KR20130100126A - 심혈관 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본원에 기재된 바와 같은 치료적 유효량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를 그를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환 및 관련된 상태 및 증상 (예를 들면, 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착)의 치료 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 대부분 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 가지고 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액을 포함한다. 투여 경로 또는 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들면, 동전기적으로-변경된 가스-풍부 유체 및 용액) 및 치료적 조성물에 대한 제제가, 심혈관 관련된 수술을 포함하나, 이에 한정되지는 않는 수술적 맥락에서의 동전기적으로 변경된 수성 유체의 사용과 함께 제공된다. 추가로 동전기적으로 변경된 유체의 생물학적 활성의 측정 방법이 제공된다.

Description

심혈관 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CARDIOVASCULAR DISEASE}

발명의 분야

특정 측면은 본원에 기재된 바와 같이 동전기적으로 변경된 수성 유체의 치료적 유효량을 이를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 일반적으로 심혈관 질환 및 관련된 상태 및 그의 증상 (예를 들면, 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착 중 하나 이상)을 치료하는 방법에 관련된다. 특정 측면은 유체에 의한 살아있는 세포의 접촉시 이온성 수성 유체 내에 안정하게 설정된 실질적으로 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 갖는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액을 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 포함하는, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 사용에 관련된다. 추가의 측면은 동전기적으로 변경된 유체의 생물학적 활성을 측정하는 방법에 관련된다.

발명의 배경

심혈관 질환은 심장 또는 혈관 (동맥 및 정맥)에 관여하는 질환의 큰 클래스이다. 심혈관 질환은 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 이들 상태는 유사한 원인, 기전, 및 치료를 갖는다. 대부분의 심혈관 질환은 염증, 높은 콜레스테롤, 및 비만을 비롯한 공통의 위험 인자를 공유한다.

추가로, 염수 용액이 사용된 많은 심혈관 수술적 시나리오가 있으며, 여기서 수술적 시나리오(예를 들면, 심폐 우회술 (CPB) 프라임(prime) (우회술 펌프 프라이밍(priming) 용액, 여기서 전신 염증성 반응이 CPB의 유해한 효과를 야기함; 염수 용액의 사용으로부터 이득을 보는 이식편이 완성된 후 관상을 씻어 내리기 위한 정맥 보존 용액 (전형적으로 파파베린 및 염수) 카디오플레지아(cadioplegia)(예를 들면, 또한 칼륨을 함유할 수 있는 글루타메이트 및/또는 아스파르테이트-함유 카디오플레지아))에 수반되는 유해한 효과를 감소시키거나 또는 제거하는 것이 바람직할 수 있다.

발명의 요약

치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 동전기적으로 변경된 수성 유체를 그를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환 및 관련된 상태 및 그의 증상 (예를 들면, 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태 또는 질환)의 치료 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 실질적으로 (예를 들면, 대부분) 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 가지며, 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기 위해 충분한 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액을 포함한다. 추가로 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들면, 동전기적으로-변경된 가스-풍부 유체 및 용액) 및 치료적 조성물에 대한 투여 경로 또는 제제가, 심혈관 관련된 수술을 포함하나, 이로 한정되지는 않는 수술적 맥락에서의 동전기적으로 변경된 수성 유체의 사용과 함께 제공된다.

특정 측면은 실질적으로 (예를 들면, 대부분) 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 가지며 이온성 수성 유체 내에 안정하게 설정된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액을 심혈관 질환 또는 상태 또는 하나 이상의 그의 증상의 치료를 제공하기에 충분한 양으로 포함하는, 치료적 유효량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를 그를 필요로하는 대상체, 또는 그의 일부에게 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환 또는 상태의 치료 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물는 이온성 수성 유체 내에 유체에 의한 살아있는 세포의 접촉시 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 안정하게 설정되었다.

특정 실시양태에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 유체 내의 주요 전하-안정화된 기체-함유 나노구조물 종이다. 일부 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물로서 유체 내에 존재하는 용존 산소 분자의 백분율은 0.01％ 초과; 0.1％ 초과; 1％ 초과; 5％ 초과; 10％ 초과; 15％ 초과; 20％ 초과; 25％ 초과; 30％ 초과; 35％ 초과; 40％ 초과; 45％ 초과; 50％ 초과; 55％ 초과; 60％ 초과; 65％ 초과; 70％ 초과; 75％ 초과; 80％ 초과; 85％ 초과; 90％ 초과; 및 95％ 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율이다. 특정 측면에서, 총 용존 산소는 실질적으로 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 평균 직경은 실질적으로 90 nm 미만; 80 nm 미만; 70 nm 미만; 60 nm 미만; 50 nm 미만; 40 nm 미만; 30 nm 미만; 20 nm 미만; 10 nm 미만; 및 5 nm 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 크기이다.

바람직한 실시양태에서, 이온성 수용액은 염수 용액을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유체는 과도산소화(superoxygenated)된다.

특정 측면에서, 유체는 용매화 전자 형태를 포함한다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 변경은 유체역학적으로 유도된 국소적인 동전기적 효과에 대한 유체의 노출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 국소화된 동전기적 효과에 대한 노출은 전압 펄스(pulse) 및 전류 펄스 중 하나 이상에 대한 노출을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유체역학적으로 유도된 국소적인 동전기적 효과에 대한 유체의 노출은 유체를 생성시키는데 사용된 장치의 동전기적 효과-유도 구조 특징에 대한 유체의 노출을 포함한다.

특정 실시양태에서, 심혈관 질환 또는 상태는 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 질환 또는 상태를 포함한다. 특정 실시양태에서, 심혈관 상태 또는 질환은 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 및 죽상동맥경화증 중 하나 이상을 포함한다. 바람직한 측면에서, 심혈관 상태 또는 질환은 심근 경색증 및 죽상동맥경화증 중 하나 이상을 포함한다.

특정 측면에서, 심혈관 질환의 하나 이상의 증상은 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태에 관련된다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 산화질소의 국소 또는 세포 수준을 조정한다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 IL-1베타, IL-8, TNF-알파, 및 TNF-베타로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 투여 부위에서의 국소적인 감소를 촉진한다.

특정 측면은 또 다른 항-염증제로 대상체를 동시에 또는 보조적으로 치료하는 것에 의한 염증의 상승작용적 또는 비-상승작용적 억제 또는 감소를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 다른 항-염증제는 스테로이드 또는 글루코코르티코이드 스테로이드 (예를 들어, 부데소니드(Budesonide) 또는 그의 활성 유도체를 포함함)를 포함한다.

특정 측면은 하나 이상의 추가의 치료제가 환자에게 투여되는 조합 요법을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 퀴니딘, 프로카이나미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 모리시진, 프로프라놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤로, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론, E-4031, 베라파밀, 딜티아젬, 아데노신, 디고크신, 마그네슘 술페이트, 와파린, 헤파린, 항-혈소판 약물 (예를 들면, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들면, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들면, 캅토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌스 및 락토키닌스), 스타틴 (예를 들면, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들면, 에플레레논 및 스피로노락톤), 디기탈리스, 이뇨제, 디고크신, 아이노트로프 (예를 들면, 밀리논), 혈관확장제 및 오메가-3 지방산 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 실시양태에서, 하나 이상의 추가 치료제는 TSLP 및/또는 TSLPR 길항제를 포함한다 (특정 측면에서, TSLP 및/또는 TSLPR 길항제는 TSLP 및 TSLP 수용체에 특이적인 중화 항체, 가용성 TSLP 수용체 분자, 및 TSLP 수용체 융합 단백질 (TSLPR-이뮤노글로불린 Fc 분자 또는 1개 초과의 수용체 사슬의 성분을 코딩하는 폴리펩티드 포함)로 이루어진 군으로부터 선택된다).

특정 측면에서, 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정은 막 회합 단백질의 입체형태, 리간드 결합 활성 또는 촉매 활성의 조정을 포함하는 세포막 구조 또는 기능 중 하나 이상을 조정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막 회합 단백질은 수용체, 막횡단 수용체, 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 부착 단백질, 인테그린 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 특정 측면에서, 막횡단 수용체는 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)를 포함한다. 특정 실시양태에서, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)는 G 단백질 α 서브유닛과 상호작용한다 (특정 측면에서, G 단백질 α 서브유닛은 Gα_s, Gα_i, Gα_q, 및 Gα₁₂로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다). 특정 실시양태에서, 하나 이상의 G 단백질 α 서브유닛은 Gα_q이다.

특정 측면에서, 세포막 전도도를 조정하는 것은 전체-세포 전도도를 조정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전체-세포 전도도를 조정하는 것은 전체-세포 전도도의 하나 이상의 전압-의존적 기여물을 조정하는 것을 포함한다.

특정 측면에서, 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정은 칼슘 의존적 세포성 메시지 전달(messaging) 경로 또는 시스템의 조정을 포함한다. 특정 측면에서, 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정은 포스포리파제 C 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정은 아데닐레이트 시클라제 (AC) 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함한다. 특정 측면에서, 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정은 심혈관계에서의 만성 염증 및 심혈관계에서의 급성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태 또는 증상과 연관된 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함하는 세포내 신호 전달을 조정하는 것을 포함한다.

특정 측면에서, 방법은 세포 네트워크 또는 층에 대한 투여를 포함하고, 추가로 그 내부에서의 세포간 연접의 조정을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포간 연접은 치밀 연접, 간극 연접, 조나 어드헤린스(zona adherens) 및 데스마솜(desmasomes)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 세포 네트워크 또는 층은 CNS 혈관 내의 내피 세포 및 내피-성상세포 치밀 연접, 혈액-뇌척수액 치밀 연접 또는 장벽, 폐 상피-유형 연접, 기관지 상피-유형 연접, 및 장 상피-유형 연접으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산소화되고, 여기서 유체 내의 산소는 대기압에서 산소 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상, 또는 60 ppm 이상의 양으로 존재한다. 일부 측면에서, 동전기적으로 변경된 유체의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물 내에 존재하는 산소의 양은 대기압에서 산소 8 ppm 이상, 15 ppm 이상, 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상, 또는 60 ppm 이상이다.

일부 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 용매화 전자 형태 및 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 용매화 전자 형태 또는 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종은 0.01 ppm 이상, 0.1 ppm 이상, 0.5 ppm 이상, 1 ppm 이상, 3 ppm 이상, 5 ppm 이상, 7 ppm 이상, 10 ppm 이상, 15 ppm 이상, 또는 20 ppm 이상의 양으로 존재한다. 특정 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체는 적어도 부분적으로 분자 산소에 의해 안정화된 용매화 전자를 포함한다.

특정 측면에서, 세포내 신호 전달의 조정을 제공하기 위해 충분한 세포막 구조 또는 기능을 변경하는 능력이 밀폐된 기밀(gas-tight) 용기에서 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 12개월 이상, 또는 그를 초과하는 기간 동안 지속된다.

일부 측면에서, 막 회합 단백질은 CCR3을 포함한다.

특정 측면에서, 치료는 세포내 NF-κB 발현 및/또는 활성의 조정을 포함한다.

바람직한 측면에서, 대상체는 포유동물 또는 인간이다.

특정 측면은 수술을 그를 필요로 하는 대상체에게 수행하는 것을 포함하는, 수술을 수행하는 방법을 제공하며, 여기서 수술의 하나 이상의 측면에서 시약 유체가 사용되며, 여기서 시약 유체는 실질적으로 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 갖는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액을 포함하는 수술적으로 유효량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를 포함한다.

특정 측면에서, 수술은 하나 이상의 심장 부정맥과 관련된 수술; 혈관 질환과 관련된 수술; 심근 경색증과 관련된 수술; 울혈성 심부전과 관련된 수술; 심근염과 관련된 수술; 죽상동맥경화증, 및 재협착과 관련된 수술; 심폐 우회술 (CPB)의 사용을 포함하는 수술; 혈관 (예를 들면, 정맥, 동맥) 보존 용액의 사용을 포함하는 수술; 및 카디오플레지아의 사용을 포함하는 수술로 이루어진 군으로부터 선택된 수술을 포함한다.

추가의 측면은 본원에 기재된 바와 같은 세포를 동전기적으로-변경된 유체와 접촉시키는 단계; 적합한 검정을 사용하여 이온-채널 측정을 수행하는 단계; 및 이온-채널 측정을 기반으로 동전기적으로-변경된 유체의 생물학적 활성 수준 또는 값을 대조군 유체와 접촉된 세포의 것과 비교하여 결정하는 단계를 포함하는, 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들면, RNS60)의 생물학적 활성의 용이한 고-처리 측정 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 이온-채널 측정은 개폐 역동학의 강화, 억제, 변경, 전압 민감도, 및 효능제-유발된 활성의 조정으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다. 특정 측면에서, 이온 채널은 5HT3A 및 TRPV1 중 하나 이상이다. 특정 실시양태에서, 방법은 세로토닌-유발된 5HT3A 및 캡세이신 유발된 TRPV1 중 하나 이상의 측정을 포함한다.

또한 추가의 측면은 본원에 기재된 바와 같이 세포를 동전기적으로-변경된 유체와 접촉시키는 단계; 라만 분광법 및 형광 편광 비등방성 측정 중 하나 이상을 수행하는 단계; 및 대조군 유체와 접촉된 세포의 측정과 비교하여 하나 이상의 측정을 기반으로, 생물학적 활성 수준 또는 동전기적으로-변경된 유체의 값을 결정하는 단계를 포함하는, 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들면, RNS60)의 생물학적 활성의 용이한 고-처리 측정 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 라만 후방산란 및 형광 편광 비등방성 중 하나 이상의 측정을 포함한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 기체-강화 유체 및 탈이온 대조군 유체의 존재 하에서의 분열촉진 검정의 시토카인 프로파일을 도해한다.

도 2-11은 시토카인의 전혈 샘플 평가의 결과를 나타낸다.

도 12-21은 기관지폐포 세척 유체 (BAL) 샘플 평가의 상응하는 시토카인 결과를 나타낸다.

도 22-29는 조절 T 세포에 영향을 주는 본원에 개시된 특정 실시양태의 능력을 나타내는 데이터를 나타낸다. 연구는 항원 제시 세포를 방사선조사하고, 항원 및 T 세포를 도입하는 것을 포함하였다.

도 30-34는 RDC1676-01 (추가의 산소가 첨가된 인스턴트 상품명(instant proprietary) 장치를 통해 처리된 멸균 염수; 가스-풍부 동전기적으로 생성된 유체 (Rev))에 노출된 인간 포피 각질세포로부터 수득된 데이터를 나타낸다.

도 35-38은 브라운 노르웨이(Brown Norway) 래트 알부민 감작 모델에서의 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체의 기도 항-염증성 특성을 평가하기 위해 수행된 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 실험과 조합된 부데소니드의 결과를 나타낸다. 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체는 호산구 계수를 감소시켰으며, 호산구 계수를 감소시키는데 있어서 부데소니드와의 강한 상승효과를 나타냈으며, 에오탁신의 혈액 수준을 감소시켰으며, 2개의 주요 항-염증성 시토카인, IL10 및 인터페론 감마의 혈액 수준을 검사 후 6시간에서 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들면, RNS-60) 단독으로 또는 부데소니드와 조합된 처리의 결과로서 유의하게 증대시켰고, 란테스(Rantes)의 전신성 수준을 감소시켰다.

도 39는 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들면, RNS-60 및 솔라스(Solas))는 DEP-유도된 세포 표면에 결합된 MMP-9 수준을 기관지 상피 세포에서 각각 대략 80%, 및 70% 억제한 반면, 생리 염수 (NS)는 미미한 효과만을 가졌다는 것을 나타낸다.

도 40 A-B는 백혈구 상에서의 세포 표면 수용체 CD193 (CCR3)의 발현 수준이 생리 염수 또는 RNS-60을 사용하여 비교된 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석의 결과를 명시한다. X축은 샘플의 로그 형광을 나타내고, Y축은 샘플에서 발생한 형광 사건을 나타낸다.

도 41 A-C는 백혈구 상에서의 세포 표면 수용체 CD154 (CD40L) (패널 A); CD11B (패널 B); 및 CD3 (패널 C)의 발현 수준이 생리 염수 또는 RNS-60을 사용하여 비교된 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석의 결과를 명시한다. X축은 샘플의 로그 형광을 나타내고, Y축은 샘플에서 발생한 형광 사건을 나타낸다.

도 42 A-C는 MBP-프라이밍된(primed) T 세포에서의 NFκB 활성화에 대한 RNS60의 효과를 검사한 2가지 겔 이동 실험 (패널 A 및 B) 및 루시퍼라제 활성 (리포터 유전자) 검정 (패널 C)의 결과를 나타낸다.

도 43 A-D는 심근 경색증의 유도 후, 트로포닌 (패널 A 및 B) 및 크레아틴 포스포키나제 (CPK) (패널 C 및 D)의 혈액 수준의 시간적 처리의 도식 묘사이다.

도 44 A-I는 특정 측면에 따라, 대조군-처리된 수컷 동물 (#3033)에서 발견된 괴사 조직의 예를 나타낸다.

도 45 A 및 B는 특정 측면에 따라, 라만 후방산란에 의해 측정된 바와 같이, 대조군 PNS60 (45A)과 비교하여 RNS60 (45B)에 대한 증가된 온도 (심장)의 효과를 나타내며, 각각의 차이 곡선, 및 2개의 산소 피크를 나타낸다.

도 46은 특정 측면에 따라, "RNS60" ("로트(Lot) A" 및 "로트 B"), "NS" (생리 염수 대조군), "RDW" (동전기적으로 처리된 탈이온수) 및 "DW" (탈이온수) 사이에서의 형광 편광 비등방성 데이터의 작지만 유의한 차이를 나타낸다.

도 47은 특정 측면에 따라, 세포외로 관류된 RNS60 (89%)은 세로토닌-유발된 5HT3A (이온 채널) 활성을 강화시키는 것을 나타낸다 (대조군과 비교하여 -101.8 ± 24.2% (n=3)의 평균 억제).

도 48은 특정 측면에 따라, RNS60 (84%)은 캡세이신 유발된 TRPV1 (이온 채널) 전류를 억제하는 것을 나타낸다 (-90.9 ± 6.7% (n=3)의 평균 억제). 비교는 생리 염수, 100 nm 캡세이신, 및 100 nm 캡세이신 +87% RNS60 사이에서 수행되었다.

도 49는 특정 측면에 따라, RNS60으로의 관류는 심근세포에서 전기적 스파이킹(spiking)을 변경시키는 것을 나타낸다; V램프(ramp), -100 mV → +40 mV; ΔV스파이크(spike), 1.67 ± .47 mV; Δt스파이크, 5.95 1.67 m초 (n = 6). 기전에 의해 구속되지 않고, 스파이킹의 지연은 나브(Nav)1.5와의 상호작용으로 인한 것일 수 있다.

발명의 상세한 설명

본원에 기재된 바와 같은 치료적 유효량의 동전기적으로 변경된 수성 유체를 그를 필요로하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환 및 관련된 상태 및 그의 증상 (예를 들면, 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태 또는 질환)의 치료 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 실질적으로 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 가지며, 유체에 의한 살아있는 세포의 접촉시 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정하게 설정된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액을 포함한다. 다른 실시양태는 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들면, 동전기적으로-변경된 가스-풍부 유체 및 용액) 및 치료적 조성물에 대한 투여 또는 제제의 특정 경로를 포함한다.

동전기적으로 생성된 유체:

본원에서 사용된 바와 같은 "동전기적으로 생성된 유체"는 본원에서의 실시예의 목적을 위해 본원에서 상세하게 기술된 예시적인 혼합 장치에 의해 생성된 본 출원인의 발명의 동전기적으로 생성된 유체를 지칭한다 (US200802190088 및 WO2008/052143 (둘 모두 전문이 본원에 참고로 포함됨)을 또한 참조한다). 이러한 동전기적 유체는, 본원에 개시 및 제시된 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, 종래 기술의 산소화 비-동전기적 유체 (예를 들어, 압력 용기의 산소화 유체 등)와 비교하는 것을 포함하여 종래 기술의 비-동전기적 유체와 비교하여 신규하고 근본적으로 독특한 유체를 나타낸다. 본원에서의 다양한 측면에서 개시된 바와 같이, 동전기적으로 생성된 유체는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는 독특하고 신규한 물리적 및 생물학적 성질이 있다:

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이고 유체에 의해 살아있는 세포에 접촉시 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정적으로 배열된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함한다.

특정 측면에서, 동전기적으로 생성된 유체는 유체역학적으로 유도된 국소적인 (예를 들어, 전체적인 유체 부피와 관련하여 균일하지 않은) 동전기적 효과 (예를 들어, 전압/전류 펄스), 예컨대 본원에 기술된 바와 같은 장치 특징-국소 효과의 존재 하에 생성된 유체를 지칭한다. 특정 측면에서, 상기의 유체역학적으로 유도된 국소화된 동전기적 효과는 본원에 개시 및 논의된 바와 같은 표면-관련 이중층 및/또는 유동 전류 효과와 조합된다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 내부에 용해된 리포터 용질 (예를 들어, 트레할로스)의 ¹³C-NMR 선폭을 조정하는데 적절하다. NMR 선폭 효과는 특정 실시예에서 본원에 기술된 바와 같은 시험 유체에서 예를 들어 용질 '텀블링(tumbling)'을 측정하는 간접적인 방법이다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 하기의 것들 중 하나 이상을 특징으로 한다: -0.14V, -0.47V, -1.02V 및 -1.36V 중 어느 하나에서의 특유의 구형파 전압전류법 피크 차이; -0.9 볼트에서의 폴라로그래프 피크; 및 -0.19 및 -0.3 볼트에서의 폴라로그래프 피크의 부재 (이는 특정 실시예에서 본원에 개시된 바와 같은 동전기적으로 생성된 유체 특유의 것임).

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 세포막 전도도 (예를 들어, 본원에 개시된 패치 클램프 연구에서 측정된 바와 같은 전체-세포 전도도의 전압-의존적 기여물)를 변경시키는데 적절하다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산소화되고, 여기서 유체 내의 산소는 대기압에서 용존 산소 15 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 ppm 이상, 40 ppm 이상, 50 ppm 이상, 또는 60 ppm 이상의 양으로 존재한다. 특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 대기압에서 용존 산소가 15 ppm 미만이거나, 10 ppm 미만이거나, 또는 대략적으로 주위 산소 수준이다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산소화되고, 여기서 유체 내의 산소는 약 8 ppm 내지 약 15 ppm의 양으로 존재하고, 이러한 경우에 때때로 본원에서 "솔라스"로 지칭된다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 용매화 전자 (예를 들어, 분자 산소에 의해 안정화됨) 및 동전기적으로 변형 및/또는 하전된 산소 종 중 하나 이상을 포함하고, 여기서 일부 실시양태에서 용매화 전자 및/또는 동전기적으로 변형 또는 하전된 산소 종은 0.01 ppm 이상, 0.1 ppm 이상, 0.5 ppm 이상, 1 ppm 이상, 3 ppm 이상, 5 ppm 이상, 7 ppm 이상, 10 ppm 이상, 15 ppm 이상, 또는 20 ppm 이상의 양으로 존재한다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 동전기적으로 변경되지 않은 유체 대조군에 비해 차별적인 (예를 들어, 증가된 또는 감소된) 유전율을 특징으로 한다. 바람직한 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 동전기적으로 변경되지 않은 유체 대조군에 비해 차별적인 증가된 유전율을 특징으로 한다. 유전율 (ε) (미터 당 패럿)은 물질이 전기장에 의해 분극되어 물질 내부의 총 전기장을 감소시키는 능력의 척도이다. 따라서, 유전율은 물질이 전기장을 전도하는 (또는 "허용하는") 능력에 관련된다. 밀접하게 관련된 성질인 정전 용량 (C) (패럿; 볼트 당 쿨롬)은 전압이 물질을 가로질러 인가되는 경우에 물질이 전하를 보유하는 능력의 척도이다 (예를 들어, 2개의 평행한 전도성 플레이트 사이에 샌드위치된 유전층이 최적의 모델임). 전압 V가 정전 용량 C의 커패시터를 가로질러 인가되면, 커패시터가 보유할 수 있는 전하 Q는 인가된 전압 V에 직접적으로 비례하고, 여기서 정전 용량 C는 비례 상수이다. 따라서, Q = CV, 또는 C = Q/V이다. 커패시터의 정전 용량은 유전층의 유전율 ε, 뿐만 아니라 커패시터의 면적 A 및 2개의 전도성 플레이트 사이의 분리 거리 d에 좌우된다. 유전율 및 정전 용량은 하기와 같이 수학적으로 관련된다: C = ε(A/d). 사용된 유전체가 진공이면, 정전 용량 Co = εo(A/d)이고, 여기서 εo는 진공의 유전율 (8.85×10^-12 F/m)이다. 유전 상수 (k), 또는 물질의 상대적인 유전율은 그의 유전율 ε 대 진공의 유전율 εo의 비이고, 따라서 k = ε/εo이다 (진공의 유전 상수는 1이다). k가 낮은 유전체는 유전율이 낮거나 또는 분극되거나 전하를 보유하는 능력이 낮은 유전체이다. 반면에, k가 높은 유전체는 유전율이 높다. k가 높은 유전체가 전하 보유를 잘하기 때문에, 커패시터에 대한 바람직한 유전체이다. k가 높은 유전체는 전하의 형태로 디지털 데이터를 저장하는 메모리 셀에서 또한 사용된다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 세포내 신호 전달의 조정을 제공하는데 충분하도록 세포막 구조 또는 기능을 변경시키는데 적절하고 (예를 들어, 막 회합 단백질의 입체형태, 리간드 결합 활성 또는 촉매 활성을 변경시킴), 여기서 특정 측면에서 막 회합 단백질은 수용체, 막횡단 수용체 (예를 들어, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), TSLP 수용체, 베타 2 아드레날린성 수용체, 브라디키닌 수용체 등), 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 부착 단백질, 및 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 일부 측면에서, 영향을 받은 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)는 G 단백질 α 서브유닛 (예를 들어, Gα_s, Gα_i, Gα_q, 및 Gα₁₂)과 상호작용한다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 칼슘 의존적 세포성 메시지 전달 경로 또는 시스템의 조정 (예를 들어, 포스포리파제 C 활성의 조정, 또는 아데닐레이트 시클라제 (AC) 활성의 조정)을 포함하여, 세포내 신호 전달을 조정하는데 적절하다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 본원의 실시예 및 다른 곳에서 기술된 다양한 생물학적 활성 (예를 들어, 시토카인, 수용체, 효소 및 기타 단백질 및 세포내 신호전달 경로의 조절)을 특징으로 한다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 본원의 실시예에서 제시된 바와 같이 기관지 상피 세포 (BEC)에서의 DEP-유도 세포 표면-결합 MMP9 수준을 억제한다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 생물학적 효과는 디프테리아 독소에 의해 억제되고, 이는 본원의 실시예에서 제시된 바와 같이 베타 차단, GPCR 차단 및 Ca 채널 차단이 동전기적으로 변경된 수성 유체의 활성 (예를 들어, 조절성 T 세포 기능에 대한 활성)에 영향을 미친다는 것을 가리킨다.

특정 측면에서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 물리적 및 생물학적 효과 (예를 들어, 세포내 신호 전달의 조정을 제공하는데 충분하도록 세포막 구조 또는 기능을 변경시키는 능력)가 밀폐된 용기 (예를 들어, 밀폐된 기밀 용기)에서 2개월 이상, 3개월 이상, 4개월 이상, 5개월 이상, 6개월 이상, 또는 그보다 긴 기간 동안 지속된다.

따라서, 추가적인 측면들은 상기 동전기적으로 생성된 용액, 및 상대적인 움직임 상태에 있고 표면들 사이의 혼합 부피를 규정하는, 간격이 있는 2개의 표면 사이에 유체 물질의 유동을 제공하고, 여기서 유동 유체 물질이 혼합 부피 내에서, 그리고 혼합 부피를 통해 1회 통과하는 체류 시간(dwell time)이 0.06초 초과 또는 0.1초 초과인 단계; 및 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 또는 60 ppm 이상의 산소를 물질 내로 용존시키는데, 그리고 유체 또는 용액을 동전기적으로 변경시키는데 적절한 조건 하에 산소 (O₂)를 혼합 부피 내의 유동 유체 물질 내로 도입하는 단계를 포함하는, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 100밀리초 미만, 200밀리초 미만, 300밀리초 미만, 또는 400밀리초 미만 내에 산소가 물질 내로 주입된다. 특정 실시양태에서, 표면적 대 부피의 비는 12 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상이다.

추가적인 측면은 표면들 사이의 혼합 부피를 규정하는, 간격이 있는 2개의 표면 사이에 유체 물질의 유동을 제공하는 단계; 및 20 ppm 이상, 25 ppm 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 또는 60 ppm 이상의 산소를 100밀리초 미만, 200밀리초 미만, 300밀리초 미만, 또는 400밀리초 미만 내에 물질 내로 주입하는데 적절한 조건 하에 산소를 혼합 부피 내의 유동 물질 내로 도입하는 단계를 포함하는, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 혼합 부피 내의 유동 물질의 체류 시간은 0.06초 초과 또는 0.1초 초과이다. 특정 실시양태에서, 표면적 대 부피의 비는 12 이상, 20 이상, 30 이상, 40 이상, 또는 50 이상이다.

추가적인 실시양태는 제1 물질 및 제2 물질을 혼합함으로써 출력 혼합물을 생성시키기 위한 혼합 장치를 사용하는 것을 포함하고, 여기서 장치가 제1 물질을 제1 물질 공급원으로부터 전달받도록 구성된 제1 챔버; 고정자(stator); 고정자의 내부에 배치되고 내부의 회전축을 따라 회전하도록 구성된, 회전축이 있는 회전자 (여기서, 회전자와 고정자 중 하나 이상에 다수의 스루홀(through-hole)이 있음); 회전자와 고정자 사이에 한정된 혼합 챔버이며, 제1 챔버와 유체 소통하고 그로부터 제1 물질을 전달받도록 구성되고, 제2 물질이 회전자와 고정자 중 하나 내에 형성된 다수의 스루홀을 통해 혼합 챔버 내로 제공되는 것인 혼합 챔버; 혼합 챔버와 유체 소통하고 그로부터 출력 물질을 수신하도록 구성된 제2 챔버; 및 제1 챔버 내부에 수용되고, 제1 물질을 제1 챔버로부터 혼합 챔버 내로 펌핑하도록 구성된 제1 내부 펌프를 포함하는 것인, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 생산하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 제1 내부 펌프는 제1 물질이 혼합 챔버 내에 진입하기 전에 제1 물질 내로 원주 속도를 부여하도록 구성된다.

추가적인 실시양태는 제1 물질 및 제2 물질을 혼합함으로써 출력 혼합물을 생성시키기 위한 혼합 장치를 사용하는 것을 포함하고, 여기서 장치가 고정자; 고정자의 내부에 배치되고 내부의 회전축을 따라 회전하도록 구성된, 회전축이 있는 회전자; 회전자와 고정자 사이에 한정된 혼합 챔버이며, 제1 물질이 그를 통해 혼합 챔버에 진입하는 개방형 제1 말단 및 출력 물질이 그를 통해 혼합 챔버에서 나가는 개방형 제2 말단이 있고, 제2 물질이 회전자와 고정자 중 하나 이상을 통해 혼합 챔버에 진입하는 것인 혼합 챔버; 혼합 챔버의 개방형 제1 말단의 적어도 대다수 부분과 소통하는 제1 챔버; 및 혼합 챔버의 개방형 제2 말단과 소통하는 제2 챔버를 포함하는 것인, 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 생산하는 방법을 제공한다.

추가적인 측면은 상기 방법들 중 어느 하나에 따라 제조된 동전기적으로 변경된 산소화 수성 유체 또는 용액을 제공한다. 특정 측면에서, 투여된 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물을 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 유체는 과도산소화된다 (예를 들어, 표준 염수 내에 각각 20 ppm, 40 ppm 및 60 ppm의 용존 산소를 포함하는 RNS-20, RNS-40 및 RNS-60). 특정 실시양태에서, 동전기적으로 변경된 유체는 과도산소화되지 않는다 (예를 들어, 표준 염수 내에 10 ppm (예를 들어, 대략적으로 주위 수준)의 용존 산소를 포함하는 RNS-10 또는 솔라스). 일부 측면에서, 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체의 염도, 멸균성, pH 등이 유체의 동전기적 생산 시점에 확립되고, 멸균성 유체가 적합한 경로에 의해 투여된다. 별법적으로, 유체의 염도, 멸균성, pH 등 중 하나 이상이 유체 투여 전에 투여 경로와 생리학적으로 상용성이도록 적합하게 조정된다 (예를 들어, 멸균 염수 또는 적합한 희석제를 사용함). 바람직하게는, 유체의 염도, 불임, pH, 등 중 하나 이상을 조정하기 위해 사용된 희석제 및/또는 염수 용액 및/또는 완충액 조성물은 또한 동전기적 유체이거나, 또는 그렇지 않으면 그와 호환된다.

특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체는 염수 (예를 들면, 하나 이상의 용해된 염(들); 예를 들면, 임의의 적합한 음이온 성분을 갖는 알칼리 금속 기반 염 (Li, Na, K, Rb, Cs, 등) 또는 알칼리 토류 기반 염 (예를 들면, Mg, Ca), 등)을 포함한다. 특정 측면은 혼합된 염 기반 동전기적 유체 (예를 들면, 다양한 조합 및 농도로 Na, K, Ca, Mg, 등)를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체는 표준 염수 (예를 들면, 대략 0.9% NaCl, 또는 약 0.15 M NaCl)를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체는 적어도 0.0002 M, 적어도 0.0003 M, 적어도 0.001 M, 적어도 0.005 M, 적어도 0.01 M, 적어도 0.015 M, 적어도 0.1 M, 적어도 0.15 M, 또는 적어도 0.2 M의 농도에서의 염수를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체의 전도도는 적어도 10 μS/cm, 적어도 40 μS/cm, 적어도 80 μS/cm, 적어도 100 μS/cm, 적어도 150 μS/cm, 적어도 200 μS/cm, 적어도 300 μS/cm, 또는 적어도 500 μS/cm, 적어도 1 mS/cm, 적어도 5, mS/cm, 10 mS/cm, 적어도 40 mS/cm, 적어도 80 mS/cm, 적어도 100 mS/cm, 적어도 150 mS/cm, 적어도 200 mS/cm, 적어도 300 mS/cm, 또는 적어도 500 mS/cm이다. 특정 측면에서, 임의의 염이 본 발명의 동전기적으로-변경된 유체를 제조하는데 사용될 수 있으며, 단 이들은 본원에 개시된 바와 같이 생물학적으로 활성 염-안정화된 나노구조물 (예를 들면, 염-안정화된 산소-함유 나노구조물)의 형성을 감안한다.

특정 측면에 따라, 전하-안정화된 가스-함유 나노구조물를 포함하는 본 발명의 유체 조성물의 생물학적 효과 (예를 들면, 증가됨, 감소됨, 조정됨, 등)는 유체의 이온성 성분을 변경시킴으로써, 예를 들면, 상기 기재된 바와 같이, 및/또는 유체의 가스 성분을 변경시킴으로써 조정될 수 있다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 동전기적 유체를 제조하는데 산소가 사용된다. 추가의 측면에서 산소와 질소, 산소, 아르곤, 이산화 탄소, 네온, 헬륨, 크립톤, 수소 및 크세논으로부터 선택된 하나 이상의 다른 가스와의 혼합물.

본원에 개시된 교시 및 검정 시스템 (예를 들면, 세포-기반 시토카인 검정, 패치-클램프(patch-clamp) 검정, 등)을 고려하여, 당업자는 본원에 개시된 생물학적 활성을 달성하기 위해 적절한 염 및 그의 농도를 쉽게 선택할 수 있을 것이다.

<표 1>

<표 2>

본 개시는 가스-풍부 이온성 수성 용액, 수성 염수 용액 (예를 들면, 표준 수성 염수 용액, 및 임의의 생리학적으로 호환되는 염수 용액을 포함하는 본원에 논의된 바와 같은, 그리고 당업계에 인식될 수 있는 다른 염수 용액), 세포 배양 배지 (예를 들면, 최소 배지, 및 다른 배양 배지)를 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 신규한 가스-풍부 유체를 제시한다.

심혈관 질환 및 관련된 상태

심혈관 질환은 심장 또는 혈관 (동맥 및 정맥)에 관여하는 질환의 큰 클래스이다. 심혈관 질환은 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 이들 상태는 유사한 원인, 기전, 및 치료를 갖는다. 대부분의 심혈관 질환은 염증, 높은 콜레스테롤, 및 비만을 포함하는 공통의 위험 인자를 공유한다. C-반응성 단백질, 인터루킨 6 (IL-6), 및 인터루킨 8 (IL-8)을 포함하는 염증성 바이오마커는 심혈관 질환과 연관지어졌다. 추가로, 매트릭스 메탈로프로테이나제는 최근에 심혈관 질환에서 역할을 갖는 것으로 밝혀졌다.

심장 부정맥은 임의의 심장에서 비정상적 전기적활성이 있는 상태의 큰, 이질성 군에 대한 용어이다. 심장 박동은 너무 빠르거나 또는 너무 느릴 수 있으며, 규칙적이거나 또는 불규칙적일 수 있다. 일부 부정맥은 심장 정지 및 돌연사를 야기할 수 있는 생명을 위협하는 의학적 응급증이다. 다른 부정맥은 증상, 예를 들면 심장 박동의 비정상적 인식 (두근거림)을 야기하며, 단지 성가실 수 있다. 이들 두근거림은 또한 심장 박동조율기/세동제거기의 심방/심실 세동, 고장선, 및 다른 기술적 또는 기계적 문제에 의해 야기되는 것으로 알려져 왔다. 그럼에도 불구하고 다른 부정맥은 어떠한 증상과도 연관되지 않을 수 있지만, 환자를 잠재적으로 생명을 위협하는 뇌졸중 또는 색전증에 걸리기 쉽게 할 수 있다. 심장 부정맥에 대한 치료는 심장의 빠른 리듬 (심장 부정맥), 예를 들면 심방 세동, 심방 조동, 심실 빈맥, 및 심실 세동을 억제하기 위해 사용되는 항부정맥제라고 하는 약물의 군을 포함한다. 항부정맥제의 5개의 주요 클래스가 존재한다. 퀴니딘, 프로카이나미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 및 모리시진을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 클래스 I 제제는 나트륨 (Na⁺) 채널을 방해한다. 클래스 II 제제 (예를 들면, 프로프라놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 및 비소프롤로)는 대부분 베타 차단제인 항-교감 신경계 제제이다. 클래스 III 제제 (예를 들면, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론 및 E-4031)는 칼륨 (K⁺) 유출에 영향을 준다. 클래스 IV 제제 (예를 들면, 베라파밀 및 딜티아젬)는 칼슘 채널 및 방실 결절 (AV node)에 영향을 준다. 클래스 V 제제 (예를 들면, 아데노신, 디고크신 및 마그네슘 술페이트)는 다른 기전 또는 알려지지 않은 기전에 의해 작용한다. 추가로, 일부 부정맥은 심장 내에서 혈액 응고를 촉진시키기고, 색전 및 뇌졸중의 위험을 증가시키기 때문에 때문에, 항응고 약 (예를 들면, 와파린 및 헤파린) 및 항-혈소판 약물, 예를 들면 아스피린은 응고의 위험을 감소시키기 위해 흔히 사용된다.

혈관 질환은 큰 및 중간 크기의 근육형 동맥의 병리학적 상태이며, 내피 세포 기능장애에 의해 촉발된다. 병원체와 같은 인자 때문에, 산화된 LDL 입자 및 다른 염증성 자극 내피 세포는 활성화된다. 이는 이들의 특징의 변화를 야기한다: 내피 세포는 시토카인 및 케모카인을 분비하기 시작하고, 그들의 표면 상에서 부착 분자를 발현하기 시작한다. 이는 결과적으로 혈관 벽을 침윤할 수 있는 백혈구 (단핵구 및 림프구)의 동원을 야기한다. 내피 세포에 의해 생성된 평활근 세포 층의 시토카인으로의 자극 및 동원된 백혈구는 평활근 세포가 증식하고, 혈관 루멘을 향하여 이동하는 것을 야기한다. 이 절차는 혈관 벽의 비대를 야기하여, 증식하는 평활근 세포, 대식세포 및 다양한 유형의 림프구로 이루어진 플라크를 형성한다. 이 플라크는 폐쇄된 혈류를 야기하여, 표적 기관에 도달하는 산소 및 영양소의 감소된 양을 야기한다. 최종 단계에서, 플라크는 또한 파열되어 혈전의 형성을 야기할 수 있으며, 결과적으로 뇌졸중을 야기할 수 있다.

심장 마비로 흔히 알려진 심근 경색증 (MI) 또는 급성 심근 경색증 (AMI)은 심장의 부분에의 혈액 공급의 중단이며, 심근 세포 사멸을 야기한다. 이는 가장 흔히 동맥의 벽에의 지질 및 백혈구의 불안정한 수집인 취약한 죽상경화판의 파열 후 심장 동맥의 폐색으로 인한 것이다. 충분한 기간 동안 치료하지 않고 방치한 경우 야기되는 허혈 및 산소 부족은 심근 조직의 손상 또는 사멸 (경색증)을 야기할 수 있다.

급성 심근 경색증의 고전적인 증상은 갑작스러운 가슴 통증 (전형적으로 좌측 팔 또는 목의 좌측으로 방사됨), 호흡곤란, 구역, 구토, 두근거림, 발한, 및 불안 (종종 임박한 종말의 감각으로서 기재됨)을 포함한다. 여성은 남성보다 더 적은 전형적인 증상, 가장 흔히 호흡곤란, 쇠약, 소화불량의 느낌, 및 피로를 경험할 수 있다. 모든 심근 경색증의 대략 4분의 1은 가슴 통증 또는 다른 증상 없이 무증상이다.

심근 손상을 검출하기 위해 이용할 수 있는 진단적 시험 중에는 심전도 (ECG), 흉부 X-레이, 및 다양한 혈액 시험이 있다. 가장 종종 사용되는 마커는 크레아틴 키나제-MB (CK-MB) 분획 및 트로포닌 수준이다. 의심되는 급성 심근 경색증에 대한 즉시 치료는 산소, 아스피린, 및 설하 니트로글리세린을 포함한다.

환자는 대개, 2차 심혈관 사건, 예를 들면 추가의 심근 경색증, 울혈성 심부전 또는 뇌혈관 사고 (CVA)를 예방하는 목표로 MI-후 다수의 장기간 약으로 시작된다. 2차 심혈관 사건을 예방하는데 유용한 약은 항혈소판 약물 요법 (예를 들면, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들면, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들면, 캅토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌스 및 락토키닌스), 스타틴 (예를 들면, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들면, 에플레레논 및 스피로노락톤) 및 오메가-3 지방산을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다.

울혈성 심부전 (CHF), 또는 심장 기능상실은 심장이 몸의 다른 기관에 충분한 혈액을 펌핑하는 것으로부터 제한된 상태이다. 이는 혈액을 심근에 공급하는 동맥의 좁혀짐 (예를 들면, 심장 동맥 질환), 심근의 정상적인 작업을 방해하는 흉터 조직을 갖는 과거의 심근 경색증, 고혈압, 과거의 류마티스성 열 또는 다른 원인으로 인한 심장 판막 질환, 심근병증, 선천성 심내 결손증, 심내막염 및/또는 심근염으로부터 야기될 수 있다. 심장으로부터 나오는 혈류가 느려지면서, 정맥을 통해 심장에 돌아오는 혈액이 백업(back up)되어, 조직에서 울혈이 야기되고, 종종 부종이 야기된다. 때때로 유체는 폐에서 수집되어 호흡을 방해하고, 특히 사람이 누워있는 경우 호흡곤란을 야기한다. CHF의 치료는 휴식, 올바른 식사, 변경된 일일 활동 및 베타 차단제 (예를 들면, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), ACE 억제제 (예를 들면, 캅토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌스 및 락토키닌스), 디기탈리스, 이뇨제, 및 혈관확장제를 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 제약을 포함한다. ACE 억제제 및 혈관확장제는 혈관을 확장시키고, 내성을 감소시킨다. 베타 차단제는 심장의 좌측 아랫방 (좌 심실)이 펌프하는 것을 개선시킨다. 디기탈리스는 심근의 펌핑 활동을 증가시키고; 이뇨제는 몸이 과량의 염 및 물을 제거하는 것을 돕는다.

심근염은 심근 (심근(myocardium))의 염증이다. 이는 심장 마비와 유사하지만, 심장 동맥은 차단되지 않는다. 심근염은 가장 종종 흔한 바이러스, 예를 들면 파르보바이러스 B19, 덜 흔히 비-바이러스성 병원체, 예를 들면 보렐리아 보그도페리(Borrelia burgdorferi) (라임병) 또는 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)에 의한 감염, 또는 약물에 대한 과민 반응으로 인한 것이다. 심근염의 중심되는 특징은 염증성 침윤하를 갖는 심장의 감염, 및 심장 동맥 또는 다른 흔한 비-감염성 원인의 차단이 없는 심근의 손상이다. 심근염은 심장 조직의 괴사를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 심근염은 예를 들면, 스트렙토코컬(Streptococcal) M 단백질 및 콕사키바이러스(coxsackievirus) B는 심장 미오신과 면역학적으로 유사한 에피토프를 가지기 때문에, 특정 제제의 감염으로 인한 자가면역 반응일 수 있다. 제제가 몸으로부터 제거된 후, 면역 시스템은 심장 미오신을 공격할 수 있다.

심근염의 증상은 폭넓게 다양하다. 심근염은 그 자체를 해결하는 임의의 증상이 없는 가벼운 질환을 야기할 수 있거나, 또는 이는 가슴 통증, 심장 기능상실, 또는 돌연사를 야기할 수 있다. 심근염의 치료는 디고크신, 이뇨제, 아이노트로프 (예를 들면, 밀리논) 및 ACE 억제제 (예를 들면, 캅토프릴, 리시노프릴)를 포함할 수 있다.

죽상동맥경화증은 지방 물질, 예를 들면 콜레스테롤의 축적 (플라크라고 함)으로 인해 동맥 벽이 두꺼워지는 상태이다. 특히, 동맥 혈관에 영향을 주는 이 증후군은, 상당한 부분은 대식세포 백혈구의 축적으로 인해, 그리고 기능적 고 밀도 지질단백질 (HDL)에 의한 대식세포로부터의 지방 및 콜레스테롤의 충분한 제거 없이 저-밀도 지질단백질에 의해 촉진되는 동맥의 벽에서의 만성 염증성 반응이다. 이는 흔히 동맥의 경화 또는 퍼링(furring)으로 지칭된다.

다음 용어는 철자법 및 의미 둘 다에서 유사하지만 구분되며, 쉽게 혼동될 수 있다: 죽상동맥경화증(arteriosclerosis), 죽상동맥경화증(arteriolosclerosis), 및 죽상동맥경화증(atherosclerosis). 죽상동맥경화증(arteriosclerosis)은 중간 또는 큰 동맥의 임의의 경화 (및 탄성의 손실)를 묘사하는 일반 용어이고; 죽상동맥경화증(arteriolosclerosis)은 세동맥 (작은 동맥)의 임의의 경화 (및 탄성의 손실)이고; 죽상동맥경화증(atherosclerosis)은 구체적으로 죽상판으로 인한 동맥의 경화이다. 용어 죽종형성이 죽상동맥경화증을 야기하는 물질 또는 절차에 대해 사용된다.

죽상동맥경화증은 전형적으로 수십년 동안 무증상이었지만, 결국 2개의 주요 문제를 생성한다: 첫 번째로, 죽상판은 비록 동맥 팽대에 의해 오랬동안 보상되었지만, 결국 플라크 파열 및 파열에 걸쳐 동맥 루멘 내의 혈전을 야기한다. 혈전은 치유되고, 대개 수축되지만 동맥의 협착증 (국소적으로 및 더 작은 하류 가지로 둘 다)을 남기고, 더 안좋게, 완전한 폐쇄를 남기며, 따라서, 그가 공급하는 조직 및 기관에의 불충분한 혈액 공급을 야기한다. 두 번째로, 보상하는 동맥 팽대 절차가 과도한 경우, 네트(net) 동맥류가 발생할 수 있다. 죽상동맥경화증은 몸 전체에 걸친 절차이므로, 이들 사건은 뇌, 심장, 장, 신장, 다리, 등의 동맥에서 발생할 수 있다.

죽상동맥경화증에 대한 치료는 베타 차단제 (예를 들면, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), ACE 억제제 (예를 들면, 캅토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌스 및 락토키닌스), 스타틴 (예를 들면, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 이뇨제, 및 식이 보충제 (예를 들면, 폴산, 니아신, 오메가 3 지방산, 및 비타민 C)를 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다.

재협착은 혈관이 좁아지는 것인 협착증의 재발생이며, 제한된 혈류를 야기한다. 재협착은 대개 좁아진 동맥 또는 다른 큰 혈관, 차단을 청소하기 위해 치료를 받고, 후속적으로 좁아진 동맥 또는 다른 큰 혈관에 관련된다. 이는 루멘의 50% 이상의 원주의 감소로서 정의될 수 있으며, 풍선 혈관성형술을 겪은 환자에서 높은 발생률 (25-50%)을 가졌으며, 여기서 환자의 다수는 6개월 내에 추가의 혈관성형술을 필요로 하였다. 재협착 치료는 혈관성형술, 근접치료, 및 관상동맥내 방사선을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다.

염증

염증은 심혈관 질환에서 역할을 갖는 것으로 알려져 있다 (예를 들면, 문헌 [Jialal and Devaraj S, "Inflammation and atherosclerosis: the value of the high-sensitivity C-reactive protein assay as a risk marker." Am J Clin Pathol (2001) 116 Suppl:S108-15]; [Zairis M, et al, "C-reactive protein and multiple complex coronary artery plaques in patients with primary unstable angina." Atherosclerosis (2002) 164(2):355]; [Lowe GD, "The relationship between infection, inflammation, and cardiovascular disease: an overview." Ann Peridontol (2001) 6(1):1-8]; [Rifai and Ridker, "Inflammatory markers and coronary heart disease." Curr Opin Lipidol (2002) 13(4):383-9]; [Bermudez and Ridker, "C-reactive protein, statin, and the primary prevention of atherosclerotic cardiovascular disease." Prev Cardiol (2002) 5(1):42-6]; [Blake and Ridker, "Inflammatory mechanisms in atherosclerosis: from laboratory evidence to clinical application." Ital Heart J (2001) 2(11):796-800]; [Pradhan AD, et al, "Inflammatory biomarkers, hormone replacement therapy, and incident coronary heart disease: prospective analysis from the Women's Health Initiative observational study". JAMA (2002) 288(8):980-7]; [Ridker PM, et al. "Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men." NEJM (1997) 336(14):973-9]; ["Interleukin 8 and cardiovascular disease" Cardiovasc Res (2009) doi: 10.1093/cvr/cvp241]을 참조함).

염증은 외래 물질, 특히 미생물 기원의 물질이 대상체를 침습하는 것에 대한 방어 반응으로서 발생할 수 있다. 추가적으로, 기계적인 외상, 독소, 및 신생물이 염증 반응을 유도할 수 있다. 백혈구의 축적 및 이어지는 활성화가 대부분의 염증 형태의 발병기전에서의 중심 사건이다. 염증 결핍은 숙주를 손상시켜, 숙주에서 감염 또는 외상이 악화되기 쉽게 한다. 과도한 염증, 예컨대 장기간의 염증 반응은 당뇨병, 심혈관 질환 (예를 들면, 동맥경화증, 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착) 황반 변성, 백내장, 만성 피부 장애, 재관류 손상 및 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 염증성 질환, 감염후 증후군 예컨대 감염성 수막염, 류마티스성 열, 및 류마티스 질환 예컨대 전신 홍반성 루푸스 및 류마티스 관절염을 초래할 수 있다. 이러한 질환들은 세계적으로 매년 수백만 명에 영향을 미치고, 증가된 사망률 및 이환률을 초래한다. 이러한 다양한 질환 과정에서의 염증 반응의 공통성은 그의 조절을 인간 질환의 예방 또는 치료에서의 주요 요소로 만든다.

염증유발성 시토카인의 과다생산이 수많은 염증성 및 자가면역 질환의 발병기전에서 연루되었다. TNFα 분비는 염증성 케스케이드 개시에서의 주요 사건이고 (문헌 [Brennan F. M., et al. Lancet, 1989, 2:244-7]; [Haworth C, et al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579]), 이러한 질환들의 개시 및 유지에 직접적으로 기여한다. 인터류킨 1β (IL-1β), IL-6, IL-8, IL-12 산화질소 (NO), IFN-γ, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 IL-10을 비롯한 기타 시토카인 또한 역할을 한다. 이러한 시토카인들 중 몇몇 (예를 들어 IL-8)은 염증 반응을 증가 또는 악화시킬 수 있는 한편, 다른 것들 (예를 들어 IL-10)은 염증 반응을 감소 또는 경감시킬 수 있다.

면역계 세포, 특히 대식세포는 활성화 자극에 반응하여 이러한 시토카인 중 다수를 분비한다. 시토카인의 표적 세포는 임의의 신체 구획 내에 위치할 수 있고 장거리 메카니즘을 통해 작용할 수 있거나, 또는 이웃 세포 상에 작용할 수 있다. 따라서, 시토카인은 국소화 또는 전신 방식으로 염증을 조절할 수 있다.

심혈관 질환 및 염증 사이의 관계

상승된 C-반응성 단백질에 의해 입증된 바와 같은 만성 염증성 상태는, 혈전 형성, 플라크 파열, 및 색전형성을 비롯한 동맥 시스템에의 유의한 손상을 야기한다. C-반응성 단백질 (CRP)은 염증에 대한 민감성이지만 비-특이적인 마커이다. 특히 높은 민감도 검정으로 측정된 상승된 CRP 혈액 수준은 MI의 위험, 및 뇌졸중 및 당뇨병의 발달을 예상할 수 있다. 추가로, MI에 대한 일부 약물은 CRP 수준을 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나, CRP가 죽상동맥경화증 또는 심혈관 질환에서 직접적인 역할을 하는지는 불확실 한 채로 남아있다.

C-반응성 단백질에 대한 연구는 콜레스테롤로 채워진 혈관의 플라크는 그들이 염증에 의해 영향받지 않는 한 어떠한 실제 위험도 제기하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. 염증은 플라크를 약화시키고, 그들을 파열 또는 응고의 핀칭 오프 (pinching off)에 대해 더 취약하게 만들고, 이는 이어서 관상 혈관을 차단할 수 있다 (문헌 [Jialal and Devaraj S, "Inflammation and atherosclerosis: the value of the high-sensitivity C-reactive protein assay as a risk marker." Am J Clin Pathol 2001 Dec;116 Suppl:S108-15]; [Zairis M, et al, "C-reactive protein and multiple complex coronary artery plaques in patients with primary unstable angina." Atherosclerosis 2002 Oct;164(2):355]; [Lowe GD, "The relationship between infection, inflammation, and cardiovascular disease: an overview." Ann Peridontol 2001 Dec;6(1):1-8]; 이들 모두는 심혈관 질환에서의 염증의 역할에 대한 그들의 교시를 포함하여 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 특히, 일련의 연구는 2천 500만 내지 3천 500만 명의 미국인은 정상 범위 내의 총 콜레스테롤을 갖지만, 그들의 심혈관계 내에 평균 수준 초과의 염증을 갖는 것을 나타낸다. 이 염증은 심장 질환 위험에 대해 유의한 영향을 갖는다 (문헌 [Rifai and Ridker, "Inflammatory markers and coronary heart disease." Curr Opin Lipidol 2002 Aug;13(4):383-9]; [Bermudez and Ridker, "C-reactive protein, statins, and the primary prevention of atherosclerotic cardiovascular disease." Prev Cardiol 2002 Winter;5(1):42-6]; [Blake and Ridker, "Inflammatory mechanisms in atherosclerosis: from laboratory evidence to clinical application." Ital Heart J 2001 Nov;2(11):796-800]; 이들 모두는 심혈관 질환에서의 염증의 역할에 대한 그들의 교시를 포함하여 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 추가로, 39,876명의 건강한 폐경후 여성을 포함한 여성의 건강 연구는, C-반응성 단백질 (및 따라서 만성 염증)의 심혈관 질환과의 관계를 지지하였다 (문헌 [Pradhan AD, et al, "Inflammatory biomarkers, hormone replacement therapy, and incident coronary heart disease: prospective analysis from the Women's Health Initiative observational study". JAMA 2002 Aug 28;288(8):980-7]; 이는 심혈관 질환에서의 염증의 역할에 대한 그의 교시를 포함하여 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 가장 높은 수준의 C-반응성 단백질을 갖는 대상체는 5배의 심혈관 질환의 발달 위험을 가졌으며, 가장 낮은 수준을 갖는 대상체와 비교하여 7배의 심장 마비 또는 뇌졸중을 갖는 위험을 가졌다. 흥미롭게도, C-반응성 단백질 수준은 이들 사건의 위험을 다른 관련된 위험 인자를 갖지 않는 것으로 보이는 여성에서도 예상하였다. 추가로, 22,000명의 초기에 건강한 남성에서 C-반응성 단백질 수준 및 심장 질환 위험을 평가한 의사 건강 연구 (Physicians' Health Study)는 염증 및 심장 마비 사이의 관계를 지지한다 (문헌 [Ridker PM, et al. "Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men." NEJM 1997 Apr 3;336(14):973-9]; 이는 심혈관 질환에서의 염증의 역할에 대한 그의 교시를 포함하여 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

추가로, 특정 염증유발성 시토카인 및 케모카인은 죽상동맥경화증을 포함하나, 이로 한정되지는 않는 심혈관 질환에서 역할을 갖는 것으로 알려졌다. 특히, 인터루킨 8은 손상된 혈관 벽의 염증성 미세-환경의 확립 및 보존에 관여되는 것으로 나타났다 (리뷰를 위해: 문헌 ["Interleukin 8 and cardiovascular disease" Cardiovasc Res (2009), doi: 10.1093/cvr/cvp241]; 이는 심혈관 질환에서의 IL-8의 역할에 대한 그의 교시를 포함하여 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).

도 2 및 도 37A 및 B로부터 볼 수 있듯이, 동전기적으로 변경된 수성 유체는 대조군 유체와 비교한 경우 염증유발성 시토카인 IL-6 및 염증유발성 케모카인 IL-8 및 에오탁신의 수준을 감소시켰다. 따라서, 특정 실시양태에 따라, 본 발명의 유체는 염증유발성 시토카인 및 케모카인의 수준을 감소시킴으로써 다수의 심혈관 질환의 많은 증상 및/또는 상태를 경감시키며, 이는 그럼으로써 염증을 제한한다.

메탈로프로테이나제

메탈로프로테이나제는 예를 들어 문헌 [N. M. Hooper FEBS Letters 354:1-6, 1994]에 기술된 바와 같이 패밀리 및 서브패밀리로 분류되는 프로테이나제 (효소)의 수퍼패밀리이다. 메탈로프로테이나제의 예로는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP) 예컨대 콜라게나제 (MMP1, MMP8, MMP13), 젤라티나제 (MMP2, MMP9), 스트로멜리신 (MMP3, MMP10, MMP II), 매트릴리신 (MMP7), 메탈로엘라스타제 (MMP12), 에나멜리신 (MMP19), MT-MMP (MMP14, MMP15, MMP16, MMP17); 레프롤리신 또는 아다말리신 또는 MDC 패밀리 (세크레타제 및 쉐다제(sheddase) 예컨대 TNF 전환 효소 (ADAM10 및 TACE) 포함); 아스타신 패밀리 (프로콜라겐 프로세싱 프로테이나제 (PCP)와 같은 효소 포함); 및 기타 메탈로프로테이나제 예컨대 아그레카나제(aggrecanase), 엔도텔린 전환 효소 패밀리 및 안지오텐신 전환 효소 패밀리가 포함된다. 총괄적으로, 메탈로프로테이나제는 광범위한 매트릭스 기질 예컨대 콜라겐, 프로테오글리칸 및 피브로넥틴을 절단하는 것으로 공지되어 있다. 메탈로프로테이나제는 생물학적으로 중요한 세포 매개물, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF)의 프로세싱 또는 분비; 및 생물학적으로 중요한 막 단백질, 예컨대 저-친화도 IgE 수용체 CD23의 번역후 단백질분해 프로세싱 또는 쉐딩(shedding)에 연루되어 있다 (예를 들어, 문헌 [N. M. Hooper et al., Biochem. J. 321:265-279, 1997] 참조).

따라서, 놀랍지 않게, 조직 재형성을 수반하는 다수의 생리학적 질환 과정 (예를 들어, 배아 발달, 골 형성, 월경 동안의 자궁 재형성 등)에서 메탈로프로테이나제가 중요한 것으로 여겨진다. 또한, 이러한 질환 및 상태, 예를 들어, 다양한 염증성 및 알레르기성 질환 예컨대 관절의 염증 (특히, 류마티스 관절염, 골관절염 및 통풍), 위장관의 염증 (특히 염증성 장 질환, 궤양성 결장염 및 위염), 피부의 염증 (특히 건선, 습진, 피부염); 종양 전이 또는 침습; 세포외 매트릭스의 제어되지 않은 분해와 연관된 질환 예컨대 골관절염; 골 재흡수 질환 (예컨대 골다공증 및 파제트병); 비정상적인 혈관신생과 연관된 질환; 당뇨병, 치주 질환 (예컨대 치은염), 각막 궤양, 피부 궤양, 수술후 상태 (예컨대 만성 문합) 및 피부 상처 치유와 연관된 강화된 콜라겐 재형성; 중추 및 말초 신경계의 탈수초성 질환 (예컨대 다발성 경화증); 알츠하이머병; 심혈관 질환 예컨대 재협착 및 아테롬성동맥경화증에서 관찰되는 세포외 매트릭스 재형성; 천식; 비염; 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPED)에서 하나 이상의 메탈로프로테이나제의 활성의 억제가 충분히 이로울 수 있다.

대식세포 엘라스타제 또는 메탈로엘라스타제로 또한 공지된 MMP12는 처음에 마우스에서 클로닝되었고 (문헌 [Shapiro et al., Journal of Biological Chemistry 267: 4664, 1992]), 1995년에 동일한 집단에 의해 인간에서 또한 클로닝되었다. MMP12는 활성화된 대식세포에서 우선적으로 발현되고, 흡연자로부터의 폐포 대식세포 (문헌 [Shapiro et al, 1993, Journal of Biological Chemistry, 268: 23824])로부터, 뿐만 아니라 아테롬성동맥경화성 병변 내의 포말 세포 (문헌 [Matsumoto et al, Am. J. Pathol. 153: 109, 1998])에서 분비되는 것으로 나타났다. COPD의 마우스 모델은 마우스에 일주일에 6일로 하루에 2개의 담배의 담배 연기를 6개월 동안 챌린지하는 것을 기초로 한다. 이러한 처치 후 야생형 마우스에서 폐 기종이 발달되었다. MMP12 녹-아웃(knock-out) 마우스를 이러한 모델에서 시험했을 때, 이들에서 유의한 기종이 발달되지 않았고, 이는 MMP12가 COPD 발병기전에서 핵심 효소라는 것을 강하게 시사한다. COPD (기종 및 기관지염)에서의 MMP12와 같은 MMP의 역할이 문헌 [Anderson and Shinagawa, 1999, Current Opinion in Anti-inflammatory and Immunomodulatory Investigational Drugs 1(1): 29-38]에서 논의되었다. 흡연이 인간 경동맥 플라크에서 대식세포 침윤 및 대식세포-유래 MMP-12 발현을 증가시킨다는 것이 최근에 발견되었다 (문헌 [Matetzky S, Fishbein M C et al., Circulation 102:(18), 36-39 Suppl. S, Oct. 31, 2000]).

MMP9 (젤라티나제 B; 92 kDa-IV형 콜라게나제; 92 kDa 젤라티나제)는 1989년에 최초로 정제된 후 클로닝되고 서열이 분석된 분비형 단백질이다 (문헌 [S. M. Wilhelm et al., J. Biol. Chem. 264 (29): 17213-17221, 1989]; 공개된 오류 정정 문헌 [J. Biol. Chem. 265 (36): 22570, 1990]) (이러한 프로테아제에 대한 상세한 정보 및 참고문헌의 리뷰를 위해, 문헌 [T. H. Vu & Z. Werb (1998) Matrix Metalloproteinases, 1998, W. C. Parks & R. P. Mecham ed., pp. 115-148, Academic Press. ISBN 0-12-545090-7]을 참조한다). 일반적으로 MMP9의 발현은 영양막, 파골세포, 호중구 및 대식세포를 비롯한 소수의 세포 유형에 한정된다 ([Vu & Werb, 상기 문헌]). 그러나, 성장 인자 또는 시토카인에 대한 세포의 노출을 비롯한 여러 매개물에 의해 이와 동일한 세포 및 기타 세포 유형에서 발현이 유도될 수 있다. 이들은 염증 반응을 개시하는 것에서 종종 관련되는 것과 동일한 매개물이다. 다른 분비형 MMP와 같이, MMP9는 불활성 효소전구체(Pro-enzyme)로서 방출되고, 이어서 효소전구체가 절단되어 효소적으로 활성인 효소를 형성한다. 생체 내에서 이러한 활성화에 요구되는 프로테아제는 공지되어 있지 않다. 활성 MMP9 대 불활성 효소의 균형은 천연 발생 단백질인 TIMP-1 (메탈로프로테이나제-1의 조직 억제제)과의 상호작용에 의해 생체 내에서 추가로 조절된다. TIMP-1은 MMP9의 C-말단 영역에 결합하여, MMP9의 촉매 도메인의 억제를 초래한다. 프로(pro)-MMP9의 발현 유도와 프로-MMP9의 활성 MMP9로의 절단과 TIMP-1의 존재의 균형이 조합되어 국소 부위에 존재하는 촉매적으로 활성인 MMP9의 양을 결정한다. 단백질분해적으로 활성인 MMP9는 젤라틴, 엘라스틴, 및 천연 IV형 및 V형 콜라겐을 포함하는 기질을 공격한다; 이는 천연 I형 콜라겐, 프로테오글리칸 또는 라미닌에 대해서는 활성이 없다. 다양한 생리학적 및 병리학적 프로세스에서 MMP9의 역할이 관련된다는 것을 나타내는 데이터가 증가하고 있다. 생리학적 역할에는 배아 이식의 초기 단계에서의 자궁 상피를 통한 배아 영양막의 침습; 골의 성장 및 발달에서의 일부 역할; 및 혈관구조로부터 조직 내로의 염증성 세포의 이동이 포함된다.

효소 면역검정을 사용하여 측정된 MMP9 방출은 다른 집단으로부터의 것들과 비교하여 미치료 천식환자로부터의 유체 및 AM 상청액에서 유의하게 강화되었다 (문헌 [Am. J. Resp. Cell & Mol. Biol., 5:583-591, 1997]). 또한, 강화된 MMP9 발현이 일부 기타 생리학적 상태에서 관찰되었고, 이는 MMP9를 질환 과정 예컨대 COPD, 관절염, 종양 전이, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 및 아테롬성동맥경화증에서의 플라크 파열 (급성 관상동맥 상태 예컨대 심근 경색을 초래함)에 연루시켰다 (본원에 참고로 포함된 WO07087637A3을 또한 참조한다).

MMP 억제제:

다수의 메탈로프로테이나제 억제제가 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Beckett R. P. and Whittaker M., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents, 8(3):259-282]; 및 [Whittaker M. et al, 1999, Chemical Reviews 99(9):2735-2776]에 의한 MMP 억제제의 리뷰 참조). WO 02/074767에는 MMP 억제제, 특히 강력한 MMP12 억제제로서 유용한 화학식의 히단토인 유도체가 개시되어 있다. 미국 특허 출원 일련 번호 11/721,590 (20080032997로 공개됨)에는 메탈로프로테이나제의 억제제이고 MMP12 및 MMP9와 같은 MMP를 억제하는 것에서 특히 흥미로운 히단토인 유도체들의 추가적인 군이 개시되어 있다. MMP12 및 MMP9와 같은 MMP를 억제하기 위한 신규 트리아졸론 유도체가 미국 특허 출원 일련 번호 10/593543 (20070219217로 공개됨)에 개시되어 있다. 추가적인 MMP12 및 MMP9 억제제들은 11/509,490 (20060287338로 공개됨)에 개시되어 있다 (10/831265 (20040259896으로 공개됨)를 또한 참조한다).

추가적으로, 4-(4-페녹시페닐술포닐)부탄-1,2-디티올 (1) 및 5-(4-페녹시페닐술포닐)펜탄-1,2-디티올 (2)인 2개의 화합물이 MMP-2 및 MMP-9에 선택적으로 결합하고 이를 강력하게 억제하는 것으로 나타났다 (문헌 [Bernardo, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:11201-11207]). 이러한 2개의 화합물은 MMP-2 및 -9를 억제하고 따라서 염증을 약화시키는 임상에서의 유의한 용도가 있을 수 있다. 또한, 준-항생제 수준으로 특정 테트라사이클린 항생제 (예를 들어, 미노사이클린(Minocycline) 및 독시사이클린(Doxycycline))를 사용하는 것이 MMP 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 본 발명의 일부 측면은 본 발명의 유체를 MMP를 억제하는데 유용한 준-항생제 수준과 조합하여 사용하는 것을 포함한다.

심혈관 질환 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 사이의 관계

매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)는 최근에 죽상동맥경화증, 재협착, 확장 심근병증, 및 심근 경색증을 비롯한 많은 심혈관 질환의 병인론에 관여하는 것으로 나타났다 (문헌 [Creemers, et al., "Matrix Metalloproteinase Inhibition after Myocardial infarction: a new approach to prevent hear failure?" (2001) Circ Res. 89(3):201-10]; [Sierevogel et al., (2003) "Matrix metalloproteinases: a therapeutic target in cardiovascular disease." Curr Pharm Des. 9(13):1033-40]; 이들 둘 다는 심혈관 질환에서의 MMP의 역할에 대한 그들의 교시를 포함하여 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 흥미롭게도, 이들 심혈관 질환의 실험적 모델에서의 합성 MMP 억제제의 투여는 죽상경화성 병변 형성, 신생혈관내막 형성, 좌 심실 재형성, 펌프 기능장애, 및 경색 치유의 진행을 유의하게 억제하였다 (문헌 [Creemers, et al. (2001)]). 추가로, MMP는 죽상동맥경화증에서 심혈관 재형성을 야기하는 세포외 매트릭스를 분해시킴으로써 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (문헌 [Ikeda and Shimada, (2003) "Matrix metalloproteinases and coronary artery diseases." Clin Cardiol 26(2):55-9]; 이는 심혈관 질환 및 심장 동맥 질환에서의 MMP의 역할에 대한 그의 교시를 포함하여 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 최근 연구는 죽상경화성 병변에서의 MMP의 증대된 발현 및 세포외 매트릭스를 분해시킴으로써 혈관 벽을 약화시키는 것에 대한 이들의 기여를 나타냈다. 추가로, 연구는 MMP 유전자 프로모터에서의 다형태는 관상동맥 심질환에 대한 감수성의 개인-간 차이에 기여하는 것을 나타냈다 (문헌 [Watanabe and Ikeda, (2004) "Matrix metalloproteinases and atherosclerosis." Curr Atheroscler Rep. 6(20:112-20]; 이는 심혈관 질환 및 죽상동맥경화증에서의 MMP의 역할에 대한 그의 교시를 포함하여 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 특정 실시양태에 따라, 본 발명의 유체는 MMP의 수준을 조정함으로써 다수의 심혈관 질환의 많은 증상 및/또는 상태를 경감시킨다.

본원의 특정 실시양태는 심혈관 질환 및/또는 연관된 상태 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하거나 또는 경감시킴으로써 대상체에 대한 치료적 조성물 및 치료 방법에 관련된다.

본원의 추가의 실시양태는 심혈관 질환 및/또는 연관된 상태에 관련된 합병증을 예방하거나 또는 경감시키기 위한 치료적 조성물 및 치료 방법에 관련된다.

치료 방법

용어 "치료하는"은 질환, 장애 또는 상태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 역전, 경감, 진행 억제 또는 예방을 지칭하고, 이를 포함하며, "치료" 및 "치유적"은 본원에서 정의된 바와 같은 치료하는 작용을 지칭한다.

"치료 유효량"은 질환, 장애 또는 상태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 역전, 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 화합물 중 임의의 것의 임의의 양이다.

본원에서의 일부 실시양태는 일부 상태 또는 질환, 예컨대 황반 변성과 연관된 염증의 하나 이상의 증상을 예방하거나 경감시키는 것에 의한 대상체에 대한 치료 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

염증과 연관된 다수의 상태 또는 질환이 스테로이드, 메토트렉세이트, 면역억제 약물 (시클로포스파미드, 시클로스포린, 아자티오프린 및 레플루노미드 포함), 비-스테로이드성 항-염증제 예컨대 아스피린, 아세트아미노펜 및 COX-2 억제제, 금 작용제 및 항-말라리아 치료로 치료된 바 있다. 이러한 약물들은 다양한 단점, 및 주사 부위 반응, 발진, 상부 호흡기 감염, 자가면역 장애 및 감염에 대한 감수성 증가를 비롯한 유해 반응이 있다. 또한, 많은 항-염증 제약 약물은, 더욱 편리하고 순응적인 경구 또는 국소 피부 경로와 대조적으로, 정맥내 (IV) 또는 피하 (SC) 투여를 요한다. 따라서, 염증에 관련된 상태 및 질환에 대한 신규 의약 및 치료 방법의 개발이 여전히 요구된다.

조합 치료. 특정 실시양태는 본 발명의 동전기적 유체를 퀴니딘, 프로카이나미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 모리시진, 프로프라놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤로, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론, E-4031, 베라파밀, 딜티아젬, 아데노신, 디고크신, 마그네슘 술페이트, 와파린, 헤파린, 항-혈소판 약물 (예를 들면, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들면, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들면, 캅토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌스 및 락토키닌스), 스타틴 (예를 들면, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들면, 에플레레논 및 스피로노락톤), 디기탈리스, 이뇨제, 디고크신, 아이노트로프 (예를 들면, 밀리논), 혈관확장제 및 오메가-3 지방산을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 하나 이상의 다른 제제와 조합하여 사용하는 조합 요법을 포함한다.

동전기적으로 생성된 기체-강화 유체 및 용액의 항-염증 활성:

본 발명의 몇몇 측면에 따르면, 본원에 개시된 기체-강화 유체 및/또는 용액은 항-염증 성질 및 효과가 있고, 염증에 관련된 질환 또는 장애에 걸린 대상체의 치료를 위한 항-염증제로서 사용될 수 있다. 도 1은 건강한 혈액 공여자로부터의 자극받은 림프구에서의 시토카인 프로파일의 실험 결과를 나타낸다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 산소-강화 유체 (물)은 특정 시토카인, 특히 IL-6, IL-8, 및 IL-1β의 하향 조절에 영향을 미쳤다.

염증유발성 시토카인의 생산 증가가 수많은 염증성 및 자가면역 질환의 발병기전에서 연루되었다. TNFα 분비는 염증성 케스케이드 개시에서의 1차 사건이고 (문헌 [Brennan F. M., et al. Lancet, 1989, 2:244-7]; [Haworth C, et al. Eur. J. Immunol. 1991, 21:2575-2579]), 염증성 및 자가면역 질환의 개시 및 유지에 직접적으로 기여한다. 인터류킨 1β (IL-1β), IL-6, IL-8, IL-12 산화질소, IFN-γ 및 GM-CSF를 비롯한 기타 염증유발성 시토카인 또한 역할을 하는 한편, IL-10과 같은 항-염증성 시토카인은 질환을 감소시킬 수 있다. 면역계 세포, 특히 대식세포는 활성화 자극에 반응하여 이러한 시토카인 중 다수를 분비한다.

다양한 세포 유형이 염증 과정에서 수반된다. 단핵구, 대식세포 및 기타 면역 세포에 의한 TNFα의 과다생산이 다수의 질환의 발병기전에서의 핵심 요소이다. 특히 대식세포 및 T-세포가 면역 반응의 개시 및 유지에서 중추적인 역할을 한다. 일단 병리학적 또는 면역원성 자극에 의해 활성화되면, TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-12, 산화질소 (NO), IL-6, GM-CSF, G-CSF, M-CSF 등을 비롯한 다수의 시토카인을 방출하는 것에 의해 대식세포가 반응한다. T-세포는 IL-2, IL-4, INF-γ, 및 기타 염증성 시토카인을 방출한다. 이러한 시토카인들이 다른 면역 세포를 활성화시키고, 일부는 독립적인 세포독성제로서 또한 작용할 수 있다. 대식세포 및 T-세포에서 유래된 염증성 매개물의 과도한 방출은 특히 정상 세포 및 주변 조직의 손상을 초래할 수 있다.

염증유발성 시토카인이 HIV-AIDS, 및 시토메갈로바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 헤르페스 바이러스 패밀리를 비롯한 기타 바이러스성 감염에 연루되었다. TNFα는 인간 시토메갈로바이러스의 주요 극초기 인핸서/프로모터의 기저 활성을 강화하고, 단핵구 전구체에서 후기 HCMV 감염의 재활성화에서 역할을 할 수 있다 (문헌 [Prosch S., et al. Virology 1995, 208:197-206]).

추가적으로, 다수의 염증성 시토카인이 패혈증 또는 내독소성 쇼크를 앓고 있는 환자에서 사망률에 기여한다. 예를 들어, TNFα 및 IL-1β는 패혈증, 패혈성 쇼크 및 내독소성 쇼크에서 잘 확립된 중추적인 역할이 있다. 포스포리파제 A2 (문헌 [Gronich J., et al. J. Clin. Invest. 1994, 93:1224-1233]) 및 NO 신타제에 대한 유전자 발현의 유도와 함께, 이러한 시토카인들의 수준 증가가 열, 저혈압 및 쇼크와 연관된다 (문헌 [Smith J. W. et al. J. Clin. Oncol. 1992, 10:1141-1152]; [Chapman P. B., et al. J. Clin. Oncol. 1987, 5:1942-1951]). hgc

평활근 세포로부터의 NO의 유도가 패혈성 쇼크 동안 감소된 평균 동맥압 및 전신성 혈관 저항을 매개하고, 이는 NO에 대한 기본적인 역할을 시사한다. 따라서, IL-6, IL-8, IL-1β, 및 NO에 대한 하향 조절 효과를 표적으로 하는 요법들이 황반 변성이 포함되는 염증성 질환 또는 장애의 치료에서 이로울 수 있다.

IL-1 및 TNFα는 동물 모델에서 다양한 급성 반응, 뿐만 아니라 만성 반응에서 중추적인 역할을 한다. 추가적으로, IL-11, IFNα 및 IFNβ가 염증 반응을 또한 상향 조절할 수 있다. 반대로, 몇몇 시토카인은 염증 반응의 하향 조절에서 수반될 수 있다 (즉, 특히 IL-4, IL-10, IL-13). 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이, 본 발명의 기체-강화 유체와 접촉된 세포는 대조군 배양 배지 + T3 항원에서보다 T3 항원으로의 IFN-γ 수준에서의 증가를 나타낸 한편, IL-8은 대조군 배양 배지 + T3 항원에서보다 본 발명의 기체-강화 배양 배지 + T3 항원에서 더 낮았다. 추가적으로, IL-6, IL-8, 및 TNF-α 수준은 대조군 배지 + PHA에서보다 본 발명의 기체-강화 배지 + PHA에서 더 낮았던 한편, IL-1β 수준은 대조군 배지 + PHA와 비교했을 때 본 발명의 기체-강화 유체 + PHA에서 더 낮았다. 본 발명의 기체-강화 배지 단독에서, IFN-γ 수준이 대조군 배지에서보다 더 높았다. 이러한 결과들은 항-염증성 미세환경과 일관된다.

NO는 염증 반응의 매개물 및 조절인자로서 인지된다. 이는 병원체에 대한 세포독성 성질을 지니지만, 대상체 자신의 조직에 대한 해로운 효과가 또한 있을 수 있다 (문헌 [Korhonen et al., Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4(4): 471-9, 2005]). NO는 가용성 구아닐레이트 시클라제와 반응하여 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP)를 형성하고, 이것이 NO의 효과 중 다수를 매개한다. 또한 NO는 분자 산소 및 수퍼옥시드 음이온과 상호작용하여, 다양한 세포 기능을 개질시킬 수 있는 반응성 산소 종을 생산할 수 있다. NO의 이러한 간접적인 효과들이 염증에서의 유의한 역할이 있고, 여기서 NO는 유도성 NO 신타제 (iNOS)에 의해 높은 양으로 생산되고, 반응성 산소 종은 활성화된 염증성 세포에 의해 합성된다.

NO는 각질세포, 섬유모세포, 내피 세포, 및 기타 가능한 것들에 의해 생산될 수 있다. NO의 혈관 작용 중 일부에는 혈관확장, 혈관 내피에 대한 혈소판 부착의 억제, 혈관 내피에 대한 백혈구 부착의 억제, 및 수퍼옥시드의 소거가 포함된다 (문헌 [Shah et al., Env. Health Persp. v. 106 (5): 1139-1143]).

또한, NO 합성의 억제는 상처 수축을 지연시키고, 콜라겐 조직화를 변경시키며, 신생표피의 두께를 변경시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Amadeu and Costa, J. Cutan. Pathol. 33: 465-473, 2006]). 상처에서의 혈관신생 및 비만 세포 이동 또한 NO 억제에 영향을 받는다 (동일 문헌). 어떠한 특정 메카니즘 이론에도 한정되지 않으면서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 기체-강화 유체는, 본원에 개시된 실시예 섹션에서 설명된 상처 치유 효과의 범위와 일관되게, 국소성 및/또는 세포성 NO 생산, 또는 분해를 조정할 수 있다. 다양한 조절 경로로 인해, 일부 실시양태에서는 본 발명의 기체-강화 유체가 NO 생산을 증가시킬 수 있고/있거나 NO 분해를 지연시킬 수 있는 한편, 다른 일부 실시양태에서는 본 발명의 기체-강화 유체가 NO 생산을 감소시키고/시키거나 NO 분해를 촉진할 수 있다.

비만 세포 이동의 경우, 산소-강화 용액에 대해 초기 및 후기 이동에서 차이가 또한 발생하였다. 이는 NO 합성의 억제에 관하여 당업계에 공지된 것과 일관된다 (문헌 [Amadeu and Costa, J. Cutan Pathol 33: 465-473, 2006]).

염증 과정의 처음 2개의 단계에서, 이물질이 파괴되거나 (예를 들어, 이물질이 유기체인 경우), 또는 이물질 주변의 조직이 느슨해진다 (예를 들어, 이물질이 파편인 경우). 치유 단계에서, 염증이 진정되기 시작한다; 개별적인 혈관 및 혈관 패턴이 다시 정상으로 되고, 상처 복구가 시작된다. 복구 과정에서의 3가지 주요 사건은 (1) 증식성 섬유모세포에 의한 새로운 결합 조직의 형성; (2) 상피 재생; 및 (3) 새로운 모세혈관의 증식(outgrowth)이다.

염증이 진정되기도 전에, 섬유모세포가 주변의 정상 조직 (일반적으로 섬유모세포가 휴면 상태로 존재함)으로부터 손상 영역 내로 이동하기 시작한다. 이는 피브린 가닥들을 따라 아메바모양 운동에 의해 이동하고, 치유 영역 전반에 걸쳐 분포된다. 손상 조직 내의 위치 내로 고정되면, 이는 콜라겐을 합성하여 이러한 단백질을 분비하기 시작하며, 이러한 단백질은 섬유로 배열된다. 이러한 섬유는 그의 세로축을 따라 최대 스트레스의 방향으로 배향된다. 콜라겐 다발이 견고하게 성장함에 따라, 섬유모세포가 점진적으로 퇴화하고, 다발에 밀접하게 부착되며, 손상 영역이 반흔 조직으로 전환된다.

반흔 조직 형성과 동시에, 상처 가장자리 상의 무손상 표피 세포가 손상 영역의 중심을 향해 하나의 시트로서 증식 및 이동하기 시작한다. 염증이 진정됨에 따라, 직접적인 혈액 공급에 대한 요구가 일어나고, 혈관신생이 상처 부위에서 발생한다.

염증은 여러 세포 유형을 수반하는 복합적인 과정이다. 예를 들어, 비만 세포는 혈관확장의 초기 단계를 유발하는 매개물을 방출하고, 내피 세포의 분리 및 내피하층 내의 콜라겐 섬유의 노출이 이에 동반된다. 혈관 내에 형성된 세포간 간극 내의 섬유는 혈소판을 포획하고, 이러한 세포로부터 매개물의 방출을 유발한다.

혈소판에 더하여, 노출된 콜라겐 섬유는 혈액-응고 케스케이드, 증가된 혈관확장, 증가된 혈관 투과성 및 화학주성의 유발 인자를 비롯한, 확장된 혈관벽의 구멍을 통해 여과되는 혈장 단백질과 또한 상호작용한다.

추가적으로, 보체 케스케이드가 여러 자극에 의해 활성화될 수 있다: 손상된 혈관, 손상된 세포가 방출하는 단백질분해성 효소, 임의의 참여 박테리아의 막 성분, 및 항원-항체 복합체. 활성화된 보체 성분들 중 일부는 염증 영역 내로의 백혈구의 유입을 담당하는 화학주성 인자로 작용하는 한편, 다른 것들은 식세포작용을 촉진하고 세포 용해에 참여한다.

특정 측면에서, 본 발명의 기체-강화 유체 또는 용액이 염증의 하나 이상의 측면에서 수반되는 하나 이상의 시토카인을 또한 조절하고, 이러한 시토카인(들)에는 MAF (대식세포 활성화 인자), MMIF (대식세포 이동 억제 인자), MCF (대식세포 화학주성 인자), LMIF (백혈구 이동 억제 인자), HRF (히스타민 방출 인자), TF (전달 인자), 인터류킨 (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15 등), TNF-α, TNF-β, 인터페론 (IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IFN-ζ, IFN-δ 등), G-CSF (과립구 콜로니 자극 인자), GM-CSF (과립구-대식세포 CSF), M-CSF (대식세포 CSF), 멀티-CSF (IL-3), 섬유모세포 성장 인자 (aFGF, bFGF), EGF (표피 성장 인자), NGF (신경 성장 인자), PDGF (혈소판-유래 성장 인자), VEGF (혈관 내피 성장 인자), 전환 성장 인자 (TGF-α, TGF-β 등), NAP-2 (호중구-활성화 단백질 2), PF-4 (혈소판 인자 4), 트롬보글로불린, MCP-1 (단핵구 화학유인 단백질 1), MCP-3, MIP-1α, MIP-1β-+ (대식세포 염증 단백질), RANTES (활성화시 조절되고, 정상적으로 T 세포에 의해 발현되며, 아마도 분비형인 케모카인), HSP (열 충격 단백질), GRP (글루코스-조절 단백질), 유비퀴틴 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

따라서, 일부 실시양태에서, 기체-강화 유체 및/또는 치료 조성물은 항-염증성 분자 또는 시토카인의 생산 및/또는 분비를 증가시키고/시키거나 항-염증성 분자 또는 시토카인의 분해를 감소시킴으로써, 염증 (예를 들면, 황반 변성)의 하나 이상의 증상을 경감시키거나 예방한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 기체-강화 유체 및/또는 치료 조성물이 염증유발성 분자 또는 시토카인의 생산 및/또는 분비를 감소시키고/시키거나 염증유발성 분자 또는 시토카인의 분해를 증가시킴으로써, 염증 및/또는 염증성 신경변성의 하나 이상의 증상을 경감시키거나 예방한다.

예시적인 관련된 분자성 상호작용:

통상적으로, 양자 성질은 10^-10 미터 미만의 기본 입자에 속하는 것으로 생각되는 한편, 일상 생활의 거시적 세계는 뉴턴의 운동 법칙에 따라 행동한다는 점에서 고전적으로 지칭된다.

최근, 분자들이 희석으로 크기가 증가하는 클러스터를 형성하는 것으로 기술되었다. 이러한 클러스터는 직경이 수 마이크로미터이고, 희석으로 크기가 비-선형으로 증가하는 것으로 보고되었다. 직경이 100 나노미터인 양자 결맞음(coherent) 도메인이 순수에서 발생하는 것으로 가정되었고, 궁극적으로 이러한 결맞음 도메인에서의 물 분자의 집단 진동이 전자기장 변동에 대해 잠긴 위상이 될 수 있어, 물에서의 안정적인 진동을 제공하고, 물의 집단 구조를 변화시키고, 차례로 이는 발달되는 특이적 결맞음 진동을 결정할 수 있는 물 내의 용해된 물질에 대해 특이적인 오래 지속되는 결맞음 진동의 여기 형태의 '메모리' 형태를 제공한다. 이러한 진동이 자기장 위상 커플링에 의해 안정화되는 경우, 물이 희석시 '시드(seed)' 결맞음 진동을 여전히 보유할 수 있다. 분자들의 클러스터가 크기가 증가함에 따라, 그의 전자기 시그너처가 상응하게 증폭되어, 물이 보유하는 결맞음 진동을 강화한다.

물의 미세한 미시적 구조 및 용해된 분자의 클러스터 크기에서의 변경에도 불구하고, 결맞음 진동의 특이성이 존재할 수 있다. 물의 성질에서의 변화를 고려하는 한 모델은 결정화에서 수반되는 고려사항들을 기초로 한다.

나노규모의 케이지(cage)를 형성하는 단순화된 양성자화 물 클러스터가 본 출원인의 기존의 특허 출원인 WO 2009/055729에서 제시되었다. 양성자화 물 클러스터는 전형적으로 H⁺(H₂O)_n의 형태를 취한다. 일부 양성자화 물 클러스터는 천연적으로, 예컨대 이온층에서 발생할 수 있다. 어떠한 특정한 이론에 의해서도 한정되지 않으면서, 그리고 특정 측면에 따르면, 본 발명의 출력 물질에 부여된 안정화된 전자 및 산소를 포함하는 구조물이 포함되는, 기타 유형의 물 클러스터 또는 구조물 (클러스터, 나노케이지(nanocage) 등)이 가능하다. 초래된 구조물에 산소 원자가 포획될 수 있다. 반-결합 나노케이지의 화학작용이 산소 및/또는 안정화된 전자가 장기간 동안 계속 용해되어 있게 한다. 기타 원자 또는 분자, 예컨대 의약 화합물이 지속 전달 목적을 위해 케이징(caging)될 수 있다. 용액 물질 및 용해된 화합물의 특이적 화학작용은 이러한 물질들의 상호작용에 좌우된다.

혼합 장치에 의해 프로세싱된 유체는 클러스터 구조의 정황에서의 유체의 분석과 일관되는 상이한 구조적 특징을 나타내는 것으로 기존에 실험을 통해 나타났다. 예를 들어, WO 2009/055729 참조.

전하-안정화된 나노구조물 (예를 들어, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물):

출원인의 WO 2009/055729의 "이중층 효과", "체류 시간", "주입 속도" 및 "기포(bubble) 크기 치수"에서 기존에 기술된 바와 같이, 동전기적 혼합 장치는 수 밀리초 내에 복합적인 동적 난류로 제1 물질과 제2 물질의 독특한 비-선형 유체 동적 상호작용을 생성시켜, 본원에 기술된 신규 동전기적 효과를 제공하는, 효과적으로 거대한 표면적 (장치 및 100 nm 미만의 이례적으로 작은 기체 기포의 표면적 포함)과 접촉된 복합 혼합을 제공한다. 추가적으로, 절연된 회전자 및 고정자 특징을 포함하는 특수하게 디자인된 혼합 장치를 사용하여 특징-국소화 동전기적 효과 (전압/전류)가 입증되었다.

당업계에 주지된 바와 같이, 전하 재분포 및/또는 용매화 전자는 수용액 내에서 고도로 불안정한 것으로 공지되어 있다. 특정 측면에 따르면, 출원인의 동전기적 효과 (예를 들어, 전하 재분포이며, 특정 측면에서는 용매화 전자가 포함됨)가 출력 물질 (예를 들어, 염수 용액, 이온 용액) 내에서 놀랄 만큼 안정화된다. 실제로, 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체 (예를 들어, RNS-60 또는 솔라스)의 생물학적 활성 및 성질의 안정성이 기밀 용기에서 수 개월 동안 유지될 수 있어, 본 발명의 용액의 성질 및 활성을 생성 및/또는 유지시키고/시키거나 매개하는 것을 돕는 것에서 용존 기체 (예를 들어, 산소)가 수반되는 것을 가리킨다. 유의하게, 전하 재분포 및/또는 용매화 전자는, 유체에 의해 살아있는 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)에 접촉했을 때 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 본 발명의 동전기적 이온성 수성 유체에서 안정적으로 배열된다 (예를 들어, WO 2009/055729의 실시예 23 및 본원에 개시된 바와 같은 세포 패치 클램프 참조).

본원에서 "분자 상호작용" 하에 기술된 바와 같이, 본 발명의 동전기적 유체 (예를 들어, 동전기적 염수 용액)의 안정성 및 생물학적 상용성을 설명하기 위해, 출원인은 물 분자와 물에 용해된 물질 (예를 들어, 산소)의 분자 사이의 상호작용이 물의 집단 구조를 변화시키고, 본 발명의 출력 물질에 부여된 산소 및/또는 안정화된 전자를 포함하는 나노구조물이 포함되는 나노규모 케이스 클러스터를 제공한다는 것을 제안하였다. 메카니즘에 한정되지 않으면서, 특정 측면에서의 나노구조물의 배열은 나노구조물이 (적어도 형성 및/또는 안정성 및/또는 생물학적 활성을 위해) 용존 기체 (예를 들어, 산소)를 포함하고; 나노구조물이, 세포막 또는 그의 관련 구성성분과 접촉 시, 동전기적 유체 (예를 들어, RNS-60 또는 솔라스 염수 유체)가 전하 및/또는 전하 효과를 조정 (예를 들어, 부여 또는 수여)하게 하며; 특정 측면에서는 나노구조물이 생물학적으로 관련된 형태의 용매화 전자의 안정화 (예를 들어, 보유, 내포(harboring), 포획)을 제공하도록 하는 것이다.

특정 측면에 따르면, 그리고 본 개시내용에 의해 지지되는 바와 같이, 이온성 또는 염수 (예를 들어, 표준 염수, NaCl) 용액에서, 본 발명의 나노구조물은 전하-안정화된 수화 쉘(shell) 내에 하나 이상의 용존 기체 분자 (예를 들어, 산소)를 포함할 수 있는 전하-안정화된 나노구조물 (예를 들어, 평균 직경 100 nm 미만)을 포함한다. 추가적인 측면에 따르면, 전하-안정화된 수화 쉘은 하나 이상의 용존 기체 분자 (예를 들어, 산소)가 내포된 케이지 또는 공극(void)을 포함할 수 있다. 추가적인 측면에 따르면, 적절한 전하-안정화된 수화 쉘의 제공에 의해, 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소 함유 나노구조물이 용매화 전자 (예를 들어, 안정화된 용매화 전자)를 추가적으로 포함할 수 있다.

메카니즘 또는 특정 이론에 한정되지 않으면서, 본 발명의 우선일 이후에, 주위 (대기) 기체와 평형 상태에 있는 수성 액체 내의 이온에 의해 안정화된 전하-안정화된 미세기포(microbubble)가 제안되었다 (문헌 [Bunkin et al., Journal of Experimental and Theoretical Physics, 104:486-498, 2007]; 전문이 본원에 참고로 포함됨). 본 발명의 특정 측면에 따르면, 출원인의 신규 동전기적 유체는 신규한 생물학적으로 활성인 형태의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물을 포함하고, 이같은 구조물의 신규 어레이, 클러스터 또는 회합물을 추가로 포함할 수 있다.

전하-안정화된 미세기포 모델에 따르면, 물 구조의 짧은 범위의 분자 질서가 기체 분자의 존재에 의해 파괴되어 (예를 들어, 초기에 비-흡착성 이온과 복합체를 형성한 용존 기체 분자가 짧은 범위의 질서의 결함을 제공함), 이온성 액적의 응축을 제공하고, 여기서 이러한 결함이 물 분자의 제1 및 제2 배위권(coordination sphere)에 둘러싸이고, 이는 배위권 내에 각각 6개 및 12개의 공격자점을 차지하는 흡착성 이온 (예를 들어, 전자 이중층을 형성하기 위한 Na⁺ 이온의 스크리닝 쉘의 획득) 및 비-흡착성 이온 (예를 들어, 제2 배위권을 차지하는 Cl^- 이온)으로 교대로 하전된다. 불충분한 포화 상태의 이온 용액 (예를 들어, 불충분한 포화 상태의 염수 용액)에서, 이러한 수화 '핵'이 제1 및 제2 배위권에 각각의 6개의 흡착성 이온 및 5개의 비-흡착성 이온이 하전될 때까지 계속 안정적이고, 이어서 쿨롬 폭발(explosion)이 진행되어 기체 분자를 함유하는 내부 공극이 생성되며, 이때 흡착성 이온 (예를 들어, Na⁺ 이온)은 생성된 공극의 표면에 흡착되는 한편, 비-흡착성 이온 (또는 그의 일부분)은 용액 내로 확산된다 ([Bunkin et al., 상기 문헌]). 이러한 모델에서, 나노구조물 내의 공극은 그의 표면에 흡착된 이온들 (예를 들어, Na⁺ 이온들) 사이의 쿨롬 반발에 의해 붕괴가 방지된다. 공극-함유 나노구조물의 안정성은 공극/기포 표면 상으로의 유사한 전하의 용해된 이온들의 선택적 흡착 및 용존 기체와 기포 내부의 기체 사이의 확산 평형에 기인하는 것으로 가정되고, 여기서 초래된 전기 이중층에 의해 발휘되는 음성 (외향) 정전 압력이 표면 장력에 대한 안정적인 보상을 제공하고, 기포 내부의 기체 압력이 주위 압력에 의해 균형을 이룬다. 이러한 모델에 따르면, 이같은 미세기포의 형성은 이온성 성분을 필요로 하고, 일부 측면에서는 입자들 간의 충돌-매개 회합이 더 큰 차수의 클러스터 (어레이)의 형성을 제공할 수 있다 (동일 문헌).

전하-안정화된 미세기포 모델은 입자들이 기체 미세기포일 수 있다는 것을 제안하지만, 주위 공기와 평형 상태에 있는 이온 용액에서의 이같은 구조물의 오직 자발적인 형성이 산소가 이같은 구조를 형성할 수 있는지 여부에 대해 특성화되지 않고 침묵하며, 마찬가지로 용매화 전자가 이같은 구조에 의해 회합 및/또는 안정화될 수 있는지 여부에 대해 침묵한다는 것만을 생각한다.

특정 측면에 따르면, 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물을 포함하는 본 발명의 동전기적 유체는 신규하고, 미세기포 모델에 따른 가정되는 비-동전기적, 대기성 전하-안정화된 미세기포 구조물과 근본적으로 상이하다. 유의하게, 적어도 부분적으로, 대조군 염수 용액에는 본원에 개시된 생물학적 성질이 없는 반면 출원인의 전하-안정화된 나노구조물은 신규한, 생물학적으로 활성인 형태의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물을 제공한다는 사실로부터 유도되어, 이러한 결론이 불가피하다.

본 발명의 특정 측면에 따르면, 출원인의 신규한 동전기적 장치 및 방법은 공기와 평형 상태에 있는 이온성 유체 또는 임의의 동전기적으로 생성되지 않은 유체에서 자발적으로 발생할 수 있는 또는 그렇지 않을 수 있는 임의의 양을 초과하여 유의한 양의 전하-안정화된 나노구조물을 포함하는 신규한 동전기적으로 변경된 유체를 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 나노구조물은 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물을 포함한다. 추가적인 측면에서, 전하-안정화된 나노구조물이 모두 또는 실질적으로 모두 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물이거나, 또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물이 동전기적 유체 내의 주요 전하-안정화된 기체-함유 나노구조물 종이다.

추가적인 측면에 따르면, 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 용매화 전자를 포함하거나 내포할 수 있고, 이에 의해 신규한 안정화된 용매화 전자 운반체를 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 신규 유형의 전자화물(electride) (또는 반전 전자화물)을 제공하고, 이는 단일한 유기적으로 배위된 양이온이 있는 통상적인 용질 전자화물과 대조적으로 오히려 공극 또는 산소 원자를 함유하는 공극 주변에 안정적으로 배열된 다수의 양이온이 있으며, 이때 배열된 나트륨 이온들에 유기 분자보다는 물 수화 쉘이 배위된다. 특정 측면에 따르면, 용매화 전자는 물 분자의 수화 쉘에 의해 수용될 수 있거나, 또는 바람직하게는 모든 양이온 전반에 걸쳐 분포된 나노구조물 공극 내에 수용된다. 일부 측면에서, 배열된 다중 나트륨 양이온에 걸친 용매화 전자의 분포/안정화를 제공할 뿐만 아니라, 공극 내의 케이징된 산소 분자(들)와 용매화 전자의 회합 또는 부분적인 회합을 제공함으로써 본 발명의 나노구조물은 용액 내의 신규한 '수퍼 전자화물' 구조를 제공한다 - 용매화 전자가 하나 이상의 산소 원자 및 나트륨 원자들의 배열에 걸쳐 분포된다. 따라서, 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적 유체와 연관되어 본원에서 개시된 바와 같은 '용매화 전자'는 물 분자에 의한 직접적인 수화를 포함하는 전통적인 모델에서 용매화되지 않을 수 있다. 별법적으로, 건조된 전자화물 염과 제한적으로 유사하게, 본 발명의 동전기적 유체 내의 용매화 전자가 다중 전하-안정화된 나노구조물에 걸쳐 분포되어, 수용액 내의 더 높은 차수의 어레이를 안정화하는 '격자 접착제'를 제공할 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명의 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 세포막 또는 그의 구성성분, 또는 단백질 등과 상호작용하여 생물학적 활성을 매개할 수 있다. 특정 측면에서, 용매화 전자가 내포된 본 발명의 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 세포막 또는 그의 구성성분, 또는 단백질 등과 상호작용하여 생물학적 활성을 매개할 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명의 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 전하 및/또는 전하 효과 공여체 (전달)로서 및/또는 전하 및/또는 전하 효과 수용체로서 세포막 또는 그의 구성성분, 또는 단백질 등과 상호작용하여 생물학적 활성을 매개할 수 있다. 특정 측면에서, 용매화 전자가 내포된 본 발명의 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 전하 및/또는 전하 효과 공여체로서 및/또는 전하 및/또는 전하 효과 수용체로서 세포막과 상호작용하여 생물학적 활성을 매개할 수 있다.

특정 측면에서, 본 발명의 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 본 발명의 동전기적 유체의 관찰된 안정성 및 생물학적 성질과 일관되고 이를 설명하며, 추가로 이온성 수용액 (예를 들어, 염수 용액, NaCl 등) 내의 안정화된 용매화 전자를 제공하는 신규 전자화물 (또는 반전 전자화물)을 제공한다.

특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 전하-안정화된 산소-함유 나노기포(nanobubble)를 실질적으로 포함하거나, 그의 형태를 취하거나, 또는 이를 발생시킬 수 있다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 클러스터는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 상대적으로 더 큰 어레이, 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노기포 또는 그의 어레이의 형성을 제공한다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 소수성 표면과의 접촉시 소수성 나노기포의 형성을 제공할 수 있다.

특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 실질적으로 1개 이상의 산소 분자를 포함한다. 일부 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 실질적으로 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 50개 이상, 100개 이상, 또는 그를 초과하는 개수의 산소 분자를 포함한다. 특정 측면에서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물은 약 20 nm × 1.5 nm의 나노기포 (예를 들어, 소수성 나노기포)를 포함하거나 이를 발생시키고, 약 12개의 산소 분자를 포함한다 (예를 들어, 산소 분자의 크기 (약 0.3 nm × 0.4 nm), 이상 기체의 가정, 및 n=PV/RT [식 중, P=1 atm, R=0.082057 l.atm/mol.K; T=295K; V=pr²h=4.7×10^-22 L (여기서, r=10×10^-9 m, h=1.5×10^-9 m, 및 n=1.95×10^-22 몰)]의 적용을 기초로 함).

일부 측면에서, 이온성 수성 유체 내의 전하-안정화된 배열을 지니는 이같은 나노구조물 또는 그의 어레이 내에 있는 유체 내에 존재하는 산소 분자의 백분율은 0.1％ 초과; 1％ 초과; 2％ 초과; 5％ 초과; 10％ 초과; 15％ 초과; 20％ 초과; 25％ 초과; 30％ 초과; 35％ 초과; 40％ 초과; 45％ 초과; 50％ 초과; 55％ 초과; 60％ 초과; 65％ 초과; 70％ 초과; 75％ 초과; 80％ 초과; 85％ 초과; 90％ 초과; 및 95％ 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 백분율 양이다. 바람직하게는, 이러한 백분율은 약 5％ 초과, 약 10％ 초과, 약 15％ 초과, 또는 약 20％ 초과이다. 추가적인 측면에서, 이온성 수성 유체 내의 전하-안정화된 배열을 지니는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물 또는 그의 어레이의 실질적인 크기는 100 nm 미만; 90 nm 미만; 80 nm 미만; 70 nm 미만; 60 nm 미만; 50 nm 미만; 40 nm 미만; 30 nm 미만; 20 nm 미만; 10 nm 미만; 5 nm 미만; 4 nm 미만; 3 nm 미만; 2 nm 미만; 및 1 nm 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 크기이다. 바람직하게는, 이러한 크기는 약 50 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 30 nm 미만, 약 20 nm 미만, 또는 약 10 nm 미만이다.

일부 측면에서, 본 발명의 동전기적 유체는 용매화 전자를 포함한다. 추가적인 측면에서, 본 발명의 동전기적 유체는 용매화 전자(들); 및 독특한 전하 분포 (극성, 대칭성, 비대칭성 전하 분포) 중 하나 이상을 포함하는, 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물, 및/또는 그의 어레이를 포함한다. 일부 측면에서, 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물, 및/또는 그의 어레이는 상자성 성질이 있다.

대조적으로, 본 발명의 동전기적 유체에 비해, 대조군인 압력 용기 산소화 유체 (비-동전기적 유체) 등은 세포막 전위 및 세포막 전도도 중 하나 이상을 조정할 수 있는, 이같은 생물학적으로 활성인 동전기적으로 생성된 전하-안정화된 나노구조물 및/또는 생물학적으로 활성인 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물 및/또는 그의 어레이를 포함하지 않는다.

기체-강화 유체 제조를 위한 시스템

이전에 출원인의 WO 2009/055729 특허 출원에 개시된 바와 같은 시스템 및 방법은 기체 (예를 들어 산소)가 수동 상실이 최소이면서 높은 농도로 안정적으로 강화되게 한다. 이러한 시스템 및 방법은 광범위한 기체를 높아진 백분율로 광범위한 유체 내로 강화시키는데 효과적으로 사용될 수 있다. 오직 예로서, 전형적으로 용존 산소의 수준이 약 2-3 ppm (백만분율)인 실온의 탈이온수가 개시된 시스템 및/또는 방법을 사용하여 약 5 ppm 이상, 약 10 ppm 이상, 약 15 ppm 이상, 약 20 ppm 이상, 약 25 ppm 이상, 약 30 ppm 이상, 약 35 ppm 이상, 약 40 ppm 이상, 약 45 ppm 이상, 약 50 ppm 이상, 약 55 ppm 이상, 약 60 ppm 이상, 약 65 ppm 이상, 약 70 ppm 이상, 약 75 ppm 이상, 약 80 ppm 이상, 약 85 ppm 이상, 약 90 ppm 이상, 약 95 ppm 이상, 약 100 ppm 이상, 또는 그보다 크거나 그 사이인 임의의 값 범위의 용존 산소 수준에 도달할 수 있다. 특정한 예시적인 실시양태에 따르면, 산소-강화 물은 용존 산소 약 30-60 ppm의 수준으로 생성될 수 있다.

표 3은 산소-강화 염수 용액 (표 3)으로 처치된 치유 중인 상처 및 본 발명의 기체-강화 산소-강화 염수 용액의 샘플에서 취해진 다양한 부분압 측정치를 나타낸다.

조직 산소 측정치

프로브 Z082BO

공기 중: 171 mmHg 23℃

칼럼 부분압 (mmHg)

B1 32-36

B2 169-200

B3 20-180*

B4 40-60

* 최소 상처 깊이, 대부분 >150, 때때로 20 s

투여 경로 및 형태

특정한 예시적인 실시양태에서, 치료 조성물이 염증의 하나 이상의 증상을 예방하거나 경감시키도록 본 발명의 기체-강화 유체가 단독으로 또는 또 다른 치료제와 조합되어 치료 조성물로 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 조성물 제제는 담체, 아주반트, 유화제, 현탁화제, 감미제, 향미제, 향료 및 결합제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 작용제를 또한 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 경우에, "제약상 허용되는 담체" 및 "담체"는 일반적으로 임의 유형의 비-독성의 불활성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제제 보조물을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 비제한적인 예는 당 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체 예컨대 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트라가칸트 분말; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제 예컨대 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일 예컨대 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; 글리콜 예컨대 프로필렌 글리콜; 에스테르 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 완충제 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열원 비함유 물; 등장성 염수; 링거(Ringer) 용액; 에틸 알콜, 및 포스페이트 완충 용액, 뿐만 아니라 기타 비-독성 상용성 윤활제 예컨대 라우릴황산나트륨 및 스테아르산마그네슘이고, 뿐만 아니라 조제자의 판단에 따라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미, 향미 및 방향 작용제, 보존제 및 항산화제가 조성물 내에 또한 존재할 수 있다. 특정 측면에서, 이같은 담체 및 부형제가 본 발명의 기체-강화 유체 또는 용액에 있을 수 있다.

본원에 기술된 제약상 허용되는 담체, 예를 들어, 비히클, 아주반트, 부형제 또는 희석제는 당업자에게 주지되어 있다. 전형적으로, 제약상 허용되는 담체는 치료제에 대해 화학적으로 불활성이고, 사용 조건 하에 해로운 부작용 또는 독성이 없다. 제약상 허용되는 담체는 중합체 및 중합체 매트릭스, 나노입자, 미세기포 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 치료적 기체-강화 유체에 더하여, 치료 조성물은 불활성 희석제 예컨대 추가적인 비-기체-강화 물 또는 기타 용매, 용해제 및 유화제 예컨대 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 오일, 배아 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 특정 치료 조성물의 신규하고 개선된 제제, 신규 기체-강화 치료 유체, 및 신규 기체-강화 치료 유체를 전달하는 신규 방법은 하나 이상의 불활성 희석제를 동일하거나 유사하거나 상이한 조성의 기체-강화 유체로 교체함으로써 수득될 수 있다. 예를 들어, 기체-강화 유체를 제공하도록 산소를 물 또는 탈이온수 내로 혼합함으로써 생산된 기체-강화 유체로 통상적인 물을 교체하거나 보완할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 기체-강화 유체는 하나 이상의 치료제와 조합될 수 있고/있거나 단독으로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 기체-강화 유체를 혼입시키는 것은 당업계에 공지된 하나 이상의 용액, 예컨대 탈이온수, 염수 용액 등을 하나 이상의 기체-강화 유체로 교체하여 대상체에게 전달하기 위한 개선된 치료 조성물을 제공하는 것을 포함할 수 있다.

일부 실시양태는 본 발명의 기체-강화 유체, 제약 조성물 또는 기타 치료제 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 및 하나 이상의 제약 담체 또는 희석제를 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 상기 질환 또는 상태의 예방 및 치료에서, 그리고 상기 언급된 바와 같은 요법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 담체는 제약상 허용되어야 하고, 조성물 내의 다른 성분들과 상용성이어야 하며, 즉 이에 대한 해로운 효과가 없어야 한다. 담체는 고체 또는 액체일 수 있고, 바람직하게는 단위 용량 제제, 예를 들어, 0.05 내지 95 중량％의 활성 성분을 함유할 수 있는 정제로서 제제화된다.

가능한 투여 경로에는 경구, 설하, 협측, 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 수조내, 방광내, 경막내, 또는 정맥내), 직장, 국소 (경피 포함), 질내, 안구내, 이내, 비내, 흡입, 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입이 포함된다.

투여 경로

특정 대상체에 대한 가장 적절한 투여 수단은 치료되는 질환 또는 상태의 성질 및 중증도 또는 사용되는 요법의 성질, 뿐만 아니라 치료 조성물 또는 추가 치료제의 성질에 좌우될 것이다. 일부 실시양태에서, 경구 또는 국소 투여가 바람직하다.

경구 투여에 적절한 제제는 각각 예정된 양의 활성 화합물을 함유하는 불연속적인 단위, 예컨대 정제, 캡슐, 카쉐(cachet), 시럽, 엘릭시르, 츄잉 검, "막대사탕" 제제, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 로젠지, 또는 겔-코팅 앰플이며; 분말 또는 과립으로서; 수성 또는 비-수성 액체 내의 용액 또는 현탁액으로서; 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼으로서 제공될 수 있다.

다양한 유형의 계량 용량 가압 에어로졸, 애터마이저(atomizer), 분무기(nebuliser), 또는 통기기에 의해 생성될 수 있는 미세 입자 분진 또는 미스트를 포함하도록 경구 투여에 적절한 추가적인 제제가 제공될 수 있다. 특히, 치료제의 분말 또는 기타 화합물이 본 발명의 기체-강화 유체에 용해 또는 현탁될 수 있다.

설하 또는 협측 투여에 의한 것과 같은 경점막 방법에 적절한 제제에는 활성 성분을 포함하고 당 및 아카시아 또는 트라가칸트와 같은 향미 기제를 전형적으로 포함하는 로젠지, 패치, 정제 등, 및 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로스 아카시아와 같은 불활성 기제 내의 활성 화합물을 포함하는 향정이 포함된다.

비경구 투여에 적절한 제제는 예정된 농도의 활성 기체-강화 유체를 함유하고 가능하게는 또 다른 치료제를 함유하는 멸균성 수용액을 전형적으로 포함한다; 이러한 용액은 바람직하게는 의도되는 수용자의 혈액과 등장성이다. 비경구 투여에 적절한 추가적인 제제에는 생리학적으로 적절한 공-용매 및/또는 착화제 예컨대 계면활성제 및 시클로덱스트린을 함유하는 제제가 포함된다. 수중유 에멀젼이 기체-강화 유체의 비경구 투여용 제제에 또한 적절할 수 있다. 이같은 용액들은 바람직하게는 정맥 내로 투여되지만, 피하 또는 근육내 주사에 의해 또한 투여될 수 있다.

요도, 직장 또는 질 투여에 적절한 제제에는 겔, 크림, 로션, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 용해가능한 고체 물질, 관주제 등이 포함된다. 바람직하게는 이러한 제제는 좌제 기제를 형성하는 하나 이상의 고체 담체, 예를 들어, 코코아 버터 내에 활성 성분을 포함하는 단위-용량 좌제로서 제공된다. 별법적으로, 본 발명의 기체-강화 유체가 있는 결장 세척제가 결장 또는 직장 투여용으로 제제화될 수 있다.

국소, 안구내, 이내 또는 비내 적용에 적절한 제제에는 연고, 크림, 페이스트, 로션, 페이스트, 겔 (예컨대 히드로겔), 스프레이, 분산성 분말 및 과립, 에멀젼, 유동 추진체를 사용하는 스프레이 또는 에어로졸 (예컨대 리포솜성 스프레이, 점비제, 비강 스프레이 등) 및 오일이 포함된다. 이같은 제제를 위한 적절한 담체에는 석유 젤리, 라놀린, 폴리에틸렌글리콜, 알콜, 및 이들의 조합물이 포함된다. 비강 또는 비내 전달은 계량 용량의 이러한 제제 중 임의의 것 등을 포함할 수 있다. 유사하게, 이내 또는 안구내 제제는 점적제, 연고, 관류액 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 제제는 임의의 적절한 방법에 의해, 전형적으로는 기체-강화 유체를 임의적으로는 활성 화합물과 함께 액체 또는 미분된 고체 담체 또는 둘 모두와 요구되는 비율로 균일하게 및 균질하게 혼합하고, 이어서 필요하다면 생성된 혼합물을 원하는 형상으로 성형함으로써 제조될 수 있다.

예를 들어, 활성 성분의 분말 또는 과립 및 하나 이상의 임의적인 성분, 예컨대 결합제, 윤활제, 불활성 희석제 또는 계면활성 분산제를 포함하는 균질 혼합물을 압축함으로써, 또는 분말화된 활성 성분 및 본 발명의 기체-강화 유체의 균질 혼합물을 성형함으로써 정제를 제조할 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위한 적절한 제제에는 다양한 유형의 계량 용량 가압 에어로졸, 애터마이저, 분무기 또는 통기기에 의해 생성될 수 있는 미세 입자 분진 또는 미스트가 포함된다. 특히, 치료제의 분말 또는 기타 화합물이 본 발명의 기체-강화 유체에 용해 또는 현탁될 수 있다.

입을 통한 폐 투여를 위해, 분말 또는 액적의 입자 크기는 기관세지 내로의 전달을 확실히 하도록 전형적으로 0.5-10 ㎛ 범위, 바람직하게는 1-5 ㎛이다. 비강 투여를 위해, 10-500 ㎛ 범위의 입자 크기가 비강에서의 유지를 확실히 하는데 바람직하다.

계량 용량 흡입기는 액화 추진체 내의 치료제의 현탁액 또는 용액 제제를 전형적으로 함유하는 가압 에어로졸 분배기이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 기체-강화 유체가 표준 액화 추진체에 더하여 또는 이를 대신하여 사용될 수 있다. 사용 동안, 이러한 장치는 치료제 및 기체-강화 유체를 함유하는 미세 입자 스프레이를 생산하기 위해 계량된 부피, 전형적으로는 10 내지 150 ㎕를 전달하도록 개조된 밸브를 통해 제제를 배출한다. 적절한 추진체에는 몇몇 클로로플루오로카본 화합물, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및 이들의 혼합물이 포함된다.

제제는 하나 이상의 공-용매, 예를 들어, 에탄올 계면활성제, 예컨대 올레산 또는 소르비탄 트리올레에이트, 항산화제 및 적절한 향미제를 추가적으로 함유할 수 있다. 분무기는 좁은 벤추리(venturi) 구멍을 통한 압축 기체 (전형적으로는 공기 또는 산소)의 가속화에 의해 또는 초음파 진탕에 의해 활성 성분의 용액 또는 현탁액을 치료용 에어로졸 미스트로 전환시키는 시판 장치이다. 분무기에서 사용하기 위한 적절한 제제는 기체-강화 유체 내에 있고 제제의 40％ w/w 이하, 바람직하게는 20％ w/w 미만을 이루는 또 다른 치료제로 이루어진다. 또한, 기타 담체, 예컨대 증류수, 멸균수, 또는 묽은 알콜 수용액을 이용할 수 있고, 바람직하게는, 이는 염화나트륨과 같은 염의 첨가에 의해 체액과 등장성이게 된다. 임의적인 첨가제는 보존제를 포함하고 (특히 제제가 멸균성으로 제조되지 않은 경우), 메틸 히드록시-벤조에이트, 항산화제, 향미제, 휘발성 오일, 완충제 및 계면활성제를 포함할 수 있다.

통기에 의해 투여를 위한 적절한 제제에는 통기기에 의해 전달될 수 있거나 코로 들이마시는 방식으로 비강 내로 취입될 수 있는 미세하게 분쇄된 분말이 포함된다. 통기기에서, 구멍이 뚫렸거나 원위치에서 열리는 캡슐 또는 카트리지 (전형적으로 젤라틴 또는 플라스틱으로 제조됨) 내에 분말이 함유되고, 흡입 시 장치를 통해 들이쉬어진 공기에 의해 또는 수동으로 작동되는 펌프에 의해 분말이 전달된다. 통기기에서 사용되는 분말은 단독으로 활성 성분으로 또는 활성 성분, 적절한 분말 희석제, 예컨대 락토스 및 임의적인 계면활성제를 포함하는 분말 블렌드로 이루어진다. 활성 성분은 전형적으로 제제의 0.1 내지 100 w/w를 이룬다.

상기에서 구체적으로 언급된 성분들에 더하여, 당해 제제의 유형을 고려하여, 본 발명의 제제는 당업자에게 공지된 기타 작용제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적절한 제제는 향미제를 포함할 수 있고, 비내 투여에 적절한 제제는 향료를 포함할 수 있다.

본 발명의 치료 조성물은 개별적인 치료제로서 또는 치료제들의 조합물에서 제약 약물과 함께 사용하기 위해 이용가능한 임의의 통상적인 방법에 의해 투여될 수 있다.

물론, 투여되는 투여량은 공지된 요인, 예컨대 특정 작용제의 약역학적 특징 및 그의 투여 방식 및 경로; 수용자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 성질 및 정도; 동반 치료의 종류; 치료 빈도; 및 원하는 효과에 따라 변할 것이다. 활성 성분의 일일 투여량은 체중 1 킬로그램 (㎏) 당 약 0.001 내지 1000 밀리그램 (㎎)인 것으로 예상될 수 있고, 바람직한 용량은 0.1 내지 약 30 ㎎/㎏이다. 몇몇 측면에 따르면, 활성 화합물의 일일 투여량은 0.001 리터 내지 10 리터일 수 있고, 바람직한 용량은 약 0.01 리터 내지 1 리터이다.

투여 형태 (투여에 적절한 조성물)는 단위 당 약 1 ㎎ 내지 약 500 ㎎의 활성 성분을 함유한다. 이러한 제약 조성물에서, 활성 성분은 보통 조성물의 총 중량을 기초로 약 0.5-95 중량％의 양으로 존재할 것이다.

연고, 페이스트, 포말, 흡장제, 크림 및 겔 또한 부형제, 예컨대 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 실리콘, 벤토나이트, 실리카산, 및 활석, 또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 분말 및 스프레이 또한 부형제 예컨대 락토스, 활석, 실리카산, 수산화알루미늄, 및 규산칼슘, 또는 이러한 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 에어로졸 제약을 제조하는데 일상적으로 사용되는 공지된 수단들 중 임의의 것에 의해 나노결정질 항균 금속의 용액이 에어로졸 또는 스프레이로 전환될 수 있다. 일반적으로, 이같은 방법은 용액의 용기를 일반적으로는 불활성 담체 기체로 가압하거나 또는 가압하기 위한 수단을 제공하는 단계, 및 가압된 기체를 소형 구멍을 통해 통과시키는 단계를 포함한다. 스프레이는 통상적인 추진체, 예컨대 질소, 이산화탄소 및 기타 불활성 기체를 추가적으로 함유할 수 있다. 또한, 치료 화합물을 대상체에게 투여하는데 요구되는 경로 중 임의의 것에서 마이크로스피어 또는 나노입자를 본 발명의 기체-강화 치료 조성물 또는 유체와 함께 사용할 수 있다.

주사용 제제는 단위-용량 또는 다중-용량 밀봉 용기, 예컨대 앰플 및 바이알에서 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액체 부형제 또는 기체-강화 유체의 첨가만을 필요로 하면서 냉동-건조 (동결건조) 조건에서 보관될 수 있다. 멸균성 분말, 과립 및 정제로부터 즉석 주사 용액 및 현탁액을 제조할 수 있다. 주사가능한 조성물을 위한 효과적인 제약 담체에 대한 요건이 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa., Banker and Chalmers, Eds., 238-250 (1982)] 및 [ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., 622-630 (1986)] 참조.

국소 투여에 적절한 제제에는 본 발명의 기체-강화 유체를 포함하고 추가 치료제 및 향미제, 일반적으로는 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 임의적으로 포함하는 로젠지; 불활성 기제, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 내에 기체-강화 유체 및 임의적인 추가 치료제를 포함하는 향정; 및 적절한 액체 담체 내에 기체-강화 유체 및 임의적인 추가 치료제를 포함하는 구강 세척액 또는 구강 세정액; 뿐만 아니라 크림, 에멀젼, 겔 등이 포함된다.

추가적으로, 직장 투여에 적절한 제제가 다양한 기제 예컨대 유화 기제 또는 수용성 기제와 혼합함으로써 좌제로서 제시될 수 있다. 질 투여에 적절한 제제는 적합한 것으로 당업계에 공지된 바와 같은 담체를 활성 성분에 더하여 함유하는 페서리(pessary), 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말, 또는 스프레이 제제로서 제시될 수 있다.

적절한 제약 담체가 이러한 분야에서의 표준 참고문헌인 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company]에 기술되어 있다.

본 발명의 맥락에서 대상체, 특히 동물, 그 중에서도 인간에게 투여되는 용량은 합당한 기간에 걸쳐 동물에서 치료 반응을 초래하는데 충분하여야 한다. 당업자는 투여량이 동물의 상태, 동물의 체중, 뿐만 아니라 치료되는 상태가 포함되는 다양한 요인에 좌우될 것임을 인지할 것이다. 적절한 용량은 원하는 반응에 영향을 미치는 것으로 공지된 대상체에서의 치료 조성물의 농도를 초래할 용량이다.

용량의 크기는 투여 경로, 시기 및 빈도, 뿐만 아니라 치료 조성물의 투여 및 원하는 생리학적 효과에 동반될 수 있는 임의의 불리한 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 또한 결정될 수 있다.

조합물의 화합물이 (1) 공동-제제 내의 화합물들의 조합에 의해 동시에, 또는 (2) 교대에 의해, 즉 화합물들을 별도의 제약 제제에서 연속적으로, 순차적으로, 병행으로, 또는 동시에 전달하는 것에 의해 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 교대 요법에서, 제2의 활성 성분 및 임의로 제3의 활성 성분을 투여하는 것에서의 지연이 활성 화합물들의 조합물의 상승작용적 치료 효과의 이점을 잃도록 하지 않아야 한다. 투여 방법 (1) 또는 (2) 중 어느 하나에 의한 일부 실시양태에 따르면, 이상적으로는 가장 효과적인 결과를 달성하도록 조합물이 투여되어야 한다. 투여 방법 (1) 또는 (2) 중 어느 하나에 의한 일부 실시양태에서, 이상적으로는 각각의 활성 성분의 피크 혈장 농도를 달성하도록 조합물이 투여되어야 한다. 조합 공동-제제의 투여에 의한 하루에 1번 환제 1개의 요법이 황반 변성을 앓고 있는 일부 환자에게 편리할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 조합물의 활성 성분들의 효과적인 피크 혈장 농도는 약 0.001 내지 100 μM의 범위일 것이다. 특정 환자에 대해 처방된 제제 및 투여 요법에 의해 최적의 피크 혈장 농도가 달성될 수 있다. 본 발명의 유체, 및 항-혈관신생 (항-VEGF) 요법, 단순 식이 보충제 및 스타틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 이상의 추가 치료제, 또는 이들 중 어느 하나의 생리학적으로 기능성인 유도체가, 동시에 제시되든지 또는 순차적으로 제시되든지, 개별적으로, 다중으로, 또는 그의 임의의 조합으로 투여될 수 있다는 것이 또한 이해될 것이다. 일반적으로, 교대 요법 (2) 동안에는 유효 투여량의 각각의 화합물이 연속적으로 투여되고, 공동-제제 요법 (1)에서는 유효 투여량의 2개 이상의 화합물이 함께 투여된다.

본 발명의 조합물은 단일 투여 형태의 제약 제제로서 편리하게 제시될 수 있다. 편리한 단일 투여량 제제는 각각 1 ㎎ 내지 1 g의 임의의 양, 예를 들어, 10 ㎎ 내지 300 ㎎이지만 이에 한정되지 않는 양으로 활성 성분들을 함유한다. 퀴니딘, 프로카인아미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 모리시진, 프로파놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤로, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론, E-4031, 베라파밀, 딜티아젬, 아데노신, 디곡신, 마그네슘 술페이트, 와파린, 헤파린, 항-혈소판 약물 (예를 들어, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들어, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들어, 캡토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌 및 락토키닌), 스타틴 (예를 들어, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들어, 에플러레논 및 스피로노락톤), 강심제, 이뇨제, 디곡신, 심근수축제 (예를 들어, 밀리논), 혈관확장제 및 오메가-3 지방산 (조합 요법))과 조합된 본 발명의 유체의 상승작용적 효과가 광범위한 비, 예를 들어 1:50 내지 50:1 (본 발명의 유체:추가 치료제)에 걸쳐 실현될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 비는 약 1:10 내지 10:1 범위일 수 있다. 또다른 실시양태에서, 공동-제제화된 조합 투여 형태, 예컨대 환제, 정제, 캐플릿(caplet) 또는 캡슐 내의 본 발명의 유체 대 퀴니딘, 프로카인아미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 모리시진, 프로파놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤로, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론, E-4031, 베라파밀, 딜티아젬, 아데노신, 디곡신, 마그네슘 술페이트, 와파린, 헤파린, 항-혈소판 약물 (예를 들어, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들어, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들어, 캡토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌 및 락토키닌), 스타틴 (예를 들어, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들어, 에플러레논 및 스피로노락톤), 강심제, 이뇨제, 디곡신, 심근수축제 (예를 들어, 밀리논), 혈관확장제 및 오메가-3 지방산 (조합 요법))의 중량/중량 비는 약 1일 것이고, 즉, 본 발명의 유체와 퀴니딘, 프로카인아미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 모리시진, 프로파놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤로, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론, E-4031, 베라파밀, 딜티아젬, 아데노신, 디곡신, 마그네슘 술페이트, 와파린, 헤파린, 항-혈소판 약물 (예를 들어, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들어, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들어, 캡토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌 및 락토키닌), 스타틴 (예를 들어, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들어, 에플러레논 및 스피로노락톤), 강심제, 이뇨제, 디곡신, 심근수축제 (예를 들어, 밀리논), 혈관확장제 및 오메가-3 지방산의 양이 대략적으로 동일할 것이다. 다른 예시적인 공동-제제에서, 더 많거나 더 적은 본 발명의 유체 및 퀴니딘, 프로카인아미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 모리시진, 프로파놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤로, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론, E-4031, 베라파밀, 딜티아젬, 아데노신, 디곡신, 마그네슘 술페이트, 와파린, 헤파린, 항-혈소판 약물 (예를 들어, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들어, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들어, 캡토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌 및 락토키닌), 스타틴 (예를 들어, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들어, 에플러레논 및 스피로노락톤), 강심제, 이뇨제, 디곡신, 심근수축제 (예를 들어, 밀리논), 혈관확장제 및 오메가-3 지방산이 있을 수 있다. 한 실시양태에서, 단독으로 사용될 때 항-염증성 활성을 나타내는 양으로 각각의 화합물이 조합물에서 사용될 것이다. 상기 조합물의 화합물들의 기타 비 및 양이 본 발명의 범주 내에서 구상된다.

단일 투여 형태는 본 발명의 유체 및 퀴니딘, 프로카인아미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 모리시진, 프로파놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤로, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론, E-4031, 베라파밀, 딜티아젬, 아데노신, 디곡신, 마그네슘 술페이트, 와파린, 헤파린, 항-혈소판 약물 (예를 들어, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들어, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들어, 캡토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌 및 락토키닌), 스타틴 (예를 들어, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들어, 에플러레논 및 스피로노락톤), 강심제, 이뇨제, 디곡신, 심근수축제 (예를 들어, 밀리논), 혈관확장제 및 오메가-3 지방산, 또는 이들 중 어느 하나의 생리학적으로 기능성인 유도체, 및 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

당업자는 치료에서 사용하기 위해 요구되는 본 발명의 조합물 내의 활성 성분들의 양이 치료되는 상태의 성질 및 환자의 연령 및 상태를 비롯한 다양한 요인에 따라 변할 것이고, 궁극적으로는 주치 의사 또는 건강 관리 실무자의 재량일 것임을 이해할 것이다. 고려될 요인에는 투여 경로 및 제제의 성질, 동물의 체중, 연령 및 전반적인 상태, 및 치료될 질환의 성질 및 중증도가 포함된다.

활성 성분 중 임의의 2가지를 제3 활성 성분과의 동시 또는 순차 투여를 위해 단일 투여 형태로 조합하는 것이 또한 가능하다. 이러한 3부 조합물은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 조합물은 2회 또는 3회 투여로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 유체 및 퀴니딘, 프로카인아미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 모리시진, 프로파놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤로, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론, E-4031, 베라파밀, 딜티아젬, 아데노신, 디곡신, 마그네슘 술페이트, 와파린, 헤파린, 항-혈소판 약물 (예를 들어, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들어, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들어, 캡토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌 및 락토키닌), 스타틴 (예를 들어, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들어, 에플러레논 및 스피로노락톤), 강심제, 이뇨제, 디곡신, 심근수축제 (예를 들어, 밀리논), 혈관확장제 및 오메가-3 지방산의 3부 조합물.

하기의 실시예는 설명적인 것으로만 의도되고, 어떠한 방식으로도 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

실시예 1

(미세기포 크기)

본 실시예는 기포 크기와 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된, 출원인의 미국 특허 출원 공보 일련번호 제11/978,137호의 실시예 2를 기준으로 한다. 기체 미세기포 크기 한계를 결정하기 위해 본 발명의 확산기를 사용함으로써 기체-강화 유체로 실험을 수행하였다. 기체-강화 유체를 0.22 및 0.1 마이크로미터 필터에 통과시킴으로써 미세기포 크기 한계가 확립되었다. 이러한 시험의 수행에서, 다량의 유체가 본 발명의 확산기를 통과하였고, 기체-강화 유체가 생성되었다. 이러한 유체 60 ㎖를 60 ㎖ 주사기 내로 배수시켰다. 그 후, 주사기 내의 유체의 용존 산소 수준을 윙클러(Winkler) 적정에 의해 측정하였다. 주사기 내의 유체를 0.22 마이크로미터 밀리포어 밀렉스(Millipore Millex) GP50 필터를 통과하여 50 ㎖ 비커 내로 주입하였다. 그 후, 50 ㎖ 비커 내의 물질의 용존 산소 비율을 측정하였다. 이러한 실험을 3회 수행하여, 하기 표 4에 설명된 결과가 달성되었다.

여과 후 용존 산소 측정
주사기 내의 용존 산소	0.22 마이크로미터 필터 후의 용존 산소
42.1 ppm	39.7 ppm
43.4 ppm	42.0 ppm
43.5 ppm	39.5 ppm

알 수 있듯이, 확산된 물질을 0.22 마이크로미터 필터를 통과시키는 것에 의해 주사기 내에서 측정된 용존 산소 수준과 50 ㎖ 비커 내의 용존 산소 수준이 유의하게 변화되지 않았고, 이는 유체 내의 용존 기체의 미세기포가 0.22 마이크로미터 이하라는 것을 암시한다.

염수 용액 배치(batch)가 본 발명의 확산기로 강화되었고, 출력 용액의 샘플이 미여과 상태로 수집된 제2 시험을 수행하였다. 미여과 샘플의 용존 산소 수준은 44.7 ppm이었다. 0.1 마이크로미터 필터를 사용하여 본 발명의 확산기로부터의 이러한 산소-강화 용액을 여과하였고, 2개의 추가적인 샘플을 취했다. 제1 샘플에 대해서는, 용존 산소 수준이 43.4 ppm이었다. 제2 샘플에 대해서는, 용존 산소 수준이 41.4 ppm이었다. 마지막으로, 필터를 제거하고, 미여과 용액으로부터 최종 샘플을 취했다. 이러한 경우에, 최종 샘플의 용존 산소 수준은 45.4 ppm이었다. 이러한 결과들은 밀리포어 0.22 마이크로미터 필터가 사용된 것과 일관되었다.

따라서, 염수 용액 내의 대다수의 기체 기포 또는 미세기포의 크기는 대략적으로 0.1 마이크로미터 미만이다. 이러한 결과는 AFM 측정 및 레이저 분광법 연구 모두에 의해 확실해졌다.

실시예 2

(시토카인 프로파일을 결정하였다)

본 실시예는 동전기적 유체에 대한 시토카인 프로파일 반응과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된, 출원인의 미국 특허 출원 공보 일련번호 제12/435,356호의 실시예 5를 기준으로 한다. 혼합된 림프구들을 단일한 건강한 자원 공여자로부터 수득하였다. 백혈구 연층 샘플을 표준 절차에 따라 세척하여, 혈소판을 제거하였다. 림프구를 본 발명의 기체-강화 유체 또는 증류수 (대조군)로 희석된 RPMI 배지 (+ 50 mm HEPES) 내에 플레이트 당 2×10⁶개의 농도로 플레이팅하였다. 세포를 1 마이크로그램/㎖ T3 항원, 또는 1 마이크로그램/㎖ 식물성 적혈구응집소 (PHA) 렉틴 (팬(pan)-T 세포 활성화제)로 자극하거나, 또는 자극하지 않았다 (음성 대조군). 24시간 인큐베이션 후, 세포를 생존력에 대해 점검하고, 상청액을 추출하여 동결시켰다.

상청액을 해동시키고, 원심분리하고, XMAP® (루미넥스(Luminex)) 비드 라이트(bead lite) 프로토콜 및 플랫폼을 사용하여 시토카인 발현에 대해 시험하였다.

2백만개의 세포를 24웰 플레이트의 6개의 웰 내로 본 발명의 산소-강화 유체 (물) (웰 1, 3 및 5) 또는 증류수 (2, 4 및 6)와 함께 완전 RPMI + 50 mm Hepes 내에 플레이팅하였다 (10× RPMI를 물에 희석하여 1×로 만듦). 세포를 1 ㎍/㎖ T3 항원 (웰 1 및 2) 또는 PHA (웰 3 및 4)로 자극하였다. 대조군 웰 5 및 6은 자극하지 않았다. 24시간 후, 세포를 생존력에 대해 점검하고, 상청액을 수집하여 동결시켰다. 다음으로, 상청액을 해동시키고, 8,000g에서 회전시켜, 펠릿화하였다. 청정화된 상청액을 루미넥스 비드 라이트(LUMINEX BEAD LITE)™ 프로토콜 및 플랫폼을 사용하여 열거된 시토카인들에 대해 검정하였다. 수치 데이터가 표 5에서 표로 작성되어 있고, 상응하는 막대 그래프가 도 1에서 도시되어 있다. 현저하게, IFN-γ 수준은 대조군 배양 배지 + T3 항원에서보다 본 발명의 기체-강화 배양 배지 + T3 항원에서 더 높았던 한편, IL-8은 대조군 배양 배지 + T3 항원에서보다 본 발명의 기체-강화 배양 배지 + T3 항원에서 더 낮았다. 추가적으로, IL-6, IL-8, 및 TNF-α 수준은 대조군 배지 + PHA에서보다 본 발명의 기체-강화 배지 + PHA에서 더 낮았던 한편, IL-1β 수준은 대조군 배지 + PHA와 비교했을 때 본 발명의 기체-강화 유체 + PHA에서 더 낮았다. 본 발명의 기체-강화 배지 단독에서, IFN-γ 수준이 대조군 배지에서보다 더 높았다.

실시예 3

(시토카인 발현)

본 실시예는 동전기적 유체에 대한 시토카인 프로파일 반응과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된, 출원인의 미국 특허 출원 공보 일련번호 제12/435,356호의 실시예 6을 기준으로 한다. 특정 측면에서, 인간의 혼합된 림프구들을 대조군 유체 또는 본 발명의 동전기적 유체 내의 T3 항원 또는 PHA로 자극하고, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12(p40), IL-12(p70), IL-13, IL-17, 에오탁신, IFN-γ, GM-CSF, MIP-1β, MCP-1, G-CSF, FGFb, VEGF, TNF-α, RANTES, 렙틴, TNF-β, TFG-β, 및 NGF에서의 변화를 평가하였다. 도 1에서 알 수 있듯이, 시험된 염증유발성 시토카인 (IL-1β, TNF-α, IL-6, 및 GM-CSF), 케모카인 (IL-8, MIP-1α, RANTES, 및 에오탁신), 염증성 효소 (iNOS, COX-2, 및 MMP-9), 알레르겐 반응 (MHC 클래스 II, CD23, B7-1, 및 B7-2), 및 Th2 시토카인 (IL-4, IL-13, 및 IL-5)이 대조군 유체에 비해 시험 유체에서 감소된었다. 대조적으로, 시험된 항-염증성 시토카인 (예를 들어, IL1R-α, TIMP)은 대조군 유체에 비해 시험 유체에서 증가되었다.

이러한 데이터를 부연하기 위해, 출원인은 알레르기성 과민 반응을 평가하기 위해 오브알부민 감작을 수반하는 당업계-공인 모델 시스템을 사용하였다. 연구된 종점은 이러한 반응의 특정한 세포학적 및 세포성 성분, 뿐만 아니라 단백질 및 LDH의 혈청학적 측정이었다. 에오탁신, IL-1α, IL-1β, KC, MCP-1, MCP-3, MIP-1α, RANTES, TNF-α, 및 VCAM의 분석을 포함하여 시토카인 분석을 수행하였다.

간략하게, 수컷 브라운 노르웨이(Brown Norway) 래트에게 수산화알루미늄 (Al(OH)₃) (200 ㎎/㎖)을 함유하는 용액 (2.0 ㎎/㎖) 내의 V등급 오브알부민 (OVA) (A5503-1G, 시그마(Sigma)) 0.5 ㎖를 제1일, 제2일 및 제3일에 각각 1번 복강 내로 주사하였다. 연구는 무작위화된 2×2 계승 배열 처치 (4개의 군)였다. 면역 반응이 일어나도록 2주 동안 기다린 후, 래트를 1주일 동안 RDC1676-00 (레발레시오(Revalesio) 특허 장치로 프로세싱된 멸균 염수) 또는 RDC1676-01 (레발레시오 특허 장치로 프로세싱되고 추가적으로 산소가 첨가된 멸균 염수)에 노출시키거나 또는 이들로 처치하였다. 하루에 한번씩 1주일 동안 처치한 후, 2개의 군을 반으로 나누고, 각각의 군 내의 래트의 50％에게 흡입에 의해 염수 또는 OVA 시험을 제공하였다.

구체적으로, 최초 감작 14일 후에, 12마리의 래트를 연속 7일 동안 매일 30분 동안의 흡입에 의해 RDC 1676-00에 노출시켰다. 시스템의 기류 속도는 10 리터/분으로 설정하였다. 분무되는 물질이 애어로넵(Aeroneb)의 12개의 하위-챔버에 진입하고 균일하게 분배되게 하는 단일 포트(port)가 있는 파이(pie) 챔버 내에 총 12마리의 래트를 정열하였다.

최초 감작 15일 후에, 12마리의 래트를 연속 7일 동안 매일 30분 동안 초음파 분무에 의해 RDC 1676-01에 노출시켰다. 동일한 분무기 및 챔버를 사용하여, 기류를 또한 10 리터/분으로 설정하였다. RDC 1676-00을 먼저 분무하였고, 에어로넵 챔버를 완전히 건조시킨 후 RDC 1676-01을 분무하였다.

최종 분무 처치로부터 약 2시간 후, RDC 1676-00 군으로부터의 래트 6마리에 펜 센츄리 마이크로스프레이어(Penn Century Microsprayer) (모델 1A-1B)를 사용하여 기관내 점적주입에 의해 전달된 OVA (염수 내 1％)를 다시 시험하였다. RDC 1676-00 군으로부터의 나머지 래트 6마리에는 대조군으로서 기관내 점적주입에 의해 전달된 염수를 시험하였다. 다음 날, RDC 1676-01 군으로 절차를 반복하였다.

다시 시험하고 나서 24시간 후, 나트륨 펜토바르비탈을 과다 투여하여 각각의 군 내의 모든 래트를 안락사시켰다. 하대 정맥으로부터 전혈 샘플을 수집하고, 2개의 다른 혈액 수집 튜브 내에 두었다: 퀴아젠(Qiagen)의 팍스진(PAXgene)™ 혈액 RNA 튜브 및 퀴아젠의 팍스진™ 혈액 DNA 튜브. 폐 장기를 프로세싱하여, 이러한 모델에서 폐 염증과 연관된 것으로 공지된 시토카인 발현 마커의 변화를 평가하기 위한 RT-PCR용으로 기관지폐포 세척액 (BAL) 및 폐 조직을 수득하였다. 폐의 오른쪽 상의 4개의 엽의 온전성을 보존하기 위해 편측 세척 기술을 사용하였다. 왼쪽의 "대형" 엽을 세척한 한편, 오른쪽의 4개의 엽은 묶어서 즉각적으로 트리-졸(TRI-zol)™ 내에 놓고, 균질화시키고, 추가적인 프로세싱을 위해 실험실로 보냈다.

BAL 분석. 폐 세척액을 수집하고, 4℃에서 10분 동안 600-800 g에서 원심분리하여, 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 신선한 튜브로 옮기고, -80℃에서 동결하였다. 기관지 세척액 ("BAL")을 2개의 분취량으로 분리하였다. 제1 분취량을 회전 침강시키고, 상청액을 분쇄된 드라이 아이스 상에서 급속 동결시키고, -80℃에 두고, 추가적인 프로세싱을 위해 실험실로 보냈다. 존재하는 단백질 및 LDH의 양은 각각 혈액 혈청 단백질 (이러한 단백질은 이러한 실험에서와 같이 시험된 경우에 막을 통해 누출되는 혈청 성분이다) 및 세포 사멸의 수준을 가리킨다. 특허 시험 측은 대조군보다 약간 덜한 단백질을 나타냈다.

기관지 세척액의 제2 분취량을 총 단백질 및 LDH 함량에 대해 평가하였고, 뿐만 아니라 세포학적 검사에 적용하였다. 처치군은 염수 대조군보다 더 큰 총 세포를 나타냈다. 추가로, 대조군에 비해 처치군에서 호산구가 약간 증가하였다. 또한 대조군 측에 비해 처치군에 대해 약간 상이한 다형핵 세포가 있었다.

혈액 분석. 1.2-2.0 ㎖ 혈액을 튜브 내로 옮기고 30분 이상 동안 응고되게 하여 전혈을 분석하였다. 나머지 혈액 샘플 (약 3.5-5.0 ㎖)은 트리-졸™ 또는 팍스진™을 사용하여 RNA 추출용으로 저장하였다. 이어서, 응고된 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 1200 g에서 원심분리하였다. 혈청 (상청액)을 제거하고, 2개의 신선한 튜브 내에 두고, 혈청을 -80℃에서 보관하였다.

트리-시약(Tri-Reagent) (TB-126, 몰레큘러 리서치 센터, 인크.(Molecular Research Center, Inc.))을 사용하는 RNA 추출을 위해, 0.2 ㎖의 전혈 또는 혈장을 전혈 또는 혈장 0.2 ㎖ 당 5N 아세트산 20 ㎕가 보충된 트리 시약 BD 0.75 ㎖에 첨가하였다. 튜브를 진탕시키고, -80℃에서 보관하였다. 팍스진™을 이용하여, 튜브를 약 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그 후, 튜브를 옆으로 놓고, -20℃ 냉동기에서 24시간 동안 보관한 후, 장기 보관을 위해 -80℃로 옮겼다.

루미넥스 분석. 루미넥스 플랫폼에 의해, 발광도 단위로 판독되고 정량 표준물과 비교될 수 있는 항체-관련 결합 반응에 대한 기판으로서 마이크로비드 분석을 이용하였다. 각각의 혈액 샘플은 2개의 샘플로서 동반적으로 실행되었다. 측정 단위는 발광도 단위였고, 군들을 OVA 시험된 대조군, OVA 시험된 처치군, 및 염수 시험된 처치군 + 특허 유체로 나눴다.

애질런트(Agilant) 유전자 어레이 데이터 생성을 위해, 폐 조직을 단리하고, 트리 시약 (TR118, 몰레큘러 리서치 센터, 인크.)에 함침시켰다. 간략하게, 약 1 ㎖의 트리 시약을 각각의 튜브 내의 50-100 ㎎의 조직에 첨가하였다. 글래스-테플론(glass-Teflon)™ 또는 폴리트론(Polytron)™ 균질화기를 사용하여, 샘플을 트리 시약에서 균질화시켰다. 샘플을 -80℃에서 보관하였다.

혈액 샘플:

도 2-11은 전체 혈액 샘플 평가의 결과를 도시한다.

예시적인 도 2는 혈액 샘플 데이터에 대한 기본 광도 데이터 제시 포맷을 나타낸다. 측정된 시토카인의 정체를 지정하는 문자 (이 경우 KC)는 각 데이터 도면의 상부 우측에 있다. 데이터는 개별 샘플의 데이터 점 (상부 그래프) 및 막대 그래프 (하부 그래프) 둘 다로서 제시된다. 어느 경우에서나, 그래프는 좌측에서 우측으로 4개 군으로 분할된다. 첫번째 2군 (각각 RDC1676-00 OVA 및 RDC1676-01 OVA)은 흡입에 의해 OVA로 재-시험된 것인 반면, 마지막 2군 (각각 RDC1676-00 OVA 및 RDC1676-01 OVA)은 단지 염수 대조군으로 재-시험된 것이었다. 다시, 접미사 00은 염수 처리를 나타내고, 접미사 01은 본 발명의 동전기적 유체 처리군을 나타낸다.

각각의 혈액 샘플을 2개 샘플로 분할하고, 샘플을 동시에 진행시켰다. 측정의 단위는 광도의 단위이고, 좌측에서 우측으로 진행하는 군은 OVA 시험된 대조군; OVA 시험된 본 발명의 동전기적 유체 처리군; 이어서 염수 시험된 염수 처리군; 및 염수 시험된 본 발명의 동전기적 유체 처리군이다. 검토를 용이하게 하기 위해, RDC1676-01 군 모두는 회색 음영 배경으로 강조된 반면, 대조군 염수 처리군은 비음영 배경을 갖는다.

일반적으로, 2개의 좌측 군의 비교에서, RDC1676-01 군 데이터의 스프레드가 다소 크지만, 전체로서 RDC1676-01 군에서의 특정 시토카인 수준은 대조군 처리군에서의 샘플보다 적다; 전형적으로는 2 군 사이에 약 30％ 수치 차이가 있음. 일반적으로, 최우측 2 군의 비교에서, RDC1676-01 군은 RDC1676-00 군에 비해 약간 높은 수치의 숫자를 갖는다.

도 3은 특정 예시적 측면에 따른 혈액 샘플 데이터에서의 란테스 (IL-8 수퍼 패밀리)의 분석을 도시한다. 최좌측 2 군 (OVA 시험된 군)에 대한 광도 유닛은, 일반적으로 RDC1676-01 처리군에서의 값이 상부 그래프 부분에서의 도트 플롯에 의해 도시된 바와 같이 RDC1676-00 대조군보다 작으며 다시 2 군 사이에 30-35％ 차이를 나타내는 반면, 단지 염수 노출된 군에서 시토카인 수준 값은 RDC1676-01 처리군에서 대략 동일하거나 아마도 약간 증가하였음을 나타낸다.

도 4는 특정 예시적 측면에 따른 혈액 샘플 데이터에서의 MCP-1의 분석을 도시한다. 최좌측 2 군 (OVA 시험된 군)에 대한 광도 유닛은, 일반적으로 RDC1676-01 처리군에서의 값이 상부 그래프 부분에서의 도트 플롯에 의해 도시된 바와 같이 RDC1676-00 대조군보다 작은 반면, 단지 염수 노출된 군에서 시토카인 수준 값은 RDC1676-01 처리군에서 대략 동일하거나 아마도 약간 증가하였음을 나타낸다.

도 5는 특정 예시적 측면에 따른 혈액 샘플 데이터에서의 TNF 알파의 분석을 도시한다. 최좌측 2 군 (OVA 시험된 군)에 대한 광도 유닛은, 일반적으로 RDC1676-01 처리군에서의 값이 상부 그래프 부분에서의 도트 플롯에 의해 도시된 바와 같이 RDC1676-00 대조군보다 작은 반면, 단지 염수 노출된 군에서 시토카인 수준 값은 RDC1676-01 처리군에서 대략 동일하거나 아마도 약간 증가하였음을 나타낸다.

도 6은 특정 예시적 측면에 따른 혈액 샘플 데이터에서의 MIP-1 알파의 분석을 도시한다. 최좌측 2 군 (OVA 시험된 군)에 대한 광도 유닛은, 일반적으로 RDC1676-01 처리군에서의 값이 상부 그래프 부분에서의 도트 플롯에 의해 도시된 바와 같이 RDC1676-00 대조군보다 작은 반면, 단지 염수 노출된 군에서 시토카인 수준 값은 RDC1676-01 처리군에서 대략 동일하거나 아마도 약간 증가하였음을 나타낸다.

도 7은 특정 예시적 측면에 따른 혈액 샘플 데이터에서의 IL-1 알파의 분석을 도시한다. 최좌측 2 군 (OVA 시험된 군)에 대한 광도 유닛은, 일반적으로 RDC1676-01 처리군에서의 값이 상부 그래프 부분에서의 도트 플롯에 의해 도시된 바와 같이 RDC1676-00 대조군보다 작은 반면, 단지 염수 노출된 군에서 시토카인 수준 값은 RDC1676-01 처리군에서 대략 동일하거나 아마도 약간 증가하였음을 나타낸다.

도 8은 특정 예시적 측면에 따른 혈액 샘플 데이터에서의 Vcam의 분석을 도시한다. 최좌측 2 군 (OVA 시험된 군)에 대한 광도 유닛은, 일반적으로 RDC1676-01 처리군에서의 값이 상부 그래프 부분에서의 도트 플롯에 의해 도시된 바와 같이 RDC1676-00 대조군보다 작은 반면, 단지 염수 노출된 군에서 시토카인 수준 값은 RDC1676-01 처리군에서 대략 동일하거나 아마도 약간 증가하였음을 나타낸다.

도 9는 특정 예시적 측면에 따른 혈액 샘플 데이터에서의 IL-1 베타의 분석을 도시한다. 최좌측 2 군 (OVA 시험된 군)에 대한 광도 유닛은, 일반적으로 RDC1676-01 처리군에서의 값이 상부 그래프 부분에서의 도트 플롯에 의해 도시된 바와 같이 RDC1676-00 대조군보다 작은 반면, 단지 염수 노출된 군에서 시토카인 수준 값은 RDC1676-01 처리군에서 대략 동일하거나 아마도 약간 증가하였음을 나타낸다.

도 10 및 11은 각각 특정 예시적 측면에 따른 혈액 샘플 데이터에서의 에오탁신 및 MCP-3의 분석을 도시한다. 각 경우에서, 최좌측 2 군 (OVA 시험된 군)에 대한 광도 유닛은, 일반적으로 RDC1676-01 처리군에서의 값이 상부 그래프 부분에서의 도트 플롯에 의해 도시된 바와 같이 RDC1676-00 대조군보다 작은 반면, 단지 염수 노출된 군에서 시토카인 수준 값은 RDC1676-01 처리군에서 대략 동일하거나 아마도 약간 증가하였음을 나타낸다.

기관지 세척 샘플:

도 12-21은 기관지폐포 세척 유체 (BAL) 샘플 평가의 상응하는 결과를 도시한다.

도 12는 특정 예시적 측면에 따른 BAL 데이터에서의 KC의 분석을 도시한다. 이 경우, 샘플링 가변성과 커플링된 반응 수준은 RDC1676-01-처리군과 RDC1676-00-처리군 사이의 차이에 관하여 결정적이 아니었다: 즉, KC는 2 군 사이에서 상대적으로 적은 차이를 보였으나, 광도 유닛은 매우 작았다

마찬가지로, 도 13은 특정 예시적 측면에 따른 BAL 데이터에서의 란테스의 분석을 도시하고, RDC1676-01 군에서의 현저한 가변성을 도시하는데 이때 한 판독은 다른것 보다 현저하게 높아서 결과를 왜곡한다.

마찬가지로, 도 14는 특정 예시적 측면에 따른 BAL 데이터에서의 TNF 알파의 분석을 도시하고, RDC1676-01-처리군과 RDC1676-00-처리군 사이의 차이를 통해 상대적으로 적은 유의성을 도시한다.

도 15는 특정 예시적 측면에 따른 BAL 데이터에서의 MCP-1의 분석을 도시하고, RDC1676-01-처리군과 RDC1676-00-처리군 사이의 차이를 통해 상대적으로 적은 유의성을 도시한다.

도 16 내지 도 21은 각각 특정 예시적 측면에 따른 BAL 데이터에서의 MIP1-A, IL-1 알파, Vcam, IL-1 베타, MCP-3, 및 에오탁신의 분석을 도시하고, RDC1676-01-처리군과 RDC1676-00-처리군 사이의 차이를 통해 상대적으로 적은 유의성을 도시한다.

요약하면, 공지의 감작에 대한 염증 반응의 본 표준 검정은 적어도 혈액 샘플에서 현저한 임상 및 혈청항적 영향을 낳았다. 추가로, 유의한 수의 대조군 동물이 과정 중 생리학적으로 스트레스를 받고 거의 죽은 반면, RDC1676-01 처리군은 이러한 임상 스트레스 효과를 전혀 보이지 않았다. 이는 이후 시토카인의 순환 수준에 반영되었고, 이때 RDC1676-01-처리군과 OVA 시험된 군에서의 RDC1676-01-처리군 사이에 대략 30％ 차이가 있었다. 대조적으로, RDC1676-01-처리군과 비-OVA 시험된 군에서의 RDC1676-01-처리군 사이에 시토카인, 세포 및 혈청학적 프로파일의 적은 및 적당히 유의하지 않은 변화가 존재하였으며, 이는 단지 유체 그 자체의 최소 기준의 변화를 나타내는 것 같다.

실시예 4

(본 발명의 동전기적으로 생성된 유체에 의한 주요 기관지 상피 세포 (BEC)의 처리는 기도 염증 경로의 두 핵심 단백질인 MMP9 및 TSLP의 감소된 발현 및/또는 활성을 초래하였다)

개관. 본 실시예는 동전기적 유체에 의한 염증 반응의 조정과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된, 출원인의 미국 특허 출원 공보 일련번호 제12/435,356호의 실시예 9를 기준으로 한다. 출원인은 이전에, B2 수용체에 대한 브래디키닌(Bradykinin) 결합이 농도 의존적이고, 표준 염수에 비해 본 개시의 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, Rev; 기체-강화된 동전기적으로 생성된 유체에서 결합 친화성이 증가하였음을 보여주었다. 추가로, 디젤 배기가스 미립자 물질 (PM, 표준 상업용 공급원)로 자극된 T-조절 세포와 관련하여 실시예 7에 나타낸 바와 같이, 데이터는 대조군 유체 (Rev 부재, 솔리스(Solis) 부재)에서의 PM에 비해 PM 및 Rev 존재 하에서의 T-조절 세포의 감소된 증식을 보여주었으며 (도 22), 이는 예를 들어 검정에서 비교적 감소된 증식에 의해 보여지는 바와 같이, 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 Rev가 조절 T-세포 기능을 개선시켰음을 나타낸다. 또한, 본 발명의 유체에 대한 노출은 염수 및 배지 대조군 (PM 부재)에 비해 IL-10의 생성을 유지시키거나 단지 약간 감소시켰다. 마찬가지로, 미립자 물질 (PM)에 의해 자극된 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)의 알레르기성 천식 (AA) 프로파일과 관련하여, 데이터는 본 개시의 유체 ("PM + Rev")에 대한 노출이 염수 및 배지 대조군에 대한 경우와 유사하게 훨씬 더 낮은 트립타제 수준을 생성하였음을 나타냈다. 추가로, 실시예 7 및 도 22-29에 나타낸 디프테리아 독소 (DT390, 절단된 디프테리아 독소 분자; 표준 상업용 농축액의 1:50 희석액) 효과는, 베타 차단, GPCR 차단 및 Ca 채널 차단이 Treg 및 PBMC 기능에 대한 동전기적으로 생성된 유체의 활성에 영향을 미침을 나타낸다. 또한, 출원인의 이전 데이터는, 추가의 측면에 따라 본 발명의 유체에 대한 노출시 밀착 연접(tight junction) 관련 단백질이 폐 조직에서 상향조절되었음을 보여준다. 데이터는 각각 연접 접착 분자 JAM 2 및 3, GJA1, 3, 4 및 5 (정셔널 애드헤린(junctional adherin)), OCLN (오클루딘(occludin)), 클라우딘(claudin) (예를 들어, CLDN 3, 5, 7, 8, 9, 10), TJP1 (밀착 연접 단백질 1)의 상향조절을 나타낸다. 또한, 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, RNS-60)는 기관지 상피 세포 (BEC; 예를 들어, Calu-3)에서 전체 세포 전도도 (예를 들어, 과분극 조건 하)의 조정에 영향을 미치며, 추가의 측면에 따르면 전체 세포 전도도의 조정이 이온 채널의 조정을 반영한다.

본 실시예에서, 출원인은 기도 염증 경로의 두 핵심 단백질의 생성 효과를 측정하기 위한 추가의 실험을 수행함으로써 이들 발견을 확대시켰다. 구체적으로, MMP9 및 TSLP를 주요 기관지 상피 세포 (BEC)에서 검정하였다.

물질 및 방법:

시판용 주요 인간 기관지 상피 세포 (BEC) (독일 프로모셀(Promocell)로부터의 HBEpC-c)를 이들 연구에 사용하였다. 대략 50,000개의 세포를 그들이 ~80％ 전면성장(confluence)에 도달할 때까지 12개 웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 이어서, 세포를 디젤 배기가스 미립자 물질 (DEP 또는 PM)과 함께 표준 염수, 대조군 유체 솔라스(Solas) 또는 1:10 희석액 (기도 상피 성장 배지 1 ml 중 100 ul)의 시험 유체 레베라(Revera) 60으로 6시간 동안 처리한 후 FACS 분석을 위해 들어올렸다. MMP9 및 TSLP 수용체 항체 모두를 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)로부터 획득하고 제조자 설명서에 따라 사용하였다.

결과:

출원인은 시험 물질 레베라 60이 기관지 상피 세포 (BEC)에서 DEP 유도된 TSLP 수용체 발현을 대략 90％로 감소시킴을 보여준다. 솔라스는 TSLP 수용체 발현에서 55％ 감소를 나타낸 반면, 표준 염수는 TSLP 수용체 발현에서 유사한 감소 수준을 나타내지 못했다 (대략 20％ 감소). TSLP 수용체 발현의 감소에 있어서 본 발명 용액의 효과는, TSLP가 알레르기성 천식의 병리생물학 및 TSLP 수용체 기능 완화된 알레르기성 질환의 국소 항체 매개된 차단에 있어서 중요한 역할을 함을 보여주는 최근의 발견에 비추어 유의한 발견이다 (문헌 [Liu, YJ, Thymic stromal lymphopoietin: Master switch for allergic inflammation, J Exp Med 203:269-273, 2006]; [Al-Shami et al., A role for TSLP in the 발달 of inflammation in an asthma model, J Exp Med 202:829-839, 2005]; 및 [Shi et al., Local blockade of TSLP receptor alleviated allergic disease by regulating airway dendritic cells, Clin Immunol. 2008, Aug 29. (Epub ahead of print)]).

마찬가지로, 도 39는 MMP 9에서 DEP-매개된 증가에 대한 레베라 60, 솔라스 및 표준 염수의 효과를 도시한다. 구체적으로, 레베라 60은 기관지 상피 세포에서 DEP-유도된 세포 표면 결합된 MMP9 수준을 대략 80％ 억제하였고, 솔라스는 대략 70％의 억제 효과를 나타낸 반면, 표준 염수 (NS)는 약 20％ 감소의 한계 효과를 나타냈다. MMP-9는 기도 염증 및 천식에서의 기관지 리모델링에 관여하는 주요 프로테이나제 중 하나이다. 최근에, MMP-9의 수준은 건강한 대조군 대상체에 비해, 안정한 천식을 갖는 환자에서 유의하게 증가하고, 급성 천식 환자에서 훨씬 더 높음이 입증되었다. MMP-9는 기도 염증 세포의 침투에 중요한 역할을 하고, 기도 과반응성의 유도는 MMP-9가 천식을 유도 및 유지하는데 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다 (문헌 [Vignola et al., Sputum metalloproteinase-9/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratio correlates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis, Am J Respir Crit Care Med 158:1945-1950, 1998]; [Hoshino et al., Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagen deposition by modulation of the balance between matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in asthma, J Allergy Clin Immunol 104:356-363, 1999]; [Simpson et al., Differential proteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma, Am J Respir Crit Care Med 172:559-565,2005]; [Lee et al., A murine model of toluene diisocyanate-induced asthma can be treated with matrix metalloproteinase inhibitor, J Allergy Clin Immunol 108:1021-1026, 2001]; 및 [Lee et al., Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cell migration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murine model of toluene diisocyanate-induced asthma, J Allergy Clin Immunol 2003;111:1278-1284]).

따라서, 추가의 측면에 따라, 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체는 예를 들어 염증 및 천식의 치료를 비롯한, TSLP 수용체 발현의 조절 (예를 들어, 감소) 및/또는 MMP-9의 발현 및/또는 활성의 억제에 대한 실질적인 치료적 유용성을 갖는다.

실시예 5

(본 발명의 동전기적으로 생성된 유체는 알레르기성 천식에 대한 당업계-공인 동물 모델에서 부데소니드(Budesonide)에 의한 상증작용적 항-염증 효과를 갖는 것으로 보였다)

본 실시예는 천식 모델의 문맥에서 동전기적 유체에 의한 염증 반응의 조정과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된, 출원인의 미국 특허 출원 공보 일련번호 제12/435,356호의 실시예 10을 기준으로 한다. 본 실시예는 브라운 노르웨이 래트 오브알부민 감작 모델에서 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, RDC-1676-03)의 기도 항-염증 성질을 평가하기 위해 수행된 실험을 기재한다. 브라운 노르웨이 래트는 기도 기능에 대한 시험 물질의 효과를 결정하기 위한 당업계-공인 모델이고, 이 품종은 예를 들어 알레르기성 천식의 모델로서 폭넓게 사용되어 왔다. 본 모델에서 오브알부민 감작에 의해 유도된 기도 병리학 및 생화학적 변화는 인간에서 관찰된 것과 닯았다 (문헌 [Elwood et al., J Allergy Clin Immuno 88:951-60, 1991]; [Sirois & Bissonnette, Clin Exp Immunol 126:9-15, 2001]). 흡입 경로는 시험 물질 또는 대조군 용액에 대한 폐 노출을 최대화하기 위해 선택하였다. 오브알부민-감작 동물은 오브알부민 시험 전 7일 동안 부데소니드 단독으로 처리하거나 시험 물질 RDC 1676-03과 조합하여 처리하였다. 시험 후 6 및 24시간에, 여러 전-염증성 및 항-염증성 시토카인의 총 혈액 수 및 수준 뿐만 아니라 다양한 호흡 파라미터를 측정하여 다양한 염증 파라미터에 대한 시험 물질 투여의 임의의 유익한 효과를 평가하였다.

물질 및 방법:

실험 착수시 체중이 대략 275±50g인 품종 Bn/Crl의 브라운 노르웨이 래트를 찰스 리버 킹스톤(Charles River Kingston)으로부터 획득하였다. 모든 동물 연구를 PCS-MTL 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의한 승인으로 수행하였다. 연구 동안, 동물의 사용 및 관리는 미국 국립 연구 회의 (USA National Research Council) 뿐만 아니라 캐나다 동물 관리 회의 (Canadian Council of Animal Care)의 지침에 따라 수행하였다.

감작. 실험 1일차에, 동물 (각 처리군에서 14 마리 동물)을 0.9％ 염화나트륨 1 ml 당 2 mg 오브알부민/100 mg 수산화알루미늄의 새로 제조된 용액의 1 ml 복강내 주사를 투여하여 감작한 후, 3일차에 주사를 반복하였다.

처리. 초기 감작 후 15일차에, 동물을 연속 7일간 15분 동안 매일 1회 단독으로 또는 부데소니드와 조합으로 투여된 대조군 (표준 염수) 또는 시험 용액 (동전기적으로 생성된 유체 RDC1676-00, RDC1676-02 및 RDC-1676-03)에 대해 분무 노출에 제공하였다. 동물을 대략 20L의 전체 바디 챔버에서 투여하고, 벅스코(Buxco) 사선 유동 펌프로부터 공기가 공급되는 에어로넵 초음파 분무기를 사용하여 챔버 공기 유입구 내로 시험 분위기를 생성하였다. 공기유동 속도는 10 리터/분으로 설정하였다.

오브알부민 시험. 21일 차, 시험 용액으로의 처리 후 2시간에, 모든 동물을 15분 동안 1％ 오브알부민 분무된 용액으로 시험하였다 (공기유동 2 L/분의 전체 바디 챔버에서).

샘플 수집. 오브알부민 시험 후 6 및 24시간의 시점에, 혈액 샘플을 총 및 차별 혈액 세포 계수를 위해서 뿐만 아니라 다양한 전-염증성 및 항-염증성 시토카인의 수준을 측정하기 위해서 수집하였다. 또한, 오브알부민 시험 직후 및 6 및 24시간 후에, 벅스코 일렉트로닉스 바이오시스템 XA 시스템(Buxco Electronics BioSystem XA system)을 사용하여 10분의 기간 동안 향상된 중지 펜(Penh) 및 호흡(tidal) 부피를 측정하였다.

결과:

호산구 수: 예상된 바와 같이, 그리고 도 35에 도시된 바와 같이, 부데소니드에 의한 처리 ("NS + 부데소니드 750 μg/Kg"; 치밀하게 그물눈음영이 있는 막대 그래프)는 표준 염수 "NS" 단독 대조군에 의한 처리 (개방형 막대 그래프)에 비해 시험된 동물에서 총 호산구 수를 감소시켰다. 추가로, 본 발명의 유체 "RDC1676-03" 단독에 의한 처리 (옅게 그물눈음영이 있는 막대 그래프)가 호산구 수를 유의하게 감소시키지 않았지만, 그럼에도 불구하고 호산구 수를 감소하는데 있어서 부데소니드와 실질적인 상승작용을 나타냈다 ("RDC1676-03 + 부데소니드 750 μg/Kg", 솔리드 짙은 막대 그래프). 유사하게, 도 36에서, 호산구 ％는 또한 유사한 경향을 반영하였다. RDC1676-03 (옅게 그물눈음영이 있는 막대 그래프) 또는 부데소니드 750 ug/kg (치밀하게 그물눈음영이 있는 막대 그래프) 단독은 시험된 동물에서 호산구 ％ 수에 대한 유의한 효과를 나타내지 않았지만, 둘의 조합은 호산구 ％를 유의하게 감소시켰다 (솔리드 짙은 막대 그래프).

따라서, 도 35 및 36은, 본 발명의 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, RDC1676-03)가 인간 알레르기성 천식을 위한 당업계-공인 래트 모델에서 호산구 수 ("호산구 ％" 및 총 수)를 유의하게 감소시키기 위해 부데소니드와 조합되어 실질적인 상증작용적 유용성을 갖는 것으로 입증되었음을 보여준다.

호흡성 파라미터:

출원인은 오브알부민 시험 직후, 6 및 24시간 후에 측정된 바와 같이 펜 및 호흡 부피에 대한 시험 유체의 관찰된 효과를 입증한다. 펜은 피크 흡기성 유동, 피크 호기성 유동 및 호기 시간으로부터 수득된 유도 값이고, 펜 값의 저하는 폐 기능에 대한 바람직한 결과를 반영한다.

펜 = (피크 호기성 유동/피크 흡기성 유동) * (호기 시간/호기성 부피의 65％를 내쉬는 시간 - 1).

부데소니드 (500 및 750 ug/kg 둘 다) 단독 또는 임의의 시험 유체와의 조합에 의한 처리는 시험 직후 펜 값에 유의하게 영향을 미치지 못했다. 그러나, 시험 6시간 후, RDC1676-03 단독 또는 부데소니드 500 또는 750 ug/kg과의 조합으로 처리된 동물은 펜 값의 유의한 하락을 나타냈다. 이 하락의 정도가 시험 후 24시간에 감소되었지만, 부데소니드 및 RDC 유체의 상승작용적 효과의 경향은 이 시점에서 여전히 관찰되었다.

호흡 부피는 말단-호기성 위치로부터 흡기 동안 폐로 유입되며, 온화한 호흡의 과정 중 흡기 동안 수동적으로 폐에서 떠나는 공기의 부피이다. 부데소니드 단독으로 처리된 동물은 시험 직후에 호흡 부피의 변화를 나타내지 않았다. 그러나, RDC1676-03 단독은 이러한 초기 시점에서조차 호흡 부피에 대한 유의한 자극 효과를 나타냈다. 그리고 다시, 부데소니드 (500 및 750 ug/kg 둘 다)와 조합된 RDC1676-03은 이 시점에서 호흡 부피 측정에 대해 훨씬 더 뚜렷한 효과를 나타냈다. 시험 후 6시간에, RDC1676-03 단독은 호흡 부피의 유의한 증가를 야기하는데 충분하였고, 치료 계획에 단독으로 또는 조합으로 부데소니드를 첨가하는 것은 호흡 부피에 대한 부가 효과를 나타내지 않았다. 그러나, 이들 초기 시점에서 관찰된 임의의 효과는 24시간 시점에서 상실되었다.

이들 데이터는 함께 취해져서, RDC1676-03 단독 또는 부데소니드와 조합된 RDC1676-03은 시험 후 6시간에 호흡 부피의 증가 및 펜 값의 감소에 의해 입증된 바와 같이 기도 염증에 대한 유의한 경감을 제공하였음을 입증한다.

시토카인 분석:

상기 논의된 생리학적 파라미터에 대해 보여진 효과의 메카니즘을 분석하기 위해, 시험 후 6 및 24시간, 생리학적 측정 직후에 수집된 혈액 샘플에서 다수의 전-염증성 시토카인 뿐만 아니라 항-염증성 시토카인을 측정하였다.

도 37A 및 37B는 Rev 60 (또는 RDC1676-03) 단독이 에오탁신의 혈액 수준을 시험 후 6 및 24시간 둘 다에서 유의하게 저하시켰음을 명확히 입증한다. 부데소니드 750 ug/kg은 또한 이들 시점 둘 다에서 혈액 에오탁신 수준을 감소시킨 반면, 부데소니드 250 ug/kg은 단지 나중의 시점에서 주목할 만한 효과를 나타냈다. 그러나, 시험 용액 Rev 60 단독은 두 시점에서 (혈액 에오탁신 수준의 감소에 있어서) 두 농도의 부데소니드보다 훨씬 더 효능있는 효과를 보여주었다. 에오탁신은 천식성 폐 및 알레르기 반응이 있는 다른 조직 (예를 들어, 크론병의 창자)에 호산구를 축적시키고 유인시키는 것으로 알려진 소형 C-C 케모카인이다. 에오탁신은 G 단백질 커플링된 수용체 CCR3에 결합한다. CCR3는 다수의 세포 유형, 예컨대 Th2 림프구, 호염기성 세포 및 비만 세포에 의해 발현되지만, Th2 림프구에 의한 이 수용체의 발현은 이들 세포가 호산구 동원을 조절하기 때문에 특히 관심대상이 된다. 여러 연구는 천식성 폐에서 에오탁신 및 CCR3의 생성 증가를 입증하였을 뿐만 아니라 이들 분자와 기도 과반응성 사이의 관련성을 확립하였다 (문헌 [Eotaxin and the attraction of eosinophils to the asthmatic lung," Dolores M Conroy and Timothy J Williams Respiratory Research 2001, 2:150-156]에서 검토됨). 이들 연구가 호산구 수에 대한 도 35 및 36에서의 결과에 완전히 동의함을 주목한다는 것이 특히 관심대상이다.

이들 연구는 함께 취해져서, RDC1676-03 단독 또는 부데소니드와 조합된 RDC1676-03이 오브알부민 시험 후 24시간에 혈액 중 호산구 총 수 및 ％를 유의하게 감소시킬 수 있음을 강하게 나타낸다. 이는 시험 후 6시간 만큼 빨리 관찰된 혈액 중 에오탁신 수준의 유의한 하락과 상관관계가 있다.

2개의 주요 핵심 항-염증성 시토카인인 IL10 및 인터페론 감마의 혈액 수준은 또한 Rev 60 단독 또는 부데소니드와의 조합 처리의 결과로서 시험 후 6시간에 유의하게 상승한다. 도 37C 및 37D는 각각 인터페론 감마 및 IL 10에 대한 상기 효과를 도시한다. 이들 도면으로부터, Rev 60 단독 또는 부데소니드 250 ug/kg와 조합된 Rev 60은 시험 후 6시간까지 시험된 동물에서 IL10의 혈액 수준을 유의하게 증가시켰음이 입증된다. 유사하게, Rev 60 단독 또는 부데소니드 250 또는 750 ug/kg와 조합된 Rev 60은 시험 후 6시간에 IFN 감마의 혈액 수준을 유의하게 증가시켰다. 이들 항-염증성 시토카인의 증가는, 적어도 부분적으로는, 시험 후 6시간에 나타난 생리학적 호흡성 파라미터에 대해 보여진 유익한 효과를 잘 설명할 수 있다. 이들 시토카인에 대한 효과는 시험 후 24시간에는 더 이상 관찰되지 않았다 (데이터는 도시되지 않음).

란테스 또는 CCL5는 순환 T 세포에 의해 발현된 시토카인이고, T 세포, 호산구 및 호염기성 세포에 대해 화학주성이며, 염증성 부위로 백혈구를 동원하는데 능동적인 역할을 한다. 란테스는 또한 호산구가 예를 들어 호산구 양이온성 단백질을 방출하도록 활성화시킨다. 그는 호산구의 밀도를 변화시키고 그들을 저밀도로 만드는데, 이는 일반화된 세포 활성화의 상태를 나타내는 것으로 생각된다. 또한, 그는 호산구에 특이적인 산화적 대사의 효능있는 활성화제이다.

도 38에 도시된 바와 같이, 란테스의 전신적 수준은 Rev 60 단독 또는 부데소니드 250 또는 750 ug/kg와의 조합 처리된 동물에서 시험 후 6시간에는 유의하게 감소하였으나 24시간에는 감소하지 않았다. 다시 한번, 부데소니드 750 ug/kg과 Rev 60의 명확한 상승작용적 효과가 존재하며 이 데이터 세트에서 주목된다. 유사한 하향 경향은 다수의 다른 전-염증성 시토카인, 예컨대 KC 또는 IL8, MCP3, IL1b, GCSF, TGFb 뿐만 아니라 NGF에 대해 관찰되었으며, Rev 60 단독 또는 부데소니드와의 조합 처리된 동물에서 시험 후 6 또는 24시간에서 관찰되었다.

실시예 6

(본 발명의 치료적 유체는 일산화 질소 수준을 조정하는데 실질적인 유용성을 갖는다)

본 실시예는 동전기적 유체에 의한 일산화 질소 수준의 조정과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된, 출원인의 미국 특허 출원 공보 일련번호 제12/435,356호의 실시예 12를 기준으로 한다. 특정 측면에 따라, 본 발명의 확산기 처리된 치료적 유체는 일산화 질소 수준 및/또는 관련 효소를 조정하는데 실질적인 유용성을 갖는다. 도 30 내지 34는 NOS1 및 3, 및 노스트린(Nostrin), NOS3를 도시하는 RDC1676-01 (추가의 산소가 부가된 본 특허 장치를 통해 처리된 멸균 염수; 본 개시의 기체-강화된 동전기적으로 생성된 유체 (Rev))에 노출된 인간 포피 케라틴형성 세포로부터 수득한 데이터를 도시한다. 대조적으로, 래트 폐 조직 ("시토카인 발현"이라는 제목의 상기 실시예의 조직)으로부터 얻은 데이터는 Rev 존재 하에 NOS2 및 3, 노스트린 및 NOS1AP의 하향 조절을 도시한다 (도 33 및 34).

실시예 7

(조절성 T-세포 검정을 사용하여 조절성 T-세포 검정에서의 T-세포 증식 및 시토카인 (Il-10) 및 기타 단백질 (예를 들어, GITR, 그랜자임(Granzyme) A, XCL1, pStat5, 및 Foxp3))의 동화, 예를 들어, PBMC 내의 트립타제(tryptase)의 조정에서의 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체의 효과를 나타냈다)

본 실시예는 동전기적 유체에 의한 염증의 조정과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된, 출원인의 미국 특허 출원 공보 일련번호 제12/435,356호의 실시예 8을 기준으로 한다. 항원 제시 세포에 방사선을 조사하고 항원 및 T 세포를 도입하는 것에 의해 T 세포를 조절하는 본원에 개시된 특정 실시양태의 능력을 연구하였다. 전형적으로, 이러한 자극된 T 세포들은 증식한다. 그러나, 조절성 T 세포의 도입시, 일반적인 T 세포 증식은 억제된다.

방법:

간략하게, 분류에서 사용된 FITC-접합 항-CD25 (ACT-1) 항체를 다코사이토메이션(DakoCytomation) (일리노이주 시카고)에서 구입하였다. 사용된 기타 항체들은 하기와 같았다: CD3 (가용성 상태에 대한 HIT3a), GITR (PE-접합), CD4 (Cy-5 및 FITC-접합), CD25 (APC-접합), CD28 (CD28.2 클론), CD127-APC, 그랜자임 A (PE-접합), FoxP3 (바이오레전드(BioLegend)), 마우스 IgG1 (이소형 대조군), 및 XCL1 항체. 모든 항체를 제조사의 설명서에 따라 사용하였다.

CD4+ T 세포를 말초 전혈로부터 CD4+ 로제트 키트(Rosette Kit) (스템셀 테크놀러지즈(Stemcell Technologies))로 단리하였다. CD4+ T 세포를 항-CD127-APC, 항-CD25-PE 및 항-CD4-FITC 항체와 함께 인큐베이션하였다. FACS 아리아(Aria)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 세포를 CD4+CD25hiCD127lo/nTreg 및 CD4+CD25- 반응체 T 세포로 분류하였다.

둥근바닥 96웰 미량역가 플레이트에서 억제 검정을 수행하였다. 3.75×10³개의 CD4+CD25neg 반응체 T 세포, 3.75×10³개의 자가 T reg, 3.75×10⁴개의 방사선 조사된 동종 CD3-고갈 PBMC를 지시된 바와 같이 첨가하였다. 모든 웰에 항-CD3 (5.0 ㎍/㎖의 클론 HIT3a)을 보충하였다. T 세포를 10％ 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 7일 동안 37℃에서 배양하였다. 인큐베이션을 끝내기 16시간 전에, 1.0 mCi의 ³H-티미딘을 각각의 웰에 첨가하였다. 톰텍(Tomtec) 세포 수거기를 사용하여 플레이트를 수거하고, 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 섬광 계수기를 사용하여 ³H-티미딘 혼입을 측정하였다. 항원 제시 세포 (APC)는 스템셉(StemSep) 인간 CD3+ T 세포 고갈 (스템셀 테크놀러지즈)에 이어지는 40 Gy의 방사선 조사를 사용하여 T 세포가 고갈된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로 이루어졌다.

조절성 T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 조건으로 자극한 후, 라이브/데드 레드(Live/Dead Red) 생존력 염료 (인비트로젠((Invitrogen)), 및 표면 마커 CD4, CD25 및 CD127로 염색하였다. 세포를 라이즈/픽스 포스플로우(Lyze/Fix PhosFlow)™ 완충제에서 고정시키고, 변성 펌버퍼(Permbuffer) III?에서 투과성이게 만들었었다. 그 후, 세포를 각각의 특정한 선택된 분자에 대한 항체로 염색하였다.

III?

그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 양측성(two-tailed) 비대응(unpaired) 스튜던트 t-시험을 사용하여 2개의 군을 비교하였다. 3개의 군 간의 비교는 1원 ANOVA를 사용하여 행하였다. 0.05 미만의 P 값을 유의한 것으로 간주하였다 (양측성). r 값이 0.7 초과 또는 -0.7 미만이면 스피어만(Spearman) 상관계수를 통해 2개의 군 간의 상관 관계를 통계적으로 유의한 것으로 결정하였다 (양측성).

결과:

도 22에 나타낸 바와 같이, 조절 T 세포 증식은 세포를 디젤 배기가스 미립자 물질 (PM, EPA로부터)로 자극시킴으로써 연구하였다. 도 22의 x-축은 솔리드 흑색 막대로서 활성화된 자가 CD4+ 이펙터 T 세포 (반응체 세포) 및 회색 막대의 조절 T 세포 단독 (에너지의 확인을 위해 나타냄)을 도시하며, 이들은 백색 막대에 도시된 바와 같이 1:1 비율로 혼합되었다. y 축은 ³H-티미딘의 흡수에 의해 측정된 증식을 도시한다. x-축을 따라 좌측에서 우측으로 도시된 바와 같이, "PM"은 디젤 배기가스 유래된 미립자 물질을 나타내고, "PM + Rev"은 PM과 본 개시의 기체-강화된 동전기적으로 생성된 유체 (Rev)를 나타내고, "Solis"는 본 개시의 동전기적으로 생성된 유체 및 단지 주변 분위기를 넘어서 기체-강화되지 않은 장치 (PM이 첨가되지 않음)를 나타내고, "Rev"는 상기 정의되 바와 같은 Rev 단독 (PM이 첨가되지 않음)을 나타내고, "Media"는 세포 성장 배지 단독 대조군 (PM 제외; Rev 부재, 솔리스 부재)을 나타내고, "Saline Con"은 염수 대조군 (PM 제외; Rev 부재, 솔리스 부재)을 나타내고, "V"는 베라파밀을 나타내고, "P"는 프로파놀롤을 나타내고, "DT"는 1:50의 DT390이다.

도 23에 도시된 바와 같이, PM (Rev 부재, 솔리스 부재)으로 자극된 세포는 분비된 IL-10의 감소를 초래한 반면, 본 개시 유체의 존재 하의 PM ("PM + Rev")에 노출된 세포는 염수 및 배지 대조군 (PM 부재)에 비해 IL-10의 생성이 유지되거나 단지 약간 감소하였다. 또한, 디프테리아 독소 (DT390, 절단된 디프테리아 독소 분자; 표준 상업용 농축액의 1:50 희석액)는 본 발명의 유체 샘플 내로 적정되었고, 도 23에서 IL-10 증가의 Rev-매개된 효과를 차단하였다. Rev 단독으로의 처리는 염수 및 배지 대조군에 비해 더 높으 IL-10 수준을 초래하였다.

마찬가지로, 도 24 내지 28에 도시된 유사한 결과는 각각 GITR, 그랜자임(Granzyme) A, XCL1, pStat5, 및 Foxp3에 의해 수득되었다. 도면에서, "NSC"는 "솔리스"와 동일하다 (PM 부재).

도 29는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC) 평가 트립타제의 알레르기성 천식 (AA) 프로파일로부터 얻은 AA PBMC 데이터를 도시한다. AA PBMC 데이터는 상기 T-조절 세포 데이터와 일치하였으며, 미립자 물질 (PM)에 의해 자극된 세포가 높은 수준의 트립타제를 나타낸 반면 본 개시 유체의 존재 하의 PM ("PM + Rev")으로 처리된 세포는 염수 및 배지 대조군의 경우와 유사하게 훨씬 더 낮은 트립타제 수준을 초래하였다. T-조절 세포로부터의 데이터와 일치하게, DT390에 대한 노출은 트립타제 수준에 대한 Rev-매개된 효과를 차단하여, PM 단독 (Rev 제외, Rev 부재, 솔리스 부재)에 대해 보여진 바와 같이 세포에서의 트립타제 수준의 증가를 초래하였다. Rev 단독으로의 처리는 염수 및 배지 대조군에 비해 더 낮은 트립타제 수준을 초래하였음을 주목한다.

요약하면, 도 22의 데이터는 대조군 유체 (Rev 부재, 솔리스 부재) 내의 PM에 비해 PM 및 Rev의 존재 하에 감소된 증식을 나타냈고, 이는 이러한 검정에서의 상대적으로 감소된 증식에 의해 제시된 바와 같이 본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 Rev가 조절성 T-세포 기능을 개선시켰음을 시사한다. 또한, 본 실시예 및 도 22 내지 29의 증거는 베타 차단, GPCR 차단 및 Ca 채널 차단이 Treg 기능에 대한 레베라의 활성에 영향을 미친다는 것을 가리킨다.

실시예 8

(RNS-60은 세포 표면 수용체: CD193 (CCR3); CD154 (CD40L); CD11B; 및 CD3의 발현에 대한 뚜렷한 효과를 나타내기 위해 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석에 의해 나타내었다)

개관. 출원인은 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60) 또는 표준 염수 대조군 유체와 함께 인큐베이션된 백혈구 세포 상에서, 세포 표면 수용체 CD193 (CCR3); CD154 (CD40L); CD11B; 및 CD3의 발현 수준을 비교하기 위해, 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 분석을 사용하였다.

방법:

피콜-하이팩(Ficoll-hypaque) 분리된 PBMC (혈액성분채집술(apheresis) - 모든 세포)를 30％ 용액의 RNS60 또는 표준 염수 (NS) 중에서 대략 1시간 예비인큐베이션하였다;

PBMC를 24 또는 40시간 동안 2 μg/ml의 PHA-L로 활성화시켰다;

세포를 수집하고, 차단/착색 완충액 내로 세척하고, 착색시키고, 고정시켰다; 그리고

세포를 유세포분석기에 의해 분석하였다.

결과:

CD193 (CCR3)에 대하여, 도 40B에 도시된 바와 같이, 수용체는 표준 염수 대조군에서의 수용체 발현 수준과 비교시 RNS-60의 존재 하에 실질적으로 하향-조절된다. 이러한 하향 조절은 MAPK p38의 인산화 (데이터는 도시되지 않음)에 영향을 미치며, 이어서 에오탁신을 하향-조절하고 (예를 들어, 실시예 3 및 도 10 참조), 이어서 IL 5를 하향 조절할 뿐만 아니라 (데이터는 도시되지 않음), 호산구 수를 변경시키며 (예를 들어, 실시예 3 참조), 그 예는 기관지수축 반응을 변경시키는 인자 중 하나이다.

오브알부민 시험 모델과 관련하여 상기 실시예 3에서 논의된 바와 같이, 그리고 도 10에 도시된 바와 같이, RNS-60은 표준 염수의 효과와 비교시 OVA 시험된 군에서의 혈청 에오탁신 수준을 감소시켰다. 따라서, 특정 측면에 따라, RNS-60은 리간드 에오탁신 및 그의 수용체 CCR3 둘 다를 감소시키는 잠재력을 갖는다.

CD154 (CD40L)에 대하여, 도 41A에 도시된 바와 같이, 수용체는 표준 염수에서의 수용체 발현의 수준과 비교시 RNS-60의 존재 하에 하향 조절된다.

CD11B에 대하여, 도 41B에 도시된 바와 같이, 수용체는 표준 염수에서의 수용체 발현의 수준과 비교시 RNS-60의 존재 하에 하향 조절된다.

CD3에 대하여, 도 41C에 도시된 바와 같이, 수용체는 표준 염수에서의 수용체 발현의 수준과 비교시 RNS-60의 존재 하에 하향 조절된다.

실시예 9

(RNS60은 MBP-프라이밍된 T 세포에서 NFκB의 활성화를 약화시켰지만 표준 염수 (NS)는 약화시키지 않았다)

개관:

인슐린 수용체 신호전달 경로의 억제는 염증 및 스트레스 반응이 인슐린 저항성을 매개하는 중심 메카니즘이라는 것은 점점 분명해지고 있다 (예를 들어, 문헌 [Wellen & Hotamisligil, The Journal of Clinical Investigation, 115:1111-1119, 2005]에 의한 검토 참조).

대사 및 면역 경로의 중복. 여러 세린/트레오닌 키나제는 염증성 또는 스트레스성 자극에 의해 활성화되며, JNK, NF-κB 키나제의 억제제 (IKK), 및 PKC-θ를 비롯한 인슐린 신호전달의 억제에 기여한다 (문헌 [Zick,Y. 2003. Role of Ser/Thr kinases in the uncoupling of insulin signaling. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 27(Suppl. 3):S56-S60]). 다시, 비만에서 이들 키나제의 활성화는 대사 및 면역 경로의 중복을 강조한다; 이들은 LPS, 펩티도글리칸, 이중가닥 RNA 및 다른 미생물 생성물에 대한 반응에 있어서 톨(Toll)-유사 수용에 (TLR) 신호전달에 의한 내재적 면역 반응에서 활성화된 동일한 키나제, 특히 IKK 및 JNK이다 (문헌 [Medzhitov, R. 2001. Toll-like receptors and innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 1:135-145]). 그러므로, TLR 신호전달 경로의 성분은 또한 강한 대사 활성을 나타낼 것이다.

PKC 및 IKK는 세포 지질 대사에 의해 활성화된다. 인슐린 작용을 반작용시키는데, 특히 지질 대한 반응에서 큰 역할을 하는 2개의 다른 염증성 키나제는 IKK 및 PKC-θ이다. 지질 주입은 세포내 지방산 대사물질, 예컨대 디아실글리세롤 (DAG) 및 지방 아실 CoA의 수준 증가를 유도하는 것으로 입증되었다. 이러한 증가는 PKC-θ의 활성화 및 IRS-1의 증가된 Ser307 인산화와 상관관계가 있다 (문헌 [Yu, C., et al. 2002. Mechanism by which fatty acids inhibit insulin activation of insulin receptor substrate-1 (IRS-1)-associated phosphatidylinositol 3-kinase activity in muscle. J. Biol. Chem. 277:50230-50236]). PKC-θ는 또다른 세린/트레오닌 키나제 IKKβ 또는 JNK의 활성화에 의해 인슐린 작용을 방해할 수 있다 (문헌 [Perseghin, G., Petersen, K., and Shulman, G.I. 2003. Cellular mechanism of insulin resistance: potential links with inflammation. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 27(Suppl. 3):S6-S11]). 따른 PKC 이소형은 또한 지질에 의해 활성화되는 것으로 보고되었으며, 또한 인슐린 신호전달의 억제에 참여할 수 있다 (문헌 [Schmitz-Peiffer, C. 2002. Protein kinase C and lipid-induced insulin resistance in skeletal muscle. Ann. N. Y. Acad. Sci. 967:146-157]).

IKKβ는 NF-κB를 활성화시킴으로써 인슐린 신호전달에 영향을 줄 수 있다. IKKβ는 적어도 2개의 경로를 통해 인슐린 신호전달에 영향을 줄 수 있다. 첫번째로, 세린 잔기 상의 IRS-1을 직접 인산화시킬 수 있다 (문헌 [Yin, M.J., Yamamoto, Y., and Gaynor, R.B. 1998. The anti-inflammatory agents aspirin and salicylate inhibit the activity of IκB kinase-β. Nature. 396:77-80, Gao, Z., et al. 2002. Serine phosphorylation of insulin receptor substrate 1 by inhibitor kappa B kinase complex. J. Biol. Chem. 277:48115-48121]).

두번째로, NF-κB의 억제제 (IκB)를 인산화시켜, 다른 표적보다도 TNF-α 및 IL-6을 비롯한 다수의 염증성 매개자의 생성을 자극하는 전사 인자인 NF-κB를 활성화시킬 수 있다 (문헌 [Shoelson, S.E., Lee, J., and Yuan, M. 2003. Inflammation and the IKKβ/IκB/NF-κB axis in obesity- and diet-induced insulin resistance. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 27(Suppl. 3):S49-S52]). IKKβ에 대한 마우스 이형접합체는 지질 주입, 고-지방 식이 또는 유전적 비만으로 인한 인슐린 저항성에 대해 부분적으로 보호된다 (문헌 [Yuan, M., et al. 2001. Reversal of obesity- and diet induced insulin resistance with salicylates or targeted disruption of IKKβ Science. 293:1673-1677; Kim, J.K., et al. 2001. Prevention of fat-induced insulin resistance by salicylate. J. Clin. Invest. 108:437-446; doi:10.1172/JCI200111559]).

또한, 인간 당뇨병에서 고용량 아스피린 처리에 의한 IKKβ의 억제도 인슐린 신호전달을 개선시키지만, 이 용량에서 다른 키나제도 영향을 받는지 여부는 명확하지 않다 (문헌 [Hundal, R.S., et al. 2002. Mechanism by which high-dose aspirin improves glucose metabolism in type 2 당뇨병. J. Clin. Invest. 109:1321-1326. doi:10.1172/JCI200214955]). 최근의 연구는 또한 인슐린 저항성의 발달에 대한 개별 조직 또는 세포 유형에서의 IKK의 중요성을 밝히기 시작했다. 간 및 골수 세포에서의 IKK의 활성화는 비만-유도된 인슐린 저항성에 기여하는 것처럼 보이지만, 이 경로는 근육에서만큼 중요하지 않을 수 있다 (문헌 [Cai, D., et al. 2005. Local and systemic insulin resistance resulting from hepatic activation of IKKβ and NF-κB. Nat. Med. 11:183-190]; [Arkan, M.C., et al. 2005. IKKβ links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11:191-198]; 및 [Rohl, M., et al. 2004. Conditional disruption of IκB kinase 2 fails to prevent obesity-induced insulin resistance. J. Clin. Invest. 113:474-481; doi:10.1172/JCI200418712]).

방법. 도 42A 및 42B에 도시된 실험의 경우, MBP-면역화 마우스로부터 단리된 T 세포를 MBP로 재-프라이밍하고, 24시간 후, 세포에 상이한 농도의 RNS60 및 NS를 수여하였다. 처리 2시간 후, NF-κB의 DNA-결합 활성을 핵 추출물에서 전기영동 이동 쉬프트 검정 (EMSA)에 의해 모니터링하였다.

도 42C에 도시된 실험의 경우, MBP-면역화 마우스로부터 단리된 T 세포를 NF-κB 의존성 수용체 구축물인 PBIIX-Luc로 형질감염시킨 후, MBP로 재프라이밍하였다. MBP 프라이밍 24시간 후, 세포를 상이한 농도의 RNS60 및 NS로 2시간 동안 처리한 후, 총 세포 추출물에서 루시퍼라제 검정 키트 (프로메가(Promega))에 의해 루시퍼라제 활성을 검정하였다. 다른 경우에서, MBP-프라이밍된 T-세포를 또한 30 nM PMA로 1시간 동안 자극시켰다. 이들 경우에서, RNS60 및 NS의 예비처리 1시간 후 PMA를 첨가하였다. 결과는 3개의 상이한 실험의 평균 + SD이다.

결과. 도 42A 내지 C는 RNS60이 MBP-프라이밍된 T 세포에서 NF-κB의 활성화를 약화시켰지만, 표준 염수 (NS)는 약화시키지 않았음을 도시한다. 구체적으로, 도 42A 및 42B는 RNS60 (도 42A 및 42B의 중앙 3개 레인 참조)가 용량-반응적 방식으로 MBP-프라이밍된 T 세포에서 NF-κB의 활성화를 약화시켰지만, NS (도 42A 및 42B의 최우측 레인 참조)는 약화시키지 않았음을 도시한다.

마찬가지로, 도 42C의 막대 그래프는 RNS60 (도 42A 및 42B의 제2, 제3 및 제4 막대 참조)가 MBP-프라이밍된 T 세포에서 NF-κB의 활성화를 약화시켰지만, NS (도 42A 및 42B의 제5 막대 참조)는 약화시키지 않았으므로, 총 세포 추출물에서 형질감염된 NF-κB-의존성 수용체 구축물 (PBIIX-Luc)로부터의 루시퍼라제 활성도 용량-반응적 방식으로 약화시켰음을 도시한다.

따라서, 특정 측면에 따르면, 개시된 동전기적으로-생성된 유체는 당뇨병 및 관련 대사 장애, 인슐린 저항성, 신경퇴행성 질환 (예를 들어, M.S., 파킨슨병, 알츠하이머병 등), 천식, 낭포성 섬유증, 혈관/관상동맥 질환, 망막 및/또는 황반 변성, 소화 장애 (예를 들어, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 크론병 등)을 포함하나 이에 제한되지 않는 염증-매개된 상태 및 질환 및 염증을 치료하는데 실질적인 유용성을 갖는다.

실시예 10

(RNS60은 암컷 및 수컷 돼지에서 심근 경색증 후 24시간 이내에 축적된 트로포닌의 생성을 제한하였지만, 비히클 대조군은 제한하지 않았다)

개관:

혈액 중 트로포닌 수준은 매우 민감하며 심근에 대한 손상의 특이적 지시자이다. 통상 혈액에서는 낮은 수준이 발견되지만, 심근 경색증에 걸린 환자는 손상된 심근 면적을 가지므로 혈액 중 상승된 심장 트로포닌 수준을 갖게 될 것이다. 따라서, 상승된 트로포닌 혈액 수준은 심근이 몇몇 종류의 손상을 입었음을 나타낼 것이다.

방법. RNS60이 심근 경색증 (MI) 후 생존 및 생리학적 파라미터에 대한 긍정적인 효과를 가짐을 확인하기 위해, 체중 45-50 kg의 가축용 돼지에서 풍선-유도된 심근 허혈 재관류 (I/R) 모델을 사용하여 연구를 수행하였다. 이 모델에서, 혈관성형술 카테터를 통상적인 경동맥을 통해 수술적으로 삽입하고, 중좌전하행 (mid-left anterior descending (LAD)) 관상 동맥에서 풍선의 팽창에 의해 심근 허혈을 야기하였다. 허혈을 40분의 기간 동안 유도한 후, 풍선의 공기를 빼서 동맥의 재관류를 생성하였다. 처리는 LAD의 재관류 후 5분간 단일 관상동맥내 주사 (3 mL)를 통해 투여한 후, 7일의 기간 동안 4시간 마다 정맥내 주사 (100 mL/투여)에 의해 투여하였다. 처리군은 표준 염수 또는 RNS60을 수여받은 수컷 또는 암컷의 군으로 구성되었다 (총 4군, 표 6).

연구 군
군 번호	n	성별	시험 물질
1F	4	암컷	표준 염수
2M	4	수컷	표준 염수
3F	4	암컷	RNS60
4M	4	수컷	RNS60

구체적으로, 도 43A 및 43B에 도시된 실험의 경우, 8마리의 암컷 돼지 (패널 A) 및 8마리의 수컷 돼지 (패널 B)를 RNS60 또는 비히클 단독으로 처리하고, 심근 경색증에 걸리게 하였다. 심근 경색증을 유도하기 전에, 각각의 돼지에 RNS60 또는 비히클 단독을 주사하였다. 심근 경색증 (MI)은 각 동물에서 혈관성형술 풍선의 팽창에 의해 유도하였다 (예를 들어, 40분 동안). 풍선의 팽창 후 및 풍선의 수축 전에 관상동맥 혈관의 총 폐색을 입증하고 풍선 위치를 교정하기 위해 혈관촬영을 수행하였다. 풍선의 수축 후, 이전에 폐색된 동맥에서의 혈액 유동의 회복을 입증하기 위해 후속 혈관촬영을 수행하였다. 풍선 팽창 후 20분에, 돼지를 RNS60 또는 표준 염수의 1 ml/분 관상동맥내 주입에 의해 처리하였다. MI를 유도하기 전에 각 동물로부터 혈액 샘플을 취하여 트로포닌의 기준 수준을 확립하였다. MI를 유도한 직후, 6시간 후, 12시간 후 및 24시간 후의 시점에서 추가의 혈액 샘플을 취하고 트로포닌 수준에 대해 검정하였다. 그래프 상의 각 점은 8마리 동물의 평균 트로포닌 혈액 수준을 나타낸다. 구체적으로, 심전도 (ECG), 체중 및 심장 박동을 평가하고, 생화학적 심장 마커 분석을 위해 -1일, 0일 (재관류와 IC 투여 사이 뿐만 아니라 6 및 12시간 이후), 1일 및 7일에 혈액을 수집하였다. 연구 말기에, 심장을 포르말린으로 관류시키고, 제거하고, 괴사 면적 (좌심실)에서 1 cm 절편으로 절단하고, 경색증 크기를 총체적으로 결정하기 위해 거시적으로 평가하였다. 추가의 조직학적 분석을 위해, 각 절편으로부터의 전면 벽을 3개의 샘플로 분할하였다. 각각의 샘플을 파라핀 고정시키고, 5μm 절편을 H&E로 착색시켰다.

결과 . 하기 결과를 수득하였다.

생존. 모든 암컷 돼지는 연구 기간에 생존하였다. 표준 염수 대조군 및 RNS60 처리군 각각으로부터의 1마리 동물은, ECG 분석 기준의 허혈 유도에 대한 분명한 실패로 인해 결과로부터 배제시켰다. 수컷 중에서, 표준 염수-처리된 동물 4마리 중 2마리가 포스트-오프 하우징(post-op housing) 기간의 3일차에 죽었다. 대조적으로, 모든 RNS60-처리된 수컷은 연구동안 생존하였다.

경색증 크기. 총 조직학을 기준으로, 생존 동물 전체에서의 경색증 크기는 심실 벽의 약 2％ 내지 약 10％에 영향을 주었다. 대조군에서 암컷 3마리 중 2마리는 육안으로 보이는 경색증을 나타냈다. 대조적으로, RNS60 처리된 암컷 3마리 중 2마리는 근육 손상의 징후를 나타내지 않았다. 단지 표준 염수가 주입된 1마리의 수컷 및 RNS60이 처리된 1마리의 수컷이 총 조직학적 분석에 의해 가시적인 경색증을 발달시켰다. 경색증과 관련된 현미경상의 변화는 모든 대조군-처리된 및 모든 RNS60-처리된 암컷의 심장 뿐만 아니라 대조군-처리된 수컷 4마리 중 3마리에서 발견되었다 (표 7). 이들 변화는 괴사, 섬유증, 무기화, 출혈, 및 단핵 침윤을 포함하였다 (예가 도 44A 내지 I에 도시되어 있다). 대조적으로, RNS60 처리된 수컷은 이 수준의 심근 손상의 임의의 징후를 나타내지 않았다 (표 7).

현미경상의 조직학 결과의 요약
처리	동물	현미경상의 조직학에 의한 경색증
비히클	2910	+
	2919	+
	3078	+
RNS60	2978	+
	2976	+
	2909	+
비히클	3038	+
	3031	-
	3080*	+
	3033*	+
RNS60	3028	-
	3029	-
	3026	-
	3030	-
(+) 경색된 조직의 존재, (-) = 경색된 조직의 부재, (*) I/R 후 3일차에 죽음.

ECG 변화 . 허혈 기간 동안, ECG는 연구에 등재된 모든 동물에서 ST 상승을 보여주었다. 즉각적인 허혈-후 기간에서 (IC 약물 투여 동안), 대조군의 모든 암컷 돼지는 T 상승, 2상 T 파(wave) 및 뒤집힌 T 파를 비롯한 비정상 T-파를 나타냈다. 대조적으로, RNS60-처리된 암컷 3마리 중 2마리는 T-파 변화가 없었으며, 이는 즉각적인 치료 이익을 시사한다. 수컷 군에서, 대조군 및 RNS60 군 모두에서 동물 4마리 중 3마리가 T 파 변화를 나타냈다. 1주일 수술-후, 대조군-처리된 수컷 2마리가 죽었고, 나머지 대조군 동물은 계속해서 T 파 변화를 나타냈다. 대조적으로, RNS60-처리된 수컷 2마리는 현재 정상적인 ECG 자취를 나타냈다.

심장 트로포닌 . RNS60으로의 처리는 수컷 및 암컷 돼지 모두에서 순환 트로포닌 수준의 I/R-유도된 증가를 감소시켰다 (도 43A 및 B); 효과는 암컷에서보다 수컷에서 더 강하였다. MI-후 3일차에 죽은 2마리 수컷 동물이 모든 수컷 중에서 가장 높은 트로포닌 수준을 나타냈다. 도 43A 및 B는 RNS60이 비히클 단독 처리된 동물에 비해 대략 2배 내지 20배로 트로포닌의 생성을 유의하게 제한하였지만, 비히클 단독은 제한하지 않았음을 도시한다. 구체적으로, 도 43A (암컷) 및 43B (수컷)는 RNS60 (도 43A 및 B의 사각형이 있는 선 참조)이 비히클 단독 (도 43A 및 B의 마름모형이 있는 선 참조)과 비교시 MI 유도에 대한 반응에서 트로포닌의 혈액 수준을, 암컷 동물 도 43A의 경우 2배 내지 3배 및 수컷 도 43A의 경우 5배 내지 20배로 감소시켰음을 도시한다.

따라서, 특정 측면에 따라, RNS60의 투여는 수컷 동물에서의 사망률을 낮추고, MI 후 ECG 변화에 대해 규범적인 경향을 가하였다. 심근 조직 생존을 위한 RN60 처리의 분명한 이익 및 생리학적 심장 기능의 보존은 심장 트로포닌의 감소된 순환 수준 및 심근 손상의 조직학적 징후의 부재에 의해 확인되었다. 이러한 연구의 발견은 RNS60 투여의 항-염증성 및 조직-보호적 효과를 나타내는 일관된 경향을 보여준다.

도 44A 내지 I는 특정 측면에 따라, 대조군-처리된 수컷 동물에서 발견된 괴사 조직의 예를 도시한다 (#3033). A. 우측에서의 괴사 조직 및 좌측에서의 생존 조직을 보여주는 낮은 확대율. 박스표시된 면적은 나타낸 바와 같이 C, F 및 G에서 보다 높은 확대율로 도시된다. B. 흑색 선으로 표시된 생존 면적과 괴사 면적 사이의 계면을 갖는, A에서 도시된 동일한 현미경사진. C. A에서 가장 크게 박스표시된 면적의 중간 확대율. 생존 면적 (V) 및 괴사 면적 (N)은 호염기성 세포 출현이 있는 조직에 의해 분리된다 (*). D. C에서의 중앙 면적의 보다 높은 확대율. 대부분의 과립형 물질이 무기화된다. 무기화된 심근세포의 촛점이 원형표시되어 있다; 단핵 염증성 세포 (화살표)가 섞여있다. E. 다초점 단핵 침윤 (화살표)을 갖는 생존 영역 (V)과 괴사 영역 (N) 사이의 계면의 높은 확대율. F. 괴사 면적 (A에서 박스표시됨) 위에놓인 외심막의 보다 높은 확대율은 중등도의 다초점 단핵 침윤 (화살표)을 도시한다. G. A의 바닥에서 박스표시된 조직의 보다 높은 배율. 다초점 무기화는 괴사성 심근세포 내에서 과립형 호염기성 세포 물질로서 보여질 수 있다. 고도의 무기화를 갖는 면적은 원형표시되어 있다. H. 괴사성 심근의 높은 확대율. 심근세포의 핵은 농축핵이다 (작고 짙은 호염기성 세포). 세포질은 응집된 것처럼 보이며, 독특한 호산구 색조를 갖는다. I. 생존 심근의 높은 확대율. H와 비교되는 핵 및 세포질 외관의 차이를 주목한다.

실시예 11

(RNS60은 암컷 돼지에서 심근 경색증 후 24시간 이내에 축적된 크레아틴 포스포키나제 (CPK)의 수준을 약화시켰지만, 비히클 대조군은 약화시키지 않았다)

개관:

혈액 중 크레아틴 포스포키나제 (CPK) 수준은 매우 민감하며 심근에 대한 손상의 특이적 지시자이다. 통상 혈액에서는 낮은 수준이 발견되지만, 심근 경색증에 걸린 환자는 손상된 심근 면적을 가지므로 혈액 중 상승된 심장 CPK 수준을 갖게 될 것이다.

방법. 본 실시예 및 도 43C 및 43D에 도시된 바와 같은 방법은 실시예 10에서 논의되었다. CPK의 기준 수준을 확립하기 위해 MI 유도 전에 각각의 동물로부터 혈액 샘플을 취하였다. MI 유도 직후, 6시간, 12시간 및 24시간 후의 시점에서 추가의 혈액 샘플을 취하고, CPK 수준에 대해 검정하였다. 그래프 상의 각각의 점은 8마리 동물의 평균 CPK 혈액 수준을 나타낸다.

결과. 도 43C (암컷 돼지)는 RNS60 (도 43C의 사각형이 있는 선 참조)이 비히클 단독 처리된 동물에 비해 대략 3배 내지 4배로 CPK의 생성을 유의하게 제한하였지만 비히클 단독 (도 43D의 마름모형이 있는 선 참조)은 제한하지 않았음을 도시한다.

따라서, 특정 측면에 따르면, 상기 결과는 RNS60으로 처리된 동물이 보다 낮은 수준의 CPK를 생성하였음을 나타내며, 이는 심근이 비히클 단독에 비해 RNS60으로 처리시 손상 수준이 감소하였음을 시사한다.

실시예 12

(개시된 동전기적으로 변경된 수성 유체 (예를 들어, RNS60, RIS60)는 심혈관 수술을 비롯한 수술과 관련하여 전형적인 염수 용액에 대한 보조제(adjunct) 및/또는 대체제를 제공한다)

개관. 추가 측면에 따르면, 개시된 동전기적으로 변경된 수성 유체 (예를 들어, RNS60, RIS60)는, 다양한 수술에 수반되는 유해한 효과를 감소시키고 결과를 개선하기 위해 심혈관 수술을 비롯한 (이에 제한되지 않음) 수술과 관련하여 사용된 전형적인 용액 (예를 들어, 염수-기반 용액 및 유체)을 증대 또는 대체시킬 수 있다.

염수 용액이 사용되며 수술 시나리오에 수반되는 유해한 효과를 감소시키거나 제거하는데 바람직한 다수의 심혈관 수술 시나리오가 존재한다.

예를 들어, 심폐 바이패스 (CPB)가 관여되는 수술에서, 일반화된 염증 반응이 유해한 효과를 야기하는 경우, 개시된 동전기적으로 변경된 수성 유체 (예를 들어, RNS60, RIS60)를 포함하는 또는 이들로 이루어진 프라이밍 용액 (바이패스 펌프 프라이밍 용액)은 CPB에 수반되는 유해한 효과를 감소시키거나 제거하는데 이용될 수 있다. 추가의 측면에 따르면, 개시된 동전기적으로 변경된 수성 유체 (예를 들어, RNS60, RIS60)는 CPB의 유해한 신경인지적 효과를 감소시키는데 이용될 수 있다.

마찬가지로, 개시된 동전기적으로 변경된 수성 유체 (예를 들어, RNS60, RIS60)는 결과를 향상시키기 위해 정맥 보존 용액 (전형적으로는 파파베린 및 염수)과 관련하여 이용될 수 있다.

추가로, 개시된 동전기적으로 변경된 수성 유체 (예를 들어, RNS60, RIS60)는 이식이 완료된 후의 관상동맥을 씻어내기 위해 심장박동정지 (예를 들어, 칼륨을 또한 함유할 수 있는 글루타메이트 및/또는 아스파르테이트-함유 심장박동정지)로서 이용될 수 있다.

따라서, 추가의 측면에 따르면, 개시된 동전기적으로 변경된 수성 유체 (예를 들어, RNS60, RIS60)는 수술 (예를 들어, 심혈관 수술) 중 어느 경우에서나 이용되어, 수술 (예를 들어, 심혈관 수술)에서 전형적으로 사용되는 용액 (예를 들어, 염수-기반 용액 및 유체)을 증대 또는 대체시킴으로써, 다양한 수술에 수반되는 유해한 효과를 감소시키고 결과를 개선시킬 수 있다.

대표적인 심혈관 관련 수술은 대동맥 축착증 수복, 블랙록-타우시그(Blalock-Taussig) 단락 생성, 동맥관개존증의 폐색, 허혈성 심장 질환 합병증의 치료 (예를 들어, 관생동맥 바이패스 이식), 선천적 심장 질환의 교정, 심장내막염을 비롯한 다양한 원인에 의해 야기된 판막 심장 질환의 치료, 관상 동맥 질환의 치료, 판막 심장 질환의 치료, 심장 종양의 치료, 흉부 대동맥류 수복, 판막 수술, 대동맥 수술, 부정맥 (심방 세동) 수술, 심부전 및 이식 수술, 최소 침습적 심장 수술, 비디오-보조 및 로보트-보조 심장 수술, 심장 판막 수술, 경심근 레이저 혈관재건술, 흉부 대동맥 수술, 혈관성형술 (예를 들어, 경피경관혈관성형술 (PTA)), 혈관조영술, 경동맥 내막절제술, 대동맥류 수복, 풍선 판막성형술, 뇌동맥류 수복, 심박정상화, 대동맥 판막 치환술, 경동맥 내막절제술, 동정맥 누공, 심도자술, 대동맥 판막 치환술, 심낭천자, 승모판 수복, 승모판 치환술, 기관내삽관, 말초 혈관 바이패수 수술, 관상동맥 스텐트 수술, 향상된 외부 대위박동, 내혈관 스텐트 수술, 문정맥 바이패스, 심장-폐 이식, 이식형 제세동기, 말초 내막절제술, 정맥 혈전증 예방, 및 심근 절제술을 포함한다.

특정 측면은 수술이 필요한 대상체 상에서 수술을 수행하는 단계를 포함하며, 시약 유체가 수술의 하나 이상의 측면에서 사용되고 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만인 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을 포함하는 동전기적으로 변경된 수성 유체를 수술 유효량으로 포함하는 것인, 수술의 수행 방법을 제공한다.

특정 측면에서, 수술은 심장 부정맥 관련 수술; 혈관 질환 관련 수술; 심근 경색증 관련 수술; 울혈성 심부전 관련 수술; 심근염 관련 수술; 죽상동맥경화증 및 재협착 관련 수술; 심폐 바이패스 (CPB)의 사용을 포함하는 수술; 혈관 (예를 들어, 정맥, 동맥) 보존 용액의 사용을 포함하는 수술; 및 심장박동정지의 사용을 포함하는 수술로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 수술을 포함한다.

실시예 13

(본 발명의 동전기적으로 생성된 유체 (RNS-60 및 솔라스)로 관류된 Calu-3 세포 상에서 수행된 패치 클램프 분석에서 (i) RNS-60 및 솔라스에 대한 노출이 전체 세포 전도도에서의 증가를 초래하였고, (ii) RNS-60에 대한 세포 노출이 15분 인큐베이션 시간에 명백한 비-선형 전도도의 증가를 일으켰으며, (iii) RNS-60에 대한 세포 노출이 칼슘 투과성 채널에 대한 RNS-60 염수의 효과를 일으켰다는 것이 밝혀졌다)

개관. 본 실시예는 동전기적 유체에 의한 막 전도도 조정과 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된, 출원인의 미국 특허 출원 공보 일련번호 제12/435,356호의 실시예 17을 기준으로 한다. 본 실시예에서, 패치 클램프 연구를 수행하여, 본 발명의 동전기적으로 생성된 염수 유체 (RNS-60 및 솔라스)의 본원에 기술된 바와 같은 유용성 (전체 세포 전류를 조정하는 유용성이 포함됨)을 추가로 확증하였다. 2가지 실험 세트를 수행하였다.

제1 실험 세트의 데이터의 요약은 솔라스 염수로 수득된 전체 세포 전도도 (전류 대 전압 관계)가 두 인큐베이션 시간 모두 (15분, 2시간) 및 모든 전압 프로토콜에 대해 고도로 선형이라는 것을 나타냈다. 그러나, 솔라스와의 더 긴 인큐베이션 (2시간)이 전체 세포 전도도를 증가시켰음이 명백하였다. RNS-60에 대한 세포 노출은 비-선형 전도도에서의 증가를 일으켰고, 이는 15분 인큐베이션 시간에서만 명백하였다. 2시간 인큐베이션 시간에서는, 이러한 비-선형 전류에 대한 RNS-60의 효과는 사라졌고, 대신 선형이었다. 앞서 관찰된 바와 같이, 비-선형 전체 세포 전도도의 기여는, 모든 전압 프로토콜에서 존재하긴 하지만, 전압 민감성이다.

제2 실험 세트의 데이터의 요약은 비-선형 전류에 대한 RNS-60 염수의 효과가 있다는 것을 가리키고, 이는 외부 용액 내의 고칼슘으로 명백해졌다. 비-선형 전체 세포 전도도의 기여는, 전압 민감성이긴 하지만, 두 전압 프로토콜 모두에서 존재하였고, 이는 칼슘 투과성 채널에 대한 RNS-60 염수의 효과를 가리킨다

제1 실험 세트 (전도도의 증가; 및 비-선형 전압 조절된 전도도의 활성화)

제1 실험 세트에 대한 방법:

일반적인 패치 클램프 방법에 대해서 WO 2009/055729의 실시예 23의 세포 패치 클램프 참조. 하기의 제1 실험 세트에서, 0 mV 유지 전위, -120 mV 또는 -60 mV부터 스테핑되는 프로토콜로, 기초 조건 하에 Calu-3 세포를 사용하여, 전체 세포 전류를 조정하는 본 발명의 동전기적으로 생성된 염수 유체 (RNS-60 및 솔라스)의 유용성을 추가로 확인하기 위해 패치 클램프 연구를 수행하였다.

각 경우에 전-세포 전도도는 15분 또는 2시간 동안 인큐베이션된 세포로부터 수득한 전류 대 전압 관계로부터 얻었다. 이 연구에서, 군은 솔라스 또는 RNS-60 염수 용액에 대해 소정의 시간에서 얻었다.

결과:

결과는 두 시점 (15분 및 2시간) 및 상이한 전압 프로토콜 (A, 0 mV부터 스테핑; B, -60 mV부터 스테핑; 및 C, -120 mV부터 스테핑)에서 상피 세포 막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, RNS-60 및 솔라스)의 효과를 평가한 일련의 패치 클램핑 실험의 결과를 나타냈다. 결과는 RNS-60이 솔라스보다 전체-세포 전도도에 대한 효과가 더 크다는 것을 나타냈다. 이러한 실험에서, 유사한 결과가 3가지 전압 프로토콜에서, 그리고 15분 및 2시간 인큐베이션 시점 양쪽에서 나타났다.

추가의 결과는 3가지 전압 프로토콜 (A. 0 mV부터 스테핑; B. -60 mV부터 스테핑; C. -120 mV부터 스테핑) 및 2가지 시점 (15분 및 2시간)에서 솔라스 전류 데이터를 RNS-60 전류 데이터에서 차감함 ("델타 전류")을 나타냈다. 이러한 데이터는 15분 시점 + RNS-60에 비-선형 전압-의존적 성분이 있고, 이는 2시간 시점에 부재한다는 것을 나타냈다.

이전의 실험에서와 같이, "표준" 염수로의 데이터는 기준물로 사용되는, 매우 일관되고 시간에 의존적이지 않은 전도도를 제공하였다. 군들을 솔라스 또는 RNS-60 염수에 매칭시킴으로써 본 결과를 수득하였고, 이는 더 짧은 인큐베이션 시간에서의 전압-조절 전도도의 활성화와 일관되게, 기초 조건 (cAMP, 또는 임의의 다른 자극이 없음) 하에서의 RNS-60 염수에 대한 Calu-3 세포의 노출이 시간-의존적 효과(들)을 일으킨다는 것을 나타냈다. 이러한 현상은 2시간 인큐베이션 시점에서 그렇게 명백하지 않았다. 본원의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, cAMP "칵테일"로의 자극에 의해 전도도가 증가될 때 선형 성분이 더욱 명백하다. 그럼에도 불구하고, 2시간 인큐베이션 시간은 RNS-60 및 솔라스 염수 둘 모두에 대해 더 높은 선형 전도도를 나타냈고, 이러한 경우에, RNS-60 염수는 솔라스 단독과 비교하여 전체 세포 전도도를 배가시켰다. 이러한 증거는 전체 세포 전도도에 대한 2가지 이상의 기여물, 즉 비-선형의 전압-조절 전도도 및 선형 전도도의 활성화가 RNS-60 염수에 의해 영향을 받는다는 것을 가리키고, 이는 더 긴 인큐베이션 시간에서 더욱 명백하다.

제2 실험 세트 (칼슘 투과성 채널에 대한 효과)

제2 실험 세트에 대한 방법:

하기의 제2 실험 세트에서, 0 mV 또는 -120 mV 유지 전위부터 스테핑되는 프로토콜로, 기초 조건 하에 Calu-3 세포를 사용하여, 전체 세포 전류를 조정하는 본 발명의 동전기적으로 생성된 염수 유체 (RNS-60 및 솔라스)의 유용성을 추가로 확증하기 위해 추가적인 패치 클램프 연구를 수행하였다.

각각의 경우의 전체-세포 전도도를 어느 한쪽 염수와 함께 15분 동안 인큐베이션된 세포로부터 수득된 전류-대-전압 관계로부터 수득하였다. 전체 세포 전도도에 대한 칼슘 투과성 채널의 기여가 있는지 여부 및 전체 세포 전도도의 이러한 부분이 RNS-60 염수와의 인큐베이션에 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해, 인큐베이션 기간 후에 세포를 생리 염수에서 패치시켰다 (NaCl의 농도가 높은 외부 용액을 필요로 하는 한편, 내부 용액은 고농도의 KCl을 함유함). 그 후, 외부 염수를 NaCl이 CsCl로 교체된 용액으로 교체하여, 주요 외부 양이온을 교체하는 것에 의한 전도도에서의 변화가 있는지 여부를 결정하였다. 이러한 조건 하에, 칼슘 진입 단계가 더욱 명백해지도록, 이어서 동일한 세포를 증가되는 농도의 칼슘에 노출시켰다.

결과:

일반적으로, 상이한 외부 염 용액을 사용하여 상이한 전압 프로토콜 (0 mV부터의 스테핑, 또는 -120 mV부터의 스테핑)에서 상피 세포 막 극성 및 이온 채널 활성에 대한 동전기적으로 생성된 유체 (예를 들어, 솔라스 및 RNS-60)의 효과를 평가한 일련의 패치 클램핑 실험의 결과는 전체 세포 전도도가 증가하였음을 나타냈다. 이러한 실험들에서, 1개의 시점인 15분을 사용하였다. 솔라스에 대해, 결과는 1) 외부 용액으로서 NaCl 대신 CsCl를 사용하는 것이 대조군과 비교했을 때 선형 거동으로 전체 세포 전도도를 증가시켰고, 2) 20 mM CaCl₂ 및 40 mM CaCl₂ 둘 모두의 CaCl₂가 비-선형 방식으로 전체 세포 전도도를 증가시켰다는 것을 나타냈다. RNS-60에 대해, 결과는 1) 외부 용액으로서 NaCl 대신 CsCl를 사용하는 것이 대조군과 비교했을 때 전체 세포 전도도에 대한 효과가 거의 없었고, 2) 40 mM의 CaCl₂가 비-선형 방식으로 전체 세포 전도도를 증가시켰다는 것을 가리킨다.

추가의 결과는 솔라스 및 RNS-60에 대해 2가지 전압 프로토콜 (0 mV부터의 스테핑; 및 -120 mV부터의 스테핑)에서 CsCl 데이터를 20 mM CaCl₂ 및 40 mM CaCl₂ 데이터에서 차감함을 나타냈다. 이러한 결과는 솔라스 및 RNS-60 용액 둘 모두가 칼슘-유도 비-선형 전체 세포 전도도를 활성화시켰음을 가리킨다. 이러한 효과는 RNS-60으로 더 컸고 (투여량 반응성을 가리킴), RNS-60으로는 더 높은 칼슘 농도에서만 증가되었다. 또한, 더 높은 칼슘 농도에서의 비-선형 칼슘 의존적 전도도가 전압 프로토콜에 의해 또한 증가되었다.

이러한 제2 실험 세트의 데이터는 Calu-3 세포에서 수득된 전체 세포 전도도 데이터에 대한 RNS-60 염수 및 솔라스 염수의 효과를 추가로 가리킨다. 이러한 데이터는 어느 한쪽 염수와의 15분 인큐베이션이 전체 세포 전도도에 대한 명료한 효과를 일으키고, 이는 RNS-60으로, 그리고 외부 칼슘이 증가되었을 때 가장 명백하다는 것을 가리키고, RNS-60 염수가 전체 세포 전도도의 칼슘-의존적 비-선형 성분을 증가시킨다는 것을 추가로 나타냈다.

축적된 증거는 기저 세포 전도도에 상이하게 기여하는 이온 채널들의 레발레시오 염수에 의한 활성화를 시사한다.

출원인의 다른 데이터 (예를 들어, 출원인의 다른 실시예의 데이터)와 함께, 본 발명의 특정 측면은 본 발명의 동전기적으로 생성된 용액을 사용하여 GPCR 및/또는 g-단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 막 구조물 (예를 들어, 막 및/또는 막 단백질, 수용체 또는 기타 막 성분)에서의 전기화학적 변화 및/또는 형태 변화를 제공하는 것을 포함하는, 막 구조, 막 전위 또는 막 전도도, 막 단백질 또는 수용체, 이온 채널, 지질 성분, 또는 세포에 의해 교환될 수 있는 세포내 성분 (예를 들어, 신호전달 경로, 예컨대 칼슘 의존적 세포성 신호전달 시스템) 중 하나 이상의 조정을 포함하여 세포내 신호 전달을 조정하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 추가적인 측면에 따르면, 이러한 효과들은 유전자 발현을 조정하고, 예를 들어 개별적인 메시지 전달 성분의 반감기 등에 의존하여, 지속될 수 있다.

실시예 14

(본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)의 원자력간 현미경 측정은 대조군 '압력 포트' (PNS-60) 유체에 존재하는 것보다 실질적으로 더 작은 소수성 표면 미세기포의 존재 및/또는 형성을 나타냈다)

개관. 본 실시예는 미세기포와 관련된 교시를 위해 본원에 참조로 포함된, 출원인의 미국 특허 출원 공보 일련번호 제12/435,356호의 실시예 18을 기준으로 한다. 출원인은 본 발명의 동전기적 유체 (RNS-60)에서의 소수성 미세기포를 특성화하기 위해 원자력간 현미경 (AFM) 측정을 사용하였다.

물질 및 방법:

AFM 연구. 당업계-공인 나노테크 유저 퍼실러티(Nanotech User Facility (NTUF))에서 AFM 연구를 수행하였다. AFM 연구를 위해, 매우 작고 민감한 바늘을 소수성 표면 상에 놓인 물 액적 내로 침지시킨다. 이어서, 바늘을 ~15분간 1 mm²와 같은 비율로 물/표면 계면 위에서 스캔한다. 바늘은 표면 기하학에서 임의의 결함을 기록하고, 작은 기포의 존재를 기록하기에 충분히 민감하다.

물 액적이 놓여있는 규소 기판을 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란을 사용하여 제조하였고, 생성된 소수성 표면은 물이 대략 95도의 접촉각으로 구술모양이 되도록 한다. 이러한 코팅은 특히 내구성이 있기 때문에 부분적으로는 다수의 AFM 연구에서 사용된다.

용액 제조. 두 시험 용액을 연구하였다: RNS-60 및 PNS-60. RNS-60은 60 ppm 산소를 포함하는 본 발명의 동전기적 유체인 반면, PNS-60은 가압 산소 헤드에의 전형적인 노출에 의해 제조된 60 ppm 산소를 포함하는 비-동전기적 대조군 유체 (즉, 압력 포트 산소화 유체)이다. 각각의 시험 용액은 먼저 소량의 중성 포스페이트 완충 (pH 7) 용액의 첨가에 의해 완충시켰고, 대략 60-70 uL의 각 완충 시험 용액 (대략 22℃)을 미리 제조한 실리카 플레이트 상에 놓았다.

결과:

AFM 하에서, RNS-60 액적은 ~20 mm 폭 및 ~1.5 nm 이하 길이의 치수를 갖는, 1 mm² 면적 중 약 20개의 소수성 미세기포의 분포를 나타냈다. 대조적으로, AFM 하에서, PNS-60 액적은 ~60 nm 폭 및 ~5 nm 길이의 치수를 갖는, 1 mm² 면적 중 대략 5개의 소수성 미세기포를 나타냈다. 따라서, PNS-60 액적이 RNS60 액적에 비해 훨씬 더 적으며 훨씬 더 큰 소수성 미세기포를 가졌다.

따라서, 특정 측면에 따르면, RNS-60 및 PNS-60 시험 용액 사이의 소수성 표면 미세기포의 크기 및 분포에 있어 실질적인 차이가 존재하며, 여기서 미세기포는 AFM 측정 동안 시험 유체 내에 먼저 존재하고/거나 형성된다.

본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 특정 측면에 따르면, 본 발명의 동전기적으로 변경된 유체는, 평균 직경이 실질적으로 약 100 나노미터 미만이며 이온성 수성 유체에 안정하게 배열된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수용액을, 유체의 의한 생존 세포 접촉시 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 포함한다.

그러나, 출원인은 AFM 실험에서 관찰된 것과 같은 (소수성 표면 상에 형성되는) 소수성 기포가 본원에 개시된 본 발명의 생물학적으로 활성인 전하-안정화된 나노구조물와 근본적으로 상이할 것임을 지적한다. 따라서, 특정 측면에 따르면, 본 실시예에서의 AFM 실험은, 소수성 기포 형성의 크기 및 분포를 기준으로, 본 발명의 동전기적 유체 (예를 들어, RNS-60)가 비-동전기적 대조군 유체와 근본적으로 상이하다는 것을 지지하는 반면, 소수성 기포는 본원에 상세하게 기재된 본 발명의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물와 상이하고/거나 그로부터 유래될 것이다. 임의의 사건에서, 본 발명의 동전기적 유체에 비해, 대조군 압력 포트 산소화 유체는 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상을 조정할 수 있는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물를 포함하지 않는다.

실시예 15

(동전기적 유체 (예를 들어, RNS-60)를 대조군 '압력 포트' (PNS-60) 유체와 구별하기 위해 라만(Raman) 분광법을 사용하였다)

도 45A 및 B는, 특정 측면에 따라, 라만 후방산란에 의해 측정된 바와 같이 대조군 PNS60 (45a)에 비해 RNS60 (45b)에 대해 증가된 온도 (열) 효과를 도시하며, 각각의 상이한 곡선 및 2개의 산소 피크를 보여준다.

특정 측면에 따르면, 라만 분광법은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)를 특성화하는데 실질적인 유용성을 갖는다. 추가의 측면에 따르면, 상기 라만 분광법 데이터/측정은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)의 생물학적 활성과 상관관계가 있다.

실시예 16

(동전기적 유체 (예를 들어, RNS-60)를 대조군 유체와 구별하기 위해 형광 편광 비등방성을 사용하였다)

도 46은, 특정 측면에 따라, "RNS60" ("로트 A" 및 "로트 B"), "NS" (표준 염수 대조군), "RDW" (동전기적으로 처리된 탈이온수) 및 "DW" (탈이온수) 사이에 형광 편광 비등방성 데이터의 작지만 유의한 차이를 도시한다.

특정 측면에 따르면, 형광 편광 비등방성은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)를 특성화하는데 실질적인 유용성을 갖는다. 추가의 측면에 따르면, 상기 형광 편광 비등방성 데이터/측정은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)의 생물학적 활성과 상관관계가 있다.

실시예 17

(동전기적 유체 (예를 들어, RNS60)는 이온 채널 활성 또는 전기 스파이킹(spiking)에 의해 입증된 바와 같이 생물학적 막과 상호작용하는 것으로 나타났다)

도 47은, 특정 측면에 따라, 세포외 관류된 RNS60 (89％)이 세로토닌-촉발된 5HT3A (이온 채널) 활성을 강화시킴을 도시한다 (대조군에 비해 평균 -101.8 ± 24.2％ (n=3)의 억제).

특정 측면에 따르면, 세로토닌-촉발된 5HT3A (이온 채널) 활성에 대한 효과의 측정은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)를 특성화하는데 실질적인 유용성을 갖는다. 추가의 측면에 따르면, 상기 세로토닌-촉발된 5HT3A (이온 채널) 활성에 대한 효과의 측정은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)의 생물학적 활성과 상관관계가 있다.

도 48은, 특정 측면에 따라, RNS60 (84％)이 캡사이신 촉발된 TRPV1 (이온 채널) 전류를 억제함을 도시한다 (평균 -90.9 ± 6.7％ (n=3)의 억제). 비교는 표준 염수, 100 nm 캡사이신 및 100 nm Capsaicin + 87％ RNS60 사이에서 이루어진다. TRPV1을 과발현하는 재조합 CHO 세포에 대해 데이터가 나타내어진다.

특정 측면에 따르면, 캡사이신 촉발된 TRPV1 (이온 채널) 전류에 대한 효과의 측정은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)를 특성화하는데 실질적인 유용성을 갖는다. 추가의 측면에 따르면, 상기 캡사이신 촉발된 TRPV1 (이온 채널) 전류의 측정은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)의 생물학적 활성과 상관관계가 있다.

특정 측면에 따르면, 이온 채널 활성의 조정은 생물학적 막과의 RNS60 상호작용을 반영한다. 추가의 측면에 따르면, 예를 들어 효능제-촉발된 활성의 조정을 비롯한 이온 채널 측정 (예를 들어, 게이팅(gating) 역학의 강화, 억제, 변경, 전압 민감성 등)은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)의 생물학적 활성을 측정하기 위한 용이한 고처리량 방법에 있어서 실질적인 유용성을 갖는다.

도 49는, 특정 측면에 따라, RNS60에 의한 관류가 심근세포에서의 전기 스파이킹 (Na+ 전류 스파이크)을 변경함을 도시한다; V_경사, -100 mV → +40 mV; ΔV_스파이크, 1.67 ± .47 mV; Δt_스파이크, 5.95 1.67 msec (n = 6).

특정 측면에 따르면, 심근세포에서의 전기 스파이킹 (예를 들어, Na+ 전류 스파이크)의 측정은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)를 특성화하는데 실질적인 유용성을 갖는다. 추가의 측면에 따르면, 상기 심근세포에서의 전기 스파이킹의 측정은 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들어, RNS60)의 생물학적 활성과 상관관계가 있다. 메카니즘에 얽매이지 않으면서, 스파이킹의 지연은 Nav1.5와의 상호작용에 기인할 수 있다.

참고로 포함됨. 본 명세서에서 지칭되고/되거나 출원인의 데이터 시트에서 열거된 상기 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비-특허 간행물 모두는 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본원의 도면 및 상세한 설명은 제한적인 방식보다는 설명적인 방식으로 간주되어야 하고, 본 발명을 개시된 특정 형태 및 예에 한정하도록 의도되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 반면에, 본 발명은 하기의 청구항에 의해 정의된 바와 같이, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 당업자에게 명백한 임의의 추가적인 변형, 변화, 재배열, 치환, 대안, 디자인 선택, 및 실시양태를 포함한다. 따라서, 하기의 청구항이 모든 추가적인 이같은 변형, 변화, 재배열, 치환, 대안, 디자인 선택, 및 실시양태를 포괄하는 것으로 해석되도록 의도된다.

상기 기술된 실시양태들은 상이한 다른 성분들 내에 함유된 상이한 성분들 또는 상이한 다른 성분들과 연결된 상이한 성분들을 서술한다. 이같은 서술된 구조들이 단지 예시적이라는 것과, 실제로는, 동일한 기능성을 달성하는 다수의 다른 구조가 실행될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 개념적인 의미에서, 동일한 기능성을 달성하기 위한 성분들의 임의의 배열이 원하는 기능성이 달성되도록 효과적으로 "연합"된다. 따라서, 특정 기능성을 달성하도록 조합된 본원에서의 임의의 2가지 성분이, 구조 또는 중간 성분과 관계없이, 원하는 기능성이 달성되도록 서로 "연합"된 것으로 보일 수 있다. 유사하게, 이렇게 연합된 임의의 2개의 성분이 원하는 기능성을 달성하도록 서로에 대해 "작동가능하게 연결"되거나 "작동가능하게 커플링"된 것으로 또한 보일 수 있다.

본 발명의 특정 실시양태가 제시 및 기술되었지만, 본원에서의 교시를 기초로, 본 발명을 벗어나지 않으면서 변화 및 변형이 이루어질 수 있고, 본 발명의 더 넓은 측면, 그리고 이에 따라, 첨부된 청구항들이 이들의 범주 내에 모든 이같은 변화 및 변형을 본 발명의 진정한 취지 및 범주 내에 있는 것처럼 포함하여야 한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 본 발명이 첨부된 청구항에 의해서만 정의된다는 것을 이해하여야 한다. 당업자는, 일반적으로, 본원에서, 특히 첨부된 청구항 (예를 들어, 첨부된 청구항의 본문)에서 사용된 용어가 일반적으로 "열린" 용어로 의도된다는 것을 이해할 것이다 (예를 들어, 용어 "~을 포함하는"은 "~을 포함하지만 이에 한정되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "~이 있는"은 "적어도 ~이 있는"으로 해석되어야 하며, 용어 "~을 포함하다"는 "~을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다"로 해석되어야 함 등). 특정 숫자의 도입된 청구항 인용이 의도되는 경우, 이같은 의도는 이러한 청구항에서 명시적으로 인용될 것이고, 이같은 인용의 부재 시에는 이같은 의도가 존재하지 않는다는 것을 당업자는 추가로 이해할 것이다. 예를 들어, 이해를 돕기 위해, 하기의 첨부된 청구항들은 청구항 인용을 도입하기 위해 "적어도 하나" 및 "하나 이상"이라는 도입 구절의 어법을 포함할 수 있다. 그러나, 이같은 구절의 사용은 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 청구항 인용의 도입이 이같은 도입된 청구항 인용을 함유하는 임의의 특정 청구항을, 동일한 청구항이 "하나 이상" 또는 "적어도 하나"라는 도입 구절 및 "a" 또는 "an"과 같은 부정 관사를 포함하는 경우에도, 오직 1개의 이같은 인용을 함유하는 발명에 한정한다고 암시하는 것으로 해석되지 않아야 한다 (예를 들어, "a" 및/또는 "an"은 전형적으로 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다); 이는 청구항 인용을 도입하기 위해 사용된 정관사의 사용에 대해서도 유효하다. 또한, 특정 숫자의 도입된 청구항 인용이 명시적으로 인용된 경우에도, 전형적으로 이같은 인용이 적어도 인용된 숫자를 의미하는 것으로 해석되어야 한다는 것을 당업자는 인지할 것이다 (예를 들어, 다른 수식어 없이 단순히 "2개의 인용"이라는 인용은 전형적으로 적어도 2개의 인용 또는 2개 이상의 인용을 의미한다). 따라서, 본 발명은 첨부된 청구항에 의한 것을 제외하고는 한정되지 않는다.

Claims (58)

1. 대부분 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 가지고 이온성 수성 유체 내에 안정하게 설정된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액을 심혈관 질환 또는 상태 또는 그의 하나 이상의 증상의 치료를 제공하기에 충분한 양으로 포함하는, 심혈관 질환 또는 상태의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 동전기적으로 변경된 수성 유체의 용도.
2. 제1항에 있어서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물이, 유체에 의한 살아있는 세포의 접촉시 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 제공하기에 충분한 양으로 이온성 수성 유체 내에 안정하게 설정된 것인 용도.
3. 제1항에 있어서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물이 유체에서 주요 전하-안정화된 가스-함유 나노구조물 종인 용도.
4. 제1항에 있어서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물로서 유체 내에 존재하는 용존 산소 분자의 백분율이 0.01% 초과, 0.1% 초과, 1% 초과, 5% 초과; 10% 초과; 15% 초과; 20% 초과; 25% 초과; 30% 초과; 35% 초과; 40% 초과; 45% 초과; 50% 초과; 55% 초과; 60% 초과; 65% 초과; 70% 초과; 75% 초과; 80% 초과; 85% 초과; 90% 초과; 및 95% 초과의 백분율로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.
5. 제1항에 있어서, 총 용존 산소가 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물 내에 실질적으로 존재하는 것인 용도.
6. 제1항에 있어서, 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물이 대부분 90 nm 미만; 80 nm 미만; 70 nm 미만; 60 nm 미만; 50 nm 미만; 40 nm 미만; 30 nm 미만; 20 nm 미만; 10 nm 미만; 및 5 nm 미만의 크기로 이루어진 군으로부터 선택된 평균 직경을 갖는 것인 용도.
7. 제1항에 있어서, 이온성 수성 용액이 염수 용액을 포함하는 것인 용도.
8. 제1항에 있어서, 유체가 과도산소화된(superoxygenated) 것인 용도.
9. 제1항에 있어서, 유체가 용매화 전자의 형태를 포함하는 것인 용도.
10. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체의 변경이 유체역학적으로-유도된, 국소화된 동전기적 효과에 대한 유체의 노출을 포함하는 것인 용도.
11. 제10항에 있어서, 국소화된 동전기적 효과에 대한 노출이 전압 펄스(pulse) 및 전류 펄스 중 하나 이상에 대한 노출을 포함하는 것인 용도.
12. 제10항에 있어서, 유체역학적으로-유도된, 국소화된 동전기적 효과에 대한 유체의 노출이, 유체를 생성하기 위해 사용된 장치의 동전기적 효과-유도 구조적 특징에 대한 유체의 노출을 포함하는 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 심혈관 질환 또는 상태가 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태 또는 질환을 포함하는 것인 용도.
14. 제13항에 있어서, 심혈관 상태 또는 질환이 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 및 죽상동맥경화증 중 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
15. 제14항에 있어서, 심혈관 상태 또는 질환이 심근 경색증 및 죽상동맥경화증 중 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
16. 제1항에 있어서, 심혈관 질환의 하나 이상의 증상이 심장 부정맥, 혈관 질환, 심근 경색증, 울혈성 심부전, 심근염, 죽상동맥경화증, 및 재협착으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태에 관련된 것인 용도.
17. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산화 질소의 국소화된 또는 세포 수준을 조정하는 것인 용도.
18. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 IL-1베타, IL-8, TNF-알파, 및 TNF-베타로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 시토카인의 투여 부위에서의 국소화된 감소를 촉진하는 것인 용도.
19. 제1항에 있어서, 치료가 염증의 상승적 또는 비-상승적 억제 또는 감소를 위해 또다른 항-염증제의 동시적 또는 보조적 사용을 추가로 포함하는 것인 용도.
20. 제19항에 있어서, 상기 다른 항-염증제가 스테로이드 또는 글루코코르티코이드 스테로이드를 포함하는 것인 용도.
21. 제20항에 있어서, 글루코코르티코이드 스테로이드가 부데소니드 또는 그의 활성 유도체를 포함하는 것인 용도.
22. 제1항에 있어서, 치료가 하나 이상의 추가의 치료제가 환자에게 투여되는 조합 요법을 추가로 포함하는 것인 용도.
23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 추가의 치료제가 퀴니딘, 프로카이나미드, 디소피라미드, 리도카인, 페니토인, 멕실레틴, 플레카이니드, 프로파페논, 모리시진, 프로프라놀롤, 에스몰롤, 티몰롤, 메토프롤롤, 아테놀롤, 비소프롤로, 아미오다론, 소탈롤, 이부틸리드, 도페틸리드, 드로네다론, E-4031, 베라파밀, 딜티아젬, 아데노신, 디고크신, 마그네슘 술페이트, 와파린, 헤파린, 항-혈소판 약물 (예를 들면, 아스피린 및 클로피도그렐), 베타 차단제 (예를 들면, 메토프롤롤 및 카르베딜롤), 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 (예를 들면, 캅토프릴, 조페노프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 포시노프릴, 카소키닌 및 락토키닌), 스타틴 (예를 들면, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 피타바스타틴, 메바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 및 심바스타틴), 알도스테론 길항제 (예를 들면, 에플레레논 및 스피로노락톤), 디기탈리스, 이뇨제, 디고크신, 아이노트로프 (예를 들면, 밀리논), 혈관확장제 및 오메가-3 지방산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.
24. 제22항에 있어서, 하나 이상의 추가의 치료제가 TSLP 및/또는 TSLPR 길항제인 용도.
25. 제24항에 있어서, TSLP 및/또는 TSLPR 길항제가 TSLP 및 TSLP 수용체에 대해 특이적인 중화 항체, 가용성 TSLP 수용체 분자, 및 하나 초과의 수용체 쇄의 성분을 코딩하는, TSLPR-면역글로불린 Fc 분자 또는 폴리펩티드를 포함하는 TSLP 수용체 융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.
26. 제2항에 있어서, 치료가 막 연관 단백질의 형태, 리간드 결합 활성, 또는 촉매 활성의 조정을 포함하는 세포 막 구조 또는 기능 중 하나 이상의 조정을 포함하는, 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
27. 제26항에 있어서, 막 연관 단백질이 수용체, 막횡단 수용체, 이온 채널 단백질, 세포내 부착 단백질, 세포 부착 단백질, 인테그린 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
28. 제27항에 있어서, 막횡단 수용체가 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)를 포함하는 것인 용도.
29. 제28항에 있어서, G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)가 G 단백질 α 서브유닛과 상호작용하는 것인 용도.
30. 제29항에 있어서, G 단백질 α 서브유닛이 Gα_s, Gα_i, Gα_q, 및 Gα₁₂로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
31. 제30항에 있어서, 하나 이상의 G 단백질 α 서브유닛이 Gα_q인 용도.
32. 제2항에 있어서, 치료가 전세포 전도도를 조정하는 것을 포함하는, 세포 막 전도도를 조정하는 것을 포함하는 것인 용도.
33. 제32항에 있어서, 전세포 전도도의 조정이 전세포 전도도의 하나 이상의 전압-의존적 기여의 조정을 포함하는 것인 용도.
34. 제2항에 있어서, 치료가 칼슘 의존적 세포 전달(messaging) 경로 또는 시스템의 조정을 포함하는 세포내 신호 도입의 조정을 포함하는, 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
35. 제2항에 있어서, 치료가 포스포리파제 C 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 도입의 조정을 포함하는, 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
36. 제2항에 있어서, 치료가 아데닐레이트 시클라제 (AC) 활성의 조정을 포함하는 세포내 신호 도입의 조정을 포함하는, 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
37. 제2항에 있어서, 치료가 심혈관계의 만성 염증, 및 심혈관계의 급성 염증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 상태 또는 증상과 연관된 세포내 신호 도입의 조정을 포함하는 세포내 신호 도입의 조정을 포함하는, 세포 막 전위 및 세포 막 전도도 중 하나 이상의 조정을 포함하는 것인 용도.
38. 제1항에 있어서, 치료가 세포 네트워크 또는 층에의 투여를 포함하고, 그의 세포간 이음부의 조정을 추가로 포함하는 것인 용도.
39. 제38항에 있어서, 세포내 이음부가 치밀 이음부, 틈새 이음부, 조나 어드헤린스(zona adherins) 및 데스마좀(desmasomes)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
40. 제38항에 있어서, 세포 네트워크 또는 층이 CNS 혈관에서의 내피 세포 및 내피-별아교세포 치밀 이음부, 혈액-뇌척수 유체 치밀 이음부 또는 장벽, 폐 상피-유형 이음부, 기관지 상피-유형 이음부, 및 장 상피-유형 이음부로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
41. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 산소화되며, 여기서, 유체 내의 산소가 대기압에서 적어도 8 ppm, 적어도 15, ppm, 적어도 25 ppm, 적어도 30 ppm, 적어도 40 ppm, 적어도 50 ppm, 또는 적어도 60 ppm 산소의 양으로 존재하는 것인 용도.
42. 제1항에 있어서, 동전기적으로-변경된 유체의 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물 내에 존재하는 산소의 양이 대기압에서 적어도 8 ppm, 적어도 15, ppm, 적어도 20 ppm, 적어도 25 ppm, 적어도 30 ppm, 적어도 40 ppm, 적어도 50 ppm, 또는 적어도 60 ppm 산소인 용도.
43. 제1항에 있어서, 동전기적으로 변경된 수성 유체가 용매화 전자, 및 동전기적으로 변형되거나 또는 하전된 산소 종의 형태 중 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
44. 제43항에 있어서, 용매화 전자 또는 동전기적으로 변형되거나 또는 하전된 산소 종의 형태가 적어도 0.01 ppm, 적어도 0.1 ppm, 적어도 0.5 ppm, 적어도 1 ppm, 적어도 3 ppm, 적어도 5 ppm, 적어도 7 ppm, 적어도 10 ppm, 적어도 15 ppm, 또는 적어도 20 ppm의 양으로 존재하는 것인 용도.
45. 제43항에 있어서, 동전기적으로 변경된 산소화된 수성 유체가 적어도 부분적으로 분자 산소에 의해 안정화된 용매화 전자를 포함하는 것인 용도.
46. 제1항에 있어서, 세포내 신호 도입의 조정을 제공하기에 충분한 세포 막 구조 또는 기능을 변경하는 능력이 닫힌 가스-기밀 용기 중에서 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 또는 더 긴 기간 동안 지속되는 것인 용도.
47. 제26항에 있어서, 막 연관 단백질이 CCR3을 포함하는 것인 용도.
48. 제1항에 있어서, 치료가 세포내 NF-κB 발현 및/또는 활성의 조정; 바람직하게는 NF-κB 발현 및/또는 활성을 감소시키는 것을 포함하는 것인 용도.
49. 제1항에 있어서, 대상체가 포유동물 또는 인간인 용도.
50. 실질적으로 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 가지며 이온성 수성 유체 내에 안정하게 설정된 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액을 수술적으로 유효량으로 포함하는, 수술의 하나 이상의 측면을 위한 약제 또는 시약 유체의 제조를 위한 동전기적으로 변경된 수성 유체의 용도.
51. 제50항에 있어서, 수술이 심혈관 수술인 용도.
52. 제51항에 있어서, 수술이 심장 부정맥과 관련된 수술; 혈관 질환과 관련된 수술; 심근 경색증과 관련된 수술; 울혈성 심부전과 관련된 수술; 심근염과 관련된 수술; 죽상동맥경화증, 및 재협착과 관련된 수술; 심폐 우회술 (CPB)의 사용을 포함하는 수술; 혈관 (예를 들면, 정맥, 동맥) 보존 용액의 사용을 포함하는 수술; 및 카디오플레지아(cadioplegia)의 사용을 포함하는 수술로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인 용도.
53. 세포를 대부분 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 갖는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액을 포함하는 동전기적으로-변경된 유체와 접촉시키는 단계;
    적합한 검정을 사용하여 이온-채널 측정을 수행하는 단계; 및
    이온-채널 측정을 기반으로 동전기적으로-변경된 유체의 생물학적 활성 수준 또는 값을 대조군 유체 (예를 들면, 비 동전기적으로 변경된 대조군 유체)와 접촉된 세포의 것과 비교하여 결정하는 단계
    를 포함하는, 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들면, RNS60)의 생물학적 활성의 용이한 고-처리 측정 방법.
54. 제53항에 있어서, 이온-채널 측정이 개폐 동역학의 강화, 억제, 변경, 전압 민감도, 및 효능제-유발된 활성의 조정으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 방법.
55. 제53항에 있어서, 이온 채널이 5HT3A 및 TRPV1 중 하나 이상인 방법.
56. 제55항에 있어서, 세로토닌-유발된 5HT3A 및 캡세이신 유발된 TRPV1 중 하나 이상의 측정을 포함하는 방법.
57. 대부분 약 100 나노미터 미만의 평균 직경을 갖는 전하-안정화된 산소-함유 나노구조물의 이온성 수성 용액에 대해 라만 분광법 및 형광 편광 비등방성 측정 중 하나 이상을 수행하는 단계; 및
    하나 이상의 라만 분광법 및 형광 편광 비등방성 측정을 동전기적으로-변경된 유체의 생물학적 활성의 양과 연관시켜, 동전기적으로-변경된 유체의 생물학적 활성의 용이한 고-처리 측정 방법이 제공되는 것인 단계
    를 포함하는, 동전기적으로-변경된 유체 (예를 들면, RNS60)의 생물학적 활성의 용이한 고-처리 측정 방법.
58. 제57항에 있어서, 라만 후방산란 및 형광 편광 비등방성 중 하나 이상의 측정을 포함하는 방법.

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