동물은 체중이 초기 결정의 10％ 내로 돌아올 때까지 적어도 하루에 2회 및 2 ml/동물/일 이하 덱스트로스 5％ 용액으로의 피하 투여 (SC) 보충적 유체 요법에 적용될 수 있다.
배뇨. 동물의 복부의 촉진을 배뇨를 돕고, 동물이 그들의 방광을 비울 수 있는지 관찰하기 위해 수행하였다.
다른 특수 간호. 동물의 항문주위 부위 및 뒷다리를 필요에 따라 촉촉한 거즈 패드로 청소하였다.
괄찰 및 검사:
임상적 징후. 21-일 연구 전체 동안, 세심한 임상적 검사를 수행하고, EAE 임상적 점수 매김 및 평가에 추가로 하루에 1회 이상 기록하였다 (하기를 참조함). 괄찰은 피부, 털, 눈, 점액 막의 변화, 분비 및 배설 (예를 들면, 설사) 및 자율신경 활성 (예를 들면, 눈물분비, 침분비, 침분비, 동공 크기, 비정상적 호흡 패턴), 걸음걸이, 자세 및 처리에 대한 반응의 발생, 및 비정상적 행동, 떨림, 경련, 수면 및 혼수상태의 존재를 포함하였다.
체중. 체중 손실은 질환 개시의 제1 징후일 수 있고, 갑작스런 현저한 체중 증가는 EAE 증상의 완화를 동반하는 경향이 있다. 따라서, 동물의 개별 체중의 결정을 연구 0일차 (연구 개시)의 EAE 유도 조금 전에 하였고, 그 후 전체 21-일 관찰 기간 동안 매일 하였다.
EAE 임상적 점수 매김 및 평가. 초기에, 모든 동물을 EAE 유도 (연구 0일차) 전에 임의의 신경계 반응 및 증상의 징후에 대해 검사하고, 그 후 21-일 관찰 기간 전체 동안 매일 검사하였다. 실험적 편견을 피하기 위해, EAE 반응을 적용되는 특정 치료를 모르는 직원에 의해 가능한 많이, 맹검 방식으로 결정하였다. EAE 반응의 점수를 매기고, 하기 표6에 나타낸 바와 같이 고전적인, 당업계-인정된 종래의 0-5 등급에 따라 중증도의 오름차순으로 기록하였다:
Figure pct00010
혈액 샘플. 연구 종료 일 (21일차)에, 모든 동물은 주사 후 1시간 동안 피를 흘렸다. 샘플을 연구 0 (예방적 군만), 7, 14, 및 21일차에 수집하였다. 혈장을 헤파린첨가 바이알 중에 수집하고, -20℃에서 보과하였다. 300μl의 부피를 혈액 계수 분석을 위해 저장하고, 루미넥스 테크놀로지(Luminex Technology)를 통한 추가의 시토킨 분석을 위해 100μl를 저장하고 사용하였다. 혈액 계수를 0, 7, 14, 및 21일차에 대해 분석하였다.
조직 수집. 연구 종료에서, 동물을 4％ PFA로 주입시켰다. 뇌 및 척수를 수집하고, 4％ PFA에서 보관하였다.
인간적 종점. 빈사 상태로 발견된 동물 및/또는 심한 통증을 나타내고 심한 곤란의 징후를 견디는 동물을 인간적으로 안락사시켰다.
통계 / 데이터 평가:
평가는 모든 치료된 군에서 수득된 절대값, 백분율 (％) 변화 및 평균 군 값 대 비히클 대조군의 절대값, 백분율 (％) 변화 및 평균 군 값으로 표현된 주로 신경계 증상 및 체중 둘 다에서의 상대적 기록된 변화를 기반으로 하였다. 적절한 통계학적 방법에 의한 데이터의 분석을 치료 효과의 유효성을 결정하기 위해 적용시켰다.
동물 간호 및 사용 성명:
이 연구를 연구가 제시된 규칙 및 규정에 따른 적절한 간호 및 실험실 동물의 사용의 도덕적 행동에 대한 위원회에 제출된 신청 양식의 승인 후 수행하였다.
결과:
연구의 결과는 도 5에 나타내며, 여기서 시간 (MBP 주사 후 일)은 X-축 상에 나타나며, "임상적 점수" (상기 "물질 및 방법"을 참조함)는 Y-축 상에 나타난다.
도 5는 본 발명의 동전기적 유체 (RHS-60)는 다발성 경화증 (MS)의 당업계-인정된 실험적 자가면역성 뇌척수염 (EAE) 래트 모델에서 실질적으로 효과적이었다는 것을 나타낸다 (상기 "물질 및 방법"을 참조함).
구체적으로, 17일 기간에 걸친 비히클 대조군 군 (검은색 다이아몬드)과 비교하여, 치료적 (MBP 주사를 수반하여 개시된 RNS-60의 일일 투여) 및 예방적 (MBP 주사 7일 전에 개시된 RNS-60의 일일 투여) RNS-60 투여량 요법 둘 다는 임상적 점수의 현저한 감소, 및 지연된 발병 (고 투여량 군에서)을 나타냈다.
저 투여량 (매일 1회 cc 주사) RNS-60 치료적 군의 임상적 점수는 비히클 대조군의 임상적 점수의 대략 반 (1/2)이었으며, 고 투여량 (매일 2회 cc 주사) RNS-60 치료적 군의 임상적 점수는 비히클 대조군의 임상적 점수의 대략 5분의 1 (1/5) 내지 10분의 1 (1/10)이었을 뿐 아니라, 또한 지연된 발병을 나타냈다.
저 투여량 (매일 1회 cc 주사) RNS-60 예방적 군의 임상적 점수는 비히클 대조군의 임상적 점수의 대략 3분의 1 (1/3)이었으며, 고 투여량 (매일 2회 cc 주사) RNS-60 예방적 군의 임상적 점수는 16일차 까지 0 (임상적 점수가 검출되지 않음)이고, 따라서 실질적으로 지연된 발병을 나타냈을 뿐 아니라, 17일차에 관찰가능할 때 동일한 시점에서의 비히클 대조군의 임상적 점수보다 10분의 1 (1/10) 미만이었다.
본 발명의 특정 측면에 따라, 따라서, 본 발명의 동전기적 조성물은 인간 MS의 당업계-인정된 래트 모델에서의 EAE의 증상의 경감 및 예방을 포함하는 치료를 위한 실질적인 이용을 갖는다.
실시예 4
(본 발명의 동전기적 유체는 다발성 경화증(MS)의 당업계-인정된 급성 실험적 알레르기성 (자가면역성) 뇌척수염 (EAE) 래트 MBP 모델에서 래트의 중량을 지속하는데 효과적인 것으로 나타났다)
개관:
이 실시예는 실시예 7에 기재된 실험에 적용된 래트의 중량 변화를 개시한다. 체중 손실은 질환 개시의 제1 징후가 될 수 있으며, 갑작스러운 현저한 체중 증가는 EAE 증상의 완화를 동반하는 경향이 있다. 따라서, 동물의 개별 체중의 결정을 연구 0일차 (연구 개시)에 EAE 유도 조금 전에 21-일 관찰 기간 동안 매일 하였다. 체중에 대한 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60의 효과는 EAE 래트 모델에 적용된 래트의 중량을 유지하는데 효과적인 것으로 나타났다 (도 7).
체중 데이터:
도 7은 체중을 100 그램을 기반으로 그램 (패널 A) 및 백분율 (패널 B)로 나타낸다. 이 실시예에서 처리된 동물의 평균 체중의 적은 감소 후, 평균 체중은 연구 종료까지 증가하기 시작하였다. 연구 종료에서, 평균 체중 증가는 비히클 처리된 동물에서 20％이었다 (군 1F). 연구 동안, 연구 0일차에 시작하여 투여된 덱사메타손 치료군 (군 2F)은 연구 중 10％ 평균 체중 손실이 있었다. 연구 종료에서, 덱사메타손 처리된 동물은 평균 체중의 2％를 손실하였다. 예방적, 저 투여량 처리된 군 (군 3F)은 연구 1-3일차에 4％ 이하의 평균 체중 손실을 나타냈으며, 이어서 연구 종료 일까지 평균 체중의 23％를 증가시켰다. 예방적, 고 투여량 처리된 군 (군 4F)은 연구 1-3일차에 5％ 이하의 평균 체중 손실을 나타냈으며, 이어서 연구 종료 일까지 평균 체중의 28％를 증가시켰다. 치료적, 저 투여량 처리된 군 (군 5F)은 연구 1-3일차에 4％ 이하의 평균 체중 손실을 나타냈으며, 이어서 연구 종료 일까지 평균 체중의 21％를 증가시켰다. 치료적, 고 투여량 처리된 군 (군 6F)은 연구 1-3일차에 4％ 이하의 평균 체중 손실을 나타냈으며, 이어서 연구 종료 일까지 평균 체중의 19％를 증가시켰다.
따라서 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 EAE 래트 모델에 적용된 래트의 중량을 유지하는데 효과적인 것으로 나타났다.
본 발명의 특정 측면에 따라, 따라서, 본 발명의 동전기적 조성물은 인간 MS의 당업계-인정된 래트 모델에서의 EAE의 증상의 경감 및 예방을 포함하는 치료를 위한 실질적인 이용을 갖는다.
실시예 5
(본 발명의 동전기적 유체는 다발성 경화증(MS)의 당업계-인정된 급성 실험적 알레르기성 (자가면역성) 뇌척수염 (EAE) 래트 MBP 모델에 적용된 래트로부터 채취한 혈액 샘플 내의 백혈구, 호중구, 및 림프구의 수준에 대해 작은 효과를 갖는 것으로 나타났다)
개관:
이 실시예는 실시예 7에 기재된 실험 중 래트로부터 채취한 혈액 샘플 내의 백혈구, 호중구, 및 림프구의 수준을 개시한다. 시토킨 수준의 변화가 백혈구의 전체 변화로 인한 것인지를 결정하기 위해, 출원인은 혈액 샘플을, 실험 동안, EAE 실험에 적용된 래트로부터 채취하였다.
백혈구, 호중구 , 및 림프구의 수준:
도 8a 내지 8d는 EAE 실험 동안 수집한 혈액 샘플의 백혈구, 호중구, 및 림프구의 수준을 나타낸다.
백혈구 (WBC), 호중구 및 림프구를 시험 품목의 연구 0 (패널 A), 7 (패널 B), 14 (패널 C) 및 21일차 (패널 D)에의 투여 1시간 후 계수하였다. 연구 7일차에 동물의 비히클로의 처리 1시간 후 최대 WBC 계수는 8.23±0.36 점이었다. 덱사메타손으로의 처리는 평균 WBC 계수 대 비히클을 2.46±0.38 점 (p<0.05)으로 유의하게 감소시켰다. 저 투여량 (군 5F)으로의 시험 품목으로의 치료는 평균 WBC 계수 대 비히클을 9.59±0.46 점으로 (p<0.1) 유의하게 증가시켰다. 고 투여량 (군 6F)으로의 시험 품목으로의 치료는 평균 WBC 계수 대 비히클을 10.84±0.88 점으로 (p<0.05) 유의하게 증가시켰다.
연구 14일차에 동물의 비히클로의 처리 1시간 후의 최대 WBC 계수는 6.34±0.28 점이었다. 덱사메타손으로의 처리는 평균 WBC 계수 대 비히클을 3.79±0.69 점으로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05). 고 투여량 (군 4F)으로의 시험 품목으로의 예방적 치료는 평균 WBC 계수 대 비히클을 7.83±0.51 점 (p<0.05)으로 유의하게 증가시켰다. 저 투여량 (군 5F)으로의 시험 품목으로의 치료는 평균 WBC 계수 대 비히클을 7.65±0.52 점 (p<0.05)으로 유의하게 증가시켰다. 고 투여량 (군 6F)으로의 시험 품목으로의 치료는 평균 WBC 계수 대 비히클을 8.05±0.43 점 (p<0.05)으로 유의하게 증가시켰다. 동물의 연구 21일 차에 비히클로의 처리 1시간 후의 최대 WBC 계수는 9.09±0.75 점이었다. 덱사메타손으로의 처리는 평균 WBC 계수 대 비히클을 5.12±0.57 점으로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05).
연구 7일차에 동물의 비히클로의 처리 1시간 후의 최대 호중구 계수는 26.20±1.62 점이었다. 덱사메타손으로의 처리는 평균 호중구 계수 대 비히클을 65.38±4.62 점으로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 시험 품목으로의 고 투여량 (군 4F)으로의 예방적 치료는 평균 호중구 계수 대 비히클을 31.90±0.96 점으로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 시험 품목으로의 고 투여량 (군 6F)으로의 치료는 평균 호중구 계수 대 비히클을 33.90±2.79 점으로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05).
연구 14일차에 동물의 비히클로의 처리 1시간 후 최대 호중구 계수는 33.00±2.58 점이었다. 덱사메타손으로의 처리는 평균 호중구 계수 대 비히클을 73.10±3.15 점으로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05).
동물의 연구 21일차에 비히클로의 처리 1시간 후의 최대 호중구 계수는 41.40±2.32 점이었다. 덱사메타손으로의 처리는 평균 호중구 계수 대 비히클을 89.33±1.97 점으로 유의하게 증가시켰다 (p<0.05). 시험 품목으로의 고 투여량 (군 6F)으로의 치료는 평균 호중구 계수 대 비히클을 34.60±3.08 점으로 (p<0.1).
연구 7일차에 비히클로의 처리 1시간 후의 최대 림프구 계수는 73.20±1.95 점이었다. 덱사메타손으로의 처리는 평균 림프구 계수 대 비히클을 30.63±1.31 점으로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05). 시험 품목으로의 고 투여량 (군 4F)으로의 예방적 치료는 평균 림프구 계수 대 비히클을 68.30±1.42 점으로 유의하게 감소시켰다 (p<0.1). 시험 품목으로의 고 투여량 (군 6F)으로의 치료는 평균 림프구 계수 대 비히클을 64.80. ±3.00 점으로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05).
연구 14일 차에 비히클로의 처리 1시간 후의 최대 림프구 계수는 66.10±2.53 점이었다. 덱사메타손으로의 처리는 평균 림프구 계수 대 비히클을 26.80±3.23 점으로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05).
연구 21일차에 비히클로의 처리 1시간 후의 최대 림프구 계수는 57.50±2.09 점이었다. 덱사메타손으로의 처리는 평균 림프구 계수 대 비히클을 10.11±2.08 점으로 유의하게 감소시켰다 (p<0.05). 고 투여량 (군 6F)으로의 시험 품목으로의 치료는 평균 림프구 계수 대 비히클을 66.20±2.74 점으로 (p<0.05) 유의하게 증가시켰다.
따라서 예방적 및 치료적으로 고 투여량으로 투여한 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 호중구 계수를 유의하게 증가시키고, 연구 7일차에 림프구 계수 대 비히클을 유의하게 감소시켰다. 예방적으로 고 투여량으로 투여된 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60, 및 두 투여량 모두에서 치료적으로 투여된 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은, 연구 14일차에 WBC 계수 대 비히클을 유의하게 증가시켰다. 고 투여량으로 치료적으로 투여된 시험 품목 RNS60은, 호중구 계수를 유의하게 감소시키고, 연구 21일차에 림프구 계수 대 비히클을 증가시켰다. 따라서 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 WBC, 호중구, 및 림프구의 전체 수준에 작은 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 6
(본 발명의 동전기적 유체는 다발성 경화증(MS)의 당업계-인정된 급성 실험적 알레르기성 (자가면역성) 뇌척수염 (EAE) 래트 MBP 모델에 적용된 래트로부터 채취한 혈액 샘플의 특정 시토킨의 수준에 영향을 미치는 것으로 나타났다)
개관:
이 실시예는 실시예 7에 기재된 실험 중 래트로부터 채취한 혈액 샘플에서 발견된 바와 같은 시토킨의 수준을 개시한다. 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60을 실시예 7에 기재된 바와 같은 치료적 투여 요법에서 평가하였다. 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 EAE 래트 모델에 적용된 래트로부터 채취한 혈액 샘플 내의 특정 시토킨의 수준에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
특정 시토킨은 다발성 경화증에서 역할을 갖는 것으로 나타났다. 특히 또한 CTLA-8 또는 IL-17A로도 알려진 인터류킨 17 (IL-17)은 급성 및 만성 EAE에서의 중추 신경계에서 상승된 수준을 갖는 것으로 입증되었다 (문헌 [Hofstetter, H. H., et al., Cellular Immunology (2005), 237:123-130]). IL-17은 다양한 비-면역 세포로부터의 광범위의 다른 시토킨의 분비를 자극하는 전염증성 시토킨이다. IL-17은 섬유아세포, 케라틴세포, 상피 및 내피 세포와 같은 부착 세포에 의해 IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1 및 G-CSF의 분비를 유도할 수 있으며, 또한 방사선 섬유아세포의 존재하에 공동배양된 경우 CD34+ 인간 전구세포의 호중구로의 ICAM-1 표면 발현, T 세포의 증식, 및 성장 및 분화를 유도할 수 있다 (문헌 [Fossiez et al., 1998, Int.Rev.Immunol. 16, 541-551]). IL-17은 대게 활성화된 기억 T 세포에 의해 생성되며, 편재하여 분포된 세포 표면 수용체 (IL-17R)에 결합함으로써 활성을 갖는다 (Yao et al., 1997, Cytokine, 9, 794-800 ). 염증성 반응을 조절하는데 유사하고 뚜렷한 역할 둘 다를 갖는 다수의 IL-17의 상동체가 확인되었다. IL-17 시토킨/수용체 족의 검토를 위해 문헌 [Dumont, 2003, Expert Opin. Ther. Patents, 13, 287-303]을 참조한다.
IL-17은 비정상적인 면역 반응에 의해 매개되는 다수의 질환, 예를 들면 류마티스 관절염 및 기도 염증, 및 기관 이식 거부반응 및 항암 면역성에 기여할 수 있다. IL-17 활성의 억제제는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 IL-17R:Fc 융합 단백질을 콜라겐-유도된 관절염에서의 IL-17의 역할을 입증하고 (문헌 [Lubberts et al., J.Immunol. 2001,167, 1004-1013]), 중성화 폴리클로날 항체 복막 유착 형성을 감소시키기 위해 (문헌 [Chung et al., 2002, J.Exp.Med., 195, 1471-1478]) 사용하였다. 중성화 모노클로날 항체는 시판된다 (R＆D Systems UK).
따라서 MS의 병인론에서 IL-17이 하는 역할을 기반으로, 출원인은 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60의 EAE 연구에서 래트로부터 채취한 혈액 샘플 내의 IL-17의 수준에 대한 효과를 검사하였다.
시토킨 데이터:
연구 중 혈액 내의 다양한 시토킨의 수준을 분석하였다. 간단히, 모든 동물을 주사 후 1-시간 동안 피를 흘리게 하고, 혈장을 헤파린첨가 바이알에 수집하였다. 100 μl 샘플을 동시에 동일한 샘플로부터 다중 시토킨의 측정을 가능하게 하는 루미넥스 테크놀로지에 의해 다양한 염증성 시토킨에 대해 분석하였다 (파노믹스(Panomics)로부터의 프로카타(Procarta) 래트 시토킨 검정 키트 PC4127을 사용함). 비-정규 분포된 데이터 및 검정 검출 역치 미만의 때때로의 결과로 인해, 검열된 데이터에 대한 비모수의 콕스(Cox) 회귀 모델을 상이한 유체를 비교하기 위해 적응시켰다. 도 9a 내지 9h에 나타낸 바와 같이, IL1a, IL1b, 및 IL17의 수준은 RNS60의 두 치료적 치료 투여량 모두 (고 및 저)에 의해 가장 현저하게 감소되었다. MBP 유도된 EAE의 임상적 징후는 약 10일차에 시작되며, 약 18일차에 최고점에 다른다. 따라서, 우리는 7일차 (질환 징후 바로 전) 및 18일차 (약 질환의 피크)를 시토킨 분석을 위한 가장 중요한 시점으로 고려하였다. 10개 동물/군으로부터의 7 및 18일 차의 IL1a, IL1b 및 IL17의 전신성 수준은 도 9a 내지 9h에 나타낸다.
IL-1은 주요 전염증성 시토킨 중 하나이며, 선천 면역 반응의 상류 매개자이다. IL-1은 양성 되먹임 루프를 사용하여 다양한 성장 및 영양 요인, 염증성 매개자, 부착 분자 및 다른 시토킨의 생성을 직접적 및 간접적으로 유발한다 (문헌 [A. Basu et al., The type 1 interleukin-1 receptor is essential for the efficient activation of microglia and the induction of multiple proinflammatory mediators in response to brain injury, J. Neurosci. 22 (2002), pp. 6071-6082]; [P.N. Moynagh, The interleukin-1 signaling pathway in astrocytes: a key contributor to inflammation in the brain, J. Anat. 207 (2005), pp. 265-269]). 이들은 중요한 조절인자, 예를 들면 NGF, ICAM 1, IL6, TNFa, CSF 등을 포함한다. MS의 진행은 주변부에서의 자가-항원-반응성 T 세포의 활성화, 이어서 CNS로의 침입에 관여한다. IL-1은 미엘린-특이적 T 세포 활성화에 참여할 뿐 아니라 또한 주변부에서의 대식세포 활성화의 주요 매개자를 대표하기 때문에 MS의 발달에 있어서 중요하다 [문헌 [R. Furlan et al., HSV-1-매개된 IL-1 receptor antagonist gene therapy ameliorates MOG(35-55)-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in C57BL/6 mice, Gene Ther. 14 (2007), pp. 93-98)]). MS에 대한 EAE 모델에서, IL-1α 및 IL-1β 둘 다는 염증성 절차의 매개자인 것으로 나타났다. IL-1β의 말초 수준은 임상적 경과와 상관관계가 있으며, IL-1β는 반응성은 CNS-침윤 대식세포 및 정주 미세아교세포에서의 EAE 중에 나타났다 ((문헌 [C.A. Jacobs et al., Experimental autoimmune encephalomyelitis is exacerbated by IL-1 alpha and suppressed by soluble IL-1 receptor, J. Immunol. 146 (1991), pp. 2983-2989)]). 따라서, IL-1은 EAE 및 MS에서 적합한 치료적 표적이다. IL-1의 비-선택적 억제적 기전은 MS에 대해 현존하는 치료제, 즉 인터페론 베타, 항-염증성 글루코코르티코이드, 면역억제제, 아토르바스타틴 및 오메가-3 폴리불포화 지방산에서 나타났다 [문헌 [F.L. Sciacca et al., Induction of IL-1 receptor antagonist by interferon beta: impliplication for the treatment of multiple scleroris, J. Neurovirol. 6 (Suppl. 2) (2000), pp. S33-S37.]; [R. Pannu et al., Attenuation of acute inflammatory response by atorvastatin after spinal cord injury in rats, J. Neurosci. Res. 79 (2005), pp. 340-350]; [A.P. Simopoulos, Omega-3 fatty acids in inflammation and autoimmune diseases, J. Am. Coll. Nutr. 21 (2002), pp. 495-505)]). 도 9c 내지 9f에 나타낸 바와 같이, RNS60의 IV 투여는 IL1α 및 IL1β 둘 다의 전신성 수준을 효과적으로 낮춘다. IL1α에 대해, RNS60 처리는 혈액 수준을 비히클 처리된 군에 비교하여 유의하게 낮추었으며, 이 시점에서 덱사메타손만큼 효과적이었다. 그러나 18일차 시점에서, 처리는 IL1α 전신성 수준에 대해 유의한 효과를 갖지 않는다. IL1β의 전신성 수준은 또한 7일의 RNS60의 IV 치료 후, 독성 부작용의 임의의 징후 없이 덱사메타손 치료 군에 필적하는 수준으로 유의하게 감소하였다. 비록 18일차 시점에서 동일한 경향이 주목되었지만, 차이점은 대조군 군에 비교하여 통계학적으로 유의하지 않았다. IL-17은 또한 강력한 전염증성 효과를 갖는 중요한 효과인자 시토킨이다. 이는 다른 전염증성 시토킨, 예를 들면 종양 괴사 인사-α 및 케모카인의 발현을 유도하고, 호중성 백혈구를 유인하고, 가지 세포의 성숙을 증진시킨다 (문헌 [Kolls JK, Linden A.Interleukin-17 family members and inflammation.Immunity. 2004 Oct;21(4):467-76]). IL-17-생성 세포는 자가면역성 질환, 예를 들면 콜라겐-유도된 관절염, 대장염, 건선, 및 EAE에서 중요한 염증성 매개자인 것으로 여겨진다. EAE에서의 T 도움17 세포는 CD4+ 세포이며, 이들은 면역 주변부 및 EAE에서의 염증성 중추 신경계 둘 다에 존재한다. 추가로, IL-17의 중성화는 임상적 질환을 완화시키며, 이는 IL-17-결핍 동물에서의 EAE 중증도의 감소와 평행한 발견이다. ((문헌 [Gold and Luhder, Interleukin-17-Extended Features of a Key Player in Multiple Sclerosis Am J Pathol. 2008 January; 172(1): 8-10.]로부터). RNS60으로의 7일의 IV 치료는 혈액의 IL17 수준의 유의한 감소를 야기하였으며, 다시 한번 덱사메타손 처리된 동물에 유사한 수준이었다. 치료 18일 후 조차에서도 비록 결과가 통계학적으로 유의하지는 않았지만, 동일한 결과가 야기되었다. RNS60은 IL1 수준을 낮추는데 효과적일 뿐 아니라, 21일의 IV 주사 후 조차에서도 주목할만한 독성 부작용없이 EAE, IL1 및 IL17에서의 2개의 주요 시토킨의 조합은 IL1 수준을 낮추는데 효과적이라는 것을 주목하는 것이 중요하다.
IL1 및 IL17에 추가로, 신경계의 염증에서 중요한 역할을 하는 다른 분자의 수는 또한 RIS60에 의해 조절된다. 이들은 란테스(Rantes), KC, NGF 및 ICAM (데이터는 나타내지 않음)을 포함한다.
따라서 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 EAE 연구에서의 래트로부터 채취한 혈액 샘플에서 IL-17의 수준에 대해 유의한 효과를 가졌다. 추가로, IL-17은 IL-6, IL-8, PGE2, MCP-1 및 G-CSF의 분비를 자극하기 때문에, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60은 혈액에서 이들 시토킨의 수준에 대해 유의한 효과를 가질 확률이 높다. 본 발명의 특정 측면에 따라, 따라서, 본 발명의 동전기적 조성물은 인간 MS의 당업계-인정된 래트 모델에서의 EAE의 증상의 경감 및 예방을 포함하는 치료에 대한 실질적인 이용을 갖는다.
실시예 7
(본 발명의 동전기적 유체 (예를 들면, RNS60)는 미세아교세포에서 투여량-의존성 방식으로 iNOS 및 IL-1β 둘 다의 발현을 억제하는 것으로 나타났다)
개관:
특정 측면에 따라 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체는 파킨슨 질환 (PD)의 치료에 대해 실질적인 이용을 갖는다.
파킨슨 질환 (PD)은 인간에서 가장 파괴적인 신경퇴행성 장애 중 하나이다. PD는 임의의 연령에 발생할 수 있으나, 30세보다 어린 사람에서는 흔하지 않다. 임상적으로, PD는 떨림, 운동완만증, 경축 및 체위 불안정성에 의해 특징화된다. 병리학적으로, 이는 흑색질 치밀부(SNpc)에서의 세포내 봉입 (루이스체)의 존재와 연관된 도파민성 뉴런의 신경아교증 및 진행성 퇴행에 의해 나타난다. 사후 PD 뇌에서, 사멸하는 뉴런은 세포 수축, 크로마틴 응결, 및 DNA 분절을 포함하는 아팝토시스의 형태학적 특징을 나타내는 것으로 보고되었다. 따라서, 효과적인 신경보호제 치료적 접근법의 발달이 질환 진행을 저지하는 것은 무엇보다도 중요하다. MPTP 마우스 모델은 PD에 대한 치료적 접근법을 시험하고 입증하는데 실질적인 이용을 갖는다.
미세아교세포 활성화는 파킨슨 질환 (PD) 및 다른 신경퇴행성 장애의 병인론에서 중요한 역할을 한다. PD의 특정 특징은 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘 (MPTP)-취한 동물에 모델링되어 있다. MPTP의 신경독성 효과는 그의 MPP+로의 전환에 의존한다. 신경아교세포에서, 모노아민 옥시다제 B (MAO-B)는 MPTP를 MPP+로 전환하고, 이어서 신경아교세포를 활성화하며, 최근에, MPP+는 미세아교세포에서 전염증성 분자의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 추가로, MPP+는 도파민성 뉴런의 아팝토시스를 야기한다.
이 실시예에서, MPP+-자극된 미세아교세포에서의 전염증성 분자의 발현을 조절하는 RNS60의 능력이 확인되었다.
물질 및 방법:
간단히, 마우스 BV-2 미세아교세포를 1시간 동안 RNS60 및 표준 염수 (NS)의 상이한 농도로 인큐베이션하고, 무혈청 상태하에 2 μM MPP+로 자극하였다. 6시간 후, 총 RNA를 단리하고, iNOS 및 IL-1β의 mRNA를 반-정량적 RT-PCR에 의해 측정하였다. 데이터는 3개의 독립적 실험을 대표한다.
결과:
도 10의 반-정량적 RT-PCR 분석에 의해 입증된 바와 같이, MPP+는 단독으로 마우스 BV-2 미세아교세포에서 유도가능한 산화질소 신타제 (iNOS) 및 인터류킨-1β(IL-1β) mRNA의 발현을 유도하였다. 유의하게, RNS60은 미세아교세포에서 투여량-의존성 방식으로 iNOS 및 IL-1β 둘 다의 발현을 억제하였다 (도 10). 대조적으로, 유사한 실험적 상태하에, 표준 염수 대조군 (NS)은 이들 2개의 전염증성 유전자의 발현에 대해 효과를 가지지 않았으며 (도 10), 효과의 특이성을 나타냈다.
구체적으로, 도 10은 대조군 표준 염수 (NS)는 아니고, 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)는 마우스 미세아교세포에서 유도가능한 산화질소 신타제 (iNOS) 및 인터류킨-1β (IL-1β)의 MPP+-유도된 발현을 약화시키는 것을 나타낸다. 1시간 동안 무혈청 배지에서 상이한 농도의 RNS60 및 표준 염수 (NS)와 예비인큐베이션된 BV-2 미세아교세포를 MPP+(파킨슨증후군(Parkinsonian) 독소)로 자극하였다. 자극 6시간 후, 총 RNA를 단리하고, iNOS 및 IL-1β의 mRNA 발현을 반-정량적 RT-PCR에 의해 분석하였다. 결과는 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
특정 측면에 따라 따라서, MPP+는 파킨슨증후군 독소이기 때문에, 이들 결과는 RNS60은 파킨슨 질환의 당업계-인정된 MPTP-유도된 마우스 모델에서 보호적 효과를 갖는 것을 나타낸다.
특정 측면에 따라, 본 발명의 동전기적 유체는 파킨슨 질환 (PD)을 치료하기 위한 실질적인 이용을 갖는다.
실시예 8
(본 발명의 동전기적 유체 (예를 들면, RNS60)는 아밀로이드-β 독성으로부터 신경 세포 및 1차 인간 뉴런을 보호하는 것으로 나타났다)
개관:
특정 측면에 따라 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체는 알츠하이머 질환 (AD)을 치료하기 위한 실질적인 이용을 갖는다.
알츠하이머 질환 (AD)은 진행성 뉴런성 사멸 및 기억 손실을 야기하는 신경퇴행성 장애이다. 사후 AD 뇌에서의 증가된 TUNEL 염색은 AD 환자의 뇌에서의 뉴런은 아팝토시스를 통해 사멸한다는 것을 나타낸다. 섬유성 아밀로이드-β 펩티드는 AD의 병태생리학에 참여한다. 신경병리학적으로, 질환은 신경섬유성 매듭, β-아밀로이드 (Aβ) 단백질의 클러스터로 구성된 신경성 플라크, 아밀로이드 전구체 단백질로부터 유도된 40-43 아미노산 단백질분해 단편, 인산화된 tau에 의해 특징화된다. 트랜스제닉 마우스에서의 Aβ 펩티드의 세포내 과다-발현은 크로마틴 분할, 응결, 및 증가된 TUNEL 염색을 야기하는 것으로 밝혀졌다. 세포 배양물 연구는 또한 Aβ 펩티드는 뉴런성 세포에 대해 세포자멸성 및 세포독성인 것을 나타냈으며, 섬유성 Aβ1-42 펩티드는 뉴런성 세포에서 아팝토시스를 유도할 수 있는 것으로 나타났다.
추가로, 연구는 점점 더 염증 및 AD 사이의 연결부를 특징화하는 것을 겨냥하며, 광범위한 아교세포 활성화는 플라크 및 매듭 주변에서 발견되었다.
이 실시예에서, 인간 SHSY5Y 신경 세포 및 1차 인간 뉴런에서의 Aβ(1-42)-유도된 아팝토시스를 차단하는 RNS60의 효과는 확인되었다.
물질 및 방법:
SHS5Y 인간 뉴런성 세포의 단편화된 DNA를 계내에서 섬유성 Aβ1-42에 대한 반응에서 생성된 DNA 단편의 3′-OH 말단의 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제 (TdT)- 매개된 결합에 의해 칼바이오켐으로부터 시판되는 키트 (TdT 프래그엘(FragEL)(tm))를 사용하여 검출하였다. 간단히, 커버슬립을 실온에서 15분 동안 20 μg/ml 프로틴아제 K로 처리하고, TdT 염색 전에 세척하였다. 뉴런을 이전에 기재되고 배양된 바와 같이 단리시켰다 (1,2).
결과:
도 11a 및 11b에 입증된 바와 같이, 섬유성 Aβ1-42 펩티드는 뉴런성 세포에서 세포자멸성 바디의 형성을 현저하게 유도하였다. 우리는 또한 Aβ1-42 처리 (2번째 줄; 도 11a) 후 뉴런성 처리의 손실을 관찰하였다. 이와 대조하여, 역 펩티드 Aβ42-1은 뉴런 아팝토시스 및 절차의 손실을 유도할 수 없었다 (3번째 줄; 도 11a). 유의하게, 상이한 투여량에서의 RNS60은 현저하게 차단된 Aβ(1-42)-유도된 아팝토시스를 시험하였으며, 뉴런성 세포에서의 절차를 보존하였다 (4번째, 5번째 ＆ 6번째 줄; 도 11a 및 11b). 대조적으로, 표준 염수 대조군 유체 (NS)는 Aβ(1-42)-유도된 아팝토시스 및 절차의 손실에 대한 효과과 없었다 (7번째 ＆ 8번째 줄; 도 11a).
구체적으로, 도 11a는 표준 염수 대조군 (NS)은 아니고, RNS60은 인간 SHSY5Y 뉴런성 세포의 섬유성 Aβ(1-42)-매개된 아팝토시스를 억제한다는 것을 나타낸다. 분화 후, SHSY5Y 세포를 RNS60 또는 NS 중 하나로 여러 농도로 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 1 μM 섬유성 Aβ(1-42) 펩티드로 손상시켰다. 치료 18시간 후, 아팝토시스를 TUNEL (칼바이오켐)에 의해 모니터링하였다. Aβ(42-1) 펩티드를 또한 대조군으로서 인큐베이션하였다. 결과는 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
추가로, 도 11b, 2번째 및 3번째 줄은 RNS60은 1차 인간 뉴런의 섬유성 Aβ(1-42)-매개된 아팝토시스를 억제한다는 것을 나타낸다. 뉴런을 RNS60으로 1시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 1 μM 섬유성 Aβ(1-42) 펩티드로 손상시켰다. 치료 18시간 후, 아팝토시스를 TUNEL (칼바이오켐)에 의해 모니터링하였다. β(42-1) 펩티드를 또한 대조군으로서 인큐베이션하였다. 결과는 3개의 독립적 실험을 나타낸다.
이들 결과는 AD의 병인학적 시약 (섬유성 Aβ1-42)은 RNS60-민감성 경로를 통해 뉴런에서 아팝토시스를 유도하고, RNS60은 배양된 뉴런 및 1차 뉴런 둘 다에서 섬유성 유도된 아팝토시스를 강하게 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
특정 측면에 따라, 본 발명의 동전기적 유체는 알츠하이머 질환 (AD)의 치료를 위한 실질적인 이용을 가지며, 바람직한 측면에서는, AD의 진행의 예방 또는 지연을 위한 실질적인 이용을 갖는다.
실시예 9
(본 발명의 동전기적 유체는 다발성 경화증 (MS)의 당업계-인정된 마우스 MOG 모델에서 투여량-반응성 방식으로 임상적 점수를 억제하는데 실질적으로 효과적인 것으로 나타났다)
개관:
이 실시예에서, 본 발명의 동전기적 유체 RNS-60을 2개의 투여량에서, 치료적 투여 요법으로, 다발성 경화증 (MS)의 당업계-인정된 실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE) 마우스 MOG 모델에서 평가하였다.
물질 및 방법:
실험적 알레르기성 뇌척수염 (EAE)은 다발성 경화증 (MS)의 많은 임상적 및 병리학적 특징과 유사한 중추 신경계 (CNS) 자가면역성 탈수초성 질환이다. MOG 뮤린 모델은 연구 0일차에 완전 프로인트 아쥬반트 (CFA) 중에 에멀젼화된 MOG의 단일 피하 투여 (SC) 주사에 의해 유도된 민감화 기간 (허리주위 영역에 걸쳐 2 X 100 μl 피하 투여 양쪽 주사로서 전달된 200 μl/동물의 총 투여량 부피로 주사된 200 μg MOG / 300 μg CFA); 이어서 백일해 독소 (PT)로의 20 μg/kg (대략 400 ng/마우스)으로의 복강내 (IP) 주사를 통한 연구 0일차에 EAE 유도의 시간에서의 1회의 복강내 (IP) 보충적 면역자극 및 다시, 48시간 후 연구 2일차에 복강내 (IP) 보충적 면역자극 (문헌 [Gilgun-Sherki Y. et al., Neurosciences Research 47:201-207, 2003])으로 이루어진다. 동물을 이어서 나타낸 도 12에서 RNS60 IV 주입으로 처리하였다. 사용된 동물은 젊은 성인, 연구 개시에서 8-9주령인 할란 라보라토리즈 이스라엘, 엘티디. (10 동물/군)로부터의 암컷 C57BL/6J 마우스이었다.
모든 동물을 신경계 반응 및 증상의 징후에 대해 EAE 유도 (연구 0일차) 전에 검사하였고, 그 후 35-일 관찰 기간 동안 매일 검사하였다. EAE 반응의 점수를 매기고, 당업계-인정된 0-15 등급에 따라 중증도의 오름차순으로 기록하였다. 임상적 점수를 각각 부분의 점수를 합함으로써 결정하였다 (예를 들면, 문헌[ Weaver et al., FASEB 2005; The FASEB Journal express article 10.1096/fj.04-2030fje. Published online August 4, 2005.] 참조).
결과:
도 12는 비히클 대조군 (비히클)은 아니고, RNS60은 다발성 경화증(MS)의 당업계-인정된 마우스 MOG 모델에서 투여량-반응성 방식으로 임상적 점수를 억제하는데 실질적으로 효과적인 것을 나타낸다. RNS-60의 고 및 저 투여량 둘 다의 치료적 일일 투여, 및 RNS-60의 3일에 1회 고 투여량 투여 (제1 임상적 징후를 수반하여 시작되는 모든 경우에서의 투여 또는 RNS-60)는 임상적 점수의 현저한 감소를 나타냈다 (백색 다이아몬드 = 비히클 대조군; 백색 정사각형 = 덱사메타손 양성 대조군; 밝은 "x" = 임상적 징후의 발병으로부터의 저 투여량 (0.09 ml RNS60) 일일 투여; 짙은 "x" = 임상적 징후의 발병으로부터의 3일에 1회 고 투여량 (0.2 ml RNS60) 투여; 및 백색 삼각형 = 임상적 징후의 발병으로부터의 고 투여량 (0.2 ml RNS60) 일일 투여).
본원의 상기 실시예의 MBP 모델과 비교하여, 이 마우스 MOG 모델은 MBP 모델에서는 나타나지 않는 특징적 MS의 축삭 손상을 모방하는 그의 능력에 대해 당업계에 알려져 있으며, 더 긴 기간에 걸쳐 관찰된 치료적 효능을 연장시킨다 (MBP 모델의 21일과 비교하여 28-30일). 추가의 측면에 따라, 비히클 대조군 (비히클)은 아닌, RNS60은 이 마우스 MOG 모델에서의 축삭 손상을 감소시키는데 실질적으로 효과적이다.
본 발명의 특정 측면에 따라, 본 발명의 동전기적 조성물은 인간 MS의 당업계-인정된 마우스 모델에서 증상의 경감 및 예방을 포함하는 치료를 위해 실질적인 이용을 갖는다. 본 발명의 추가의 측면에 따라, 본 발명의 동전기적 조성물은 괴로워하는 포유동물 (바람직하게는 인간)에서의 MS의 증상의 경감 및 예방을 포함하는 치료를 위해 실질적인 이용을 갖는다.
또다른 추가의 측면에서, 본 발명의 동전기적 조성물은 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 가로지르며, 따라서 중추 신경계의 염증성 상태를 치료하기 위한 신규한 방법을 제공한다.
실시예 10
(표준 염수 (NS)는 아니고, RNS60은 MBP-최회민감 T 세포에서의 NFκB의 활성화를 약화시켰다)
개관. NF-κB 키나제는 당업계에 염증-매개된 상태 및 질환에서의 염증성 반응을 매개하는 것으로 널리 인정되는 키나제이다.
이 실시예는 표준 염수 (NS)는 아니고, RNS60은 MBP-최회민감 T 세포에서 NFκB의 활성화를 약화시키는 것을 나타낸다. 특정 측면에 따라, 따라서, 본원의 동전기적으로-생성된 유체는 당뇨병 및 관련된 대사 장애, 인슐린 내성, 신경퇴행성 질환 (예를 들면, M.S., 파킨슨병, 알츠하이머병, 등), 천식, 낭성섬유증, 혈관/심장동맥 질환, 망막 및/또는 반점 퇴행, 소화 장애 (예를 들면, 염증성 장 질환, 궤양 대장염, 크론병, 등)을 포함하나 이들로 제한되지는 않는 염증 및 염증-매개된 상태 및 질환의 치료를 위해 실질적인 이용을 갖는다.
방법. 도 13a 및 13b에 나타낸 실험을 위해, MBP-면역화된 마우스로부터 단리된 T 세포를 MBP로 재-최회민감하고, 24시간 후, 세포는 상이한 농도의 RNS60 및 NS를 받았다. 2시간의 치료 후, NF-κB의 DNA-결합 활성을 전기영동상 유동성 이동 검정 (EMSA)에 의해 핵 추출물에서 모니터링하였다.
도 13c에 나타낸 실험을 위해, MBP-면역화된 마우스로부터 단리된 T 세포를 NF-κB 의존성 리포터 구조물인 PBIIX-Luc으로 형질감염하고, 이어서 MBP으로 재최회민감하였다. 24시간의 MBP 최회민감 후, 세포를 상이한 농도의 RNS60 및 NS로 2시간 동안 처리하고, 이어서 루시퍼라제 검정 키트 (Promega)에 의해 총 세포 추출물에서의 루시퍼라제 활성의 검정을 수행하였다. 다른 경우에서, MBP-최회민감 T 세포를 또한 30 nM PMA로 1시간 동안 자극하였다. 이들 경우에서, PMA를 RNS60 및 NS으로의 예비처리 1시간 후 첨가하였다. 결과는 3개의 상이한 실험의 평균 + SD이다.
결과. 도 13a 내지 13c는 표준 염수 (NS)는 아니고, RNS60은 MBP-최회민감 T 세포에서 NF-κB의 활성화를 약화시켰다는 것을 나타낸다. 구체적으로, 도 13a 및 13b는 NS (도 13a 및 13b의 가장-우측 레인을 참조함)는 아니고, RNS60 (도 13a 및 13b의 중간 3개 레인을 참조함)은 투여량-반응성 방식으로 MBP-최회민감 T 세포에서 NF-κB의 활성화를 약화시켰다는 것을 나타낸다.
마찬가지로, 도 13c의 막대 그래프는 NS (도 13a 및 13b의 다섯 번째 막대를 참조함)는 아니고, RNS60 (도 13a 및 13b의 두 번째, 세 번째 및 네 번째 막대를 참조함)은 MBP-최회민감 T 세포에서 NF-κB의 활성화를 약화시켰다는 것을 나타내며, 따라서 또한 총 세포 추출물에서의 투여량-반응성 방식으로 형질감염된 NF-κB-의존성 리포터 구조물 (PBIIX-Luc)로부터의 루시퍼라제 활성을 약화시켰다는 것을 나타낸다.
특정 측면에 따라, 따라서, 개시된 동전기적으로-생성된 유체는 당뇨병 및 관련된 대사 장애, 인슐린 내성, 신경퇴행성 질환 (예를 들면, M.S., 파킨슨병, 알츠하이머병, 등), 천식, 낭성섬유증, 혈관/심장동맥 질환, 망막 및/또는 반점 퇴행, 소화 장애 (예를 들면, 염증성 장 질환, 궤양 대장염, 크론병, 등)를 포함하나 이들로 제한되지는 않는 염증 및 염증-매개된 상태 및 질환을 치료하기 위한 실질적인 이용을 갖는다.
실시예 11
(표준 염수 (NS)는 아니고, RNS60은 마우스에서 파킨슨 질환의 MPTP 유도된 병리학적 징후를 약화시켰다)
개관:
마우스는 파킨슨 질환 (PD)의 병리학적 징후 (예를 들면, 이동 시간의 감소, 이동 거리의 감소, 회전 막대에 균형을 이루기 위한 더 낮은 능력, 떨림, 및 줄무늬-조절된 행동 패턴 상동증 및 양육 (수직 이동)의 손실)를 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘 (MPTP)으로 처리함으로써 나타내도록 유도될 수 있다. MPTP의 신경독성 효과는 MPP+로의 그의 전환에 의존한다. 신경아교세포에서, 모노아민 옥시다제 B (MAO-B)는 MPTP를 MPP+로 전환시키고, 이어서 신경아교세포를 활성화시키며, 최근에, MPP+는 미세아교세포에서 전염증성 분자의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 추가로, MPP+는 도파민성 뉴런의 아팝토시스를 야기하는 것으로 나타났다.
이 실시예에서, MPTP-처리된 마우스에서의 PD의 병리학적 증상 (예를 들면, 배위된 이동의 개선, 줄무늬 의존성 행동의 손실의 방지, 및 도파민성 뉴런의 구조)을 감소시키는 RNS60의 능력을 확인하였다.
물질 및 방법:
간단히, C57BL/6 마우스는 염수 중의 MPTP-HCl (18 mg/kg의 유리 염기)의 4회의 복강내 주사를 2-시간 간격으로 투여받았다. 대조군 동물은 동일한 부피의 염수를 받았다. RNS60 또는 표준 염수 (NS)으로의 처리를 MPTP 중독 1일 전에 시작하였다. 운동 활성을 MPTP 주사 7일 후 컴퓨터-지원형 디지스캔(Digiscan) 적외선 활성 모니터 (도 14 및 15)로 측정하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되었으며, P 값은 ANOVA에 의해 계산되었다; * = P < .05, ** = P < .01, *** = P < .001, ns = 유의하지 않음.
RNS60 처리가 MPTP에 취한 마우스의 도파민성 뉴런을 구조하는 것을 확인하는 실험을 위해, 줄무늬를 MPTP 중독 7일 후 해부하였다 (도 16). 흑색질 치밀부에서의 도파민성 뉴런의 존재를 도파민 합성에 관여하는 속도-제한적 효소인 티로신 히드록실라제에 대한 항체로의 면역염색에 의해 검출하였다. 패널 A는 대조군 마우스 = MPTP에 취하지 않은 건강한 대조군 마우스로부터의 줄무늬를 나타내고, 패널 B는 MPTP = MPTP-장애가 있는 마우스로부터의 줄무늬를 나타내고, 패널 C는 RNS60으로 처리된 MPTP + RNS60 = MPTP-장애가있는 마우스로부터의 줄무늬를 나타낸다.
결과:
도 14 및 15의 운동 분석에 의해 입증되는 바와 같이, MPP+는 단독으로 대상체에서 이동 시간 (도 14a), 거리 (도 14b), 회전하는 막대 (도 14c)에서 그들의 균형을 유지하는 마우스의 능력, 줄무늬-조절된 행동 패턴 상동증의 손실 (그루밍(grooming)) (도 15a), 및 양육 (수직 이동) (도 15b)을 감소시키는 것을 포함하는 PD-유사 증상을 유도하였다. 유의하게, RNS60은 실질적으로 이들 증상을 완화시켰으며, 일부 배위된 이동 실험에서 마우스 행동은 대조군 마우스에 유사하였다. 대조적으로, 유사한 실험적 상태하에, 표준 염수 대조군 (NS)으로 예비-처리되고, 이어서 MPP+로 유도된 마우스는 MPP+ 치료 단독과 유사한 증상을 가졌다 (도 14 및 15). 따라서, 이들 데이터는 RNS60은 MPP+-취한 마우스에 대해 특이적인 보호적 효과를 갖는 것을 나타낸다.
따라서, 도 14 및 15는 대조군 표준 염수 (NS)는 아니고, 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)는 배위된 이동을 개선시키고, PD의 마우스 모델에서 마우스의 줄무늬-의존성 행동의 손실을 예방하는 것을 나타낸다.
추가로, 흑색질 치밀부에서의 면역염색, PD에서 대게 영향받은 뇌의 부분은, RNS60 (도 16)으로 처리된 마우스에서 도파민성 뉴런의 주목할만한 구조를 밝혔으며, 이는 치료의 신경보호제 활성을 확인시켰다. 도 16에 나타낸 바와 같이, MPP+ 중독은 티로신 히드록실라제 (TH)-양성 뉴런의 손실, 및 흑색질 치밀부(SNpc)에서의 RNS60 보호된 TH-양성 뉴런의 예비-치료로 이어졌다.
추가로, 마우스의 모든 군 (군 당 n=6)의 선조체 TH 면역염색의 정량화는 이전에 기재된 바와 같이 수행될 것이다 (1, 2). 흡광도 측정치는 디지털 영상 분석 (Scion)에 의해 수득될 것이다. 선조체 TH 흡광도는 기본적으로 도파민성 섬유 신경분포를 반영한다.
특정 측면에 따라 따라서, MPP+는 신경독소이기 때문에, 이들 결과는 RNS60은 신경독소로부터 보호적 효과를 갖는 것을 나타낸다. 추가의 특정 측면에 따라, MPP+는 도파민성 신경독소이기 때문에, 이들 결과는 RNS60은 도파민성 신경독소로부터 보호적 효과를 갖는 것을 나타낸다.
특정 측면에 따라, 본 발명의 동전기적 유체는 신경독소에의 노출로부터 생성된 예방 신경독성 증상에 대한 실질적인 이용을 갖는다.
상기 부분에서 인용된 참조 문헌:
1. Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J.H., Mufson, E.J., Mosely, R.L., Ghosh, S., Gendelman, H.E. ＆ Pahan, K. 2007. Selective inhibition of NF-κB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104: 18754-18759.
2. Ghosh, A., Roy, A., Matras, J., Brahmachari, S., Gendelman, H.E., ＆ Pahan, K. 2009. Simvastatin inhibits the activation of p21ras and prevents the loss of dopaminergic neurons in a mouse model of Parkinson's disease. J. Neurosci. 29: 13543 - 13556.
실시예 12
(표준 염수 (NS)는 아니고, RNS60은 생체내에서 흑색질 치밀부(SNpc)에서 미세아교세포 iNOS의 MPTP 유도된 발현을 억제한다)
개관:
특정 측면에 따라 본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체는 신경독소로부터 신경 세포를 보호하기 위한 실질적인 이용을 갖는다.
마우스는 이들을 1-메틸-4- 페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘 (MPTP)으로 처리함으로써 파킨슨 질환 (PD)의 병리학적 징후를 나타내도록 유도될 수 있다. MPTP의 신경독성 효과는 MPP+로의 그의 전환에 의존한다. 신경아교세포에서, 모노아민 옥시다제 B (MAO-B)는 MPTP를 MPP+로 전환시키고, 이어서 신경아교세포를 활성화시키며, 최근에, MPP+는 미세아교세포에서 전염증성 분자의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 추가로, MPP+는 도파민성 뉴런의 아팝토시스를 야기한다.
실시예 7 및 11에서, 미세아교세포에서 유도가능한 산화질소 신타제 (iNOS) 및 IL-1β의 MPP+-유도된 발현을 억제하고, 선조체 도파민성 뉴런을 보호하고, PD의 MPTP 마우스 모델에서 운동 활성을 개선시키는 RNS60의 능력을 나타낸다. 추가의 실험을 a) 생체내에서 MPTP-취한 마우스의 흑색질 치밀부(SNpc)에서의 미세아교세포 iNOS에 대한 RIS60의 효과를 검사하기 위해 수행하였다.
물질 및 방법:
RIS60 또는 IS (i.p. 주사를 통해 300 μl/d/마우스)를 받는 수컷 C57BL/6 마우스 (각각 군에서 n=3)는 MPTP 중독 1일 전에 2시간 간격으로 4개의 MPTP 주사를 받을 것이다. RIS60/IS로의 처리는 지속될 것이며, MPTP 중독 1일 후, 마우스는 사멸되고, 그들의 뇌는 고정되고, 포매되며, 이전에 기재된 바와 같이 iNOS 면역염색을 위해 처리된다 (1,2). 간단히, 모든 군의 마우스의 복측 중뇌 단면 (염수, MPTP, MPTP-RIS60-300 μl, MPTP-IS-300 μl)은 (미세아교세포에 대해) 기재된 바와 같이 iNOS 및 CD11b에 대한 항체로의 자유-플로팅(free-floating) 이중-면역표지를 거친다 (1-3).
CD11b-양성, iNOS-양성, 및 CD11b 및 iNOS 둘 다에 대해 양성인 세포는 올림푸스 IX81 형광 현미경에서 "마이크로스위트(Microsuite) 생물학적 스위트" 소프트웨어를 사용하여, iNOS의 미세아교세포 활성화 및 발현이 대조군 MPTP 마우스 및 IS (비히클)-처리된 MPTP 마우스와 비교하여 RIS60-처리된 MPTP-취한 마우스의 SNpc에서 감소되었는지 결정하기 위해 계수될 것이다. 각각 3마리의 동물로부터 단리한 각각 뇌의 6 흑질 단면을 MPTP-처리된 마우스의 SNpc에서의 CD11b 및 iNOS의 단백질 수준에 대한 RIS60의 효과를 결정하기 위해 사용하였다.
결과:
특정 실시양태에 따라, 표준 염수는 아니고, RNS60은 생체내에서 흑색질 치밀부(SNpc)에서 미세아교세포 iNOS의 MPTP 유도된 발현을 억제한다). 따라서 이들 생체내 실험은 실시예 7에 나타낸 결과를 확인시키며, 반-정량적 PCR은 표준 염수는 아니고, RNS60은 마우스 미세아교세포에서 iNOS의 MPTP 유도된 발현을 억제하는 것을 나타냈다.
상기 부분에 인용된 참조 문헌:
1. Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J.H., Mufson, E.J., Mosely, R.L., Ghosh, S., Gendelman, H.E. ＆ Pahan, K. 2007. Selective inhibition of NF-κB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104: 18754-18759.
2. Ghosh, A., Roy, A., Matras, J., Brahmachari, S., Gendelman, H.E., ＆ Pahan, K. 2009. Simvastatin inhibits the activation of p21ras and prevents the loss of dopaminergic neurons in a mouse model of Parkinson's disease. J. Neurosci. 29: 13543 - 13556.
3. Roy, A. ＆ Pahan, K. 2010. Prospects of statins in Parkinson's disease. Neuroscientist 16: 000-000.
실시예 13
(표준 염수 (NS)는 아니고, RNS60은 1차 뉴런 및 성상교세포에서의 Akt 인산화의 활성화를 유도하였다)
개관. Akt는 글루코스 대사, 세포 증식, 아팝토시스, 전사 및 세포 이동을 포함하는 다중 세포 절차에서 주요 역할을 하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. Akt는 세포 생존을 조절하는 것으로 알려져 있다. 특히, 인산화된 Akt는 BAD (프로-세포자멸성 단백질)을 불활성화시킴으로써 아팝토시스를 억제하는 것으로 나타났다. (문헌 [Song G, et al., (2005). "The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival". J. Cell. Mol. Med. 9 (1): 59-71.]) 당업계에 인정되는 바와 같이, Akt의 인산화는 신경 세포를 포함하는 세포를 독성 및 프로-세포자멸성 자극으로부터 보호하는 주요 요소이다.
이 실시예에서, 1차 신경 세포 및 성상교세포에서 Akt의 인산화를 유도하는 RNS60의 능력은 확인되었다. 추가로, 아팝토시스를 차단하는 RNS60의 능력에서의 Akt의 역할은 입증되었다.
물질 및 방법:
뉴런을 이전에 기재된 바와 같이 단리시키고 배양하였다 (1,2). 성상교세포를 이전에 기재된 바와 같이 단리시키고 배양하였다. 뉴런 또는 성상교세포를 10％ RIS60 또는 IS (대조군으로서 사용됨)로 0', 15', 30', 60', 90', 120', ＆ 180' 동안 처리하고, Akt의 활성화를 포스포-Akt 및 보통 Akt (세포 신호전달)에 대한 항체로의 세포 추출물의 웨스턴 블럿에 의해 모니터링하였다. 총 Akt를 보통 Akt에 대한 항체에 의해 검출하였다. 뉴런 또는 성상교세포를 상이한 투여량 RIS60 (2％, 5％, 10％, ＆ 20％)으로 처리하였다. IS의 상이한 투여량을 대조군으로서 사용하였다. Akt의 활성화를 상기 기재된 바와 같이 모니터링하였다.
도 17a는 1차 뉴런에서 Akt의 인산화를 유도하는 것에 대해 표준 염수 (NS) 대조군과 비교하여 RNS60의 효과를 검사하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. Akt 인산화를 β-튜불린 및 포스포-Akt에 대한 항체를 사용한 이중-표지 면역형광에 의해 모니터링하였다. 베타-튜불린을 뉴런에 대한 마커로서 사용하고, DAPI 염색을 세포의 핵을 가시화하기 위해 사용하였다. 패널 B 및 C는 Akt 인산화는 10％ RNS60에 의해 유도되었으며, 대조군 표준 염수 ("NS")는 효과가 없었다는 것을 나타낸다.
도 17b는 RNS60의 존재 및 부재하에 1차 뉴런에서의 Akt의 억제 효과를 검사하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 섬유성 Aβ1-42 (Bachem Biosciences)는 이전에 기재된 바와 같이 섬유성 형태로 변화하였다 (1,3). 뉴런에서의 인산화된 Akt의 기능을 AktI (칼바이오켐으로부터 수득한 Akt의 특이적 억제제)에 의해 억제하였다. 30분 동안 AktI의 상이한 농도로 예비인큐베이션한 뉴런을 RNS60으로 처리하였다. 1시간의 인큐베이션 후, 세포를 섬유성 Ab1-42으로 검사하였다. 12시간 후, 뉴런 아팝토시스를 TUNEL에 의해 모니터링하고, 24시간 후, 세포 사멸을 이전에 기재된 바와 같이 MTT 및 LDH 방출에 의해 평가하였다 (1,2). 결과 (도 17b)는 Akt 억제제, AktI은 섬유성 Ab-장애가있는 뉴런에 대해 RNS60의 보호적 효과를 없앴다는 것을 나타냈다.
결과는 따라서, RNS60은 Akt가 뉴런을 Ab 독성으로부터 보호하는 것을 요구하는 것을 확인시켰다. 도 18은 표준 염수 (NS) 대조군과 비교하여, 1차 뉴런에서의 Akt의 인산화의 유도에 대해 RNS60의 효과를 검사하는 시간 경과 (0분, 15분, 60분, 및 120분) 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 그래프는 RNS60 또는 표준 염수 중 하나로 처리한 경우 인산화된 Akt의 양 대 성상교세포에 존재하는 Akt의 총 양 사이의 비율을 나타낸다. 도 18에 나타낸 바와 같이, RNS60은 표준 염수 (NS)의 효과에 비교한 경우 성상교세포에서의 Akt 인산화에서 4-배 증가를 유도한다. 따라서, RNS60은 구체적으로 Akt 인산화를 유도한다.
특정 측면에 따라 본원에 기재된 바와 같이, 그리고 임의의 특정 기전에 의해 제한되지 않고, 본 발명의 동전기적 유체는 독소에의 노출에 의해 유도된 아팝토시스의 예방에 의해 신경독소로부터 신경 세포를 보호하기 위한 실질적인 이용을 갖는다.
상기 부분에 인용된 참조 문헌:
1. Jana, A. ＆ Pahan, K. 2004. Fibrillar amyloid-β peptides kill human primary neurons via NADPH oxidase-mediated activation of neutral sphingomyelinase: Implications for Alzheimer's disease. J. Biol. Chem. 279: 51451-51459.
2. Jana, A. ＆ Pahan, K. 2004. HIV-1 gp120 induces apoptosis in human primary neurons through redox-regulated activation of neutral sphingomyelinase. J. Neurosci. 24: 9531-9540.
실시예 14
(표준 염수 (NS)는 아니고, RNS60은 섬유성 1차 뉴런에서의 Aß1-42 펩티드 유도된 tau 인산화를 약화시켰다)
개관. Tau의 과인산화는 뇌 및 뉴런성 조직에서의 매듭의 특징이며, 함께 분류되어 타우패시(taupathies)로 알려진 다수의 질환 중 하나로 이어질 수 있다. 타우패시는 알츠하이머 질환, 아르기오르필릭 그레인(argyorphilic grain) 질환, 이마관자엽 치매, 진행성 핵상 마비, 코르티코기저 퇴행, 이마관자 엽 퇴행 (픽스 질환), 및 권투선수 치매 (DP) (또한, 복서(boxer's) 치매, 만성 복서 뇌병으로도 알려짐)을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
도 19a 내지 19b는 표준 염수 (NS) 대조군과 비교하여 1차 뉴런에서의 섬유성 Aβ(1-42)-매개된 tau 인산화에 대한 RNS60의 효과를 검사하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. tau 인산화를 β-튜불린 및 포스포-tau에 대한 항체를 사용한 이중-표지 면역형광에 의해 모니터링하였다. 베타-튜불린을 뉴런에 대한 마커로서 사용하고, DAPI 염색을 세포의 핵을 가시화하기 위해 사용하였다. "(p)-tau"로 표지된 칼럼의 위에서부터의 제3 및 제4 패널은 Tau 인산화는 RNS60에 의해 투여량-의존성 방식으로 억제되었으며, 대조군 표준 염수 ("NS")는 10％의 고 투여량에서조차 효과가 없었다는 것을 나타낸다 ("(p)-tau"로 표지된 칼럼의 아래 패널을 참조한다.
실시예 15
(신경독소의 존재하에 RNS60의 보호적 효과는 Akt 억제제에 의해 차단되었다)
개관. Akt는 글루코스 대사, 세포 증식, 아팝토시스, 전사 및 세포 이동을 포함하는 다중 세포 절차에서 주요 역할을 하는 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. 특히, Akt는 세포 생존을 조절하는 것으로 알려져 있다. 특히, 인산화된 Akt는 BAD (프로-세포자멸성 단백질)를 불활성화시킴으로써 아팝토시스를 억제하는 것으로 나타났다. (문헌 [Song G, et al., (2005). "The activation of Akt/PKB signaling pathway and cell survival". J. Cell. Mol. Med. 9 (1): 59-71.]을 참조함) 당업계에 인정된 바와 같이, Akt의 인산화는 독성 및 프로-세포자멸성 자극으로부터 신경 세포를 포함하는 세포를 보호하는 주요 요소이다.
실시예 13 및 14는 a) Akt는 1차 뉴런에서 RNS60의 존재하에 인산화되었으며, b) RNS60은 1차 뉴런에서 tau 인산화 유도된 섬유성 Aß1-42 펩티드를 약화시켰다는 것을 나타냈다. 이 실시예에 개시된 실험은 신경독소의 존재하에 RNS60의 보호적 효과는 Akt 억제제에 의해 차단될 수 있다는 것을 확인시켰다. 따라서 이 실시예는 RNS60은 Akt가 Aβ 독성으로부터 뉴런을 보호하는 것을 요구하는 것을확인시켰다.
뉴런 또는 성상교세포를 이전에 기재된 바와 같이 단리시키고 배양하였다 (1,2). 뉴런 또는 성상교세포를 10％ RIS60 또는 IS (대조군으로서 사용됨)로 0', 15', 30', 60', 90', 120', ＆ 180' 동안 처리하고, Akt의 활성화를 포스포-Akt 및 보통 Akt (세포 신호전달)에 대한 항체로의 세포 추출물의 웨스턴 블롯에 의해 모니터링하였다. 총 Akt를 보통 Akt에 대한 항체에 의해 검출하였다. 뉴런 또는 성상교세포를 RNS60 (2％, 5％, 10％, ＆ 20％)의 증가하는 투여량으로 처리하였다. NS의 상이한 투여량을 대조군으로서 사용하였다. 상기 기재된 바와 같이 Akt의 활성화를 모니터링하였다.
섬유성 Aβ1-42 (바켐 바이오사이언스)를 이전에 기재된 바와 같이 섬유성 형태로 변화시켰다 (1,3). 뉴런에서의 인산화된 Akt의 기능을 AktI (칼바이오켐으로부터 수득한 Akt의 특이적 억제제)에 의해 억제하였다.
상이한 농도의 AktI로 30분 동안 예비인큐베이션한 뉴런을 RNS60으로 처리하였다. 인큐베이션 1시간 후, 세포를 섬유성 Aβ1-42로 검사하였다. 12시간 후, 뉴런 아팝토시스를 TUNEL에 의해 모니터링하고, 24시간 후, 이전에 기재된 바와 같이 세포 사멸을 MTT 및 LDH 방출에 의해 평가하였다 (1,2).
결과는 Akt 억제제, AktI는 섬유성 Aβ-장애가있는 뉴런에 대한 RNS60의 보호적 효과를 없앴다는 것을 나타냈다. 따라서, 결과는 RNS60은 Akt가 Aβ 독성으로부터 뉴런을 보호하는 것을 요구하는 것을 확인시켰다.
상기 부분에 인용된 참조 문헌:
1. Jana, A. ＆ Pahan, K. 2004. Fibrillar amyloid-β peptides kill human primary neurons via NADPH oxidase-mediated activation of neutral sphingomyelinase: Implications for Alzheimer's disease. J. Biol. Chem. 279: 51451-51459.
2. Jana, A. ＆ Pahan, K. 2004. HIV-1 gp120 induces apoptosis in human primary neurons through redox-regulated activation of neutral sphingomyelinase. J. Neurosci. 24: 9531-9540.
3. Jana, M. ＆ Pahan, K. 2008. Fibrillar amyloid-β peptides activate microglia via toll-like receptor 2: Implications for Alzheimer's disease. J. Immunol. 181: 7254-7262.
실시예 16
(신경독소의 존재하에 RNS60의 보호적 효과는 PI-3 키나제 억제제에 의해 차단되었다)
개관. PI-3 키나제는 세포 성장, 증식, 분화, 운동, 생존 및 세포내 수송을 포함하는 다중 세포 절차에서 주요 역할을 한다. 추가로, PI 3-키나제는 또한 인슐린 신호전달 경로의 주요 성분이다. 특히, PI-3 키나제는 인산화시키는 것으로 알려져 있으며, 따라서, 독성 및 프로-세포자멸성 자극으로부터 신경 세포를 포함하는 세포를 보호하는 주요 요소인 Akt를 활성화시킨다.
본원의 상기 실시예 13 및 15는 a) Akt는 1차 뉴런에서 RNS60의 존재하에 인산화되었으며; b) 신경독소로부터의 RNS60-매개된 보호는 Akt 억제제에 의해 차단될 수 있다는 것을 나타냈다. 이 실시예는 추가로 신경독소 유도된 아팝토시스로부터의 RNS60-매개된 보호는 PI-3 키나제 경로를 요구하는 것을 입증한다.
도 20은 PI-3 키나제 억제제로 처리된 인간 1차 뉴런에 대한 RNS60의 효과를 검사하는 실험으로부터의 결과를 나타낸다. 인간 1차 뉴런을 이전에 기재된 바와 같이 단리시키고 배양하였다 (1,2). 섬유성 Aβ1-42 (바켐 바이오사이언스)를 이전에 기재된 바와 같이 섬유성 형태로 변화시켰다 (1,3). 뉴런에서의 PI-3 키나제의 기능을 LY294002에 의해 억제하였다 (에노진(Enogene)으로부터 수득한 PI-3 키나제의 특이적 억제제).
2 μm LY294002로 예비인큐베이션된 뉴런을 RNS60으로 처리하였다. 1시간의 인큐베이션 후, 세포를 섬유성 Aβ1-42로 검사하였다. 12시간 후, 뉴런 아팝토시스를 TUNEL에 의해 모니터링하고, 24시간 후, 세포 사멸을 이전에 기재된 바와 같이 MTT 및 LDH 방출에 의해 평가하였다 (1,2).
결과는 PI-3 키나제 억제제, LY294002는 섬유성 Aβ-장애가있는 뉴런에 대한 RNS60의 보호적 효과를 없앴다는 것을 나타냈다. 따라서, 결과는 RNS60은 PI-3 키나제가 Aβ 독성으로부터 뉴런을 보호하는 것을 요구하는 것을 입증하였다.
특정 실시양태에 따라, 따라서, 그리고 도 21에 도식적으로 나타낸 바와 같이, 뉴런에서, RNS60은 막 효과를 통해 PI-3 키나제를 활성화시킨다 (예를 들면, 이온 채널(들)의 조절, 그리고 이어서 Akt의 인산화 및 활성화에 의해). 인산화된 Akt는 이어서 뉴런성 세포의 신경독소-매개된 아팝토시스를 차단시킨다.
참조로 도입. 이 명세서에 기재되고/되거나 적용 데이터 시트에 나열된 상기 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 발행, 미국 특허 출원, 해외 특허, 해외 특허 출원 및 비-특허 발행은 그 전문이 본원에 참조로 도입된다.
본원의 도면 및 상세한 설명은 제한적 방식보다는 설명적으로 여겨져야 한다는 것이 이해되어야 하며, 본 발명을 특정 형태 및 개시된 실시예에 제한시킬 의도는 없다. 이와 달리, 본 발명은 본 발명의 목적 및 범주로부터 벗어나지 않고 다음 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같이 임의의 추가로 변형, 변화, 재구성, 대체, 대안, 설계 선택, 및 당업자에게 명백한 실시양태를 포함한다. 따라서, 다음 특허청구범위는 모든 상기 추가의 변형, 변화, 재구성, 대체, 대안, 설계 선택, 및 실시양태를 포함하는 것으로 해석될 것이 의도된다.
상기 기재된 실시양태는 상이한 다른 성분 내에 함유되거나, 또는 상이한 다른 성분과 연결된 상이한 성분을 묘사한다. 상기 묘사된 구성은 단지 예시적이며, 동일한 기능성을 달성하는 많은 다른 구성이 시행될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 개념적인 의미에서, 동일한 기능성을 달성하기 위한 성분의 임의의 구성은 원하는 기능성이 달성되도록 효과적으로 "연관"되어 있다. 따라서, 특정 기능성을 달성하기 위해 합해진 본원의 임의의 2개 성분은 구성 또는 중간 성분에 불구하고 원하는 기능성이 달성 되도록 서로 "연관"되었다고 볼 수 있다. 마찬가지로, 연관된 임의의 2개 성분은 또한 원하는 기능성을 달성하기 위해 서로 "실시적으로 연결"되거나, 또는 "실시적으로 커플링"되었다고 볼 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태가 나타내고 기재되었지만, 본원의 교시를 기반으로, 본 발명 및 그의 더 넓은 측면을 벗어나지 않고 변화 및 변형이 수행될 수 있으며, 따라서, 부착된 특허청구범위는 그의 범주 내에 본 발명의 참 목적 및 범주 내의 모든 상기 변화 및 변형을 포함해야 한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 추가로, 본 발명은 단지 부착된 특허청구범위에 의해 정의되어야 한다는 것이 이해되어야 한다. 일반적으로, 본원, 및 특별히 부착된 특허청구범위 (예를 들면, 부착된 특허청구범위의 바디)에 사용된 용어는 일반적으로 "열린" 용어 (예를 들면, 용어 "포함하는"은 "포함하나 이들로 제한되지는 않는,"으로 해석되어야 하며, 용어 "갖는"은 "이상을 갖는,"으로 해석되어야 하며, 용어 "포함하는(includes)"은 "포함하나 이들로 제한되지는 않는," 등으로 해석되어야 함)로 의도되는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 추가로 특정 수의 도입된 특허청구범위 인용이 의도된 경우, 이러한 의도는 명백히 특허청구범위에 인용될 것이고, 이러한 인용이 없는 경우 이러한 의도는 존재하지 않는다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들면, 이해의 도움으로서, 다음 부착된 특허청구범위는 특허청구범위 인용을 도입하기 위해 도입 구절 "하나 이상의" 및 "하나 이상의"의 사용을 함유할 수 있다. 그러나, 상기 구절의 사용은 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 특허청구범위 인용의 도입은, 동일한 특허청구범위가 도입 구절 "하나 이상의" 또는 "하나 이상의" 및 부정 관사, 예를 들면 "a" 또는 "an" (예를 들면, "a" 및/또는 "an"은 전형적으로 "하나 이상의" 또는 "하나 이상의"를 의미하도록 해석되어야 함)을 포함하는 경우에 조차 상기 도입된 특허청구범위 인용을 함유하는 임의의 특정 특허청구범위를 하나의 상기 인용만을 함유하는 발명으로 제한하는 것을 암시하는 것으로 해석되어서는 안되며; 특허청구범위 인용을 도입하기 위해 사용된 정 관사의 사용에 대해서도 동일하게 적용된다. 추가로, 심지어 특정 수의 도입된 특허청구범위 인용이 명백히 인용된 경우, 당업자는 상기 인용은 전형적으로 적어도 인용된 수를 의미도록 해석되어야 한다는 것을 인정할 것이다 (예를 들면, 다른 변형자 없이 "2개 인용,"의 기본 인용은 전형적으로 2개 이상의 인용, 또는 2개 이상의 인용을 의미함). 따라서, 본 발명은 부착된 특허청구범위에 의한 것을 제외하면 제한되지 않는다.

Claims (56)

  1. 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이며 이온성 수성 유체에 안정하게 배열된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 이온성 수용액을 포함하는 치료 유효량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를, 신경독성제로부터의 신경보호를 제공하기에 충분한 양으로 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경독성제에의 노출로 인한 신경독성으로부터 보호하거나 상기 신경독성을 감소시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 신경독소에 노출된 대상체에서의 운동 협응의 상실로부터 보호하거나 상기 상실을 감소시키는 것을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 신경독소-매개된 뉴런 아팝토시스의 보호 또는 감소를 제공하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 대상체의 뉴런에서 PI-3 키나제 및 Akt 인산화 중 하나 이상을 활성화시키거나 유도하는 것을 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체가, 이온성 수성 유체에 의한 생존 세포 접촉시 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절을 제공하기에 충분한 양으로 상기 유체에 안정하게 배열된 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 유체의 투여가 신경독성제에의 노출 전 유체의 투여를 포함하는 것인 방법.
  7. 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체가 유체 중 주요한 전하-안정화된 가스-함유 나노구조체 종인 제1항의 동전기적 유체.
  8. 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체로서 유체 중에 존재하는 용존 산소 분자의 백분율이 0.01％, 0.1％, 1％, 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％ 및 95％ 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율인 제1항의 동전기적 유체.
  9. 전체 용존 산소가 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체에 실질적으로 존재하는 것인 제1항의 동전기적 유체.
  10. 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 평균 직경이 실질적으로 90 nm, 80 nm, 70 nm, 60 nm, 50 nm, 40 nm, 30 nm, 20 nm, 10 nm 및 5 nm 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 크기 미만인 제1항의 동전기적 유체.
  11. 이온성 수용액이 염수 용액을 포함하는 것인 제1항의 동전기적 유체.
  12. 슈퍼산소화된 제1항의 동전기적 유체.
  13. 용매화 전자의 형태를 포함하는 제1항의 동전기적 유체.
  14. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 변경이 수력학적으로 유도된 국부화 동전기적 효과에 대한 유체의 노출을 포함하는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 국부화 동전기적 효과에 대한 노출이 전압 펄스 및 전류 펄스 중 하나 이상에 대한 노출을 포함하는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 수력학적으로 유도된 국부화 동전기적 효과에 대한 유체의 노출이 유체를 생성하는데 사용된 장치의 구조적 특징을 유도하는 동전기적 효과에 대한 유체의 노출을 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산화질소의 국부화 수준 또는 세포 수준을 조절하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 IL-1베타, IL-8, TNF-알파 및 TNF-베타로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시토킨의 투여 부위에서 국부화 감소를 촉진하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제가 환자에게 투여되는 조합 요법을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제가 아드레날린성 신경독소, 콜린성 신경독소, 도파민성 신경독소, 흥분독소 및 화학치료제로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  21. 제5항에 있어서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절이, 막 관련 단백질의 형태, 리간드 결합 활성 또는 촉매 활성 중 하나 이상의 조절을 포함하는 세포막 구조 또는 기능 중 하나 이상의 조절을 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 막 관련 단백질이 수용체, 횡단막 수용체, 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 접착 단백질 및 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 횡단막 수용체가 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)를 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)가 G 단백질 α 서브유닛과 상호작용하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, G 단백질 α 서브유닛이 Gαs, Gαi, Gαq 및 Gα12로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 하나 이상의 G 단백질 α 서브유닛이 Gαq인 방법.
  27. 제5항에 있어서, 세포막 전도성의 조절이 전세포 전도도 (conductance)의 조절을 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 전세포 전도도의 조절이 전세포 전도도의 하나 이상의 전압-의존성 기여의 조절을 포함하는 것인 방법.
  29. 제5항에 있어서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절이 칼슘 의존성 세포 메세징 경로 또는 시스템의 조절을 포함하는 세포내 신호 전달의 조절을 포함하는 것인 방법.
  30. 제5항에 있어서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절이 포스포리파제 C 활성의 조절을 포함하는 세포내 신호 전달의 조절을 포함하는 것인 방법.
  31. 제5항에 있어서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절이 아데닐레이트 사이클라제 (AC) 활성의 조절을 포함하는 세포내 신호 전달의 조절을 포함하는 것인 방법.
  32. 제5항에 있어서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절이 중추 신경 및 뇌의 만성 염증, 및 중추 신경 및 뇌의 급성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태 또는 증상과 관련된 세포내 신호 전달의 조절을 포함하는 것인 방법.
  33. 제1항에 있어서, 세포망 또는 세포층에의 투여를 포함하고, 그 내부의 세포간 연접의 조절을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 세포내 연접이 밀착 연접, 갭 연접, 접착대 (zona adherin) 및 데스모좀 (desmosome)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  35. 제33항에 있어서, 세포망 또는 세포층이 중추신경계 (CNS) 혈관에서의 내피 세포 및 내피-성상교세포 밀착 연접, 혈액-뇌척수액 밀착 연접 또는 장벽, 폐 상피-유형 연접, 기관지 상피-유형 연접 및 장 상피-유형 연접으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  36. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산소화되고, 유체 중의 산소가 대기압에서 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상 또는 60 ppm 이상의 산소의 양으로 존재하는 것인 방법.
  37. 제1항에 있어서, 동전기적으로-변경된 유체의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체 중에 존재하는 산소의 양이 대기압에서 산소 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상 또는 60 ppm 이상인 방법.
  38. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 용매화 전자의 형태 또는 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 용매화 전자의 형태 및 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종이 0.01 ppm 이상, 0.1 ppm 이상, 0.5 ppm 이상, 1 ppm 이상, 3 ppm 이상, 5 ppm 이상, 7 ppm 이상, 10 ppm 이상, 15 ppm 이상 또는 20 ppm 이상의 양으로 존재하는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체가 산소 분자에 의해 적어도 부분적으로 안정화된 용매화 전자를 포함하는 것인 방법.
  41. 제5항에 있어서, 세포막 포텐셜 및 세포막 전도성 중 하나 이상의 조절 능력이 밀폐된 가스-조밀 용기에서 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상 또는 이보다 긴 기간 동안 지속되는 것인 방법.
  42. 제21항에 있어서, 막 관련 단백질이 CCR3을 포함하는 것인 방법.
  43. 제1항에 있어서, 치료가 국소, 흡입, 비내, 구강 및 정맥 중 하나 이상에 의한 투여를 포함하는 것인 방법.
  44. 제1항에 있어서, 동전기적으로-변경된 유체의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체가 본원에 개시된 표 1 및 2에서의 하나 이상의 염 또는 이온을 포함하는 것인 방법.
  45. 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이며 이온성 수성 유체에 안정하게 배열된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 이온성 수용액을 포함하는 동전기적으로 변경된 수성 유체를, 신경독성제에의 노출로 인한 신경독성으로부터 보호하거나 상기 신경독성을 감소시키기에 충분한 양으로 포함하는 제약 조성물.
  46. 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이며 이온성 수성 유체에 안정하게 배열된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조체의 이온성 수용액을 포함하는 치료 유효량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를, 운동 협응의 상실을 특징으로 하는 신경퇴행성 상태 또는 질환을 갖는 대상체에서의 운동 협응을 보존하거나 개선하기에 충분한 양으로 상기 신경퇴행성 상태 또는 질환을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경퇴행성 상태 또는 질환을 갖는 대상체에서의 운동 협응을 보존하거나 개선하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, PI-3 키나제 및 Akt 인산화 중 하나 이상의 활성화 또는 유도를 포함하는 방법.
  48. 제46항에 있어서, 신경퇴행성 상태 또는 질환이 포유동물에서의 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 뇌졸중/뇌 허혈, 두부 외상, 척수 손상, 헌팅톤 질환, 편두통, 뇌 아밀로이드 맥관병증, AIDS 관련 염증성 신경퇴행성 상태, 나이 관련 인지 저하, 경도 인지 장애 및 프리온 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염증성 신경퇴행성 상태 또는 질환을 포함하는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 염증성 신경퇴행성 상태 또는 질환이 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머 질환 및 파킨슨 질환 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  50. 제46항에 있어서, 대상체를 또다른 소염제로 동시에 또는 보조적으로 치료하는 것에 의한 염증의 상승작용적 또는 비상승작용적 억제 또는 감소를 추가로 포함하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 또다른 소염제가 스테로이드 또는 글루코코르티코이드 스테로이드를 포함하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 글루코코르티코이드 스테로이드가 부데소니드 또는 이의 활성 유도체를 포함하는 것인 방법.
  53. 제46항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제가 환자에게 투여되는 조합 요법을 추가로 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제가 글라티라머 아세테이트, 인터페론-β, 미톡산트론, 나탈리주맙, MMP-9 및 MMP-2의 억제제를 포함한 MMP의 억제제, 단기작용성 β2-효능제, 장기작용성 β2-효능제, 항콜린제, 코르티코스테로이드, 전신성 코르티코스테로이드, 비만 세포 안정화제, 류코트리엔 변형제, 메틸크산틴, β2-효능제, 알부테롤, 레발부테롤, 퍼부테롤, 아트포모테롤, 포모테롤, 살메테롤, 이프라트로피움 및 티오트로피움을 포함한 항콜린제; 베클로메타손, 부데소니드, 플루니솔리드, 플루티카손, 모메타손, 트리암시놀론, 메티프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손을 포함한 코르티코스테로이드; 몬텔루카스트, 자피를루카스트 및 질류톤을 포함한 류코트리엔 변형제; 크로몰린 및 네도클로밀을 포함한 비만 세포 안정화제; 테오필린을 포함한 메틸크산틴; 이프라트로피움과 알부테롤, 플루티카손과 살메테롤, 부데소니드와 포모테롤을 포함한 조합 약물; 히드록시진, 디펜히드라민, 로라타딘, 세티리진 및 히드로코르티손을 포함한 항히스타민; 타크로리무스 및 피메크로리무스를 포함한 면역계 조절 약물; 시클로스포린; 아자티오프린; 미코페놀라테모페틸; 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제가 TSLP 및/또는 TSLPR 길항제인 방법.
  56. 제55항에 있어서, TSLP 및/또는 TSLPR 길항제가 TSLP 및 TSLP 수용체에 특이적인 중화 항체, 가용성 TSLP 수용체 분자, 및 1개 초과의 수용체 쇄 성분을 코딩하는 TSLPR-이뮤노글로불린 Fc 분자 또는 폴리펩티드를 포함한 TSLP 수용체 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
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