CN103347493A - 用于治疗心血管疾病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗心血管疾病和相关病症及症状(如，心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄)的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的电动改变的水性流体。在特定方面，所述电动改变的水性流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构主要具有小于约100纳米的平均直径，并足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节。本发明提供了电动改变的流体(如，电动改变的富含气体的流体和溶液)和治疗性组合物的施用途径或制剂，以及所述电动改变的水性流体在包括但不限于心血管相关手术的手术环境下的用途。本发明另外提供了用于测量电动改变的流体的生物活性的方法。

Description

用于治疗心血管疾病的组合物和方法
发明领域
特定的方面整体涉及治疗心血管疾病和相关病症及其症状(如，心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄中的至少一种)的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的电动改变的水性流体。某些方面涉及电动改变的水性流体的用途，所述流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并在离子水性流体中以在流体与活细胞接触时足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节的量稳定成形。进一步的方面涉及测量电动改变的流体的活性的方法。
发明背景
心血管疾病是一大类涉及心脏或血管(动脉和静脉)的疾病。心血管疾病包括但不限于心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄。这些病症具有相似的病因、机理和治疗措施。大多数心血管疾病具有共同的危险因素，包括炎症、高胆固醇和肥胖。
另外，有许多心血管手术过程要用到盐水溶液并期望减少或消除手术过程伴随的有害影响，这些手术过程例如心肺分流术(CPB)预充(分流泵预充液)(其中全身性炎性反应导致CPB的有害影响)；静脉保存液(通常为罂粟碱和盐水)、停搏液(如，含谷氨酸盐和/或天冬氨酸盐的停搏液，其还可以含有钾)可在完成移植后冲洗受益于盐水溶液的使用的冠状动脉。
发明概述
本发明提供了治疗心血管疾病和相关病症及其症状(如，选自心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄的至少一种病症或疾病)的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的电动改变的水性流体。在特定方面，该电动改变的水性流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构基本上(例如，主要)具有小于约100纳米的平均直径，并足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节。本发明另外提供了电动改变的流体(如，电动改变的富含气体的流体和溶液)和治疗性组合物的施用途径或制剂，以及电动改变的水性流体在包括但不限于心血管相关手术的手术环境下的用途。
特定的方面提供用于治疗心血管疾病或病症的方法，包括向对其有需要的受试者或其部分施用治疗有效量的电动改变的水性流体，所述流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构基本上(例如，主要)具有小于约100纳米的平均直径并在离子水性流体中以足以治疗心血管疾病或病症或其至少一种症状的量稳定成形。在某些方面，电荷稳定的含氧纳米结构稳定成形在离子水性流体中，其量在流体与活细胞接触时足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节。
在特定实施方案中，电荷稳定的含氧纳米结构是流体中主要的电荷稳定的含气体纳米结构物种。在特定方面，作为电荷稳定的含氧纳米结构存在于流体中的溶解氧分子的百分比为选自大于以下值的百分比：0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％。在特定方面，总溶解氧基本上以电荷稳定的含氧纳米结构存在。在某些实施方案中，电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有低于选自以下值的尺寸的平均直径：90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm，以及低于5nm。
在优选的实施方案中，离子水性溶液包括盐水溶液。在某些实施方案中，该流体为超氧合的。
在特定方面，该流体包括溶剂化电子的形式。
在某些方面，电动改变的水性流体的改变包括将流体暴露于流体动力引起的局部电动效应。在特定实施方案中，暴露于局部电动效应包括暴露于电压脉冲和电流脉冲中的至少一种。在特定实施方案中，将流体暴露于流体动力引起的局部电动效应包括将流体暴露于用于产生所述流体的装置的电动效应引起的结构特征。
在某些实施方案中，心血管疾病或病症包括选自心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄的至少一种病症或疾病。在特定实施方案中，心血管病症或疾病包括心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎和动脉粥样硬化中的至少一种。在优选的方面，心血管病症或疾病包括心肌梗死和动脉粥样硬化中的至少一种。
在特定方面，心血管疾病的至少一种症状与选自以下的至少一种病症相关：心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄。
在某些方面，电动改变的水性流体调节一氧化氮的局部或分子水平。
在特定方面，电动改变的水性流体促进施用部位的选自以下的至少一种细胞因子的局部降低：IL-1β、IL-8、TNF-α和TNF-β。
特定的方面进一步包括通过用另一种抗炎剂同时地或附加地治疗受试者而协同或非协同地抑制或减轻炎症。在某些实施方案中，所述其他抗炎剂包括类固醇或糖皮质类固醇(例如，包括布地奈德或其活性衍生物)。
特定的方面进一步包括联合治疗，其中将至少一种另外的治疗剂施用给患者。在某些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂选自：奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮、莫雷西嗪、普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆、E-4031、维拉帕米、地尔硫卓、腺苷、地高辛、硫酸镁、华法令、肝素、抗血小板药物(例如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(例如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(例如依普利酮和螺甾内酯)、毛地黄、利尿剂、地高辛、正性肌力药物(例如米力农)、血管扩张剂和ω-3脂肪酸以及它们的组合。
在某些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂包括TSLP和/或TSLPR拮抗剂。在特定方面，TSLP和/或TSLPR拮抗剂选自：TSLP和TSLP受体的特异性中和抗体、可溶性TSLP受体分子以及TSLP受体融合蛋白，包括编码不止一条受体链的组分的TSLPR-免疫球蛋白Fc分子或多肽。
在特定方面，调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种包括调节细胞膜结构或功能中的至少一种，所述调节细胞膜结构或功能中的至少一种包括调节膜相关蛋白的构象、配体结合活性或催化活性。在某些实施方案中，膜相关蛋白包括选自以下的至少一种：受体、跨膜受体、离子通道蛋白、细胞内附着蛋白、细胞粘附蛋白、整合素等。在特定方面，跨膜受体包括G蛋白偶联受体(GPCR)。在某些实施方案中，G蛋白偶联受体(GPCR)与G蛋白α亚基相互作用。在特定方面，G蛋白α亚基包括选自以下的至少一者：Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。在某些实施方案中，所述至少一种G蛋白α亚基为Gαq。
在特定方面，调节细胞膜电导率包括调节全细胞电导。在某些实施方案中，调节全细胞电导包括调节全细胞电导的至少一种电压依赖性贡献因素。
在某些方面，细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节钙依赖性细胞信息传递途径或系统。在某些方面，细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节磷脂酶C活性。在某些方面，细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节腺苷酸环化酶(AC)活性。在某些方面，细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节包括调节细胞内信号转导，包括调节与选自以下的至少一种病症或症状相关的细胞内信号转导：心血管系统中的慢性炎症，以及心血管系统中的急性炎症。
在特定方面，该方法包括施用到细胞网络或细胞层，并进一步包括调节其中的细胞间连接。在某些实施方案中，细胞内连接包括选自紧密连接、间隙连接、黏附区和桥粒的至少一种。在特定实施方案中，细胞网络或细胞层包括选自以下的至少一种：中枢神经系统脉管中的内皮细胞和内皮-星形胶质细胞紧密连接，血液-脑脊髓液紧密连接或屏障，肺上皮型连接，支气管上皮型连接以及肠上皮型连接。
在特定方面，电动改变的水性流体为氧合的，并且其中在大气压下氧在流体中的氧以至少8ppm、至少15，ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧的量存在。在某些方面，在大气压下以电动改变的流体的电荷稳定的含氧纳米结构存在的氧的量为至少8ppm、至少15ppm、至少20ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。
在某些方面，电动改变的水性流体包含溶剂化电子形式以及电动改性或荷电的氧物种中的至少一种。在特定实施方案中，溶剂化电子形式或电动改性或荷电的氧物种的含量为至少0.01ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少3ppm、至少5ppm、至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm或至少20ppm。在特定实施方案中，电动改变的氧合水性流体包含至少部分地通过分子氧稳定的溶剂化电子。
在特定方面，改变细胞膜结构或功能足以提供细胞内信号转导调节的能力在密闭气密性容器中持续至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少6个月、至少12个月或更长的时间。
在某些方面，膜相关蛋白包括CCR3。
在特定方面，治疗包括调节细胞内NF-κB表达和/或活性。
在优选的方面，受试者为哺乳动物或人。
特定的方面提供执行手术的方法，包括对其有需要的受试者执行手术，其中将试剂流体用于手术的至少一个方面，并且其中该试剂流体包含手术有效量的电动改变的水性流体，所述流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径。
在特定方面，该手术包括选自以下的至少一种：与心律失常相关的手术；与血管疾病相关的手术；与心肌梗死相关的手术；与充血性心力衰竭相关的手术；与心肌炎相关的手术；与动脉粥样硬化和再狭窄相关的手术；包括使用心肺分流术(CPB)的手术；包括使用血管(例如静脉、动脉)保存液的手术；以及包括使用停搏液的手术。
另外的方面提供简便高通量测量电动改变的流体(如RNS60)生物活性的方法，包括：使细胞与本文所定义的电动改变的流体接触；使用合适的测定法执行离子通道测量；以及基于相对于与对照流体接触的细胞的离子通道测量确定电动改变的流体的生物活性水平或值。在某些实施方案中，该离子通道测量为选自以下的至少一者：门控动力学、电压敏感性的增强、抑制、改变，以及激动剂诱发活性的调节。在特定方面，该离子通道为5HT3A和TRPV1中的至少一者。在某些实施方案中，该方法包括测量血清素诱发的5HT3A和辣椒碱诱发的TRPV1中的至少一者。
进一步的方面提供测量电动改变的流体(如RNS60)生物活性的简便高通量方法，包括：使细胞与本文所定义的电动改变的流体接触；执行拉曼光谱和荧光偏振各向异性测量中的至少一种；以及基于相对于与对照流体接触的细胞的所述至少一种测量确定电动改变的流体的生物活性水平或值。在某些实施方案中，该方法包括测量拉曼后向散射和荧光偏振各向异性中的至少一者。
附图简述
图1示出了在存在富含气体的流体和去离子对照流体的情况下促有丝分裂测定的细胞因子谱。
图2-11显示了全血样品细胞因子评估的结果。
图12-21显示了支气管肺泡灌洗液(BAL)样品评价的相应细胞因子结果。
图22-29显示了表明本文所公开的特定实施方案能够影响调节性T细胞的数据。研究涉及照射抗原呈递细胞并引入抗原和T细胞。
图30-34显示了从暴露于RDC1676-01(通过本发明的专有装置处理的添加了另外的氧的无菌盐水；富含气体的电动产生的流体(Rev))的人包皮角质形成细胞获得的数据。
图35-38显示了与本发明的电动产生的流体相结合的布地奈德实验的结果，实验的开展是为了评价本发明的电动产生的流体在棕色挪威大鼠卵清蛋白致敏模型中的气道抗炎性质。本发明的电动产生的流体降低了嗜酸性粒细胞计数，显示了与布地奈德在降低嗜酸性粒细胞计数方面的强协同作用，降低了嗜酸性粒细胞活化趋化因子的血液水平，在挑战后6小时因单独的或与布地奈德相结合的本发明的电动产生的流体(例如RNS-60)的处理明显提高了两种关键抗炎细胞因子IL10和干扰素γ的血液水平，以及降低了受激活调节正常T细胞表达和分泌因子(Rantes)的全身水平。
图39显示了本发明的电动产生的流体(如RNS-60和Solas)抑制了支气管上皮细胞中DEP诱导的细胞表面结合MMP-9水平，抑制幅度分别达约80％和70％、而生理盐水(NS)只具有轻微的影响。
图40A-B展示了荧光活化细胞分选(FACS)分析的结果，其中使用生理盐水或RNS-60对白血球上的细胞表面受体CD193(CCR3)的表达水平进行了比较。X轴代表样品的荧光对数值，Y轴代表样品中发生的荧光事件。
图41A-C展示了荧光活化细胞分选(FACS)分析的结果，其中使用生理盐水或RNS-60对白血球上的细胞表面受体CD154(CD40L)(图A)、CD11B(图B)和CD3(图C)的表达水平进行了比较。X轴代表样品的荧光对数值，Y轴代表样品中发生的荧光事件。
图42A-C显示了两个凝胶迁移实验(图A和图B)和荧光素酶活性(报告基因)测定(图C)的结果，它们检查了RNS60对MBP初免T细胞中NFκB活化的作用。
图43A-D是诱导心肌梗死后肌钙蛋白(图A和图B)和磷酸肌酸激酶(CPK)(图C和图D)的血液水平时间过程的图示。
图44A-I根据特定的方面显示了存在于对照处理雄性动物(#3033)中的坏死组织的实例。
图45A和B根据特定的方面显示了提高的温度(热)相对于对照PNS60(45A)而言对RNS60(45B)的影响(通过拉曼后向散射测量)，图中显示了相应的差异曲线和两个氧气峰。
图46根据特定的方面显示了在“RNS60”(“批次A”和“批次B”)、“NS”(生理盐水对照)、“RDW”(电动处理的去离子水)和“DW”(去离子水)之间和之中荧光偏振各向异性数据小但明显的差异。
图47根据特定的方面显示了细胞外灌注的RNS60(89％)增强了血清素诱发的5HT3A(离子通道)活性(-101.8±24.2％的平均抑制(n＝3)，相对于对照)。
图48根据特定的方面显示了RNS60(84％)抑制了辣椒碱诱发的TRPV1(离子通道)电流(-90.9±6.7％的平均抑制(n＝3))。比较在生理盐水、100nm辣椒碱与100nm辣椒碱+87％RNS60之间进行。
图49根据特定的方面显示了RNS60灌注改变了心肌细胞中的电尖峰信号；V斜坡，-100mV→+40mV；ΔV尖峰，1.67±.47mV；Δt尖 峰，5.951.67ms(n＝6)。不受机理的束缚，尖峰信号的延迟可能是由于与Nav1.5的相互作用。
发明详述
本发明提供了治疗心血管疾病和相关病症及其症状(如，选自心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄的至少一种病症或疾病)的方法，包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所述的电动改变的水性流体。在特定方面，该电动改变的水性流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并在离子水性流体中以在流体与活细胞接触时足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节的量稳定成形。其他实施方案包括电动改变的流体(如，电动改变的富含气体的流体和溶液)和治疗性组合物的特定施用途径或制剂。
电动产生的流体：
如本文所用的“电动产生的流体”是指申请人的发明性电动产生的流体，其出于本文工作实施例的目的通过本文详细描述的示例性混合装置而产生(另见US200802190088和WO2008/052143，均以引用方式全文并入本文)。如本文所公开和展示的数据所表明，该电动流体代表了新型且与现有技术非电动流体根本性不同的流体，包括相对于现有技术的氧合非电动流体(例如，压力罐氧合流体等等)。如本文的各方面所公开，该电动产生的流体具有独特新颖的物理和生物学性质，包括但不限于以下方面：
在特定方面，该电动改变的水性流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并在离子水性流体中以在流体与活细胞接触时足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节的量稳定成形。
在特定方面，电动产生的流体是指在存在流体动力引起的局部(相对于整个流体体积不均匀的)电动效应(如，电压/电流脉冲)，诸如本文所述的装置特征局部效应下产生的流体。在特定方面，所述流体动力引起的局部电动效应与如本文所公开和论述的表面相关双层和/或流动电流效应相结合。
在特定方面，该电动改变的水性流体适于调节溶于其中的报告溶质(如海藻糖)的13C-NMR线宽。NMR线宽效应存在于如本文、尤其是工作实施例中所述的测试流体中测量(例如)的溶质“翻滚”(tumbling)的间接方法中。
在特定方面，该电动改变的水性流体特征在于以下至少一种：在-0.14V、-0.47V、-1.02V和-1.36V任一者下存在区别性的方波伏安法峰差异；在-0.9伏特下存在极谱峰；以及在-0.19和-0.3伏特下不存在极谱峰，这是本文、尤其是工作实施例中所公开的电动产生的流体所特有。
在特定方面，该电动改变的水性流体适于改变细胞膜电导率(如，在本文所公开的膜片钳研究中测量的全细胞电导的电压依赖性贡献因素)。
在特定方面，该电动改变的水性流体为氧合的，其中在大气压下在流体中的氧以至少15，ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧的量存在。在特定方面，该电动改变的水性流体在大气压下具有低于15ppm、低于10ppm的溶解氧或大约为环境氧水平。
在特定方面，该电动改变的水性流体为氧合的，其中在流体中的氧以介于约8ppm和约15ppm之间的量存在，在这种情况下本文有时称为“Solas”。
在特定方面，该电动改变的水性流体包含溶剂化电子(如，通过分子氧稳定的)和电动改性和/或荷电的氧物种中的至少一种，并且其中在某些实施方案中，该溶剂化电子和/或电动改性或荷电的氧物种以至少0.01ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少3ppm、至少5ppm、至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm或至少20ppm的量存在。
在特定方面，该电动改变的水性流体的特征在于相对于对照非电动改变的流体具有差异(增加或降低的)电容率。在优选的方面，该电动改变的水性流体的特征在于相对于对照非电动改变的流体具有差异、增加的电容率。电容率(ε)(法拉/米)是材料被电场极化并因此减弱材料内部总电场的能力的度量。因此，电容率涉及材料传播(或“允许”)电场的能力。电容(C)(法拉；库仑每伏特)这一紧密相关的性质是在向材料(例如，最佳模型为夹在两平行导电板之间的介电层)两端施加电压时材料保持电荷的能力。如果在电容为C的电容器两端施加电压V，则电容器可保持的电荷Q与施加的电压V成正比，而电容C为比例常数。因此，Q＝CV或C＝Q/V。电容器的电容取决于介电层的电容率ε以及电容器的面积A和两导电板之间的间距d。电容率和电容的数学相关式如下：C＝ε(A/d)。当所用的电介质为真空时，则电容Co＝εo(A/d)，其中εo为真空的电容率(8.85x10-12F/m)。材料的介电常数(k)或相对电容率是其电容率ε与真空电容率εo的比率，因此k＝ε/εo(真空的介电常数为1)。低k值的电介质是电容率较低或极化和保持电荷能力较低的电介质。在另一方面，高k值的电介质则具有高电容率。由于高k值电介质善于保持电荷，因此它们是电容器的优选电介质。高k值电介质还用以电荷形式存储数字数据的存储单元。
在特定方面，该电动改变的水性流体适于改变细胞膜结构或功能(如，改变膜相关蛋白的构象、配体结合活性或催化活性)，足以提供细胞内信号转导的调节，其中在特定方面，膜相关蛋白包括选自受体、跨膜受体(如G蛋白偶联受体(GPCR)、TSLP受体、β2肾上腺素能受体、缓激肽受体等)、离子通道蛋白、细胞内附着蛋白、细胞粘附蛋白和整合素中的至少一种。在某些方面，受影响的G蛋白偶联受体(GPCR)与G蛋白α亚基(如Gαs、Gαi、Gαq和Gα12)相互作用。
在特定方面，该电动改变的水性流体适于调节细胞内信号转导，包括调节钙依赖性细胞信息传递途径或系统(如，调节磷脂酶C活性或调节腺苷酸环化酶(AC)活性)。
在特定方面，该电动改变的水性流体特征在于工作实施例和本文其他地方所述的各种生物活性(如，调节细胞因子、受体、酶及其他蛋白和细胞内信号通路)。
在特定方面，该电动改变的水性流体抑制如本文工作实施例中所示的支气管上皮细胞(BEC)中DEP诱导的细胞表面结合MMP9水平。
在特定方面，该电动改变的水性流体的生物效应由白喉毒素抑制，表明β阻滞、GPCR阻滞和钙通道阻滞影响电动改变的水性流体的活性(如，对调节性T细胞功能的活性)，如本文工作实施例中所示。
在特定方面，该电动改变的水性流体的物理和生物效应(如，改变细胞膜结构或功能足以提供细胞内信号转导调节的能力)在密闭容器(如，密闭气密性容器)中持续至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少6个月或更长的时间。
因此，进一步的方面提供所述电动产生的溶液以及产生电动力改变的氧合水性流体或溶液的方法，包括：在相对运动的并在其间限定混合容积的两个间隔表面之间使流体材料流动，其中流动的流体材料从混合容积内单次通过的停留时间大于0.06秒或大于0.1秒；以及在适于将至少20ppm、至少25ppm、至少30、至少40、至少50或至少60ppm的氧溶于所述材料中并且电动改变所述流体或溶液条件下，将氧(O2)引入混合容积内的流动流体材料中。在某些方面，在短于100毫秒、短于200毫秒、短于300毫秒或短于400毫秒的时间内将氧注入材料中。在特定的实施方案中，表面积与容积的比率为至少12、至少20、至少30、至少40或至少50。
另外的方面提供产生电动改变的氧合的水性流体或溶液的方法，包括：在其间限定混合容积的两个间隔表面之间使流体材料流动；以及在适于将至少20ppm、至少25ppm、至少30、至少40、至少50或至少60ppm的氧注入所述材料中的条件下，在短于100毫秒、短于200毫秒、短于300毫秒或短于400毫秒内将氧引入混合容积内的流动材料中。在某些方面，流动材料在混合容积内的停留时间大于0.06秒或大于0.1秒。在特定的实施方案中，表面积与容积的比率为至少12、至少20、至少30、至少40或至少50。
另外的实施方案提供产生电动改变的氧合水性流体或溶液的方法，包括使用混合装置通过混合第一材料和第二材料形成输出混合物，该装置包括：被构造成从第一材料源接纳第一材料的第一室；定子；具有旋转轴线的转子，该转子设置在定子内部并被构造成在其中绕旋转轴线旋转，转子和定子的至少一者具有多个通孔；在转子与定子之间限定的混合室，该混合室与第一室流体连通并被构造成从第一室接纳第一材料，而第二材料则通过转子和定子之一中形成的多个通孔提供给混合室；在转子与定子之间限定的混合室，该混合室与第一室流体连通并被构造成从第一室接纳第一材料，而第二材料则通过转子和定子之一中形成的多个通孔提供给混合室；第二室，其与混合室流体连通并被构造成从其中接纳输出材料；以及容纳在第一室内部的第一内部泵，该第一内部泵被构造成从第一室将第一材料泵送进混合室。在某些方面，第一内部泵被构造成在第一材料进入混合室前使第一材料中产生圆周速度。
进一步的实施方案提供产生电动改变的氧合水性流体或溶液的方法，包括使用混合装置通过混合第一材料和第二材料形成输出混合物，该装置包括：定子；具有旋转轴线的转子，该转子设置在定子内部并被构造成在其中绕旋转轴线旋转；在转子与定子之间限定的混合室，该混合室具有开口第一末端，第一材料通过该末端进入混合室，以及开口第二末端，输出材料通过该末端离开混合室，而第二材料则通过转子和定子中至少一者进入混合室；与混合室的开口第一末端的至少大部分连通的第一室；以及与混合室的开口第二末端连通的第二室。
另外的方面提供根据任何上述方法制备的电动改变的氧合水性流体或溶液。在特定方面，施用的本发明的电动改变的流体包含电荷稳定的含氧纳米结构，其量足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节。在某些实施方案中，该电动改变的流体是超氧合的(如RNS-20、RNS-40和RNS-60，在标准盐水中分别含20ppm、40ppm和60ppm的溶解氧)。在特定的实施方案中，该电动改变的流体不是超氧合的(如RNS-10或Solas，在标准盐水中含10ppm(如，约为环境水平)的溶解氧)。在某些方面，本发明的电动改变的流体的盐度、无菌性、pH等在电动产生所述流体时确立，并通过合适的途径施用所述无菌流体。可选地，在施用流体前适当地调节(例如，使用无菌盐水或合适的稀释剂)流体盐度、无菌性、pH等的至少一种以与施用途径在生理学上相容。优选地，用于调节流体的盐度、无菌性、pH等的至少一种的稀释剂和/或盐水溶液和/或缓冲组合物也是电动流体，或者以其他方式与之相容。
在特定方面，本发明的电动改变的流体包括盐水(例如，一种或多种溶解盐；例如，碱金属类盐(Li、Na、K、Rb、Cs等)或碱土金属类盐(如Mg、Ca)等与任何合适的阴离子组分)。特定的方面包括基于混合盐的电动流体(如，Na、K、Ca、Mg等，以各种组合和浓度)。在特定方面，本发明的电动改变的流体包括标准盐水(例如，约0.9％NaCl或约0.15M NaCl)。在特定方面，本发明的电动改变的流体包括浓度为至少0.0002M、至少0.0003M、至少0.001M、至少0.005M、至少0.01M、至少0.015M、至少0.1M、至少0.15M或至少0.2M的盐水。在特定方面，本发明的电动改变的流体的电导率为至少10μS/cm、至少40μS/cm、至少80μS/cm、至少100μS/cm、至少150μS/cm、至少200μS/cm、至少300μS/cm或至少500μS/cm、至少1mS/cm、至少5mS/cm、10mS/cm、至少40mS/cm、至少80mS/cm、至少100mS/cm、至少150mS/cm、至少200mS/cm、至少300mS/cm或至少500mS/cm。在特定方面，任何盐均可用于制备本发明的电动改变的流体，前提条件是它们允许形成如本文所公开的具有生物活性的盐稳定化纳米结构(如，盐稳定化含氧纳米结构)。
根据特定的方面，本发明的包含电荷稳定的含气体纳米结构的流体组合物的生物学效应可通过改变流体的离子组分(例如，如上所述)和/或改变流体的气体组分而调节(例如，增强、减弱、微调等)。在优选的方面，氧用于制备本发明的电动流体。在另外的方面，氧与选自氮、氧、氩、二氧化碳、氖、氦、氪、氢和氙的至少一种其他气体一起形成混合物。
鉴于本文所公开的教导和测定系统(如，基于细胞的细胞因子测定、膜片钳测定等)，本领域的技术人员将能够容易地选择合适的盐及其浓度以实现本文所公开的生物学活性。
表1.示例性阳离子和阴离子。
普通阳离子：
Figure BDA00003030967500161
Figure BDA00003030967500171
表2.示例性阳离子和阴离子。
单原子阳离子
化学式 电荷 名称
H+ 1+ 氢离子
Li+ 1+ 锂离子
Na+ 1+ 钠离子
K+ 1+ 钾离子
Cs+ 1+ 铯离子
Ag+ 1+ 银离子
Mg2+ 2+ 镁离子
Ca2+ 2+ 钙离子
Sr2+ 2+ 锶离子
Ba2+ 2+ 钡离子
Zn2+ 2+ 锌离子
Cd2+ 2+ 镉离子
Al3+ 3+ 铝离子
多原子阳离子
化学式 电荷 名称
NH4 + 1+ 铵离子
H3O+ 1+ 水合氢离子
多价阳离子
化学式 电荷 名称
Cr2+ 2 铬(II)或二价铬离子
Cr3+ 3 铬(III)或三价铬离子
Mn2+ 2 锰(II)或二价锰离子
Mn4+ 4 锰(IV)离子
Fe2+ 2 铁(II)或二价铁离子
Fe3+ 3 铁(III)或三价铁离子
Co2+ 2 钴(II)或二价钴离子
Co3+ 3 钴(II)或三价钴离子
Ni2+ 2 镍(II)或二价镍离子
Ni3+ 3 镍(III)或三价镍离子
Cu+ 1 铜(I)或一价铜离子
Cu2+ 2 铜(II)或二价铜离子
Sn2+ 2 锡(II)或二价锡离子
Sn4+ 4 锡(IV)或四价锡离子
Pb2+ 2 铅(II)或二价铅离子
Pb4+ 4 铅(IV)或四价铅离子
单原子阴离子
化学式 电荷 名称
H- 1- 氢负离子
F- 1- 氟离子
Cl- 1- 氯离子
Br- 1- 溴离子
I- 1- 碘离子
O2- 2- 氧离子
S2- 2- 硫离子
N3- 3- 氮离子
多原子阴离子
化学式 电荷 名称
OH- 1- 氢氧根离子
CN- 1- 氰离子
SCN- 1- 硫氰酸根离子
C2H3O2 - 1- 醋酸根离子
ClO- 1- 次氯酸根离子
ClO2 - 1- 亚氯酸根离子
ClO3 - 1- 氯酸根离子
ClO4 - 1- 高氯酸根离子
NO2 - 1- 亚硝酸根离子
NO3 - 1- 硝酸根离子
MnO4 2- 2- 高锰酸根离子
CO3 2- 2- 碳酸根离子
C2O4 2- 2- 草酸根离子
CrO4 2- 2- 铬酸根离子
Cr2O7 2- 2- 重铬酸根离子
SO3 2- 2- 亚硫酸根离子
SO4 2- 2- 硫酸根离子
PO3 3- 3- 亚磷酸根离子
PO4 3- 3- 磷酸根离子
本发明阐述新型富含气体的流体，包括但不限于富含气体的离子水性溶液、盐水溶液(如，标准盐水溶液，以及如本文所论述和本领域将认识到的其他盐水溶液，包括任何生理相容性盐水溶液)、细胞培养基(例如，基本培养基和其他培养基)。
心血管疾病和相关病症
心血管疾病是一大类涉及心脏或血管(动脉和静脉)的疾病。心血管疾病包括但不限于心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄。这些病症具有相似的病因、机理和治疗措施。大多数心血管疾病具有共同的危险因素，包括炎症、高胆固醇和肥胖。炎性生物标记物(包括C反应蛋白、白介素6(IL-6)和白介素8(IL-8))与心血管疾病相关。此外，最近已发现基质金属蛋白酶在心血管疾病中起着作用。
心律失常是一大类在心脏中存在异常电活动的不同病症中任何一种的术语。心搏可以过快或过慢，并可以为规则或不规则的。一些心律失常是可导致心搏停止和突然死亡的致命医疗紧急事件。其他心律失常会导致诸如异常心搏意识(心悸)的症状，并可以仅仅是令人烦恼。还已知的是这些心悸由心房/心室纤颤、心脏起搏器/除颤器的线路故障和其他技术或机械问题造成。还有一些心律失常可能根本没有任何症状，但可能使患者易于发生致命的中风或栓塞。心律失常的治疗包括一组称为抗心律失常剂的药物，其用于抑制心脏的快速节律(心律失常)，诸如心房纤颤、心房扑动、室性心动过速和心室纤颤。有五大类抗心律失常剂。包括但不限于奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮和莫雷西嗪的I类抗心律失常剂干扰钠(Na+)通道。II类抗心律失常剂(如普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔和比索洛尔)为抗交感神经系统剂，它们中大部分为β阻滞剂。III类抗心律失常剂(如胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆和E-4031)影响钾(K+)外流。IV类抗心律失常剂(如维拉帕米和地尔硫卓)影响钙通道和房室结。V类抗心律失常剂(如腺苷、地高辛和硫酸镁)以其他或未知的机理发挥作用。此外，由于某些心律失常会促进心脏中的凝血并提高栓塞和中风的风险，因此抗凝血药(如华法令和肝素)和抗血小板药物诸如阿司匹林通常用于降低凝血风险。
血管疾病是大和中肌动脉的病理状态，因内皮细胞功能障碍而触发。由于如病原体、氧化的LDL粒子和其他炎性刺激等因素，内皮细胞被活化。这使它们的特性发生变化：内皮细胞开始分泌细胞因子和趋化因子并在它们的表面上表达粘附分子。继而导致白血球(单核细胞和淋巴细胞)募集，其可浸润血管壁。通过内皮细胞和募集的白血球产生的细胞因子对平滑肌细胞层的刺激导致平滑肌细胞增殖并朝血管腔迁移。该过程导致血管壁变厚，形成由增殖平滑肌细胞、巨噬细胞和各种类型的淋巴细胞组成的斑块。该斑块导致血流阻塞，从而使到达目标器官的氧和营养物质的量减少。在最终阶段，斑块还可能破裂，导致形成凝块，并因而发生中风。
心肌梗死(MI)或急性心肌梗死(AMI)通常称为心脏病发作，是通往心脏部分的血液供应发生中断，从而导致心肌细胞死亡。其最常见的原因是动脉粥样硬化易损斑块(血管壁中脂类和白血球的不稳定集合)破裂后的冠状动脉堵塞。所产生的缺血和缺氧如果长时间不进行治疗会导致心肌组织损伤或死亡(梗死)。
急性心肌梗死的典型症状包括突然胸痛(通常辐射到左臂或颈左侧)、呼吸短促、恶心、呕吐、心悸、出汗和忧虑(通常称为厄运将临的感觉)。女性出现的典型症状可少于男性，最常见的是呼吸短促、虚弱、消化不良感和疲乏。大约所有心肌梗死中的四分之一为悄无声息的，无胸痛或其他症状。
可用于检测心肌损伤的诊断测试包括心电图(ECG)、胸部X光以及各种血检。最常用的标志物为肌氨酸激酶MB(CK-MB)片段和肌钙蛋白水平。疑似急性心肌梗死的立即治疗包括氧气、阿司匹林和舌下硝酸甘油。
患者通常在心肌梗死后开始使用多种长期药物，目的是预防继发性心血管事件，诸如进一步的心肌梗死、充血性心力衰竭或脑血管意外(CVA)。可用于预防继发性心血管事件的药物包括但不限于：抗血小板药治疗(如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(如依普利酮和螺甾内酯)以及ω-3脂肪酸。
充血性心力衰竭(CHF)或心力衰竭是心脏受限不能向身体其他器官泵送足量的血液的病症。这可因以下方面所致：向心肌供血的动脉变窄(如冠状动脉疾病)、具有干扰心肌正常工作的疤痕组织的陈旧性心肌梗死、高血压、因陈旧性风湿热或其他原因导致的心脏瓣膜疾病、心肌病、先天性心脏缺损、心内膜炎和/或心肌炎。随着流出心脏的血流变慢，通过静脉返回心脏的血液回流，从而导致组织充血，并通常导致浮肿。有时，体液在肺部聚集并干扰呼吸，从而导致呼吸短促，尤其是当病人躺下时。CHF的治疗包括休息、适当饮食、改变日常活动以及药物，包括但不限于β阻滞剂(如美托洛尔和卡维地洛)、ACE抑制剂(如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、毛地黄、利尿剂和血管扩张剂。ACE抑制剂和血管扩张剂扩张血管并降低阻力。β阻滞剂可很好地改善心脏左下室(左心室)泵的作用。毛地黄提高心肌的泵送作用；而利尿剂则有助于身体排除过多的盐和水。
心肌炎是指心脏肌肉(心肌)发炎。它与心脏病发作相似但不堵塞冠状动脉。心肌炎最常见的原因是常见病毒(诸如微小病毒B19)感染，较少见的是非病毒性病原体，诸如博氏疏螺旋体(莱姆病)或克氏锥虫，或作为对药物的超敏反应。心肌炎的核心特征是心脏感染、具有炎性浸润以及对心肌的损伤，而无冠状动脉阻断或其他常见的非感染性原因。心肌炎可以或可以不包括心脏组织坏死。心肌炎可以是因某些感染原感染导致的自身免疫反应，因为(例如)链球菌M蛋白和柯萨奇病毒B具有在免疫学上与心肌肌凝蛋白相似的表位。在将感染原从体内清除后，免疫系统可攻击心肌肌凝蛋白。
心肌炎的症状差异很大。心肌炎可导致无任何症状的可自行消退的轻微疾病，或者可以导致胸痛、心力衰竭或突然死亡。心肌炎的治疗可包括地高辛、利尿剂、正性肌力药物(如米力农)和ACE抑制剂(如卡托普利、赖诺普利)。
动脉粥样硬化是一种动脉壁因脂肪物质诸如胆固醇的堆积(称为斑块)而变厚的病症。具体地讲，影响动脉血管的这种综合征是动脉壁中的慢性炎症反应，在很大程度上是由于巨噬细胞白血球的蓄积，并通过低密度脂蛋白加重，而功能性高密度脂蛋白(HDL)不能从巨噬细胞充分移除脂肪和胆固醇。其通常称为动脉硬化或“垢化(furring)”。
以下术语在称谓和含义方面均相似但却不同，并容易混淆：动脉硬化、小动脉硬化和动脉粥样硬化。动脉硬化是描述中动脉或大动脉任何硬化(及丧失弹性)的一般性术语；小动脉硬化是细动脉(小动脉)的任何硬化(及丧失弹性)；动脉粥样硬化是具体因粥样斑块导致的动脉硬化。术语“致动脉粥样化的”用于导致动脉粥样硬化的物质或过程。
动脉粥样硬化虽然通常数十年无症状，但最终会产生两大问题：其一，粥样斑块，虽然通过动脉扩张长期代偿，但最终会导致斑块破裂，在动脉腔内的破裂上形成凝块。凝块愈合并通常发生收缩，但却留下动脉狭窄(局部和位于小下游分支)或恶化、完全封闭，并因此使所供给的组织和器官供血不足。其次，如果代偿性动脉扩张过程过度，则会发生净动脉瘤(net aneurysm)。由于动脉粥样硬化是一个全身性的过程，这些事件会在通往脑、心、肠、肾、腿等的动脉中发生。
动脉粥样硬化的治疗包括但不限于：β阻滞剂(如美托洛尔和卡维地洛)、ACE抑制剂(如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、利尿剂和膳食补充剂(如叶酸、烟酸、ω-3脂肪酸和维生素C)。
再狭窄是狭窄(血管变窄)的复发，导致血流受限。再狭窄通常涉及已变窄、接受清除堵塞治疗随后又再次变窄的动脉或其他大血管。其可定义为管腔周长减小内径50％或更多，并在接受过球囊血管成形术的患者中具有高发病率(25-50％)，大部分患者在6个月内需要接受进一步的血管成形术。再狭窄治疗包括但不限于血管成形术、短距离放射治疗和冠状动脉内辐射。
炎症
炎症已知在心血管疾病中起着作用(参见例如Jialal和Devaraj S，“Inflammation and atherosclerosis：the value of the high-sensitivityC-reactive protein assay as a risk marker.”Am J Clin Pathol(2001)116Suppl：S108-15；Zairis M等，“C-reactive protein and multiple complexcoronary artery plaques in patients with primary unstable angina.”Atherosclerosis(2002)164(2)：355；Lowe GD，“The relationship betweeninfection，inflammation，and cardiovascular disease：an overview.”AnnPeridontol(2001)6(1)：1-8；Rifai和Ridker，“Inflammatory markers andcoronary heart disease.”Curr Opin Lipidol(2002)13(4)：383-9；Bermudez和Ridker，“C-reactive protein，statins，and the primaryprevention of atherosclerotic cardiovascular disease.”Prev Cardiol(2002)5(1)：42-6；Blake和Ridker，“Inflammatory mechanisms in atherosclerosis：from laboratory evidence to clinical application.”Ital Heart J(2001)2(11)：796-800；Pradhan AD等，“Inflammatory biomarkers，hormonereplacement therapy，and incident coronary heart disease：prospectiveanalysis from the Women’s Health Initiative observational study”.JAMA(2002)288(8)：980-7；Ridker PM等“Inflammation，aspirin，and the risk ofcardiovascular disease in apparently healthy men.”NEJM(1997)336(14)：973-9；“Interleukin8and cardiovascular disease”CardiovascRes(2009)doi：10.1093/cvr/cvp241)。
炎症可作为对外源物质(尤其是微生物源的)入侵受试者的防御反应而发生。另外，机械性创伤、毒素和瘤变也可引起炎性反应。白细胞的积聚及随后的活化是炎症的大多数形式的发病中的核心事件。炎症障碍会损害宿主，使其感染或创伤易于恶化。严重发炎诸如长时间炎症反应可导致炎性疾病，包括但不限于糖尿病、心血管疾病(如动脉硬化、心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄)、黄斑变性、白内障、慢性皮肤病、再灌注损伤和癌症；导致感染后综合征，诸如在感染性脑膜炎、风湿热；以及导致风湿性疾病，诸如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎。这些疾病在全世界每年困扰着数百万人，并导致死亡率和患病率升高。在这些不同的疾病过程中炎性反应的共性使其成为防止或治疗人类疾病的主要调节要素。
促炎性细胞因子的过量产生已与许多炎性和自身免疫性疾病的发病机理有牵连。TNFα的分泌是引发炎症级联反应的主要事件(Brennan F.M.等Lancet，1989，2：244-7；Haworth C等Eur.J.Immunol.1991，21：2575-2579)并直接促使了这些疾病的发生和维持。其他细胞因子也在发挥着作用，包括白介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-12、一氧化氮(NO)、IFN-γ、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和IL-10。其中某些细胞因子(如IL-8)可增强或加剧炎性反应，而其他的(如IL-10)则可降低或缓解炎性反应。
免疫系统的细胞(尤其是巨噬细胞)响应活化刺激而分泌其中许多细胞因子。细胞因子的靶细胞可位于任何体室中并可通过长距离机制发挥作用或可作用于相邻细胞。因此，细胞因子可以局部或全身性方式调节炎症。
心血管疾病与炎症之间的联系
如升高的C反应蛋白所表明的慢性炎症状态导致动脉系统的明显损伤，包括血栓形成、斑块破裂和栓塞。C反应蛋白(CRP)是一种灵敏但非特异性的炎症标志物。升高的CRP血液水平(尤其是通过高灵敏度测定法测量)可预测MI以及中风和发生糖尿病的风险。此外，某些MI药物已表明可降低CRP水平。然而，CPR在动脉粥样硬化或心血管疾病中是否起着直接作用尚不得而知。
对C反应蛋白的研究表明血管中的胆固醇填充斑块可能不会造成任何实际的危险，除非它们受到炎症的影响。炎症使斑块弱化，使得它们更易破裂或夹断凝块，然后会阻塞冠状血管(Jialal和Devaraj S，“Inflammation and atherosclerosis：the value of the high-sensitivityC-reactive protein assay as a risk marker.”Am J Clin Pathol2001年12月；116Suppl：S108-15；Zairis M等，“C-reactive protein and multiplecomplex coronary artery plaques in patients with primary unstableangina.”Atherosclerosis2002年10月；164(2)：355；Lowe GD，“Therelationship between infection，inflammation，and cardiovascular disease：an overview.”Ann Peridontol2001年12月；6(1)：1-8；它们均全文以引用方式并入本文，包括它们关于炎症在心血管疾病中的作用的教导)。具体地讲，一系列研究表明两千五百万至三千五百万美国人具有处于正常范围内的总胆固醇，但在它们的心血管系统中炎症水平高于平均值。该炎症对心脏病风险有显著影响(Rifai和Ridker，“Inflammatorymarkers and coronary heart disease.”Curr Opin Lipidol2002年8月；13(4)：383-9；Bermudez和Ridker，“C-reactive protein，statins，and theprimary prevention of atherosclerotic cardiovascular disease.”PrevCardiol2002Winter；5(1)：42-6；Blake和Ridker，“Inflammatorymechanisms in atherosclerosis：from laboratory evidence to clinicalapplication.”Ital Heart J2001年11月；2(11)：796-800；它们均全文以引用方式并入本文，包括它们关于炎症在心血管疾病中的作用的教导)。此外，涉及39，876名绝经后妇女的女性健康研究支持C反应蛋白(并因此慢性炎症)与心血管疾病存在关联(Pradhan AD等，“Inflammatorybiomarkers，hormone replacement therapy，and incident coronary heartdisease：prospective analysis from the Women’s Health Initiativeobservational study”.JAMA2002年8月28日；288(8)：980-7；其全文以引用方式并入本文，包括其关于炎症在心血管疾病中的作用的教导)。具有最高水平的C反应蛋白的那些受试者发生心血管疾病的风险是具有最低水平的受试者的五倍，出现心脏病发作或中风的风险则达七倍。令人感兴趣的是，C反应蛋白水平预测了这些事件的风险，即使在似乎无其他相关风险因素的女性中。此外，在22,000名最初健康的男性中评价C反应蛋白水平和心脏病风险的医生健康研究支持炎症与心脏病发作之间存在关系(Ridker PM等“Inflammation，aspirin，and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men.”NEJM1997年4月3日；336(14)：973-9；其全文以引用方式并入本文，包括其关于炎症在心血管疾病中的作用的教导)。
此外，某些促炎性细胞因子和趋化因子已知在心血管疾病中起着作用，包括但不限于动脉粥样硬化中。具体地讲，已表明白介素8与侵害血管壁的炎性微环境的确立和保持有关(有关综述，参见：“Interleukin8and cardiovascular disease”Cardiovasc Res(2009)，doi：10.1093/cvr/cvp241；其全文以引用方式并入本文，包括其关于IL-8在心血管疾病中的作用的教导)。
如图2以及图37A和B中可见，电动改变的水性流体与对照流体相比降低了促炎性细胞因子IL-6以及促炎性趋化因子IL-8和嗜酸性粒细胞活化趋化因子的水平。因此，根据某些实施方案，本发明的流体通过降低促炎性细胞因子和趋化因子继而限制炎症而缓解多种心血管疾病的许多症状和/或病症。
金属蛋白酶
金属蛋白酶是分成家族和亚家族的蛋白酶(酶)的超家族，如例如在N.M.Hooper FEBS Letters354：1-6，1994中所述。金属蛋白酶的实例包括基质金属蛋白酶(MMP)，诸如胶原酶(MMP1、MMP8、MMP13)、明胶酶(MMP2、MMP9)、间质溶解素(MMP3、MMP10、MMP II)、基质溶解因子(MMP7)、金属弹性蛋白酶(MMP12)、釉质溶解素(MMP19)、MT-MMP(MMP14、MMP15、MMP16、MMP17)；reprolysin或adamalysin或MDC家族，包括分泌酶和脱落酶，诸如TNF转化酶(ADAM10和TACE)；虾红素家族，包括诸如前胶原加工蛋白酶(PCP)的酶；以及其他金属蛋白酶，诸如聚蛋白多糖酶、内皮素转化酶家族和血管紧张素转化酶家族。总之，金属蛋白酶已知可裂解多种多样的基质底物，诸如胶原、蛋白聚糖和纤粘蛋白。金属蛋白酶与生物学上具有重要意义的细胞介体(诸如肿瘤坏死因子(TNF))的加工或分泌；以及生物学上具有重要意义的膜蛋白(诸如低亲和IgE受体CD23)的翻译后蛋白质水解加工或脱落有牵连(参见例如N.M.Hooper等，Biochem.J.321：265-279，1997)。
因此，不出意料地，据信金属蛋白酶在涉及组织重塑(如，胚胎发育、骨形成、月经期子宫重塑等)的许多生理疾病过程中具有重要意义。此外，抑制一种或多种金属蛋白酶的活性将在以下疾病或病症中带来充分的益处，例如：各种炎性和过敏性疾病，诸如关节炎症(尤其是类风湿性关节炎、骨关节炎和痛风)、胃肠道疾病(尤其是炎性肠病、溃疡性结肠炎和胃炎)、皮肤炎症(尤其是牛皮癣、湿疹、皮炎)；肿瘤转移或侵袭；与不受控的细胞外基质降解相关的疾病，诸如骨关节炎；骨吸收疾病(诸如骨质疏松和佩吉特氏病)；与异常血管新生相关的疾病；与糖尿病、牙周病(诸如齿龈炎)、角膜溃疡、皮肤溃疡、术后病症(诸如结肠吻合术)及表皮伤口愈合相关的增强的胶原重塑；中枢神经系统和周围神经系统的脱髓鞘疾病(诸如多发性硬化)；阿尔茨海默病；在心血管疾病诸如再狭窄和动脉硬化中观察到的细胞外基质重塑；哮喘；鼻炎；和慢性阻塞性肺病(COPED)。
MMP12也称为巨噬细胞弹性蛋白酶或金属弹性蛋白酶，最初在小鼠中进行了克隆(Shapiro等，Journal of Biological Chemistry267：4664，1992)并已在1995年由同一小组在人中进行了克隆。MMP12优先地在活化的巨噬细胞中表达，并已表明其从吸烟者的肺泡巨噬细胞中分泌(Shapiro等，1993，Journal of Biological Chemistry，268：23824)以及在粥样硬化病变的泡沫细胞中分泌(Matsumoto等，Am.J.Pathol.153：109，1998)。COPD小鼠模型基于用香烟烟雾挑战小鼠六个月，每天两只烟，每周六天。野生型小鼠在该处理后发生了肺气肿。当对MMP12敲除小鼠在此模型中进行测试时，它们未发生显著的气肿，从而强烈表明MMP12是COPD发病中的关键酶。MMP(诸如MMP12)在COPD(气肿和支气管炎)的作用在Anderson和Shinagawa，1999，Current Opinion in Anti-inflammatory and ImmunomodulatoryInvestigational Drugs1(1)：29-38中进行了论述。最近已发现，吸烟会增加巨噬细胞浸润和人颈动脉粥样斑块中巨噬细胞源性MMP-12的表达(Matetzky S，Fishbein M C等，Circulation102：(18)，36-39Suppl.S，Oct.31，2000)。
MMP9(明胶酶B；92kDa IV型胶原酶；92kDa明胶酶)是一种分泌蛋白，其最早在1989年得以纯化，然后克隆和测序(S.M.Wilhelm等，J.Biol.Chem.264(29)：17213-17221，1989；于J.Biol.Chem.265(36)：22570，1990中公布勘误)(对于详细信息的综述以及此蛋白酶的参考文献，参见T.H.Vu&Z.Werb(1998)(In：MatrixMetalloproteinases，1998，由W. C.Parks&R.P. Mecham编辑，pp.115-148，Academic Press.ISBN0-12-545090-7)。MMP9的表达一般限制在少数细胞类型中，包括滋养细胞、破骨细胞、中性粒细胞和巨噬细胞(Vu&Werb，同上)。然而，通过若干介体(包括将细胞暴露于生长因子或细胞因子)，可在这些相同的细胞以及其他细胞类型中诱导表达。这些介体与通常与引发炎性反应有牵连的介体相同。与其他分泌的MMP一样，MMP9作为无活性的酶原释放，其随后裂解形成具有酶活性的酶。在体内这种活化所需的蛋白酶尚不清楚。活性MMP9与无活性的酶的平衡在体内进一步受与TIMP-1(金属蛋白酶1组织抑制剂，一种天然存在的蛋白)的相互作用的调节。TIMP-1结合到MMP9的C端区域，从而导致MMP9催化结构域受到抑制。ProMMP9的诱导型表达的平衡、Pro-裂解成活性MMP9以及TIMP-1的存在一起决定了局部位点存在的催化活性MMP9的量。具有蛋白分解活性的MMP9攻击包括明胶、弹性蛋白和天然IV型及V型胶原的底物；其对天然I型胶原、蛋白聚糖或层粘蛋白无活性。已有越来越多的数据暗示MMP9在各种生理和病理过程中的作用。生理作用包括在胚胎植入早期通过子宫上皮侵袭胚胎滋养细胞；骨生长及发育中的一些作用；以及炎性细胞从脉管系统向组织的迁移。
未治疗的哮喘患者与其他人群相比，MMP9的释放(使用酶免疫测定法测定)在体液和AM上清液中明显升高(Am.J.Resp.Cell&Mol.Biol.，5：583-591，1997)。另外，在某些其他病理状态中也观察到了增加的MMP9表达，从而暗示MMP9存在于疾病过程中，诸如COPD、关节炎、肿瘤转移、阿尔茨海默病、多发性硬化以及动脉硬化中的斑块破裂，从而导致急性冠心病，诸如心肌梗死(另见WO07087637A3，以引用方式并入本文)。
MMP抑制剂：
许多金属蛋白酶抑制剂是已知的(参见例如以下文献作出的MMP抑制剂综述：Beckett R.P.和Whittaker M.，1998，Exp.Opin.Ther.Patents，8(3)：259-282；以及Whittaker M.等，1999，Chemical Reviews99(9)：2735-2776)。WO02/074767公开了可用作MMP抑制剂，尤其是用作强效MMP12抑制剂的化学式的乙内酰脲衍生物。美国专利申请序列No.11/721,590(以20080032997公布)公开了另一组乙内酰脲衍生物，它们为金属蛋白酶抑制剂并在抑制诸如MMP12和MMP9的MMP中尤其引人关注。抑制诸如MMP12和MMP9的MMP的新型三唑酮衍生物在美国专利申请序列No.10/593543(以20070219217公布)中公开。另外的MMP12和MMP9抑制剂在11/509,490(以20060287338公布)中有所公开(另见10/831265(以20040259896公布))。
另外，已表明两种化合物4-(4-苯氧基苯基磺酰基)丁烷-1，2-二硫醇(1)和5-(4-苯氧基苯基磺酰基)戊烷-1，2-二硫醇(2)可选择性结合并强效抑制MMP-2和MMP-9(Bernardo等(2002)J.Biol.Chem.277：11201-11207)。这两种化合物在临床中抑制MMP-2和-9并因此减轻炎症具有重要的用途。此外，已表明，以亚抗生素水平使用某些四环素抗生素(如，米诺环素和强力霉素)可有效抑制MMP活性。本发明的某些方面包括与可用于抑制MMP的亚抗生素水平结合使用本发明的流体。
心血管疾病与基质金属蛋白酶之间的联系
最近已表明，基质金属蛋白酶(MMP)与许多心血管疾病的发病机理有关，包括动脉粥样硬化、再狭窄、扩张型心肌病和心肌梗死(Creemers等，“Matrix Metalloproteinase Inhibition after MyocardialInfarction：a new approach to prevent hear failure？”(2001)Circ Res.89(3)：201-10；Sierevogel等，(2003)“Matrix metalloproteinases：atherapeutic target in cardiovascular disease.”Curr Pharm Des.9(13)：1033-40；均全文以引用方式并入本文，包括它们关于MMP在心血管疾病中的作用的教导)。令人感兴趣的是，在这些心血管疾病的实验模型中施用合成的MMP抑制剂明显抑制了粥样硬化病变形成、新生内膜形成、左心室重构、泵功能障碍和梗死愈合的进展(Creemers等(2001))。此外，已表明MMP在动脉粥样硬化中通过降解导致心血管重塑的细胞外基质而发挥着重要作用(Ikeda和Shimada，(2003)“Matrix metalloproteinases and coronary artery diseases.”ClinCardiol26(2)：55-9；其全文以引用方式并入本文，包括其关于MMP在心血管疾病和冠状动脉疾病中的作用的教导)。最近的研究已表明MMP在粥样硬化病变中的表达提高，并且它们有助于通过降解细胞外基质而弱化血管壁。此外，研究已表明，MMP基因启动子的多态性有助于冠心病易感性方面的个体间差异(Watanabe和Ikeda，(2004)“Matrix metalloproteinases and atherosclerosis.”Curr Atheroscler Rep.6(20：112-20；其全文以引用方式并入本文，包括其关于MMP在心血管疾病和动脉粥样硬化中的作用的教导)。因此，根据某些实施方案，本发明的流体通过调节MMP水平而缓解多种心血管疾病的多种症状和/或病症。
本文的某些实施方案涉及治疗受试者的治疗性组合物和方法，方式是防止或缓解心血管疾病和/或相关病症或疾病的至少一种症状。
本文进一步的实施方案涉及治疗性组合物和治疗方法以防止或缓解与心血管疾病和/或相关病症相关的并发症。
治疗方法
术语“治疗”是指并包括逆转、缓解、防止疾病、障碍或病症或其一种或多种症状或抑制其进展；以及“治疗”和“治疗学”是指治疗行为，如本文所定义。
“治疗有效量”是用于实施本文提供的发明的过程的任何化合物的任何量，该量足以逆转、缓解、防止疾病、障碍或病症或其一种或多种症状或抑制其进展。
本文的某些实施方案涉及治疗受试者的治疗性组合物和方法，方式是防止或缓解与某些病症或疾病如黄斑变性相关的炎症的至少一种症状。
与炎症相关的许多病症或疾病已通过以下物质得到了治疗：类固醇、甲氨蝶呤、免疫抑制药物(包括环磷酰胺、环孢霉素、硫唑嘌呤和来氟米特)、非甾体抗炎剂(诸如阿司匹林、对乙酰氨基酚和COX-2抑制剂)、金药剂和抗疟疾治疗。这些药物具有多种缺点和不良反应，包括注射部位反应、皮疹、上呼吸道感染、自身免疫障碍以及对感染的易感性增加。此外，与更方便和依从性更高的口服或皮肤局部途径相对，许多抗炎药物需要静脉内(IV)或皮下(SC)施用。因此，仍需要开发用于炎症相关的病症和疾病的新型药剂和治疗方法。
联合治疗.特定实施方案包括使用与至少一种其他药剂结合的本发明电动流体的联合治疗，所述至少一种其他药剂包括但不限于：奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮、莫雷西嗪、普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆、E-4031、维拉帕米、地尔硫卓、腺苷、地高辛、硫酸镁、华法令、肝素、抗血小板药物(例如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(例如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(例如依普利酮和螺甾内酯)、毛地黄、利尿剂、地高辛、正性肌力药物(例如米力农)、血管扩张剂和ω-3脂肪酸。
电动产生的富含气体的流体和溶液的抗炎活性：
根据本发明的某些方面，本文所公开的富含气体的流体和/或溶液具有抗炎性质和效果，并可用作抗炎剂治疗受炎症相关的疾病或障碍折磨的受试者。图1显示了在得自健康供血者的刺激淋巴细胞中细胞因子谱的实验结果。如图1可见，本发明的富含氧的流体(水)影响了特定细胞因子，特别是IL-6、IL-8和IL-1β的下调。
促炎性细胞因子的产生增加已在许多炎性和自身免疫性疾病中存在牵连。TNFα的分泌是引发炎症级联反应的主要事件(Brennan F.M.等Lancet，1989，2：244-7；Haworth C等Eur.J. Immunol.1991，21：2575-2579)并直接促使炎性和自身免疫性疾病的引发和维持。其他促炎性细胞因子也发挥着作用，包括白介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-12、一氧化氮、IFN-γ和GM-CSF，而抗炎细胞因子诸如IL-10则可减轻疾病。免疫系统的细胞(尤其是巨噬细胞)响应活化刺激而分泌其中许多细胞因子。
炎性过程中涉及到多种细胞类型。单核细胞、巨噬细胞及其他免疫细胞过量产生TNFα是多种疾病发病中的关键因素。巨噬细胞和T细胞尤其在免疫应答的引发和维持中发挥着核心作用。通过病理或免疫原性刺激进行活化后，巨噬细胞通过释放出许多细胞因子作出响应，包括TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12、一氧化氮(NO)、IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CSF等等。T细胞释放IL-2、IL-4、INF-γ及其他炎性细胞因子。这些细胞因子活化其他免疫细胞，一些还可作为独立的细胞毒素剂。巨噬细胞和T细胞源性炎症介质的过量释放尤其会导致正常细胞和周围组织受到损害。
促炎性细胞因子已与HIV-AIDS和其他病毒感染(包括巨细胞病毒、流感病毒和病毒疱疹家族)有牵连。TNFα增强人巨细胞病毒的主要即刻早期增强子/启动子的基础活性，并可能在前单核细胞中的潜在HCMV感染的再活化中发挥作用(Prosch S.等Virology1995，208：197-206)。
另外，许多炎性细胞因子提高患败血病或内毒素休克的患者的死亡率。例如，TNFα和IL-1β在败血病、败血性休克和内毒素休克中具有研究透彻的核心作用。这些细胞因子的水平升高引起发烧、低血压和休克(Smith J.W.等J. Clin.Oncol.1992，10：1141-1152；Chapman P.B.等J. Clin.Oncol.1987，5：1942-1951)同时诱导磷脂酶A2(Gronich J.等J. Clin.Invest.1994，93：1224-1233)和NO合酶的基因表达。
从平滑肌细胞诱导NO介导败血性休克期间平均动脉压和体循环血管阻力的降低，从而表明NO的基础性作用。因此，靶向对IL-6、IL-8、IL-1β和NO的下调作用的疗法可能对治疗炎性疾病或障碍有益，包括黄斑变性。
IL-1和TNFα在动物模型的各种急性以及慢性反应中发挥着核心作用。另外，IL-11、IFNα和IFNβ也可上调炎性反应。相反，若干细胞因子则涉及炎性反应的下调(即，IL-4、IL-10、IL-13等等)。如实施例2和3中所示，与本发明的富含气体的流体(含T3抗原)接触的细胞表现出与含T3抗原的对照培养基中相比IFN-γ水平升高，而与含T3抗原的对照培养基中相比，IL-8则在含T3抗原的本发明的富含气体的培养基中更低。另外，IL-6、IL-8和TNFα水平在含PHA的本发明的富含气体的培养基中比在含PHA的对照培养基中更低，而IL-1β水平在含PHA的本发明的富含气体的流体中与含PHA的对照培养基相比时更低。在单独的本发明的富含气体的培养基中，IFN-γ水平比在对照培养基中高。这些结果与抗炎微环境一致。
NO被视为炎性反应的介质和介体。其具有对病原体的细胞毒性，但对受试者自身组织也有毒害作用。(Korhonen等，Curr Drug TargetsInflamm Allergy4(4)：471-9，2005)。NO与可溶性鸟苷酸环化酶反应形成环磷酸鸟苷(cGMP)，其介导NO的许多作用。NO还可与分子氧和超氧阴离子反应产生反应性氧物种，其可改变多种细胞功能。NO的这些间接作用在炎症中发挥着重要作用，其中NO通过诱导型一氧化氮合酶(iNOS)大量产生，并且反应性氧物种通过活化的免疫细胞合成。
NO可通过角化细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及可能还有其他细胞产生。NO的一些血管作用包括血管舒张、抑制血细胞与血管内皮的粘附、抑制白细胞与血管内皮的粘附以及清除超氧化物。(Shah等，Env.Health Persp.v.106(5)：1139-1143.)
此外，抑制NO的合成已表明可延迟伤口收缩、改变胶原组织以及改变和新生表皮厚度。(Amadeu和Costa，J. Cutan.Pathol.33：465-473，2006.)伤口中的肥大细胞迁移和血管新生也受NO抑制的影响。(同上)不受任何特定机理理论的束缚，在某些实施方案中，本发明的富含气体的流体可以调节局部和/或细胞NO产生或降解，与本文所公开的实施例部分中所示的伤口愈合作用的谱图一致。由于调节途径的可变性，在某些实施方案中，本发明的富含气体的流体可增加NO的产生和/或延迟NO的降解，而在某些其他实施方案中，本发明的富含气体的流体可减少NO的产生和/或加快NO的降解。
就肥大细胞迁移而言，对于富氧溶液，在早期和晚期迁移中也存在差异。这与本领域就NO合成受到抑制所知的一致(Amadeu和Costa，J. Cutan Pathol33：465-473，2006)。
在炎性过程的最初两个阶段中，外来物要么被破坏(例如，如果外来物为生物体)，要么其周围的组织被松开(例如，如果其为碎片)。在愈合阶段，炎症开始减退；个体的血管和血管模式再次变正常；以及伤口开始修复。在修复过程中的三个主要事件是(1)通过成纤维细胞增殖形成新的结缔组织；(2)上皮再生；以及(3)新的毛细血管长出。
甚至在炎症减退前，成纤维细胞就开始从周围的正常组织(其中它们通常以休眠状态存在)中进入受伤的区域。它们通过变形运动沿着纤维蛋白束迁移，并将自身分布在整个愈合区域中。在受伤组织中固定到位后，它们开始合成胶原并分泌这种蛋白，这些蛋白将自身安排到纤维中。纤维自身取向，使其纵向轴线在应力最大的方向上。随着胶原束长牢，成纤维细胞逐渐降解，并紧密附着到胶原束，而受伤的区域则转化成疤痕组织。
在疤痕组织形成的同时，伤口边缘的完整表皮细胞开始增殖并作为一个薄片向受伤区域的中心移动。随着炎症的减退，需要直接供血，在伤口部位出现血管新生。
炎症是涉及多种细胞类型的复杂过程。例如，肥大细胞释放介体，触发血管舒张的早期阶段，伴随内皮下层中内皮细胞的分离和胶原纤维的暴露。在血管中形成的细胞间隙中的纤维捕集血小板并触发这些细胞释放介体。
除了血小板外，暴露的胶原纤维还与通过扩张的血管壁的孔滤过的血浆蛋白相互作用，包括触发凝血级联、血管舒张增加、血管渗透性增加和趋化性的因子。
另外，补体级联可通过若干刺激而活化：受伤的血管、受损细胞释放的蛋白分解酶、参与的任何细菌的膜成分以及抗原-抗体复合物。一些活化的补体成分作为趋化因子发挥作用，其负责白细胞向发炎区域的流入，而其他的则有助于细胞吞噬作用并参与细胞裂解。
在特定方面，本发明的富含气体的流体或溶液还调控炎症至少一个方面中涉及到的至少一种细胞因子，所述细胞因子包括但不限于MAF(巨噬细胞活化因子)、MMIF(巨噬细胞迁移抑制因子)、MCF(巨噬细胞趋化因子)、LMIF(白细胞迁移抑制因子)、HRF(组胺释放因子)、TF(转移因子)、白介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15等)、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ζ、IFN-δ等)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞CSF)、M-CSF(巨噬细胞CSF)、多重集落刺激因子(IL-3)、成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)、EGF(上皮生长因子)、NGF(神经生长因子)、PDGF(血小板源性生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、转化生长因子(TGF-α、TGF-β等)、NAP-2(中性粒细胞活化蛋白2)、PF-4(血小板因子4)、血小板球蛋白、MCP-1(单核细胞趋化蛋白1)、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β-+(巨噬细胞炎性蛋白)、RANTES(调控活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子)、HSP(热休克蛋白)、GRP(葡萄糖调节蛋白)、泛素等等。
因此，在某些实施方案中，该富含气体的流体和/或治疗性组合物增加抗炎分子或细胞因子的产生和/或分泌和/或减少抗炎分子或细胞因子的降解，从而缓解或防止炎症(如黄斑变性)的至少一种症状。在其他实施方案中，本发明的富含气体的流体和/或治疗性组合物减少促炎性分子或细胞因子的产生和/或分泌和/或增加促炎性分子或细胞因子的降解，从而缓解或防止炎症和/或炎性神经变性的至少一种症状。
示例性相关分子相互作用：
通常，量子特性被认为属于小于10-10米的基本粒子，而我们日常生活的宏观世界被称为经典的，原因在于其表现符合牛顿运动定律。
最近，已有人描述分子形成随着稀释而尺寸增大的簇。这些簇的直径量度达若干微米，并有报告称随着稀释其尺寸非线性地增大。已假设直径量度达100纳米的量子相干域在纯水中出现，并且在相干域中水分子的集体振动可最终变为对电磁场波动的相锁定，从而提供水中的稳定振荡，提供水中溶解物质特定的长效相干振荡激发形式的“记忆”形式，其改变水的总体结构，继而可确定发生的特定相干振荡。如果这些振荡通过磁场相耦合而变稳定，则水在稀释后仍可携带“种子”相干振荡。随着一簇分子尺寸的增大，其电磁特征相应地被放大，从而加强水携带的相干振荡。
尽管溶解分子的簇大小以及水的详细微观结构存在变化，但尽管如此仍可存在相干振荡的特异性。一种考虑水性质变化的模型基于结晶中涉及到的考虑因素。
形成纳米级笼状结构的简化质子化水簇在本申请人之前的专利申请WO2009/055729中所示。质子化水簇通常呈H+(H2O)n的形式。一些质子化水簇天然存在，诸如在电离层中。不受任何特定理论的束缚，并根据特定的方面，其他类型的水簇或结构(簇、纳米笼等)也是可能的，包括赋予本发明的输出材料的含氧及稳定质子的结构。氧原子可被捕捉在所得的结构中。半结合纳米笼的化学性质允许氧和/或稳定化质子长期保持溶解。其他原子或分子(诸如药物化合物)也可被关在笼中以便持续递送。溶液材料和溶解化合物的特定化学性质取决于这些材料的相互作用。
由混合装置加工的流体之前已通过实验表明可表现出不同的结构特性，这与簇结构背景下的流体分析一致。参见例如WO2009/055729。
电荷稳定的纳米结构(如，电荷稳定的含氧纳米结构)：
如之前在本申请人的WO2009/055729的“双层效应”、“停留时间”、“注入速率”和“气泡大小测量”中所述，电动混合装置在大约毫秒级内产生独特的第一材料和第二材料非线性流体动力学相互作用，其具有复杂的、动态的扰动，从而提供与有效巨大的表面积(包括装置的表面积以及低于100nm的极小气泡的表面积)接触的复杂混合，继而提供如本文所述的新型电动效应。另外，使用包括绝缘转子和定子特征的特别设计的混合装置证实了特征局部电动效应(电压/电流)。
如本领域所熟知，电荷再分布和/或溶剂化电子已知在水性溶液中高度稳定。根据特定的方面，申请人的电动效应(如，电荷再分布，在特定方面包括溶剂化电子)出人意料地在输出材料(如盐水溶液、离子溶液)中稳定。事实上，如本文所述，本发明的电动流体(如RNS-60或Solas)的性质和生物活性的稳定性可在气密封容器中保持数月，从而表明溶解气体(如，氧)涉及到有助于生成和/或维持和/或调节本发明的溶液的性质和活性。明显地，电荷再分布和/或溶剂化电子在本发明的电动离子水性流体中稳定成形，其量足以在流体与或细胞(如，哺乳动物细胞)接触时提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节(例如，参见WO2009/055729中的细胞膜片钳工作实施例23以及如本文所述)。
如本文在“分子相互作用”下所述，为了解释本发明的电动流体(如，电动盐水溶液)的稳定性和生物相容性，申请人已提出水分子与溶于水中的物质(如氧)的分子之间的相互作用改变水的总体结构并提供纳米级笼簇，包括赋予本发明的输出材料的含氧和/或稳定化电子的纳米结构。不受机理的束缚，在特定方面纳米结构的构造使得它们：包含(至少针对形成和/或稳定性和/或生物活性)溶解气体(如，氧)；使电动流体(如RNS-60或Solas盐水流体)能够调节(如，赋予或接受)与细胞膜或其相关成分接触时的电荷和/或电荷效应；以及在特定方面，以生物学相关形式提供溶剂化电子的稳定化(如，携带、包藏、捕获)。
根据特定的方面，以及如本公开所支持，在离子或盐水(如，标准盐水，NaCl)溶液中，本发明的纳米结构包括电荷稳定的纳米结构(如，平均直径小于100nm)，其在电荷稳定的水化壳内包含至少一个溶解的气体分子(如，氧)。根据另外的方面，该电荷稳定的水化壳可包括包藏所述至少一个溶解的气体分子(如，氧)的笼或空隙。根据进一步的方面，通过提供合适的电荷稳定的水化壳，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构可另外包含溶剂化电子(如，稳定的溶剂化电子)。
不受机理或特定理论的束缚，在本发明优先权日之后，已有人提出了在水性流体中通过离子稳定的电荷稳定化微泡与环境(Bunkin等，Journal of Experimental and Theoretical Physics，104：486-498，2007；全文以引用方式并入本文)。根据本发明的特定方面，申请人的新型电动流体包含新型、生物活性形式的电荷稳定的含氧纳米结构，并可进一步包括新型阵列、簇或此类结构的缔合。
根据电荷稳定的微泡模型，水结构的短程分子有序因气体分子的存在而破坏(如，最初与非吸附性粒子复合的溶解气体分子提供短程有序缺陷)，从而提供离子液滴的凝聚，其中该缺陷被水分子的第一和第二配位层围绕，其可选地被在配位层中分别占据6个和12个空位的吸附性离子(如，获得Na+粒子的屏蔽壳形成双电层)和非吸附性粒子(如占据第二配位层的Cl-离子)填充。在不饱和离子溶液(如，不饱和盐水溶液)中，此水合“核”保持稳定，直到第一和第二层分别被六个吸附性和五个非吸附性离子填充，然后发生库仑爆炸，形成含气体分子的内部空隙，其中吸附性离子(如Na+离子)被吸附到所得空隙的表面，而非吸附性离子(或其某一部分)则扩散到溶液中(Bunkin等，同上)。在此模型中，纳米结构中的空隙通过吸附到其表面上的离子(如Na+离子)之间的库仑排斥而防止塌陷。假设含空隙纳米结构的稳定性是由于具有同样电荷的溶解离子选择性吸附到空隙/气泡表面上以及溶解气体与气泡内部气体之间的扩散平衡，其中所得双电层施加的向外静电负压提供表面张力的稳定补偿，并且气泡内部的气体压力通过环境压力得到平衡。根据该模型，此类微泡的形成需要离子组分，并且在某些方面，粒子之间碰撞介导的缔合可使得形成更大的有序簇(阵列)(同上)。
电荷稳定的微泡模型表明，粒子可以是气体微泡，但是设想只能在与环境气体平衡的离子溶液中自发形成此类结构，至于氧能否形成此类结构尚不得而知，同样，溶剂化电子是否可通过此类结构缔合和/或稳定也不清楚。
根据特定的方面，本发明的包含电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构的电动流体是新型的并与根据微泡模型的假设非电动、大气电荷稳定的微泡结构本质不同。明显地，此结论不可避免至少部分地基于以下事实：对照盐水溶液不具有本文所公开的生物学性质，而申请人的电荷稳定的纳米结构则提供新型的、生物学活性形式的电荷稳定化含氧纳米结构。
根据本发明的特定方面，申请人的新型电动装置和方法提供新型电动改变的流体，其包含大量的电荷稳定的纳米结构，这种量超过可以或不能在与空气平衡的离子流体中或在任何非电动产生的流体中自发形成的任何量。在特定方面，电荷稳定的纳米结构包括电荷稳定的含氧纳米结构。在另外的方面，电荷稳定的纳米结构全部或基本上全部为电荷稳定的含氧纳米结构，或电荷稳定的含氧纳米结构是电动流体中的主要电荷稳定的含气体纳米结构物种。
根据进一步的方面，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构可包含或包藏溶剂化电子，并因而提供新型稳定的溶剂化电子载体。在特定方面，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构提供新类型的电子化合物(或逆电子化合物)，其与具有单个有机配位阳离子的常规溶质电子化合物相反，而是具有多个围绕空隙或含氧原子的空隙稳定阵列化的多个阳离子，其中阵列化的钠离子通过水化壳而不是有机分子配位。根据特定的方面，溶剂化电子可通过水分子的水化壳容纳，或优选地容纳在分布在整个阳离子上的纳米结构空隙内。在某些方面，本发明的纳米结构在溶液中提供新型“超电子化合物”结构，方式是不仅通过提供溶剂化电子在多个阵列化钠阳离子上的分布/稳定化，还通过提供空隙中溶剂化电子与笼中氧分子的缔合或部分缔合-溶剂化电子分布在一系列钠原子和至少一个氧原子上。因此，根据特定的方面，如本文结合本发明的电动流体公开的“溶剂化电子”可以不在包含水分子的直接水合的传统模型中溶剂化。可选地，在用干燥的电子化合物盐有限类推中，本发明电动流体中的溶剂化电子可以分布在多个电荷稳定的纳米结构上，以提供“晶格胶”使水性溶液中的更高阶阵列稳定化。
在特定方面，本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构能够与细胞膜或其成分或蛋白质等相互作用，从而调节生物活性。在特定方面，本发明的包藏溶剂化电子的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构能够与细胞膜或其成分或蛋白质等相互作用，从而调节生物活性。
在特定方面，本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构与细胞膜或其成分或蛋白质等相互作用，作为电荷/或电荷效应供体(提供)和/或作为电荷和/或电荷效应受体以调节生物活性。在特定方面，本发明的包藏溶剂化电子的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构与细胞膜或其成分或蛋白质等相互作用，作为电荷/或电荷效应供体(提供)和/或作为电荷和/或电荷效应受体以调节生物活性。
在特定方面，本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构与本发明的电动流体观察到的稳定性和生物学性质一致，并对这些性质作出解释，以及进一步提供新型电子化合物(或逆电子化合物)，其在水性离子溶液(如，盐水溶液、NaCl等)中提供稳定的溶剂化电子。
在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构基本上包含电荷稳定的含氧纳米泡、呈所述纳米泡的形式或可形成所述纳米泡。在特定方面，电荷稳定的含氧簇使得形成相对更大阵列的电荷稳定的含氧纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米泡或其阵列。在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构可使得在与疏水表面接触时形成疏水纳米泡。
在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构基本上包含至少一个氧分子。在某些方面，电荷稳定的含氧纳米结构基本上包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少50个、至少100个或更多个氧分子。在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构包含或产生约20nm x1.5nm的纳米泡(如，疏水纳米泡)，包含约12个氧分子(如，基于氧分子的大小(约0.3nm x0.4nm)，n＝PV/RT的理想气体和应用的假设，其中P＝1atm、R＝0.0820571.atm/mol.K；T＝295K；V＝pr2h＝4.7x10-22L，其中r＝10x10-9m、h＝1.5x10-9m以及n＝1.95x10-22mol)。
在某些方面，存在于流体中的以离子水性流体中具有电荷稳定化成形的此类纳米结构或其阵列形式的氧分子的百分比选自大于以下值的百分比：0.1％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％以及大于95％。优选地，此百分比大于约5％、大于约10％、大于约15％或大于约20％。在另外的方面，在离子水性流体中具有电荷稳定成形的电荷稳定含氧纳米结构或其阵列的基本尺寸选自小于以下值的尺寸：100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm和1nm。优选地，该尺寸小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm、小于约20nm或小于约10nm。
在某些方面，本发明的电动流体包含溶剂化电子。在进一步的方面，本发明的电动流体包含电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构和/或其阵列，其包含以下至少一者：溶剂化电子；以及独特的电荷分布(极性、对称、非对称电荷分布)。在某些方面，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构和/或其阵列具有顺磁性。
相比之下，相对于本发明的电动流体，对照压力罐氧合流体(非电动流体)等不含能够调节细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的此类电动产生的电荷稳定的生物活性纳米结构和/或生物活性电荷稳定的含氧纳米结构和/或其阵列。
制备富含气体的流体的系统
如之前申请人的WO2009/055729专利申请中所公开的系统和方法可使气体(如，氧)在最少的被动损失的情况下高浓度地稳定富集。该系统和方法可有效地用于以高百分比将多种气体富集到多种流体中。仅以举例的方式，使用本发明所公开的系统和/或方法，在室温通常具有约2-3ppm(百万分之一)溶解氧水平的去离子水可实现以下范围内的溶解氧水平：至少约5ppm、至少约10ppm、至少约15ppm、至少约20ppm、至少约25ppm、至少约30ppm、至少约35ppm、至少约40ppm、至少约45ppm、至少约50ppm、至少约55ppm、至少约60ppm、至少约65ppm、至少约70ppm、至少约75ppm、至少约80ppm、至少约85ppm、至少约90ppm、至少约95ppm、至少约100ppm或者更大或其间的任何值。根据特定的示例性实施方案，可生成溶解氧水平为约30-60ppm的富氧水。
表3示出了在用富氧盐水溶液(表3)处理的愈合伤口中以及本发明的富含气体的富氧盐水溶液样品中获取的各种分压测量值。
表3
Figure BDA00003030967500451
施用途径和形式
在特定的示例性实施方案中，本发明的富含气体的流体可单独地或与另一种治疗剂相结合用作治疗性组合物，使得该治疗性组合物防止或缓解炎症的至少一种症状。本发明的治疗性组合物包括能够施用到对其有需要的受试者的组合物。在某些实施方案中，治疗性组合物制剂还可以包含选自以下的至少一种另外的物质：载体、佐剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、矫味剂、香料和粘结剂。
如本文所用，“药学上可接受的载体”和“载体”通常是指任何类型的无毒、惰性固体、半固体或流体填料、稀释剂、包封材料或制剂辅剂。可用作药学上可接受的载体的材料的某些非限制性实例为糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可油和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；不含热源的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒相容性润滑剂，诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂及芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可根据配制师的判断存在于组合物中。在特定方面，此类载体和赋形剂可以是本发明的富含气体的流体或溶液。
本文所述的药学上可接受的载体(例如，媒介物、佐剂、赋形剂或稀释剂)是本领域的技术人员熟知的。通常，药学上可接受的载体对治疗剂是化学惰性的，并且在使用条件下无有害副作用或毒性。药学上可接受的载体可包括聚合物和聚合物基质、纳米粒子、微泡等。
除了本发明的治疗性富含气体的流体外，治疗性组合物可进一步包含惰性稀释剂，诸如另外的不富含气体的水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽、花生、玉米、胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和山梨醇脂肪酸酯以及它们的混合物。如本领域的技术人员将认识到，特定治疗性组合物的新型改进制剂、新型富含气体的治疗性流体以及递送新型富含气体的治疗性流体的新方法可通过将一种或多种惰性稀释剂用相同、相似或不同组成的富含气体的流体进行替换而获得。例如，常规的水可用将氧混合到水或去离子水中以提供富含气体的流体而产生的富含气体的流体替换或补充。
在某些实施方案中，本发明的富含气体的流体可与一种或多种治疗剂结合和/或单独使用。在特定的实施方案中，掺入富含气体的流体可包括将本领域已知的一种或多种溶液，诸如去离子水、盐水溶液等用一种或多种富含气体的流体替换，从而提供用于递送给受试者的改进的治疗性组合物。
某些实施方案提供治疗性组合物，其包含本发明的富含气体的流体、药物组合物或其他治疗剂或药学上可接受的盐或其溶剂化物，以及至少一种药学载体或稀释剂。这些药物组合物可用于上述疾病或病症的预防和治疗中以及如上所述的疗法中。优选地，载体必须是药学上可接受的载体，并且必须与组合物的其他成分相容，即，不对其他成分产生有害作用。载体可以是固体或流体，并优选地配制成单位剂量制剂，例如，可包含0.05至95重量％的活性成分的片剂。
可能的施用途径包括口腔、舌下、颊部、肠胃外(例如，皮下、肌内、动脉内、腹膜内、脑池内、膀胱内、鞘内或静脉内)、直肠、局部(包括经皮、阴道内、眼内、耳内、鼻内、吸入)以及注射或插入可植入式装置或材料。
施用途径
针对特定受试者最合适的施用方式将取决于所治疗的疾病或病症的性质和严重性或所用疗法的性质以及治疗性组合物或另外治疗剂的性质。在某些实施方案中，口腔施用或局部施用是优选的。
适于口腔施用的制剂可作为分立的单位提供，例如片剂、胶囊、囊片、糖浆、酏剂、口香糖、“棒棒糖(lollipop)”制剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、锭剂或凝胶包衣的安瓿，每一者都含有预定量的活性化合物；作为粉末剂或颗粒剂提供；作为水性或非水性流体中的溶液剂或混悬剂提供；或作为水包油或油包水乳剂提供。
可提供适于口腔施用的另外制剂以包含可通过各种类型的计量剂量的加压气溶胶、喷雾器、雾化器或吹入器产生的细小粒子粉尘或薄雾。具体地讲，治疗剂的粉末或其他化合物可溶于或悬在本发明的富含气体的流体中。
适于经粘膜方法(诸如通过舌下或颊面施用)的制剂包括锭剂、贴片、片剂等，它们包含活性化合物以及通常还包含调味基质，诸如糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶，以及在惰性基质(诸如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶)中包含活性化合物的软锭剂(pastille)。
适于胃肠外施用的制剂通常包括无菌水性溶液，其包含预定浓度的活性富含气体的活性流体以及可能的另一种治疗剂；该溶液优选地为与预期受体的血液等渗。适于胃肠外施用的另外制剂包括含有生理上合适的共溶剂和/或络合剂诸如表面活性剂和环糊精的制剂。水包油乳剂也可适用于富含气体的流体的胃肠外施用的制剂。虽然此类溶液优选地在静脉内施用，但是它们也可通过皮下或肌内注射而施用。
适于尿道、直肠或阴道施用的制剂包括凝胶剂、霜剂、洗剂、水性或油性混悬剂、可分散粉剂或颗粒剂、乳剂、可溶性固体物质、冲洗剂(douch)等等。制剂优选地以单位剂量栓剂提供，其在形成栓剂基质的一种或多种载体(例如，可可油)中包含活性成分。可选地，可配制具有本发明的富含气体的流体的结肠洗剂，用于结肠或直肠施用。
适于局部、眼内、耳内或鼻内应用的制剂包括油膏剂、霜剂、糊剂、洗剂、凝胶剂(诸如，水凝胶)、喷雾剂、可分散粉剂和颗粒剂、乳剂、使用流动推进剂的喷雾剂或气溶胶(诸如脂质体喷雾剂、滴鼻剂、喷鼻剂等等)和油剂。此类制剂的合适石油凝胶、羊毛脂、聚乙二醇、醇类以及它们的组合。鼻腔或鼻内递送可包括计量剂量的任何这些制剂或其他制剂。同样，耳内或眼内制剂可包括滴剂、油膏剂、冲洗液等。
本发明的制剂可通过任何合适的方法配制，通常通过按所需的比例将富含气体的流体(任选地具有活性化合物)与流体或细分的固体载体或这两者均匀紧密地配混，然后在必要时将所得的混合物成型为所需的形状。
例如，可通过以下方法制备片剂：压制包含活性成分与一种或多种任选成分(诸如粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂或表面活性分散剂)的粉末或颗粒的紧密混合物，或模制粉末化活性成分与本发明的富含气体的流体的紧密混合物。
适于通过吸入而施用的制剂包含可通过各种类型的计量剂量的加压气溶胶、喷雾器、雾化器或吹入器产生的细小粒子粉尘或薄雾。具体地讲，治疗剂的粉末或其他化合物可溶于或悬于本发明的富含气体的流体中。
对于经口的肺部施用，粉末或液滴的粒度通常在0.5-10μM、优选1-5μM的范围内，以确保递送到支气管树中。对于经鼻施用，10-500μM范围内的粒度是优选的以确保留在鼻腔内。
计量剂量的吸入器是加压气溶胶喷罐，通常装有治疗剂在液化推进剂中形成的混悬剂或溶液。在某些实施方案中，如本文所公开，除了标准液化推进剂外或取代标准液化推进剂，可使用本发明的富含气体的流体。在使用期间，这些装置将制剂通过适于递送计量体积(通常为10至150μL)的阀门而排出，以产生包含治疗剂和富含气体的流体的细颗粒喷雾。合适的推进剂包括某些氯氟烃化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷以及它们的混合物。
制剂可另外包含一种或多种共溶剂，例如乙醇表面活性剂，诸如油酸或脱水山梨糖醇三油酸酯，抗氧化剂和适合的矫味剂。雾化器是可商购获得的装置，其将活性成分的溶液或悬浮液转化成治疗性气溶胶薄雾，方式为通过加速压缩气体(通常为空气或氧气)通过窄文丘里孔，或者通过超声搅拌。适用于雾化器的制剂由富含气体的流体中的并占制剂最多40重量％优选低于20重量％的另一种治疗剂组成。此外，可以使用其他载体，诸如蒸馏水、无菌水或稀水性醇溶液，优选地通过加入盐诸如氯化钠制备为与体液等渗。任选的添加剂包括防腐剂，尤其是当制剂不是以无菌方式制备时，并可包括羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂、矫味剂、挥发油、缓冲剂和表面活性剂。
适于通过吹入施用的制剂包括细粉碎的粉末，其可通过吹入器递送或以鼻烟的方式送入鼻腔。在吹入器中，粉末被容纳在通常由明胶或塑料制成的胶囊或药筒中，其被原位刺穿或打开，粉末在吸入时通过穿过装置的空气而递送，或通过手动操作的泵而递送。吹入器中所用的粉末仅由活性成分组成或由包含活性成分、合适的粉末稀释剂(诸如乳糖)和任选的表面活性剂的粉末共混物组成。活性成分通常占制剂的0.1至100重量％。
除了上文具体提及的成分外，本发明的制剂可包含本领域技术人员就组织中的制剂类型所知的其他物质。例如，适于经口施用的制剂可包含矫味剂，以及适于鼻内施用的制剂可包含香料。
本发明的治疗性组合物可通过可与药物(作为单独的治疗剂或与治疗剂相结合)联合使用的任何常规方法施用。
施用的剂量当然将根据已知的因素而变化，诸如特定药剂的药效动力学特性及其施用模式和途径；受体的年龄、健康情况和体重；症状的性质和程度；同步治疗的种类；治疗的频率；以及所需的效果。活性成分的每日剂量预计可为约0.001至1000毫克(mg)每千克(kg)体重，优选剂量为0.1至约30mg/kg。根据某些方面，活性成分的每日剂量可为.001升至10升，优选的剂量为约.01升至1升。
剂量形式(适于施用的组合物)每单位包含约1mg至约500mg活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将通常以组合物总重量的约0.5-95重量％存在。
油膏剂、糊剂、泡沫剂、闭塞剂(occlusion)、霜剂和凝胶剂可包含赋形剂，诸如淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、硅酮、膨润土、硅石和滑石或它们的混合物。粉末剂和喷雾剂也可包含赋形剂，诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝和硅酸钙，或这些物质的混合物。纳米晶抗微生物金属的溶液可通过任何已知的通常用于制备气溶胶药物的方式转化成气溶胶或喷雾剂。一般来讲，此类方法包括加压溶液容器或提供加压溶液容器的方法，通常使用惰性载气，以及使压缩气体通过小孔。喷雾剂另外可包含惯用的推进剂，诸如氮气、二氧化碳和其他惰性气体。此外，微球或纳米粒子可与本发明的富含气体的治疗性组合物或流体一起用于将治疗性化合物施用给受试者所需的任何途径。
注射用制剂可存在于单位剂量或多剂量密封容器中，诸如安瓿和小瓶中，并可保存在只需在紧接使用前添加无菌流体赋形剂或富含气体的流体的冷冻干燥(冻干)条件下。即时注射溶液和混悬液可通过无菌粉末、颗粒和片剂制备。对注射用组合物的有效药物载体的要求对本领域的技术人员而言是熟知的。参见例如：Pharmaceutics andPharmacy Practice，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa.，Banker和Chalmers编辑，238-250(1982)以及ASHP Handbook on InjectableDrugs，Toissel，第4版，622-630(1986)。
适于局部施用的制剂包括含有本发明的富含气体的流体和任选地另外的治疗剂和芳香剂(通常为的蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶)的锭剂；在惰性基质(诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶)中包含富含气体的流体和任选的另外治疗剂的软锭剂；以及在合适的流体载体中包含富含气体的流体和任选的另外治疗剂的漱口剂或漱口水；以及霜剂、乳剂、凝胶剂等等。
另外，适用于经直肠施用的制剂可通过混合多种基质(诸如乳化基质或水溶性基质)以栓剂提供。适用于经阴道施用的制剂可作为阴道栓剂、卫生棉条(tampon)、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾配方提供，它们除了活性成分外还包含本领域已知合适的载体。
合适的药用载体在Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company(本领域的标准参考文献)中有所描述。
在本发明背景下施用给受试者特别是动物尤其是人的剂量应足以在合理的时间段内在动物中实现治疗反应。本领域的技术人员将认识到剂量将取决于多种因素，包括动物的病症、动物的体重以及治疗的病症。合适的剂量为将会在受试者中产生已知会影响所需反应的治疗组合物浓度的量。
剂量大小还将通过施用途径、时间和频率以及可伴随治疗性组合物的施用的任何副作用的存在性、性质和程度以及所需的生理效应而决定。
将认识到，组合的化合物可：(1)通过在共同制剂中组合化合物而同时施用，或(2)通过交替施用，即，在单独的药物制剂中按顺序地、依次地、平行地或同时地递送化合物。在交替疗法中，施用第二种、和任选地第三种活性成分的延迟不应丧失活性成分的组合所带来的协同治疗效果的益处。根据某些实施方案，通过施用方法(1)或(2)，理想的是，应施用组合以达到最有效的结果。在某些实施方案中，通过施用方法(1)或(2)，理想的是，联合用药应达到每种活性成分的峰值血浆浓度。通过施用联合共同制剂的每日一次一粒药丸的方案对患有黄斑变性的某些患者是可行的。根据某些实施方案，组合的活性成分的有效峰值血浆浓度将在约0.001至100μM的范围内。最佳的峰值血浆浓度可通过开具给特定患者的制剂和给药方案而实现。还将理解的是，本发明的流体以及选自抗血管新生(anti-VEGF)治疗剂、简单膳食补充剂以及他汀类或其任何生理功能衍生物的至少一种另外的治疗剂(无论单独地还是顺序地提供)可单独地、多次地或以其任何组合而施用。一般来讲，在交替疗法(2)期间，每种化合物的有效剂量按顺序施用，而在共同制剂疗法(1)中，两种或更多种化合物的有效剂量同时施用。
本发明的组合可便利地作为单位剂量形式的药物制剂提供。便利的单位剂量制剂包含的活性成分的每一者的量为1mg至1g的任何量，例如但不限于10mg至300mg。与以下药剂结合的本发明流体的协同效应可在宽比率范围内实现，例如1∶50至50∶1(本发明流体：另外治疗剂)：奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮、莫雷西嗪、普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆、E-4031、维拉帕米、地尔硫卓、腺苷、地高辛、硫酸镁、华法令、肝素、抗血小板药物(例如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(例如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(例如依普利酮和螺甾内酯)、毛地黄、利尿剂、地高辛、正性肌力药物(例如米力农)、血管扩张剂和ω-3脂肪酸(联合疗法)。在一个实施方案中，该比率可以在约1∶10至10∶1。在另一个实施方案中，在共同配制的复方剂型诸如丸剂、片剂、囊片或胶囊中本发明流体与奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮、莫雷西嗪、普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆、E-4031、维拉帕米、地尔硫卓、腺苷、地高辛、硫酸镁、华法令、肝素、抗血小板药物(例如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(例如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(例如依普利酮和螺甾内酯)、毛地黄、利尿剂、地高辛、正性肌力药物(例如米力农)、血管扩张剂和ω-3脂肪酸(联合疗法)的重量比将为约1，即大约等量的本发明流体与奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮、莫雷西嗪、普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆、E-4031、维拉帕米、地尔硫卓、腺苷、地高辛、硫酸镁、华法令、肝素、抗血小板药物(例如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(例如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(例如依普利酮和螺甾内酯)、毛地黄、利尿剂、地高辛、正性肌力药物(例如米力农)、血管扩张剂和ω-3脂肪酸。在其他示例性的复合制剂中，可以存在更多或更少的本发明流体与奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮、莫雷西嗪、普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆、E-4031、维拉帕米、地尔硫卓、腺苷、地高辛、硫酸镁、华法令、肝素、抗血小板药物(例如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(例如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(例如依普利酮和螺甾内酯)、毛地黄、利尿剂、地高辛、正性肌力药物(例如米力农)、血管扩张剂和ω-3脂肪酸。在一个实施方案中，每种化合物将按单独使用时表现出抗炎活性的量用在组合中。在本发明的范围内设想了所述组合的化合物的其他比率和量。
单位剂量形式可进一步包含本发明流体与奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮、莫雷西嗪、普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆、E-4031、维拉帕米、地尔硫卓、腺苷、地高辛、硫酸镁、华法令、肝素、抗血小板药物(例如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(例如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(例如依普利酮和螺甾内酯)、毛地黄、利尿剂、地高辛、正性肌力药物(例如米力农)、血管扩张剂和ω-3脂肪酸，或其任意一者的生理功能衍生物，以及药学上可接受的载体。
本领域的技术人员将认识到，用于治疗所需的本发明组合中活性成分的量将根据多种因素而变化，包括所治疗的病症的性质以及患者的年龄和状况，并将最终由主治医生或保健医师决定。要考虑的因素包括但不限于施用途径和制剂性质，动物体重、年龄和整体状况，以及待治疗的疾病的性质和严重性。
还可能的是，将用于同时或顺序施用的单位剂量形式中活性成分的任何两种与第三种活性成分组合。三部分组合可同时地或按顺序地施用。当按顺序施用时，组合可以两次或三次施用。根据某些实施方案，三部分组合本发明的流体与奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮、莫雷西嗪、普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆、E-4031、维拉帕米、地尔硫卓、腺苷、地高辛、硫酸镁、华法令、肝素、抗血小板药物(例如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(例如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(例如依普利酮和螺甾内酯)、毛地黄、利尿剂、地高辛、正性肌力药物(例如米力农)、血管扩张剂和ω-3脂肪酸。
以下实施例意在仅为例证性的，不以任何方式进行限制。
实施例1
(微泡大小)
本实施例基于申请人已公布的美国专利申请序列号11/978,137的实施例2，该专利关于气泡大小的教导以引用的方式并入本文。通过使用本发明的扩散器用富含气体的流体进行了实验，以便确定气体微泡大小限值。通过使富含气体的流体通过0.22和0.1微米的过滤器确立了微泡大小限值。在执行这些测试时，一定体积的流体通过本发明的扩散器并生成富含气体的流体。将六十毫升这种流体吸入60ml注射器。然后通过温克勒尔滴定测量了注射器中流体的溶解氧水平。将注射器中的流体通过0.22微米Millipore Millex GP50过滤器注射进50ml烧杯中。然后测量50ml烧杯中材料的溶解氧率。进行实验三次，得到下表4中所示的结果。
表4：过滤后的溶解氧测量。
Figure BDA00003030967500561
可以发现，在注射器内测得的溶解氧水平和50ml烧杯中的溶解氧水平在将扩散材料通过0.22微米过滤器后未明显变化，这意味着流体内的溶解氧的微泡不大于0.22微米。
进行了第二测试，其中将一批盐水溶液用本发明的扩散器富集，以未过滤的状态采集输出溶液的样品。未过滤样品的溶解氧水平为44.7ppm。将0.1微米过滤器用于过滤得自本发明扩散器的富氧溶液，采集了另外两个样品。对于第一个样品，溶解氧水平为43.4ppm。对于第二个样品，溶解氧水平为41.4ppm。最后，移除过滤器，从未过滤的溶液中采集最终样品。在此情况下，最终样品的溶解氧水平为45.4ppm。这些结果与使用Millipore0.22微米过滤器的结果一致。
因此，盐水溶液中大部分的气泡或微泡的尺寸约小于0.1微米。该结果已通过AFM测量和激光光谱研究加以证实。
实施例2
(测定了细胞因子谱)
本实施例基于申请人已公布的美国专利申请序列号12/435,356的实施例5，该专利关于细胞因子谱对电动流体的反应的教导以引用的方式并入本文。从一名健康自愿捐献者获得混合淋巴细胞。根据标准程序洗涤血沉棕黄层样品，以除去血小板。将淋巴细胞以2x106个/板的浓度接种到用本发明的富含气体的流体或蒸馏水(对照)稀释的RPMI培养基(+50mm HEPES)中。将细胞用1微克/毫升T3抗原或1微克/毫升植物血球凝集素(PHA)(全T细胞活化剂)刺激，或不进行刺激(隐性对照)。24小时温育后，检查细胞的活力，提取上清液并冷冻。
将上清液解冻、离心，使用
Figure BDA00003030967500571
(Luminex)bead lite方案和平台测试细胞因子表达。
将两百万个细胞接种到24孔板的6个孔中，孔中含有完全RPMI+50mm Hepes以及本发明的富含氧的流体(水)(第1、3和5个孔)或蒸馏水(第2、4和6个孔)(用水将10X RPMI稀释到1x)。将细胞用1μg/ml T3抗原(第1和2个孔)或PHA(第3和4个孔)刺激。第5和6个对照孔不进行刺激。24小时后，检查细胞的活力，采集并冷冻上清液。接下来，解冻上清液，以8,000g离心沉淀。使用LUMINEXBEAD LITETM方案和平台测定澄清上清液中的所列细胞因子。数据在表5中列出，相应的条形图在图1中示出。要注意的是，与含T3抗原的对照培养基中相比，在含T3抗原的本发明的富含气体的培养基中IFN-γ水平更高，而与含T3抗原的对照培养基中相比，IL-8在含T3抗原的本发明的富含气体的培养基中更低。另外，IL-6、IL-8和TNFα水平在含PHA的本发明的富含气体的培养基中比在含PHA的对照培养基中更低，而IL-1β水平在含PHA的本发明的富含气体的流体中与含PHA的对照培养基相比时更低。在单独的本发明的富含气体的培养基中，IFN-γ水平比在对照培养基中高。
表5
样品 IFN Il-10 Il-12p40 Il-12p70 Il-2 Il-4 Il-5 Il-6 Il-8 Il-ib IP-10 TNFa
1 0 0 0 2.85 0 0 7.98 20.3 1350 7.56 11500 15.5
2 0 0 0 3.08 0 0 8 15.2 8940 3.68 4280 7.94
3 0 581 168 3.15 0 0 8 16400 2200 3280 862 13700
4 0 377 56.3 4.22 0 0 8.08 23800 22100 33600 558 16200
5 0 0 0 2.51 0 0 7.99 24 1330 7.33 5900 8.55
6 0 0 0 2.77 0 0 8 5.98 3210 4.68 3330 0
实施例3
(细胞因子表达)
本实施例基于申请人已公布的美国专利申请序列号12/435,356的实施例6，该专利关于细胞因子谱对电动流体的反应的教导以引用的方式并入本文。在特定方面，将人混合淋巴细胞在本发明的电动流体或对照流体中用T3抗原或PHA刺激，并评价IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、嗜酸性粒细胞活化趋化因子、IFN-γ、GM-CSF、MIP-1β、MCP-1、G-CSF、FGFb、VEGF、TNF-α、RANTES、瘦素、TNF-β、TFG-β和NGF的变化。如可从图1中所见，所测试的促炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6和GM-CSF)、趋化因子(IL-8、MIP-1α、RANTES和嗜酸性粒细胞活化趋化因子)、炎性酶(iNOS、COX-2和MMP-9)、过敏原反应(MHC II类、CD23、B7-1和B7-2)以及Th2细胞因子(IL-4、IL-13和IL-5)在测试流体中与对照流体相比有所减少。相比之下，所测试的抗炎性细胞因子(如IL1R-α、TIMP)在测试流体中与对照流体相比有所增加。
为了扩展这些数据，申请人使用了本领域公认的涉及卵清蛋白致敏的模型系统，以评估变应性超敏反应。研究的终点指标是反应的特定细胞学和细胞组分，以及蛋白和LDH的血清学测定。进行了细胞因子分析，包括嗜酸性粒细胞活化趋化因子、IL-1α、IL-1β、KC、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、RANTES、TNF-α和VCAM的分析。
简而言之，在第1、2和3天向雄性棕色挪威(Norway)大鼠腹膜内注射含有氢氧化铝(Al(OH)3)(200mg/mL)的0.5mL卵清蛋白(OVA)V级(A5503-1G， Sigma)溶液(2.0mg/mL)，每天一次。研究为随机化的2x2因子排列的处理(4组)。在使免疫反应发生的两周等待期后，将大鼠暴露于以下盐水或用以下盐水处理一周：RDC1676-00(通过Revalesio专有装置处理的无菌盐水)和RDC1676-01(通过Revalesio专有装置处理并添加了另外的氧的无菌盐水)。在一天一次为期1周的处理结束时，将2组各分成两半，每组50％的大鼠通过吸入接受盐水或OVA挑战。
具体地讲，在初始致敏后14天，将12只大鼠通过吸入暴露于RDC1676-00，每天30分钟，连续7天。将通过系统的空气流速设为10升/分钟。将总共12只大鼠在饼图式构造的室(pie chamber)内对齐，该室具有单个孔以供雾化材料进入并均匀分布到Aeroneb的12个小室。
在初始致敏后15天，通过超声雾化将12只大鼠暴露于RDC1676-01，每天30分钟，连续7天。使用相同的雾化器和室将流速也设为10升/分钟。首先雾化RDC1676-00，在雾化RDC1676-01前将Aeroneb室彻底干燥。
在最后一次雾化处理后约2小时，将RDC1676-00组中的6只大鼠用通过使用Penn Century Microsprayer(型号1A-1B)进行的气管滴注而递送的OVA(1％的盐水溶液)再次挑战。将RDC1676-00组中的另外6只大鼠用通过气管滴注而递送的盐水挑战作为对照组。第二天，对RDC1676-01组重复以上步骤。
再次挑战后24小时，将各组中的所有大鼠通过过量服用戊巴比妥钠实施安乐死。从下腔静脉采集全血样品，置于两根不同的采血管中：Qiagen PAXgeneTM血液RNA采集管和Qiagen PAXgeneTM血液DNA采集管。处理肺器官得到用于RT-PCR的支气管肺泡灌洗(BAL)液和肺组织，以评估该模型中已知与肺部炎症相关的细胞因子表达标记物的变化。采用了单侧灌洗技术以便保持肺右侧4个肺叶的完整性。灌洗了左侧“大”肺叶，而将4个右侧肺叶结扎，立即置于TRI-zolTM中，匀化，然后送往实验室进一步处理。
BAL分析。采集肺灌洗液，在4℃下以600-800g离心10分钟以使细胞沉淀。将上清液转移到新的管中，在-80℃下冷冻。将支气管灌洗液(“BAL”)分成两等份。将第一等分试样离心，将上清液在碎干冰上速冻，置于-80℃下，运输到实验室进一步处理。所存在的蛋白和LDH的量分别表示血清蛋白(该蛋白是一种血清组分，如在本实验中挑战时，通过膜漏出)水平和细胞死亡。专有测试装置表明蛋白比对照略少。
评价了支气管灌洗液第二等分试样的总蛋白和LDH含量，并接受细胞学检查。处理组表明总细胞数大于盐水对照组。另外，处理组与对照组相比，嗜酸性粒细胞增加。处理组与对照组相比，多形核细胞数也略有不同。
血液分析。通过将1.2-2.0mL全血转入试管并使其凝结至少30分钟而对全血进行分析。保存剩余的血样(约3.5-5.0mL)用于通过TRI-zolTM或PAXgeneTM抽提RNA。接下来，将凝结的血样在室温下以1200g离心10分钟。移除血清(上清液)，置于两根新的管中，将血清在-80℃下储存。
对于利用Tri-Reagent(TB-126，Molecular Research Center，Inc.)的RNA抽提，将0.2mL全血或血浆添加到0.75mL TRI Reagent BD中，其每0.2mL全血或血浆补充了20μL5N的乙酸。摇动试管，然后储存在-80℃下。利用PAXgeneTM，将试管在室温下温育约两小时。然后，将试管适当放置，储存在-20℃的冷冻机中24小时，然后转移到-80℃下长期储存。
Luminex分析。通过Luminex平台，使用微珠分析作为抗体相关结合反应(以光度单位读取)的底物，并可与定量标准品进行比较。各血样以2个样品同时运行。计量单位为光度单位，将试验组分成OVA挑战对照、OVA挑战处理以及专有流体的盐水挑战处理。
对于Agilant基因芯片数据生成，分离肺组织，然后浸入TRIReagent(TR118，Molecular Research Center，Inc.)。简而言之，将大约1mL TRI Reagent加入各试管中的50-100mg组织。将样品在TRIReagent中使用glass-TeflonTM或PolytronTM匀化器匀化。将样品储存在-80℃下。
血样：
图2-11显示了全血样品评估的结果。
示例性图2显示了血样数据的基本光度数据表现格式。表示所测细胞因子(在此情况下为KC)的种类的字母位于各数字数据的右上方。该数据被表示为各样品的数据点(上图)和条形图(下图)。在任一种情况下，图线均从左向右分成四组。前两组(分别为RDC1676-00OVA和RDC1676-01OVA)为通过吸入OVA再次挑战的那些，而后两组(分别为RDC1676-00OVA和RDC1676-01OVA)为仅通过盐水对照再次挑战的那些。另外，后缀00代表盐水处理，后缀01代表本发明的电动流体处理组。
将各血样分成2个样品，两样品同时运行。计量单位为光度单位，从左向右的分组为：OVA挑战的对照；OVA挑战的本发明的电动流体处理；然后为盐水挑战的盐水处理；以及盐水挑战的本发明的电动流体处理。为了便于查看，将RDC1676-01组均以灰色阴影背景突出显示，而对照盐水处理组的背景没有阴影。
一般来讲，比较左边两组时，虽然RDC1676-01组数据的分布有点大，但是RDC1676-01组中的特定细胞因子水平作为一个整体低于对照处理组中的样品；通常在2组之间约30％的数值差异。一般来讲，比较最右边两组时，RDC1676-01组与RDC1676-00组相比具有略高的数值。
图3显示了根据特定的示例性方面在血样数据中的RANTES(IL-8超家族)分析。最左边两组(OVA挑战组)的光度单位表明一般来讲RDC1676-01处理组的值低于RDC1676-00对照组，如上图部分中的点阵图所示，其再次显示了两组之间30-35％的差异；而在仅暴露于盐水的组中，细胞因子水平值大致相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图4显示了根据特定的示例性方面在血样数据中的MCP-1分析。最左边两组(OVA挑战组)的光度单位表明一般来讲RDC1676-01处理组的值低于RDC1676-00对照组，如上图部分中的点阵图所示；而在仅暴露于盐水的组中，细胞因子水平值大致相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图5显示了根据特定的示例性方面在血样数据中的TNFα分析。最左边两组(OVA挑战组)的光度单位表明一般来讲RDC1676-01处理组的值低于RDC1676-00对照组，如上图部分中的点阵图所示；而在仅暴露于盐水的组中，细胞因子水平值大致相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图6显示了根据特定的示例性方面在血样数据中的MIP-1α分析。最左边两组(OVA挑战组)的光度单位表明一般来讲RDC1676-01处理组的值低于RDC1676-00对照组，如上图部分中的点阵图所示；而在仅暴露于盐水的组中，细胞因子水平值大致相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图7显示了根据特定的示例性方面在血样数据中的IL-1α分析。最左边两组(OVA挑战组)的光度单位表明一般来讲RDC1676-01处理组的值低于RDC1676-00对照组，如上图部分中的点阵图所示；而在仅暴露于盐水的组中，细胞因子水平值大致相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图8显示了根据特定的示例性方面在血样数据中的Vcam分析。最左边两组(OVA挑战组)的光度单位表明一般来讲RDC1676-01处理组的值低于RDC1676-00对照组，如上图部分中的点阵图所示；而在仅暴露于盐水的组中，细胞因子水平值大致相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图9显示了根据特定的示例性方面在血样数据中的IL-1β分析。最左边两组(OVA挑战组)的光度单位表明一般来讲RDC1676-01处理组的值低于RDC1676-00对照组，如上图部分中的点阵图所示；而在仅暴露于盐水的组中，细胞因子水平值大致相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图10和11分别显示了根据特定的示例性方面在血样数据中的嗜酸性粒细胞活化趋化因子和MCP-3分析。在每种情况下，最左边两组(OVA挑战组)的光度单位表明一般来讲RDC1676-01处理组的值低于RDC1676-00对照组，如上图部分中的点阵图所示；而在仅暴露于盐水的组中，细胞因子水平值大致相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
支气管灌洗样品：
图12-21显示了支气管肺泡灌洗液(BAL)样品评价的相应结果。
图12根据特定的示例性方面显示了BAL数据中的KC分析。在此情况下，与采样变化性相结合的反应水平在RDC1676-01与RDC1676-00处理组之间的差异方面是不确定的；也就是说，KC在两组之间表现出相对小的差异，但光度单位非常小。
同样，图13根据特定的示例性方面显示了BAL数据中的RANTES分析，并表明RDC1676-01组中显著的变化性，其中一个读数显著高于其他读数，从而使结果发生偏差。
同样，图14根据特定的示例性方面显示了BAL数据中的TNFα分析，并表明在RDC1676-01与RDC1676-00处理组之间的差异方面显著性相对较小。
同样，图15根据特定的示例性方面显示了BAL数据中的MCP-1分析，并表明在RDC1676-01与RDC1676-00处理组之间的差异方面显著性相对较小。
图16至21根据特定的示例性方面分别显示了BAL数据中的MIP1-A、IL-1α、Vcam、IL-1β、MCP-3和嗜酸性粒细胞活化趋化因子分析，并表明在RDC1676-01与RDC1676-00处理组之间的差异方面显著性相对较小。
概括地说，对已知致敏的炎性反应的该标准测定法至少在血样中产生明显的临床和血清影响。另外，虽然在该过程中大量的对照动物受生理应激并接近死亡，但是RDC1676-01处理组无一表现出此类临床应激效应。这继而反映在细胞因子的循环水平中，其中在OVA挑战组中在RDC1676-01处理组与RDC1676-01处理组之间存在约30％的差异。相比之下，在非OVA挑战组中在RDC1676-01处理组与RDC1676-01处理组之间细胞因子、细胞和血清学谱存在小而微不足道的变化，其可能仅代表流体本身的细微基线变化。
实施例4
(用本发明的电动产生的流体处理原代支气管上皮细胞(BEC)导致了气道炎性通路的两种关键蛋白MMP9和TSLP的表达和/或活性降低)
概述。本实施例基于申请人已公布的美国专利申请序列号12/435,356的实施例9，该专利关于电动流体调节炎性反应的教导以引用的方式并入本文。申请人之前已证实结合B2受体的缓激肽为浓度依赖性的，并且其结合亲和力在本公开的电动产生的流体(例如Rev；富含气体的电动产生的流体)中与生理盐水中相比得以提高。另外，如实施例7在用柴油机废气颗粒物(PM，标准商业来源)刺激的调节性T细胞背景下所示，数据表明在存在PM和Rev的情况下相对于对照流体(无Rev，无Solis)中的PM而言调节性T细胞增殖降低(图22)，从而表明本发明的电动产生的流体Rev改善了调节性T细胞功能；例如，如该测定法中相对低的增殖所证实。此外，暴露于本发明的流体导致了相对于盐水和培养基对照(无PM)而言IL-10的产生得以维持或只是略微降低。同样，在用颗粒物(PM)刺激的外周血单核细胞(PBMC)的过敏性哮喘(AA)谱的背景下，数据表明暴露于本公开的流体(“PM+Rev”)导致了与盐水和培养基对照的相应值相似的明显更低的类胰蛋白酶水平。另外，实施例7和图22-29中所示的白喉毒素(DT390，截短的白喉毒素分子；1∶50稀释度的标准商业浓度)的作用表明β阻滞、GPCR阻滞和钙通道阻滞会影响电动产生的流体对Treg和PBMC功能的活性。此外，申请人之前的数据表明，根据另外的方面，暴露于本发明的流体后，紧密连接相关蛋白在肺组织中上调。数据表明连接粘附分子JAM2和3，GJA1、3、4和5(缝隙连接蛋白)，OCLN(occludin)，claudin(如CLDN3、5、7、8、9、10)，TJP1(紧密连接蛋白1)分别上调。此外，本发明的电动产生的流体(例如，RNS-60)会影响支气管上皮细胞(BEC，例如Calu-3)中全细胞电导的调节(例如，在超极化条件下)，并根据另外的方面，全细胞电导的调节反映了离子通道的调节。
在此实施例中，申请人已通过开展另外的实验来测量气道炎性通路中的两种关键蛋白的生成的影响而扩展了这些发现成果。具体地讲，在原代支气管上皮细胞(BEC)中测定了MMP9和TSLP。
材料和方法：
将市售的原代人支气管上皮细胞(BEC)(得自Promocell，Germany的HBEpC-c)用于这些研究。将大约50,000个细胞接种到12孔板的每个孔中，直到达到约80％的汇合度。然后将细胞用生理盐水、对照流体Solas或测试流体Revera60以1∶10的稀释度(100ul溶于1ml气道上皮细胞生长培养基)与柴油机废气颗粒物(DEP或PM)一起处理6小时，再提升进行FACS分析。MMP9和TSLP受体抗体均得自BDBiosciences，并根据制造商规范使用。
结果：
申请人表明测试材料Revera60将支气管上皮细胞(BEC)中DEP诱导的TSLP受体表达降低了约90％。Solas导致了55％的TSLP受体表达降低，而生理盐水未能产生类似的TSLP受体表达降低水平(降低约20％)。本发明的溶液在降低TSLP受体表达方面的作用鉴于以下最近研究成果是一项重大发现：TSLP在过敏性哮喘的病理学中发挥着关键作用，局部抗体介导的TSLP受体功能阻断缓解了过敏性疾病(Liu，YJ，Thymic stromal lymphopoietin：Master switch for allergicinflammation，J Exp Med203：269-273，2006；Al-Shami等，A role forTSLP in the development of inflammation in an asthma model，J ExpMed202：829-839，2005；以及Shi等，Local blockade of TSLP receptoralleviated allergic disease by regulating airway dendritic cells，ClinImmunol.2008年8月29日.(Epub先于印刷))。
同样，图39显示了Revera60、Solas和生理盐水对DEP介导的MMP9升高的影响。具体地讲，Revera60抑制了支气管上皮细胞中DEP诱导的细胞表面结合MMP9水平，幅度达约80％、Solas具有约70％的抑制效应，而生理盐水(NS)只有轻微的影响，即降低约20％。MMP-9是气道炎症和哮喘支气管重塑中涉及到的主要蛋白酶之一。最近，已证实与健康的对照受试者相比MMP-9的水平在患有稳定哮喘的患者中明显升高，在患有急性哮喘的患者中甚至更高。MMP-9在气道炎性细胞的浸润以及气道高反应性的诱导中发挥着至关重要的作用，从而表明MMP-9可能在引起和维持哮喘中具有重要的作用(Vignola等，Sputum metalloproteinase-9/tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1ratio correlates with airflow obstruction in asthmaand chronic bronchitis，Am J Respir Crit Care Med158：1945-1950，1998；Hoshino等，Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagendeposition by modulation of the balance between matrixmetalloproteinase-9and tissue inhibitor of metalloproteinase-1expressionin asthma，J Allergy Clin Immunol104：356-363，1999；Simpson等，Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilicasthma，Am J Respir Crit Care Med 172：559-565，2005；Lee等，A murinemodel of toluene diisocyanate-induced asthma can be treated with matrixmetalloproteinase inhibitor，J Allergy Clin Immunol108：1021-1026，2001；以及Lee等，Matrix metalloproteinase inhibitor regulatesinflammatory cell migration by reducing ICAM-1and VCAM-1expression in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma，JAllergy Clin Immunol2003；111：1278-1284)。
因此，根据附加的方面，本发明的电动产生的流体对于调节(如，降低)TSLP受体表达和/或抑制MMP-9的表达和/或活性具有明显的治疗效用，包括(例如)对于治疗炎症和哮喘。
实施例5
(经证实本发明的电动产生的流体在本领域公认的过敏性哮喘动物模型中与布地奈德具有协同抗炎作用)
本实施例基于申请人已公布的美国专利申请序列号12/435,356的实施例10，该专利关于在哮喘模型的背景下电动流体调节炎性反应的教导以引用的方式并入本文。本工作实施例描述为评价本发明的电动学产生的流体(如RDC-1676-03)在棕色挪威大鼠卵清蛋白致敏模型中的气道抗炎特性而开展的实验。棕色挪威大鼠是用于确定测试材料对气道功能影响的本领域公认的模型，该品系已广泛用作(例如)过敏性哮喘模型。在该模型中通过卵清蛋白致敏而诱导的气道病理和生化改变与在人类中观察到的相似(Elwood等，J Allergy Clin Immuno88：951-60，1991；Sirois&Bissonnette，Clin Exp Immunol126：9-15，2001)。选择吸入途径，使肺部对测试材料或对照溶液的暴露量最大。将卵清蛋白致敏的动物用单独的或与测试材料RDC1676-03相结合的布地奈德在卵清蛋白挑战前处理7天。挑战后6小时和24小时，测量了总血细胞计数和多种促炎性细胞因子和抗炎细胞因子的水平以及各种呼吸参数，以估计施用测试材料对各种炎症参数的任何有益影响。
材料和方法：
Bn/Crl品系棕色挪威大鼠得自Charles River Kingston，在实验开始时体重约275±50g。所有动物研究的开展均得到PCS-MTL机构动物护理和使用委员会(PCS-MTL Institutional Animal Care and UseCommittee)的批准。在研究中，根据USA National Research Council以及Canadian Council of Animal Care的指导原则进行动物的使用和护理。
致敏。在实验第1天，将动物(每个处理组14只动物)通过腹膜内注射1ml新配制的溶液(每1ml0.9％的氯化钠溶液含2mg卵清蛋白/100mg氢氧化铝)然后在第3天重复注射而致敏。
处理。在初次致敏后15天，使动物暴露于雾化的对照溶液(生理盐水)或测试溶液(电动产生的流体RDC1676-00、RDC1676-02和RDC-1676-03)，它们单独地施用或结合布地奈德施用，每日一次，一次15分钟，连续7天。将动物置于约20L的全身式暴露箱中定量施用，使用由Buxco偏流泵供气的Aeroneb超声雾化器产生测试气氛送入暴露箱空气入口。气流量设为10升/分钟。
卵清蛋白挑战。在第21天，用测试溶液处理后2小时，将所有动物用1％卵清蛋白雾化溶液挑战15分钟(以2L/min的气流量在全身式暴露箱中)。
样品采集。在卵清蛋白挑战后6小时和24小时时间点，采集血样用于总血细胞计数和分化血细胞计数以及测量各种促炎性细胞因子和抗炎细胞因子水平。此外，在卵清蛋白挑战后立刻以及6小时和24小时时，使用Buxco Electronics BioSystem XA系统测量了为期10分钟的增强呼气间歇Penh和潮气量。
结果：
嗜酸性粒细胞计数：如预期和图35所示，布地奈德处理(“NS+布地奈德750μg/Kg”；密集阴影条形图)相对于仅生理盐水“NS”对照处理(空白条形图)降低了挑战动物中的总嗜酸性粒细胞计数。另外，虽然仅用本发明的流体“RDC1676-03”(稀疏阴影条形图)并未明显降低嗜酸性粒细胞计数，但尽管如此仍显示出与布地奈德在降低嗜酸性粒细胞计数方面的显著协同作用(“RDC1676-03+布地奈德750μg/Kg”，深色实线条形图)。相似地，在图36中，嗜酸性粒细胞％也反映出相似的趋势。虽然单独的RDC1676-03(稀疏阴影条形图)或布地奈德750ug/kg(密集阴影条形图)对挑战动物中的嗜酸性粒细胞％并无显著影响，但两者相结合却明显降低了嗜酸性粒细胞％(深色实线条形图)。
因此，图35和图36根据本发明的特定方面显示了经证实本发明的电动产生的流体(如RDC1676-03)与布地奈德相结合具有显著的协同效用，在本领域公认的人过敏性哮喘大鼠模型中明显降低嗜酸性粒细胞计数(“嗜酸性粒细胞％”和总计数)。
呼吸参数：
申请人展示测试流体对卵清蛋白挑战后立即、6小时和24小时测量的Penh和潮气量的观测影响。Penh是得自吸气流量峰值、呼气流量峰值和呼气时间的导出值，降低penh值反映了有利的肺功能预后。
Penh＝(呼气流量峰值/吸气流量峰值)*(呼气时间/呼出65％呼气量的时间-1)。
单独的或与任何测试流体相结合的布地奈德(500和750ug/kg)处理在挑战后立刻未能明显影响Penh值。然而，挑战后6小时，用单独的或与布地奈德500或750ug/kg相结合的RDC1676-03处理的动物显示出Penh值的明显降低。虽然该降低程度在挑战后24小时时减弱，但布地奈德与RDC流体的协同作用的趋势在此时间点仍可观察到。
潮气量是从呼气终末位置吸气的过程中吸入肺部的空气量，其在平静呼吸过程的呼气中使肺处于被动状态。用单独的布地奈德处理动物在挑战后立刻未显示出潮气量变化。然而，单独的RDC1676-03甚至在该早期时间点也对潮气量具有明显的刺激作用。同样，与布地奈德(500和750ug/kg)结合的RDC1676-03在此时间点对潮气量具有甚至更明显的影响。挑战后六小时，单独的RDC1676-03足以导致潮气量的明显增加，单独地或组合地将布地奈德加入处理方案对潮气量无附加影响。然而，在这些较早的时间点观察到的任何影响在24小时时间点时丧失。
总之，这些数据表明单独的或与布地奈德相结合的RDC1676-03在挑战后6小时对气道炎症提供了显著的缓解，如潮气量的增加和Penh值的降低所证实。
细胞因子分析：
为了分析上述生理参数所见影响的作用机理，在生理参数测量后立即测量了挑战后6小时和24小时采集的血样中的多种促炎性细胞因子以及抗炎细胞因子。
图37A和图37B清楚地表明在挑战后6小时和24小时单独的Rev60(或RDC1676-03)均降低了血液嗜酸性粒细胞活化趋化因子水平。布地奈德750ug/kg也在这两个时间点降低了血液嗜酸性粒细胞活化趋化因子水平，而布地奈德250ug/kg仅在后一时间点具有明显的作用。然而，单独的测试溶液Rev60显示了在两个时间点均比两种浓度的布地奈德明显更强(降低血液嗜酸性粒细胞活化趋化因子水平)的作用。嗜酸性粒细胞活化趋化因子是在过敏反应中已知会在哮喘肺和其他组织(如，克罗恩病的肠道)中蓄积并将噬酸性粒细胞吸引到所述肺和其他组织的小C-C细胞因子。嗜酸性粒细胞活化趋化因子结合G蛋白偶联受体CCR3。CCR3由多种类型的细胞表达，诸如Th2淋巴细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞，但Th2淋巴细胞对该受体的表达尤其引人关注，因为这些细胞调控嗜酸性粒细胞募集。多项研究已表明，嗜酸性粒细胞活化趋化因子和CCR3在哮喘肺中的产生增加以及在这些分子与气道高反应性之间建立起了联系(综述见“Eotaxin and the attraction of eosinophils to the asthmatic lung，”DoloresM Conroy和Timothy J Williams Respiratory Research2001，2：150-156)。尤其值得注意的是，这些研究与图35和图36中关于嗜酸性粒细胞计数的结果完全一致。
总之，这些结果强烈表明，单独的或与布地奈德结合的RDC1676-03处理可明显降低卵清蛋白挑战后24小时血液中的嗜酸性粒细胞总数和百分比。这与早至挑战后6小时观察到的血液嗜酸性粒细胞活化趋化因子水平的显著降低存在关联。
因单独的或与布地奈德相结合的Rev60处理，在挑战后6小时，两种关键抗炎细胞因子IL10和干扰素γ的血液水平也明显提高。图37C和图37D分别显示了对干扰素γ和IL10的此类影响。从这些图中显而易见的是，单独的Rev60或与布地奈德250ug/kg相结合的Rev60在挑战后最多6小时明显提高了挑战动物中IL10的血液水平。相似地，单独的或与布地奈德250或750ug/kg相结合的Rev60在挑战后6小时时明显提高了IFNγ的血液水平。这些抗炎细胞因子的增加可以很好地解释(至少部分地)在挑战后6小时所见的对生理呼吸参数的有益影响。对这些细胞因子的影响在挑战后24小时时不再能够观察到(数据未显示)。
Rantes或CCL5是由循环T细胞表达的细胞因子，对T细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞具有趋化性，在将白细胞募集到炎性部位中具有积极作用。Rantes还激活嗜酸性粒细胞以释放(例如)嗜酸性粒细胞阳离子蛋白。它改变嗜酸性粒细胞的密度，使得它们为低密度的，这被认为代表了一种广义细胞活化状态。它还是嗜酸性粒细胞特异性氧化代谢的强效激活因子。
如图38所示，Rantes的全身水平在用单独的或与布地奈德250或750ug/kg相结合的Rev60处理的动物中在挑战后6小时但非24小时时明显降低。再次，在这组数据中注意到了布地奈德750ug/kg与Rev60明显的协同作用。在用单独的或与布地奈德相结合的Rev60处理的动物中，在挑战后6小时或24小时时，观察到了多种其他促炎性细胞因子类似的下降趋势，诸如KC或IL8、MCP3、IL1b、GCSF、TGFb以及NGF。
实施例6
(本发明的治疗性流体对于调节一氧化氮水平具有明显的效用)
本实施例基于申请人已公布的美国专利申请序列号12/435,356的实施例12，该专利关于电动流体调节一氧化氮水平的教导以引用的方式并入本文。根据特定的方面，本发明的经扩散器处理的治疗性流体对于调节一氧化氮水平和/或相关酶具有明显的效用。图30-34显示了从暴露于RDC1676-01(通过本发明的专有装置处理的添加了另外的氧的无菌盐水；本公开的富含气体的电动产生的流体(Rev))的人包皮角质形成细胞获得的数据，表明NOS1和3以及Nostrin、NOS3得到上调。相比之下，从大鼠肺组织(上文题为“细胞因子表达”中的组织)获得的数据表明Rev使NOS2和3、Nostrin和NOS1AP下调(图33和图34)。
实施例7
(使用调节性T细胞测定法展示本发明的电动产生的流体在调节T细胞增殖和例如PBMC中的类胰蛋白酶的作用，并在调节性T细胞测定中详细阐述细胞因子(Il-10)和其他蛋白(如GITR、颗粒酶A、XCL1、pStat5和Foxp3))
本实施例基于申请人已公布的美国专利申请序列号12/435,356的实施例8，该专利关于电动流体调节炎症的教导以引用的方式并入本文。通过照射抗原呈递细胞并引入抗原和T细胞，研究了本文所公开的特定实施方案调控T细胞的能力。通常，这些经刺激的T细胞发生增殖。然而，在引入调节性T细胞后，通常的T细胞增殖受到抑制。
方法：
简而言之，从DakoCytomation(Chicago，IL)购得用于分选的FITC偶联抗CD25(ACT-1)抗体。所用的其他抗体如下：CD3(用于可溶性条件的HIT3a)、GITR(PE偶联的)、CD4(Cy-5和FITC偶联的)、CD25(APC偶联的)、CD28(CD28.2克隆)、CD127-APC、颗粒酶A(PE偶联的)、FoxP3(BioLegend)、小鼠IgG1(同种型对照)和XCL1抗体。所有的抗体均根据制造商说明使用。
使用CD4+Rosette试剂盒(Stemcell Technologies)从外周全血中分离CD4+T细胞。将CD4+T细胞用抗CD127-APC抗体、抗CD25-PE抗体和抗CD4-FITC抗体温育。使用FACS Aria通过流式细胞术将细胞分选成CD4+CD25hiCD127lo/nTreg和CD4+CD25反应性T细胞。
在圆底96孔微滴定板中进行抑制测定。根据说明，将3.75x103个CD4+CD25neg反应性T细胞、3.75x103个自体T reg、3.75x104个异体刺激CD3去除PBMC加入。所有的孔均补充抗CD3抗体(5.0μg/ml的克隆HIT3a)。将T细胞在补充了10％胎牛血清的RPMI1640培养基中在37℃下培养7天。在温育结束前16小时，将1.0mCi3H胸苷加入各孔中。使用Tomtec细胞收集器收获平板上的细胞，使用Perkin Elmer闪烁计数器测定3H-胸苷结合。使用StemSep人CD3+T细胞去除试剂盒(StemCell Technologies)使由外周血单核细胞(PBMC)组成的抗原呈递细胞(APC)去除T细胞，然后进行40Gy的照射。
将调节性T细胞用抗CD3和抗CD28条件刺激，然后用Live/DeadRed活力检测染料(Invitrogen)以及表面标记物CD4、CD25和CD127染色。将细胞固定在Lyze/Fix PhosFlowTM缓冲液中，在变性Permbuffer
Figure BDA00003030967500741
中透性化。然后将细胞用各特定的选定分子的抗体进行染色。
使用GraphPad Prism软件进行统计分析。通过使用双尾、未配对的Student t检验进行两组之间的比较。通过使用单因素方差分析(ANOVA)进行三组之间的比较。P值小于0.05被视为具有显著性(双尾)。通过Spearman系数确定两组之间的相关性，如果r值大于0.7或小于-0.7(双尾)则具有统计学显著性。
结果：
如图22中所示，通过用柴油机废气颗粒物(PM，得自EPA)刺激细胞研究了调节性T细胞增殖。图22的x轴以黑色实线条显示了活化的自体CD4+效应T细胞(应答细胞)，以灰色条显示了单独的调节性T细胞(显示的目的是为了证实无效能)，白色条显示的则为两者的1∶1混合物。y轴显示了通过3H-胸苷的摄取而度量的增殖。如沿着x轴从左向右所示，“PM”表示柴油机废气产生的颗粒物，“PM+Rev”表示PM加上本公开的富含气体的电动产生的流体(Rev)；“Solis”表示仅为本公开和装置的电动产生的流体(未添加PM)，其在环境气压外不富含气体；“Rev”表示如上所定义的单独的Rev(未添加PM)；“Media”表示单独的细胞生长培养基对照(减去PM；无Rev，无Solis)；“Saline Con”表示盐水对照(减去PM；无Rev，无Solis)；“V”表示维拉帕米；“P”表示普萘洛尔；以及“DT”为1∶50的DT390。
如图23所示，用PM刺激(无Rev，无Solis)的细胞导致了分泌的IL-10降低，而在存在本公开的流体的情况下暴露于PM(“PM+Rev”)的细胞导致了相对于盐水和培养基对照(无PM)而言IL-10的产生得以维持或只是略微降低。此外，将白喉毒素(DT390，截短的白喉毒素分子；1∶50稀释度的标准商业浓度)滴定到本发明的流体样品中，阻断了Rev介导的IL-10升高效应(图23)。注意，单独的Rev处理导致了相对于盐水和培养基对照而言IL-10水平更高。
同样，分别得到了GITR、颗粒酶A、XCL1、pStat5和Foxp3的如图24-28中所示的类似结果。在这些图中，“NSC”与“Solis”相同(无PM)。
图29显示了从评价类胰蛋白酶的外周血单核细胞(PBMC)的过敏性哮喘(AA)谱得到的AAPBMC数据。AAPBMC数据与上面的调节性T细胞数据一致，因为用颗粒物(PM)刺激的细胞表现出高水平的类胰蛋白酶，而在本公开的流体存在下用PM处理的细胞(“PM+Rev”)导致了与盐水和培养基对照的相应值相似的明显更低的类胰蛋白酶水平。与得自调节性T细胞的数据一致，暴露于DT390阻断了Rev介导的对类胰蛋白酶水平的作用，从而导致细胞中的类胰蛋白酶水平升高，如对于单独的PM所见(减去Rev、无Rev、无Solis)。注意，单独的Rev处理导致了相对于盐水和培养基对照而言类胰蛋白酶水平较低。
概括地说，图22的数据表明，在存在PM和Rev的情况下相对于对照流体(无Rev、无Solis)中的PM而言增殖降低，表明本发明的电动产生的流体Rev改善了调节性T细胞功能，如通过该测定法中相对低的增殖所证实。此外，该实施例和图22-29的证据表明β阻滞、GPCR阻滞和钙通道阻滞影响了Revera对Treg功能的活性。
实施例8
(通过荧光活化细胞分选(FACS)分析表明RNS-60对以下细胞表面受体的表达具有显著影响：CD193(CCR3)、CD154(CD40L)、CD11B和CD3)
概述。申请人使用荧光活化细胞分选(FACS)分析对用本发明的电动流体(RNS-60)或生理盐水对照流体温育的白血球上的以下细胞表面受体表达水平进行了比较：CD193(CCR3)、CD154(CD40L)、CD11B和CD3。
方法：
通过Ficoll-hypaque分离在30％的RNS60溶液或生理盐水(NS)中预温育大约1小时的PBMC(分离术-所有细胞)；
将PBMC用2μg/ml的PHA-L活化24或40小时；
采集细胞，在封闭/染色缓冲液中洗涤，染色并固定；以及
将细胞通过流式细胞术分析。
结果：
至于CD193(CCR3)，如图40B所示，与生理盐水对照中的受体表达水平相比，在存在RNS-60的情况下，受体明显下调。该下调影响MAPK p38的磷酸化(数据未示出)，继而下调嗜酸性粒细胞活化趋化因子(例如，参见实施例3和图10)，继而下调IL5(数据未示出)以及改变嗜酸性粒细胞计数(例如，参见实施例3)，其为例如改变支气管收缩反应的因素之一。
如上文实施例3在卵清蛋白挑战模型的背景下所讨论以及图10所示，与生理盐水的作用相比，在OVA挑战组中，RNS-60降低了血清嗜酸性粒细胞活化趋化因子水平。因此，根据特定方面，RNS-60具有减少配体嗜酸性粒细胞活化趋化因子及其受体CCR3的潜能。
至于CD154(CD40L)，如图41A所示，与生理盐水中的受体表达水平相比，在存在RNS-60的情况下，受体下调。
至于CD11B，如图41B所示，与生理盐水中的受体表达水平相比，在存在RNS-60的情况下，受体下调。
至于CD3，如图41C所示，与生理盐水中的受体表达水平相比，在存在RNS-60的情况下，受体下调。
实施例9
(RNS60但非生理盐水(NS)减弱了MBP初免T细胞中NFκB的活化)
概述：
日益清晰的是，胰岛素受体信号通路的抑制是炎性和应激反应介导胰岛素抗性所依赖的中心机制(参见例如以下综述：Wellen&Hotamisligil，The Journal of Clinical Investigation，115：1111-1119，2005)。
代谢和免疫途径的重叠。多种丝氨酸/苏氨酸激酶由炎性或压力刺激激活，并有助于抑制胰岛素信号传导，包括JNK、NF-κB激酶抑制剂(IKK)和PKC-θ(Zick，Y.2003.Role of Ser/Thr kinases in theuncoupling of insulin signaling.Int.J. Obes.Relat.Metab.Disord.27(Suppl.3)：S56-S60)。另外，这些激酶在肥胖症中的活化强调了代谢和免疫途径发生的重叠；这些酶是通过响应LPS、肽聚糖、双链RNA和其他微生物产物的Toll样受体(TLR)信号传导在固有免疫应答中活化的相同激酶，尤其是IKK和JNK(Medzhitov，R.2001.Toll-likereceptors and innate immunity.Nat.Rev.Immunol.1：135-145)。因此，可能的是，TLR信号传导通路的组件也将表现出强烈的代谢活性。
PKC和IKK由细胞脂类代谢物激活。在抵消胰岛素作用(尤其是对脂类代谢物作出响应)中发挥着重要作用的其他两种炎性激酶为IKK和PKC-θ。已表明脂类输注可导致细胞内脂肪酸代谢物诸如二酰基甘油(DAG)和脂肪酰基辅酶A的水平升高。该升高与PKC-θ的激活以及IRS-1增加的Ser307磷酸化存在关联(Yu，C.等2002.Mechanism by which fatty acids inhibit insulin activation of insulinreceptor substrate-1(IRS-1)-associated phosphatidylinositol3-kinaseactivity in musele.J. Biol.Chem.277：50230-50236)。PKC-θ可通过激活另一种丝氨酸/苏氨酸激酶IKKβ或JNK而损害胰岛素作用(Perseghin，G.，Petersen，K.和Shulman，G.I.2003.Cellular mechanismof insulin resistance：potential links with inflammation.Int.J. Obes.Relat.Metab.Disord.27(Suppl.3)：S6-S11)。也已报道了其他PKC同种型由脂类激活并且也可参与胰岛素信号传导的抑制(Schmitz-Peiffer，C.2002.Protein kinase C and lipid-induced insulin resistance inskeletal musele.Ann.N.Y.Acad.Sci.967：146-157)。
IKKβ可通过激活NF-κB影响胰岛素信号传导。IKKβ可通过至少2种途径影响胰岛素信号传导。其一，它可直接使丝氨酸残基上的IRS-1磷酸化(Yin，M.J.，Yamamoto，Y.和Gaynor，R.B.1998.Theanti-inflammatory agents aspirin and salicylate inhibit the actiVity of IκBkinase-β.Nature.396：77-80；Gao，Z.等2002.Serine phosphorylationof insulin receptor substrate1by inhibitor kappa B kinase complex.J.Biol.Chem.277：48115-48121)。
其二，它可使NF-κB抑制剂(IκB)磷酸化，从而激活NF-κB，这种转录因子除了其他靶标外刺激多种炎性介质(包括TNF-α和IL-6)的产生(Shoelson，S.E，Lee，J.和Yuan，M.2003.Inflammation and theIKKβ/IκB/NF-κB axis in obesity-and diet-induced insulin resistance.Int.J. Obes.Relat.Metab.Disord.27(Suppl.3)：S49-S52)。IKKβ的小鼠杂合子因脂类输注、高脂肪饮食或遗传型肥胖而部分地免于发生胰岛素抗性(Yuan，M.等2001.Reversal of obesity-and diet induced insulinresistance with salicylates or targeted disruption of IKKβ Science.293：1673-1677；Kim，J.K.等2001.Prevention of fat-induced insulinresistance by salicylate.J. Clin.Invest.108：437-446；doi：10.1172/JCI200111559)。
此外，通过高剂量阿司匹林治疗而抑制人类糖尿病患者中的IKKβ也可改善胰岛素信号传导，虽然在此剂量下，不清楚其他激酶是否也受到了影响(Hundal，R.S.等2002.Mechanism by whichhigh-dose aspirin improves glucose metabolism in type2diabetes.J. Clin.Invest.109：1321-1326.doi：10.1172/JCI200214955)。最近的研究也已开始发现IKK在各组织或细胞类型中对于发展胰岛素抗性的重要性。IKK在肝脏和骨髓细胞中的激活似乎会促进肥胖诱导的胰岛素抗性，但该途径在肌肉中可能不是如此重要(Cai，D.等2005.Local andsystemic insulin resistance resulting from hepatic activation of IKKβ andNF-κB.Nat.Med.11：183-190；Arkan，M.C.等2005.IKKβ linksinflammation to obesity-induced insulin resistance.Nat.Med.11：191-198；以及Rohl，M.等2004.Conditional disruption of IκBkinase2fails to prevent obesity-induced insulin resistance.J.Clin.Invest.113：474-481；doi：10.1172/JCI200418712)。
方法。对于图42A和42B中所示的实验，将从MBP免疫小鼠中分离的T细胞用MBP再次初免，24h后，细胞接受不同浓度的RNS60和NS。处理2h后，通过电泳迁移率改变分析(EMSA)监测了核抽提物中NF-κB的DNA结合活性。
对于图42C中所示的实验，将从MBP免疫小鼠中分离的T细胞用PBIIX-Luc(NF-κB依赖性报告构建体)转染，然后用MBP再次初免。MBP初免后24小时，将细胞用不同浓度的RNS60和NS处理2h，然后通过荧光素酶测定试剂盒(Promega)测定总细胞抽提物中的荧光素酶活性。在其他情况下，将MBP初免的T细胞也用30nM PMA处理1h。在这些情况下，在1h的RNS60和NS预处理后加入PMA。结果为三个不同实验的平均值+SD。
结果。图42A-C显示了RNS60但非生理盐水(NS)减弱了MBP初免T细胞中NF-κB的活化。具体地讲，图42A和42B显示了RNS60(参见图42A和42B的中间三个图)但非NS(参见图42A和42B最右边的图)以剂量反应性方式减弱了MBP初免T细胞中NF-κB的活化。
同样，图42C的条形图显示了RNS60(参见图42A和42B的第二、第三和第四条)但非NS(参见图42A和42B的第五条)以剂量反应性方式减弱了MBP初免T细胞中NF-κB的活化，并因此也减弱了总细胞抽提物中来自转染的NF-κB依赖性报告构建体(PBIIX-Luc)的荧光素酶活性。
因此，根据特定的方面，本发明所公开的电动产生的流体对于治疗炎症和炎症介导的病症和疾病具有明显的效用，包括但不限于糖尿病及相关代谢障碍、胰岛素抗性、神经变性疾病(如M.S.、帕金森病、阿尔茨海默病等)、哮喘、囊性纤维化、血管疾病/冠心病、视网膜和/或黄斑变性、消化障碍(如炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病等)。
实施例10
(RNS60但非媒介物对照限制了母猪和公猪心肌梗死后24小时内肌钙蛋白的蓄积产生)
概述：
血液中的肌钙蛋白水平是灵敏度和特异性非常高的心肌损伤标志。虽然在血液中的水平通常较低，但是患有心肌梗死的患者将具有心肌受损的区域并因此在血液中将会具有升高的心肌肌钙蛋白水平。因此，升高的肌钙蛋白血液水平将表明心肌多少受到一定损伤。
方法。为了确认在心肌梗死(MI)后RNS60对存活和生理参数具有积极作用，使用45-50kg体重家猪中的球囊引起的心肌局部缺血再灌注(I/R)模型开展了研究。在该模型中，将血管成形导管通过外科手术经颈总动脉插入，通过在冠状动脉左前降支(LAD)中段膨胀球囊导致心肌局部缺血。诱导缺血40分钟，之后，将球囊放气，导致动脉再灌注。通过LAD再灌注后5分钟单次冠状动脉内注射(3mL)接着每4小时一次静脉注射(100mL/剂)持续7天而给予处理。处理组包括接受生理盐水或RNS60的公猪或母猪组(共4组，表6)。
表6研究组
组编号 n 公母 测试材料
1F 4 母 生理盐水
2M 4 公 生理盐水
3F 4 母 RNS60
4M 4 公 RNS60
具体地讲，对于图43A和图43B中所示的实验，将八只母猪(图A)和八只公猪(图B)用单独的RNS60或媒介物处理，并造成心肌梗死。在引起心肌梗死前，将每只猪注射单独的RNS60或媒介物。在每只动物中通过膨胀血管成形术球囊而引起心肌梗死(MI)(例如，持续40分钟)。在球囊膨胀后于球囊放气前进行了血管造影，以便确认冠状血管完全阻塞且球囊定位正确。在球囊放气后，进行了后续血管造影，以确认之前阻塞的动脉中血流恢复。球囊膨胀后二十分钟，将猪通过冠状动脉内输注1ml/min的RNS60或生理盐水进行处理。在诱导MI前从各动物采集血样，以建立肌钙蛋白基线水平。在诱导MI后立即、六小时、十二小时和二十四小时时间点采集了另外的血样并测定肌钙蛋白水平。图线上的每个点代表八只动物的平均肌钙蛋白血液水平。具体地讲，在第-1天、第0天(再灌注与IC给药之间，以及6小时和12小时后)、第1天和第7天评价了心电图(ECG)、体重和心率并采集了血液进行生化心脏标记物分析。在研究结束时，用福尔马林灌注心脏，摘除，在坏死区(左心室)切成1cm切片，并在宏观上进行了评估以粗略确定梗死面积。为进行进一步的组织学分析，将各切片的前壁分成三个样品。将各样品用石蜡包埋，将5μm切片用H&E染色。
结果。得到了以下结果。
存活。所有母猪在研究过程中均存活。生理盐水对照组和RNS60处理组各有一只动物被排除在结果统计之外，因为基于ECG分析诱导缺血明显失败。在公猪中，四只生理盐水处理动物中的两只在术后图养期的第3天死亡。相比之下，所有RNS60处理的公猪在研究中均存活。
梗死面积。基于大体组织学，存活动物中的梗死面积总体上影响了心室壁的约2％至约10％。对照组中三只母猪的两只显示出宏观可见的梗死。相比之下，RNS60处理的三只母猪中的两只未显示出肌肉损伤的症状。只有一只注射生理盐水的公猪和一只用RNS60处理的公猪发展出大体组织学分析可见的梗死。与梗死相关的微观变化存在于所有对照处理和所有RNS60处理的母猪心脏中，以及四只对照处理公猪的三只中(表7)。这些变化包括坏死、纤维变性、矿化、出血和单核细胞浸润(实例示于图44A-I中)。相比之下，RNS60处理的公猪中没有一只在这种水平下表现出任何心肌损伤症状(表7)。
表7.微观组织学结果汇总
(+)存在梗死组织，(-)＝不存在梗死组织，(*)I/R后第3天死亡
ECG变化。在缺血期，ECG表明进入研究中的所有动物的ST段均升高。在缺血后即刻期间(IC药物施用过程中)，对照组的所有母猪表现出T波异常，包括T波增高、双相T波和倒置T波。相比之下，三只RNS60处理母猪中的两只无T波改变，表明存在立即的处理有益效果。在公猪组中，对照组和RNS60组中四只动物中的三只均表现出T波改变。在术后一周，对照处理公猪中的两只死亡，其余的对照动物仍表现出T波改变。相比之下，RNS60处理公猪中的两只现在表现出正常的ECG描记。
心肌肌钙蛋白。RNS60处理降低了公猪和母猪中I/R诱导的循环性肌钙蛋白水平升高(图43A和B)；该效应在公猪中比在母猪中稳定。在MI后第3天死亡的两只公猪显示了在所有公猪中最高的肌钙蛋白水平。图43A和B显示了RNS60但非单独的媒介物明显限制了肌钙蛋白的产生，相对于仅用媒介物处理的动物幅度约达2至20倍。具体地讲，图43A(母猪)和B(公猪)显示了RNS60(参见图43A和B带方形的线)响应于MI的诱导使血液肌钙蛋白水平与仅媒介物(参见图43A和B带菱形的线)相比降低了2至3倍(对于图43A的母猪)和5至20倍(对于图43B的公猪)。
因此，根据特定方面，施用RNS60降低了MI后雄性动物中的死亡率，并对ECG变化产生了规范的趋势。RN60处理对于心肌组织存活和心脏生理功能保护的明显有益效果通过降低了心肌肌钙蛋白循环水平以及不存在心肌损伤的组织学迹象而得以证实。本研究的发现显示出一致的趋势，表明RNS60施用产生了抗炎和组织保护作用。
图44A-I根据特定的方面显示了存在于对照处理雄性动物(#3033)中的坏死组织的实例。A.低倍放大，显示了右侧的坏死组织和左侧的活组织。在C、F和G以高倍显示了方框区域，如图所示。B.与图A所示相同的显微照片，活组织与坏死组织之间的界面以黑线标记。C.A中最大方框区域的中倍放大。活区域(V)和坏死区域(N)通过具有嗜碱性染色外观的组织(*)分离。D.C的中心区域的高倍放大。大部分颗粒物质发生矿化。图出了矿化心肌细胞灶；混杂的为单核炎性细胞(箭头)。E.活(V)与坏死(N)区域之间的界面的高倍放大，带多灶性单核细胞浸润(箭头)。F.覆盖坏死区域(A中框出)的心外膜的高倍放大，显示了轻度多灶性单核细胞浸润(箭头)。G.A底部框出的组织的高倍放大。可见多灶性矿化，如坏死心肌细胞中的颗粒状嗜碱染色物质。图出了重度矿化的区域。H.坏死心肌的高倍放大。心肌细胞核为致密核(小而深染嗜碱性)。细胞质表现为凝结的，并具有截然不同的嗜酸染色色调。I.活心肌的高倍放大。注意与H相比细胞核和细胞质外观的差异。
实施例11
(RNS60但非媒介物对照降低了母猪中心肌梗死后24小时内蓄积的磷酸肌酸激酶(CPK)水平)
概述：
血液中的磷酸肌酸激酶(CPK)水平是灵敏度和特异性非常高的心肌损伤标志。虽然在血液中的水平通常较低，但是患有心肌梗死的患者将具有心肌受损的区域并因此在血液中将会具有升高的心肌CPK水平。
方法。本实施例的以及如图43C和43D所示的方法在实施例10中进行了讨论。在诱导MI前从各动物采集血样，以建立CPK基线水平。在诱导MI后立即、六小时、十二小时和二十四小时时间点采集了另外的血样并测定CPK水平。图线上的每个点代表八只动物的平均CPK血液水平。
结果。图43C(母猪)表明，RNS60(见图43C带方形的线)但非单独的媒介物(见图43D带菱形的线)明显限制了CPK的产生，相对于仅用媒介物处理的动物幅度约达三至四倍。
因此，根据特定的方面，结果表明，RNS60处理的动物产生了较低水平的CPK，这表明当用RNS60处理时相较于仅用媒介物处理心肌损伤程度较低。
实施例12
(本发明所公开的电动改变的水性流体(如RNS60、RIS60)在包括心血管手术的手术环境下可作为常规盐水溶液的辅助和/或替代品)
概述。根据特定的方面，本发明所公开的电动改变的水性流体(如RNS60、RIS60)可增强或取代用于包括但不限于心血管手术的手术背景下的常规溶液(如，基于盐水的溶液和流体)以改善各种手术的预后以及减轻各种手术所伴随的有害影响。
有许多心血管手术过程要用到盐水溶液并期望减少或消除手术过程所伴随的有害影响。
例如，在涉及心肺分流术(CPB)的手术中，其中全身性炎性反应导致有害影响，可采用包含本发明所公开的电动改变的水性流体(如RNS60、RIS60)或由其组成的预充液(分流泵预充液)来减轻或消除CPB伴随的有害影响。根据进一步的方面，本发明所公开的电动改变的水性流体(如RNS60、RIS60)可用于降低CPB的有害神经认知效应。
同样，本发明所公开的电动改变的水性流体(如RNS60、RIS60)可用在静脉保存液(通常为罂粟碱和盐水)的背景下以改善预后。
另外，本发明所公开的电动改变的水性流体(如RNS60、RIS60)可用作停搏液(如，含谷氨酸盐和/或天冬氨酸盐的停搏液，其还可以含有钾)以在完成移植后冲洗冠状动脉。
因此，根据进一步的方面，本发明所公开的电动改变的水性流体(如RNS60、RIS60)可用在手术(例如心血管手术)中的任何地方，以增强或替代常用于该手术(例如心血管手术)中的溶液(例如基于盐水的溶液和流体)以改善预后并降低各种手术伴随的有害效应。
代表性的心血管相关手术包括但不限于：主动脉缩窄修复术、B-T分流术、动脉导管未闭封堵、治疗缺血性心脏病并发症(例如冠状动脉旁路移植术)、先心病矫治术、治疗由各种原因导致的心脏瓣膜病(包括心内膜炎)、治疗冠状动脉疾病、治疗心脏瓣膜病、治疗心脏肿瘤、胸主动脉瘤修复术、瓣膜手术、主动脉手术、心律失常(心房纤颤)手术、心力衰竭和移植手术、微创心脏手术、视频辅助和机器人辅助心脏手术、心脏瓣膜手术、激光心肌血运重建术、胸主动脉手术、血管成形术(例如经皮腔内血管成形术(PTA))、血管造影术、颈动脉内膜切除术、主动脉瘤修复术、球囊瓣膜成形术、脑动脉瘤修复术、复律、主动脉瓣置换术、颈动脉内膜切除术、动静脉瘘、心导管插入术、主动脉瓣置换术、心包穿刺术、二尖瓣修复术、二尖瓣置换术、气管插管术、周围血管搭桥术、冠状动脉支架术、增强型体外反搏、血管内支架术、门静脉转流、心肺移植、植入型心律转复除颤器、末梢动脉内膜切除术、静脉血栓形成预防和心肌切除术。
特定的方面提供执行手术的方法，包括对其有需要的受试者执行手术，其中将试剂流体用于手术的至少一个方面，并且其中该试剂流体包含手术有效量的电动改变的水性流体，该流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，该纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径。
在特定方面，该手术包括选自以下的至少一种：与心律失常相关的手术；与血管疾病相关的手术；与心肌梗死相关的手术；与充血性心力衰竭相关的手术；与心肌炎相关的手术；与动脉粥样硬化和再狭窄相关的手术；包括使用心肺分流术(CPB)的手术；包括使用血管(例如静脉、动脉)保存液的手术；以及包括使用停搏液的手术。
实施例13
(对用本发明的电动产生的流体(RNS-60和Solas)灌注的Calu-3细胞进行的膜片钳分析表明：(i)暴露于RNS-60和Solas导致了全细胞电导的增加，(ii)细胞暴露于RNS-60使电导非线性增加，在15分钟的温育时间时很明显，以及(iii)细胞暴露于RNS-60产生了RNS-60盐水对钙渗透通道的影响)
概述。本实施例基于申请人已公布的美国专利申请序列号12/435,356的实施例17，该专利关于电动流体调节膜电导的教导以引用的方式并入本文。在该实施例中，进行了膜片钳研究以进一步确认本发明的电动产生的盐水流体(RNS-60和Solas)如本文所述的实用性，包括调节全细胞电流的实用性。进行了两组实验。
第一组实验的数据汇总表明，用Solas盐水得到的全细胞电导(电流与电压关系)对于两个温育时间(15分钟，2小时)以及对于所有电压方案均是高度线性的。然而，显然的是，用Solas较长时间温育(2小时)增加了全细胞电导。细胞暴露于RNS-60产生了电导的非线性增加，其只在15分钟的温育时间时明显。在两小时温育时间时，RNS-60对此非线性电流的影响消失，而成为线性的。如之前所观察，非线性全细胞电导的贡献因素为电压敏感性的，但存在于所有电压方案下。
第二组实验的数据汇总表明，RNS-60盐水存在对非线性电流的影响，其在外部溶液中钙浓度较高时明显。非线性全细胞电导的贡献因素虽然为电压敏感性的，但在两种电压方案中均存在，并表明RNS-60盐水对钙渗透通道的影响。
第一组实验(电导增加；以及非线性电压整定电导的激活)
第一组实验的方法：
有关一般的膜片钳方法，参见WO2009/055729的细胞膜片钳工作实施例23。在以下第一组实验中，进行了膜片钳研究，以进一步确认本发明的电动产生的流体(RNS-60和Solas)调节全细胞电流的实用性，实验使用Calu-3细胞在基础条件下进行，方案从0mV保持电位、-120mV或-60mV阶跃。
在每种情况下，全细胞电导均得自电流与电压关系，而该关系则得自温育了15分钟或两小时的细胞。在本研究中，在给定的时间获得Solas或RNS-60盐水溶液的小组结果。
结果：
结果显示了一系列膜片钳实验的结果，这些实验评价了电动产生的流体(例如RNS-60和Solas)在两个时间点(15分钟和2小时)以及不同的电压方案(A，从0mV阶跃；B，从-60mV阶跃；以及C，从-120mV阶跃)下对上皮细胞膜极性和离子通道活性的影响。结果表明RNS-60对全细胞电导的影响大于Solas。在该实验中，在三个电压方案以及15分钟和两小时温育两个时间点均观察到了类似的结果。
进一步的结果显示了在三种电压方案(“δ电流”)(A，从0mV阶跃；B，从-60mV阶跃；以及C，从-120mV阶跃)以及两个时间点(15分钟和2小时)从RNS-60电流数据减去Solas电流数据。这些数据表明，在用RNS-60的15分钟时间点，存在非线性电压依赖性分量，该分量在2小时时间点时不存在。
如在之前的实验中，“生理”盐水的数据给出了用作参考的非常一致且无时间依赖性的电导。本发明的结果通过将小组与Solas或RNS-60盐水进行匹配而获得，并表明在基础条件(无cAMP或任何其他刺激)下将Calu-3细胞暴露于RNS-60盐水产生了时间依赖性影响，与在较短温育时间下电压整定电导的激活一致。这种现象不如在两小时温育时间点时明显。如本文其他地方所述，当通过用cAMP“混合物”进行刺激而增加电导时，该线性分量更明显。尽管如此，两小时温育时间表明RNS-60和Solas盐水的线性电导均更高，并且在此情况下，与仅有Solas相比，RNS-60盐水使全细胞电导翻倍。这一证据表明全细胞电导的至少两个贡献因素受RNS-60盐水影响，即，非线性电压整定电导的激活以及线性电导，后者在较长的温育时间时更明显。
第二组实验(对钙渗透通道的影响)
第二组实验的方法：
在以下第二组实验中，进行了另外的膜片钳研究，以进一步确认本发明的电动产生的流体(RNS-60和Solas)调节全细胞电流的实用性，实验使用Calu-3细胞在基础条件下进行，方案从0mV或-120mV保持电位阶跃。
在每种情况下，全细胞电导均得自电流与电压关系，而该关系则得自用任一盐水温育15分钟的细胞。为了确定钙渗透通道是否对全细胞电导有贡献，以及这部分全细胞电导是否受RNS-60盐水温育的影响，将细胞在温育期(采用高NaCl的外部溶液，而内部溶液则含高KCl)后在生理盐水中钳制。然后将外部盐水用其中NaCl被CsCl替换的溶液替换，以确定通过更换主要外部阳离子是否存在电导的变化。在这些条件下，将相同的细胞暴露于递增浓度的钙，使得钙进入步骤变得更明显。
结果：
概括地讲，一系列膜片钳实验的结果表明全细胞电导得到提高，这些实验评价了电动产生的流体(例如Solas和RNS-60)在使用不同的外部盐溶液以及在不同的电压方案下(从0mV阶跃或从-120mV阶跃)对上皮细胞膜极性和离子通道活性的作用。在这些实验中，使用了15分钟的一个时间点。对于Solas，结果表明：1)使用CsCl而不是NaCl作为外部溶液，当与对照相比时增加了全细胞电导，并具有线性行为；以及2)CaCl2在20mM CaCl2和40mM CaCl2两种浓度下均以非线性方式增加了全细胞电导。对于RNS-60，结果表明：1)使用CsCl而不是NaCl作为外部溶液当与对照相比时对全细胞电导的作用甚微；以及2)CaCl2在40mM下以非线性方式增加了全细胞电导。
另外的结果显示了Solas和RNS-60在两种电压方案(从0mV阶跃以及从-120mV阶跃)下从20mM CaCl2和40mM CaCl2数据减去CsCl数据。结果表明，Solas和RNS-60溶液均激活了钙诱导的非线性全细胞电导。使用RNS-60时影响更大(表明存在剂量反应关系)，而使用RNS-60时仅在较高的钙浓度下才使影响增加。此外，在较高钙浓度下的非线性钙依赖性电导也通过电压方案增加。
第二组实验的数据进一步表明了RNS-60盐水和Solas盐水对在Calu-3细胞中获得的全细胞电导数据的影响。数据表明，任一盐水15分钟的温育均对全细胞电导产生了明显的影响，在使用RNS-60时以及增加外部钙时最明显，并且进一步表明RNS-60盐水增加了全细胞电导的钙依赖性非线性分量。
积累的证据表明Revalesio盐水对离子通道的活化，其对基础细胞电导产生不同的贡献。
与申请人的其他数据(如，申请人其他工作实施例的数据)合在一起，本发明的特定方面提供用于调节细胞内信号转导的组合物和方法，包括调节以下至少一者：膜结构、膜电位或膜电导率、膜蛋白或受体、离子通道、脂质成分或细胞可交换的细胞内成分(如，信号通路，诸如钙依赖性细胞信号系统，包括使用本发明的电动产生的溶液赋予膜结构(如，膜和/或膜蛋白、受体或其他膜成分)的电化学和/或构象变化)，包括但不限于GPCR和/或g蛋白。根据另外的方面，这些影响将调节基因表达，并可例如根据各信息传递成分的半衰期等因素而持续存在。
实施例14
(本发明电动流体(RNS-60)的原子力显微术(AFM)测量表明存在和/或形成了明显小于对照压力罐(PNS-60)流体中存在的疏水表面纳米泡)
概述。本实施例基于申请人已公布的美国专利申请序列号12/435,356的实施例18，该专利关于纳米泡的教导以引用的方式并入本文。申请人使用了原子力显微术(AFM)测量来表征本发明电动流体(RNS-60)中的疏水纳米泡。
材料和方法：
AFM研究。在本领域公认的Nanotech User Facility(NTUF)中进行了AFM研究。对于AFM研究，将非常小而灵敏的针浸入置于疏水表面上的水滴中。针然后以诸如1mm2的速率在约15分钟内扫描水/表面界面。针记录表面几何中的任何瑕疵，并且足够灵敏地记录小泡的存在。
水滴所处的硅基板使用1H，1H，2H，2H-全氟辛基三氯硅烷制备，所得的疏水表面导致水以大约95度的接触角形成水珠。将该涂层用于许多AFM研究，部分地由于其非常耐用。
溶液配制。研究了两种测试溶液：RNS-60和PNS-60。RNS-60是含有60ppm氧的本发明的电动流体，而PNS-60是通过暴露于加压氧气头常规方法制备的含60ppm氧的非电动对照流体(即，压力罐氧合流体)。将各测试溶液最初通过加入少量的中性磷酸盐缓冲液(pH7)进行缓冲，然后将大约60-70uL各缓冲测试溶液(约22℃)置于之前制备的硅板上。
结果：
在AFM下，RNS-60液滴显示出在1mm2的面积中约20个疏水纳米泡的分布，尺寸为约20nm宽和1.5nm高或更小。相比之下，在AFM下，PNS-60液滴显示出在1mm2的面积中约5个疏水纳米泡，尺寸为约60nm宽和5nm高。因此，PNS-60液滴与RNS60液滴相比具有少得多且大得多的疏水纳米泡。
因此，根据特定的方面，在RNS-60与PNS-60测试溶液之间疏水表面纳米泡的大小和分布存在显著差异，其中这些纳米泡最初存在于测试流体中和/或在AFM测量过程中在测试流体中形成。
如本文其他地方所述，根据本发明的特定方面，本发明的电动改变的水性流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并在离子水性流体中以在流体与活细胞接触时足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节的量稳定成形。
然而，申请人指出，疏水气泡(在疏水表面上形成)诸如在AFM实验中观察到的那些气泡可能与本文所公开的本发明生物学活性电荷稳定的纳米结构在根本上不同。因此根据特定方面，虽然本工作实施例中的AFM实验根据疏水气泡形成的大小和分布支持本发明的电动学流体(如RNS-60)与非电动学对照流体在根本上不同，但是疏水气泡可能与本文其他地方详细描述的本发明的电荷稳定含氧纳米结构不同和/或由其产生。在任何情况下，相对于本发明的电动流体，对照压力罐氧合流体都不含能够调节细胞膜电位和细胞膜电导率至少一者的电荷稳定含氧纳米结构。
实施例15
(采用了拉曼光谱区分电动流体(如RNS-60)与对照‘压力罐‘(PNS-60)流体)
图45A和B根据特定的方面显示了提高的温度(热)相对于对照PNS60(45A)而言对RNS60(45B)的影响(通过拉曼后向散射测量)，图中显示了相应的差异曲线和两个氧气峰。
根据特定的方面，拉曼光谱对于表征电动改变的流体(如RNS60)具有明显的效用。根据进一步的方面，将此类拉曼光谱数据/测量与电动改变的流体(如RNS60)的生物活性相关联。
实施例16
(使用了荧光偏振各向异性来区分电动流体(如RNS-60)与对照流体)
图46根据特定的方面显示了在“RNS60”(“批次A”和“批次B”)、“NS”(生理盐水对照)、“RDW”(电动处理的去离子水)和“DW”(去离子水)之间和之中荧光偏振各向异性数据小但明显的差异。
根据特定的方面，荧光偏振各向异性对于表征电动改变的流体(如RNS60)具有明显的效用。根据进一步的方面，将此类荧光偏振各向异性数据/测量与电动改变的流体(如RNS60)的生物活性相关联。
实施例17
(电动流体(如RNS60)表明可与生物膜相互作用，如通过离子通道或电尖峰信号的调节所证实)
图47根据特定的方面显示了细胞外灌注的RNS60(89％)增强了血清素诱发的5HT3A(离子通道)活性(-101.8±24.2％的平均抑制(n＝3)，相对于对照)。
根据特定方面，对血清素诱发的5HT3A(离子通道)活性的影响进行测量对于表征电动改变的流体(如RNS60)具有明显的效用。根据进一步的方面，对血清素诱发的5HT3A(离子通道)活性的影响进行的此类测量与电动改变的流体(如RNS60)的生物活性相关联。
图48根据特定的方面显示了RNS60(84％)抑制了辣椒碱诱发的TRPV1(离子通道)电流(-90.9±6.7％的平均抑制(n＝3))。比较在生理盐水、100nm辣椒碱与100nm辣椒碱+87％RNS60之间进行。显示的数据为过表达TRPV1的重组CHO细胞的数据。
根据特定方面，对辣椒碱诱发的TRPV1(离子通道)电流的影响进行测量对于表征电动改变的流体(如RNS60)具有明显的效用。根据进一步的方面，对辣椒碱诱发的TRPV1(离子通道)电流的影响进行的此类测量与电动改变的流体(如RNS60)的生物活性相关联。
根据特定方面，离子通道活性的调节反映了RNS60与生物膜的相互作用。根据另外的方面，离子通道测量(如门控动力学、电压敏感性等的增强、抑制、改变)，包括(例如)激动剂诱发活性的调节，对于简便高通量测量电动改变的流体(如RNS60)生物活性的方法具有明显的效用。
图49根据特定的方面显示了RNS60灌注改变了心肌细胞中的电尖峰信号(Na+电流尖峰)；V斜坡，-100mV→+40mV；ΔV尖峰，1.67±.47mV；Δt尖峰，5.951.67ms(n＝6)。
根据特定方面，心肌细胞中电尖峰信号(例如，(Na+电流尖峰))的测量对于表征电动改变的流体(如RNS60)具有明显的效用。根据进一步的方面，对心肌细胞中电流尖峰的此类测量与电动改变的流体(如RNS60)的生物活性相关联。不受机理的束缚，尖峰信号的延迟可能是由于与Nav1.5的相互作用。
以引用方式并入.在本说明书中参考的和/或在申请数据表中所列的所有上述美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请以及非专利出版物均全文以引用方式并入本文。
应当理解，本文的附图和详细描述应视为示例性的而非限制性的，并且不旨在将本发明限制到所公开的特定形式和实施例。相反，在不脱离本发明的精神和范围)如以下权利要求书所限定)的情况下本发明包括任何进一步的修改、变化、重排、替换、替代、设计选择以及对本领域普通技术人员显而易见的实施方案。因此，以下权利要求书意在被视为包括所有此类进一步的修改、变化、重排、替换、替代、设计选择以及实施方案。
前述实施方案示出了不同的组件，它们包含在另外的不同组件中或与另外不同的组件相联系。应当理解，此类示出的构造仅为示例性的，并且事实上可实施能实现相同功能的许多其他构造。在概念意义上，为实现相同功能的组件的任何安排有效“相关”，以使得实现所需的功能。因此，本文相结合以实现特定功能的任何两个组件可视为彼此“相关”，以使得实现所需的功能，而不论构造或中间组件如何。同样，如此相关的任何两个组件也可被视为彼此“操作相关”或“操作连接”的，以实现所需的功能。
虽然已经示出和描述了本发明的特定实施方案，但是对本领域的技术人员显而易见的是，基于本文的教导，可在不脱离本发明及其更宽方面的情况下作出改变和变型，并且因此，所附的权利要求书将在其范围内涵盖所有此类改变和变型，如同落在本发明的真实精神和范围内。此外，应当理解本发明仅由所附权利要求书限定。本领域的技术人员将理解的是，一般来讲，本文所用的特别是在所附权利要求书(如，所附权利要求书的主体)中的术语通常旨在为“开放式”术语(如，术语“包括”应被视为“包括但不限于”，术语“具有”应被视为“具有至少”，以及术语“包含”应被视为“包含但不限于”等等)。本领域的技术人员将进一步理解的是，如果有意给出所介绍的权利要求表述的特定数量，则此意图将为在该权利要求中明确表述的，并且在不存在此表述的情况下，不存在此意图。例如，为了有助于理解，以下所附权利要求可包含介绍性短语“至少一个(种)”和“一个(种)或多个(种)”的使用以介绍权利要求表述。然而，此类短语的使用不应被视为暗示通过不定冠词“一”或“一个(种)”来介绍的权利要求表述将含有此类介绍的权利要求表述的任何特定权利要求限制到只含一个此类表述的发明，即使当相同的权利要求包含介绍性短语“一个(种)或多个(种)”或“至少一个(种)”以及诸如“一”或“一个(种)”的不定冠词也是如此(例如，“一”和/或“一个(种)”通常应被视为表示“至少一个(种)”和“一个(种)”或“多个(种)”；对于用来介绍权利要求表述的定冠词的使用同样也是如此。此外，即使当明确表述了所介绍的权利要求表述的特定数量，本领域的技术人员也将认识到此类表述通常应被视为至少表示所表述的数量(如，无其他修饰词的仅表述为“两个表述”通常表示至少两个表述或者两个或更多个表述)。因此，除了由所附权利要求书限制外，本发明不应受其他限制。

Claims (58)

1.一种电动改变的水性流体在制备治疗心血管疾病或病症的药剂中的用途，其中所述流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构主要具有小于约100纳米的平均直径并在所述离子水性流体中以足以治疗心血管疾病或病症或其至少一种症状的量稳定成形。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构稳定成形在所述离子水性流体中，其量在所述流体与活细胞接触时足以提供对细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的调节。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构是所述流体中主要的电荷稳定的含气体纳米结构物种。
4.根据权利要求1所述的用途，其中作为所述电荷稳定的含氧纳米结构存在于所述流体中的溶解氧分子的百分比为选自大于以下值的百分比：0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述总溶解氧基本上以所述电荷稳定的含氧纳米结构存在。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构主要具有低于选自以下值的尺寸的平均直径：90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm，以及低于5nm。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述离子水性溶液包括盐水溶液。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述流体为超氧合的。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述流体包括溶剂化电子的形式。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述电动改变的水性流体的改变包括将所述流体暴露于流体动力引起的局部电动效应。
11.根据权利要求10所述的用途，其中暴露于所述局部电动效应包括暴露于电压脉冲和电流脉冲中的至少一种。
12.根据权利要求10所述的方法，其中将所述流体暴露于流体动力引起的局部电动效应包括将所述流体暴露于用于产生所述流体的装置的电动效应引起的结构特征。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述心血管疾病或病症包括选自以下的至少一种病症或疾病：心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述心血管病症或疾病包括心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎和动脉粥样硬化中的至少一种。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述心血管病症或疾病包括心肌梗死和动脉粥样硬化中的至少一种。
16.根据权利要求1所述的用途，其中心血管疾病的所述至少一种症状与选自以下的至少一种病症相关：心律失常、血管疾病、心肌梗死、充血性心力衰竭、心肌炎、动脉粥样硬化和再狭窄。
17.根据权利要求1所述的用途，其中所述电动改变的水性流体调节一氧化氮的局部或分子水平。
18.根据权利要求1所述的用途，其中所述电动改变的水性流体促进选自以下的至少一种细胞因子在施用部位的局部降低：IL-1β、IL-8、TNF-α和TNF-β。
19.根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗进一步包括同时地或附加地使用另一种抗炎剂协同或非协同地抑制或减轻炎症。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述其他抗炎剂包括类固醇或糖皮质类固醇。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述糖皮质类固醇包括布地奈德或其活性衍生物。
22.根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗进一步包括联合治疗，其中将至少一种另外的治疗剂施用给所述患者。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂选自：奎尼丁、普鲁卡因胺、双异丙吡胺、利多卡因、苯妥英、美西律、氟卡尼、普罗帕酮、莫雷西嗪、普萘洛尔、艾司洛尔、噻吗洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、比索洛尔、胺碘酮、索他洛尔、伊布利特、多非利特、决奈达隆、E-4031、维拉帕米、地尔硫卓、腺苷、地高辛、硫酸镁、华法令、肝素、抗血小板药物(例如阿司匹林和氯吡格雷)、β阻滞剂(例如美托洛尔和卡维地洛)、血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利、佐芬普利、依那普利、雷米普利、喹那普利、培哚普利、赖诺普利、贝那普利、福辛普利、酪激肽和乳激肽)、他汀类(例如阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀)、醛固酮拮抗剂(例如依普利酮和螺甾内酯)、毛地黄、利尿剂、地高辛、正性肌力药物(例如米力农)、血管扩张剂和ω-3脂肪酸以及它们的组合。
24.根据权利要求22所述的用途，其中所述至少一种另外的治疗剂为TSLP和/或TSLPR拮抗剂。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述TSLP和/或TSLPR拮抗剂选自：TSLP和TSLP受体的特异性中和抗体、可溶性TSLP受体分子以及TSLP受体融合蛋白，包括编码不止一条受体链的组分的TSLPR-免疫球蛋白Fc分子或多肽。
26.根据权利要求2所述的用途，其中所述治疗包括调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种，所述调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种包括调节细胞膜结构或功能中的至少一种，所述调节细胞膜结构或功能中的至少一种包括调节膜相关蛋白的构象、配体结合活性或催化活性。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述膜相关蛋白包括选自以下的至少一种：受体、跨膜受体、离子通道蛋白、细胞内附着蛋白、细胞粘附蛋白、整合素等。
28.根据权利要求27所述的用途，其中所述跨膜受体包括G蛋白偶联受体(GPCR)。
29.根据权利要求28所述的用途，其中所述G蛋白偶联受体(GPCR)与G蛋白α亚基相互作用。
30.根据权利要求29所述的用途，其中所述G蛋白α亚基包括选自以下的至少一者：Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述至少一种G蛋白α亚基为Gαq。
32.根据权利要求2所述的用途，其中所述治疗包括调节细胞膜电导率，所述调节细胞膜电导率包括调节全细胞电导。
33.根据权利要求32所述的用途，其中调节全细胞电导包括调节所述全细胞电导的至少一种电压依赖性贡献因素。
34.根据权利要求2所述的用途，其中所述治疗包括调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种，所述调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节钙依赖性细胞信息传递途径或系统。
35.根据权利要求2所述的用途，其中所述治疗包括调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种，所述调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节磷脂酶C活性。
36.根据权利要求2所述的用途，其中所述治疗包括调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种，所述调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节腺苷酸环化酶(AC)活性。
37.根据权利要求2所述的用途，其中所述治疗包括调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种，所述调节细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种包括调节细胞内信号转导，所述调节细胞内信号转导包括调节与选自以下的至少一种病症或症状相关的细胞内信号转导：心血管系统中的慢性炎症，以及心血管系统中的急性炎症。
38.根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗包括施用到细胞网络或细胞层，并进一步包括调节其中的细胞间连接。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述细胞内连接包括选自紧密连接、间隙连接、黏附区和桥粒的至少一种。
40.根据权利要求38所述的用途，其中所述细胞网络或细胞层包括选自以下的至少一种：中枢神经系统脉管中的内皮细胞和内皮-星形胶质细胞紧密连接，血液-脑脊髓液紧密连接或屏障，肺上皮型连接，支气管上皮型连接以及肠上皮型连接。
41.根据权利要求1所述的用途，其中所述电动改变的水性流体为氧合的，并且其中在大气压下氧在所述流体中的含量为至少8ppm、至少15，ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。
42.根据权利要求1所述的用途，其中在大气压下以所述电动改变的流体的电荷稳定的含氧纳米结构中存在的氧的量为至少8ppm、至少15，ppm、至少20ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。
43.根据权利要求1所述的用途，其中所述电动改变的水性流体包含溶剂化电子形式以及电动改性或荷电的氧物种中的至少一种。
44.根据权利要求43所述的用途，其中所述溶剂化电子形式或电动改性或荷电的氧物种以至少0.01ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少3ppm、至少5ppm、至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm或至少20ppm的量存在。
45.根据权利要求43所述的用途，其中所述电动改变的氧合水性流体包含至少部分地通过分子氧稳定的溶剂化电子。
46.根据权利要求1所述的用途，其中改变细胞膜结构或功能足以提供细胞内信号转导调节的能力在密闭气密性容器中持续至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少6个月、至少12个月或更长的时间。
47.根据权利要求26所述的用途，其中所述膜相关蛋白包括CCR3。
48.根据权利要求1所述的用途，其中所述治疗包括调节细胞内NF-κB表达和/或活性；优选地降低NF-κB表达和/或活性。
49.根据权利要求1所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物或人。
50.一种电动改变的水性流体在制备用于手术至少一个方面的药剂或试剂流体中的用途，其中所述流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径并在所述离子水性流体中以手术有效量稳定成形。
51.根据权利要求50所述的用途，其中所述手术为心血管手术。
52.根据权利要求51所述的用途，其中所述手术包括选自以下的至少一种：与心律失常相关的手术；与血管疾病相关的手术；与心肌梗死相关的手术；与充血性心力衰竭相关的手术；与心肌炎相关的手术；与动脉粥样硬化和再狭窄相关的手术；包括使用心肺分流术(CPB)的手术；包括使用血管(例如静脉、动脉)保存液的手术；以及包括使用停搏液的手术。
53.一种用于简便高通量测量电动改变的流体(如RNS60)生物活性的方法，包括：
使细胞接触电动改变的流体，所述流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液，所述纳米结构主要具有小于约100纳米的平均直径；
使用合适的测定法执行离子通道测量；以及
基于相对于与对照流体(例如，非电动改变的对照流体)接触的细胞的所述离子通道测量确定所述电动改变的流体的生物活性水平或值。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述离子通道测量为选自以下的至少一者：门控动力学、电压敏感性的增强、抑制、改变，以及激动剂诱发活性的调节。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述离子通道为5HT3A和TRPV1中的至少一者。
56.根据权利要求55所述的方法，包括测量血清素诱发的5HT3A和辣椒碱诱发的TRPV1中的至少一者。
57.一种用于简便高通量测量电动改变的流体(如RNS60)生物活性的方法，包括：
对电荷稳定的含氧纳米结构的离子水性溶液执行拉曼光谱和荧光偏振各向异性测量中的至少一种，所述纳米结构主要具有小于约100纳米的平均直径；以及
将所述至少一种拉曼光谱和荧光偏振各向异性测量与所述电动改变的流体的生物活性量相关联，其中提供了用于简便高通量测量所述电动改变的流体的生物活性的方法。
58.根据权利要求57所述的方法，包括测量拉曼后向散射和荧光偏振各向异性中的至少一者。
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