CN102993269B

CN102993269B - 一类环四肽化合物及其制备方法和在制备抗污损剂中的应用

Info

Publication number: CN102993269B
Application number: CN201210431886.6A
Authority: CN
Inventors: 漆淑华; 鲍洁
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2012-11-01
Filing date: 2012-11-01
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2032-11-01
Also published as: CN102993269A

Abstract

本发明公开了一类环四肽化合物及其制备方法和在制备抗污损剂中的应用。所述的环四肽化合物的结构如式（Ⅰ）所示。本发明从一株柳珊瑚共附生曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076CCTCC NO.M2012397的发酵液中分离得到一类新的具有抑制草苔虫幼虫附着活性的环四肽化合物aspergillpeptide A、aspergillpeptide B和aspergillpeptide C，这些化合物具有抗海洋污损作用，可以用于制备高效的海洋防污剂，也可以将其采用现有技术制备抗污涂料，例如将这种化合物渗入或扩散于成膜天然树脂、聚乙烯以及其它可水解、可溶或不溶性树脂等聚合物中得到抗污涂料，抗污涂料能释放出足够量的有效成分至表面达到防污作用。

Description

一类环四肽化合物及其制备方法和在制备抗污损剂中的应用

技术领域：

本发明属于海洋生物领域，具体涉及一类环四肽化合物及其制备方法和在制备抗污损剂中的应用。

背景技术：

在开发海洋、利用海洋的历史进程中，人类一直面临着防除海洋附着生物的问题。海洋污损生物（marine fouling organism）是海洋生物种栖息或附着在船舶和各种水下人工设施上，对人类经济活动产生不利影响的各种动物、植物和微生物的总称。全世界海洋污损生物共4000余种，我国沿海记录614种，其中最主要的类群是藻类、水螅、外肛动物、尤介虫、双壳类、藤壶和海鞘等。海洋污损生物在船体、水管、渔箱、油井等各种物体表面附着、生长以至形成群落，造成海洋生物污损，严重影响和阻碍了人们对海洋资源的探索与利用。

20世纪70年代以后由于汞、砷等防污剂的禁用，大部分船体的防污一直都基于防污漆释放廉价且持续时间长的有机锡。20世纪80年代，人们发现有机锡在鱼类、贝类体内会积累，导致遗传变异甚至还有可能进入食物链，于是到80年代末，各国纷纷立法，禁用或限用有机锡防污涂料。国际海事组织（IMO）于2001年10月通过了国际协定即控制船体防污中有害防污剂的应用，到2008年全面禁止在防污涂料中使用有机锡。随后在市场占主导地位的防污涂料是低释放率的含铜防污涂料，然而，重金属元素会在海洋中，特别是在海港中大量聚集，导致海藻的大量死亡，影响鲤鱼、虾、蟹及各种软体、背囊动物的胚胎生长，破坏其血细胞，从而破坏其生态平衡，也最终将会被禁用。因此，开发研制高效低毒（无毒）的天然海洋防污剂具有重要经济和社会价值。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供具有抗海洋生物污损活性的一类新的环四肽化合物aspergillpeptide A、aspergillpeptide B和aspergillpeptide C。

本发明的一类环四肽化合物，其结构式如式（Ⅰ）所示，

其中化合物1：R=H，双键构型E，命名为aspergillpeptide A；化合物2：R=H，双键构型Z，命名为aspergillpeptide B；化合物3：R=OH，双键构型E，命名为aspergillpeptide C。

本发明的环四肽化合物aspergillpeptide A、aspergillpeptide B和aspergillpeptide C是通过以下方法制备的，该方法包括以下步骤：

（a）制备曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076CCTCC NO.M2012397的发酵液；

（b）将步骤(a)得到的发酵液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶剂萃取，浓缩得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物；

（c）将步骤(b)所述的乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物经过反相硅胶柱层析，依次用甲醇体积分数为5%、30%、40%、50%、75%和100%的水-甲醇系统梯度洗脱，收集用甲醇体积分数为40%和50%的水-甲醇为洗脱剂冲洗下来的组份A，B，这两个组分分别经过硅胶柱和凝胶柱层析得到粗品，经HPLC纯化，分别得到化合物aspergillpeptide C以及化合物aspergillpeptide A和aspergillpeptide B。

步骤（a）中所述的发酵液可通过以下方法制备：将曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076CCTCC NO.M2012397接种到曲霉属真菌适用的培养基中，在通常的发酵条件下制得，优选的制备方法是将曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076CCTCC NO.M2012397接种于1#培养基中，于转速200r/min摇床、温度28℃培养3天，得到种子液，再将得到的种子液接种于1#培养基，于室温静置培养30天，得到发酵液，所述的1#培养基为：每升含山梨醇20g，酵母膏3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，味精10g，色氨酸0.5g,，KH₂PO₄0.5g，麦芽糖20g，海盐30g，余量为水，pH6.5。

步骤（b）所述的萃取最好用乙酸乙酯，所述的浓缩可以采用常规的方法，如减压浓缩。

步骤（c）所述的纯化可以采用色谱柱分离。

本发明的环四肽化合物aspergillpeptide A、aspergillpeptide B和aspergillpeptide C经实验发现，它们具有抑制草苔虫幼虫附着的活性，其中aspergillpeptide C抑制草苔虫幼虫附着的EC₅₀（半数有效抑制浓度）为11μg/ml，低于美国海军舰队规定的天然抗污损物质的EC₅₀值（25μg/ml）要求，aspergillpeptide A和aspergillpeptide B在浓度25μg/ml时也能有效抑制草苔虫幼虫附着，抑制率分别为58%和62%。

由此本发明的第三个目的是提供环四肽化合物aspergillpeptide A、aspergillpeptide B和aspergillpeptide C在制备抗污损剂中的应用，特别是海洋防污涂料中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076，其保藏编号为CCTCC NO.M2012397。

本发明的曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076是本发明人从海洋动物南海鳞海底柏柳珊瑚（Melitodes squamata）的组织内分离得到。该菌株的internal transcribed spacer ITS rRNA基因序列（其序列如SEQ ID NO.1所示）与Genbank数据库中的序列进行BLAST比对分析，结果表明：该菌株与Paz在2010年报道的一种海绵共附生真菌Aspergillus sp.OY10607（序列登录号FJ571434）(Paz,Z.,Komon-Zelazowska,M.,Druzhinina,I.S.,Aveskamp,M.M.,Schneiderman,A.,Aluma,Y.,Carmeli,S.,Ilan,M.and Yarden,O.（2010）Diversity and potential antifungal properties of fungi associated with a Mediterranean sponge.Fungal Divers42：17-26)的同处于一个最小的分支，进化距离最近。曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076的ITS rRNA基因序列与Aspergillus sp.OY10607的相似性达99%以上(该菌株的系统发育树见图1)。综合生理生化特征和菌落形态特征，将其鉴定属于曲霉属，命名为曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076。该菌于2012年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO.M2012397。

本发明的第五个目的是提供曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076CCTCC NO.M2012397在制备环四肽化合物aspergillpeptide A、aspergillpeptide B或aspergillpeptide C中的应用。

本发明从一株柳珊瑚共附生曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076CCTCC NO.M2012397的发酵液中分离得到一类新的具有抑制草苔虫幼虫附着活性的环四肽化合物aspergillpeptideA、aspergillpeptide B和aspergillpeptide C，这些化合物具有抗海洋污损作用，可以用于制备高效的海洋防污剂，也可以将其采用现有技术制备抗污涂料，例如将这种化合物渗入或扩散于成膜天然树脂、聚乙烯以及其它可水解、可溶或不溶性树脂等聚合物中得到抗污涂料，抗污涂料能释放出足够量的有效成分至表面达到防污作用。

本发明的曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076，于2012年10月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为：CCTCC NO.M2012397。

附图说明：

图1是曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076CCTCC NO.M2012397的系统发育树。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

将山梨醇20g，酵母膏3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，味精10g，色氨酸0.5g，KH₂PO₄0.5g，麦芽糖20g，海盐30g混合，用水定容到1L，调节pH至6.5，得到1L1#培养基，按照此方式配置1#培养基。将该培养基装入约130个1000mL的三角烧瓶中，每瓶约300mL，在115℃高压蒸汽灭菌25分钟。

用竹签挑取适量的曲霉菌Aspergillus sp.SCSGAF0076CCTCC NO.M2012397菌种接种入装有150mL1#培养基的500ml三角烧瓶中，于摇床(转速200r/min）温度28℃培养3天，得到种子液，再将得到的种子液按每10mL接入每瓶约300mL1#培养基的上述三角瓶中，于室温（28℃）静置培养30天后，收取发酵液。

将经1#培养基培养得到的发酵液40L用乙酸乙酯（也可用二氯甲烷或氯仿）萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯粗提物14g。乙酸乙酯粗提物用反相硅胶（Rp-18）干法拌样后，装入玻璃层析柱（直径5cm，柱长50cm，含反相Rp-18填料），常温减压柱层析，依次用甲醇体积分数为5%、30%、40%、50%、75%和100%的水-甲醇系统梯度洗脱（甲醇比例不断加大），根据薄层层析情况合并各个流分，回收洗脱溶剂，蒸干流分用甲醇转移。收集用甲醇体积分数为40%和50%的水-甲醇为洗脱剂冲洗下来的组份A，B。组分B经常压硅胶柱层析分离（直径1.5cm，柱长60cm，含200目硅胶填料），用氯仿/甲醇（v/v100:0-50:50）为洗脱溶剂系统，梯度洗脱得到5个小组分，其中用氯仿/甲醇(v/v50:50)洗脱得到的第五个小组分经半制备高效液相色谱仪进一步分离纯化，检测波长为280nm，流速为3mL/min，流动相为甲醇-水（v/v50:50），色谱柱为phenomenex Gemini10mm×250mm，得到化合物1（t_R=16.0min）和2（t_R=20.0min）。组分A经凝胶柱层析（直径10mm，柱长1600mm，凝胶为sephedexLH-20，流动相为体积比1:1的甲醇-氯仿），得粗品，粗品采用高效液相半制备分离，检测波长为280nm，流速为3mL/min，流动相为甲醇-水（v/v47:53），色谱柱为phenomenex Gemini10mm×250mm，得到化合物3（t_R=26.5min）。

结构推定：

化合物1，¹H和¹³C数据如表1所示，通过高分辨质谱（HRESIMS）在m/z处给出准分子离子峰517.2643[M+H]⁺，结合NMR波谱数据，得知化合物的分子式为C₂₆H₃₆N₄O₇。¹³C谱和DEPT谱显示在低场区有5个酰胺或酯羰基的碳信号（δ_C172.0，171.81，171.76，170.9，165.9），¹H中显示出4个酰胺质子信号（δ_H8.81，8.78，8.08，7.35），这说明该化合物是一个环肽类化合物。通过HSQC、HMBC以及H-H COSY信号，δ_C165.9（s，C-18），118.2（d，C-19），139.7（d,C-20），125.8（s，C-21），129.2（d，C-22），115.7（d，C-23），158.9（s，C-24）,以及δ_H7.45（2H，d，J=8.5Hz，H-22），6.82（2H，d，J=8.5Hz，H-23），6.87（1H，d，J=16Hz，H-19），7.40(1H，d，J=15.5Hz，H-20），9.90(1H，s，OH）组成了片段3-(4’-hydroxyphenyl)acrylic acid(HPAA)，并且H-19与H-20之间的偶合常数J_H-19/H-20（16Hz）说明该双键是E构型。进一步通过HSQC、HMBC以及H-H COSY，我们推测出两个结构片段Leu-Thr-HPAA和Ala-AMPA（3-amino-2-methylpropanoic acid）。虽然δ_C171.81（C-1）和δ_C171.76（C-8）很难区分，通过Ala-NH与C-8之间的HMBC相关信号以及Me-7与Leu-NH，H-10与Ala-NH之间的NOE信号可以看出Ala与Leu相连，δ_H5.08（H-16）与δ_C171.81（C-1）之间的HMBC信号说明AMPA与Thr相连。通过以上推测确定该化合物的平面结构如式（Ⅰ）示。

化合物1的绝对构型通过Marfey反应得以确定。基本方法：①化合物水解。称取该化合物0.5mg溶于1ml的6N HCl中，115℃条件下17小时，冷却蒸干后溶于100ul水中；②Marfey反应。100ul水样样品中，加1M的NaHCO₃20ul，FDAA（1%，丙酮溶解）100ul，40℃条件下1小时，冷却后，加入20ul2M HCl，蒸干后溶于甲醇；③HPLC分析。用15%-45%的乙腈/水进行梯度洗脱，其中水相中含有0.04%TFA，流速1.0ml/min，检测波长340nm，分析用色谱柱为YMC-Pack ODS-A column（250×10mm)。标准品D-Ala,L-Ala,D-Leu,L-Leu,D-Thr,L-Thr用同样的方法进行上述②，③处理。最终通过比较反应物的FDAA衍生物和标准品FDAA衍生物在HPLC分析的保留时间确定为D-Ala,L-Leu,L-Thr（如式Ⅰ示），由此确定化合物1的结构式如式（Ⅰ）所示，其R=H，双键构型E，命名为aspergillpeptide A。

化合物2，¹H和¹³C数据如表1所示，通过高分辨质谱（HRESIMS）在m/z处给出准分子离子峰517.2651[M+H]⁺，结合NMR波谱数据，得知化合物的分子式为C₂₆H₃₆N₄O₇。该化合物的¹H、¹³C以及DEPT谱与化合物1非常类似，但是H-19和H-20的偶合常数有明显不同，化合物1的J_H-19/H-20是16.0Hz，化合物2的J_H-19/H-20为13.0Hz，这说明化合物2中C₁₉=C₂₀的双键构型与化合物1不同，为Z构型。进一步的通过HSQC、HMBC、H-H COSY、NOESY波谱分析以及Marfey反应确定了化合物2的结构如式（Ⅰ）示，其R=H，双键构型Z，命名为aspergillpeptide B。

化合物3，¹H和¹³C数据如表1所示，通过高分辨质谱（HRESIMS）在m/z处给出准分子离子峰533.2607[M+H]⁺，结合NMR波谱数据，得知化合物的分子式为C₂₆H₃₆N₄O_8。该化合物的¹H、¹³C以及DEPT谱与化合物1比较类似，只是出现了一个3,4-dihydroxy-1,3,4-trisubstituted phenyl ring片段[δ_H6.76(1H,d,J=8.0Hz),6.89(1H,dd,J=1.5,8.5Hz),7.00(1H,s);δ_C114.1(d),115.6(s),120.4(d),126.3(s),145.5(s),147.4(s)，而不是3-(4’-hydroxyphenyl)acrylic acid片段。进一步通过HSQC、HMBC、H-H COSY、NOESY波谱分析以及Marfey反应确定了化合物3的结构如式（Ⅰ）示，其R=OH，双键构型E，命名为aspergillpeptide C。

化合物1-3均易溶于甲醇、DMSO，难溶于氯仿、水。

表1：化合物1-3的¹H和¹³C数据(500,125MHz,DMSO-d₆,δppm)

实施例2：环四肽类化合物aspergillpeptide A、aspergillpeptide B和aspergillpeptide C的抗海洋大型污损生物草苔虫幼虫附着活性测试

活性测试模型采用目前实验室最常用的海洋污损生物模型之一多室草苔虫幼虫（Bugulaneritina）的附着抑制试验。将采集到的成熟的多室草苔虫放置到用0.22μm滤膜过滤的海水中，用光照刺激，收集成熟多室草苔虫经光照刺激产生的幼虫。将幼虫放置到盛有用0.22μm滤膜过滤的海水的表面皿中。用草苔虫经光照产生的幼虫做活性试验。采用24孔聚苯乙烯板测定化合物的抗幼虫附着活性。将纯化合物（aspergillpeptide A、aspergillpeptide B或aspergillpeptide C）溶于DMSO，用无菌过滤海水稀释成不同的浓度溶液（60-140μg/mL）。每个孔中加入1mL测试液和20±2个成熟的藤壶幼虫，每个浓度设5个重复样，无菌过滤海水做空白对照。将24孔细胞培养板置于28℃培养箱中放置3小时。在显微镜下统计附着的幼虫数，用spss11.0软件进行统计分析，计算半数有效抑制浓度EC₅₀值和半数致死浓度LC₅₀值。

实验结果显示，化合物aspergillpeptide C抑制草苔虫幼虫附着的EC₅₀值为11μg/ml，LC₅₀值＞200μg/ml；aspergillpeptide A和aspergillpeptide B在浓度25μg/ml时也能有效抑制草苔虫幼虫附着，抑制率分别为58%和62%，LC₅₀值＞200μg/ml，由此可见aspergillpeptide A、aspergillpeptide B和aspergillpeptide C都具有较好的抑制草苔虫幼虫活性，能用于抗污损剂，特别是海洋防污涂料中。

Claims

1.一类环四肽化合物，其结构式如式（Ⅰ）所示，

2.一种权利要求1所述的环四肽化合物aspergill peptide A、aspergill peptide B和aspergill peptide C的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（a）制备曲霉菌Aspergillus sp. SCSGAF 0076 CCTCC NO.M 2012397的发酵液；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（a）中所述的发酵液是通过以下方法制备：将曲霉菌Aspergillus sp. SCSGAF 0076 CCTCC NO.M 2012397接种于1#培养基中，于转速200r/min摇床、温度28℃培养3天，得到种子液，再将得到的种子液接种于1#培养基，于室温静置培养30天，得到发酵液，所述的1#培养基为：每升含山梨醇20g，酵母膏3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，味精10g，色氨酸0.5g，KH₂PO₄0.5g，麦芽糖20g，海盐30g，余量为水，pH6.5。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（b）所述的萃取是用乙酸乙酯萃取，所述的浓缩采用减压浓缩。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（c）所述的纯化采用色谱柱分离。

6.权利要求1所述的环四肽化合物aspergillpeptide A、aspergillpeptide B或aspergillpeptide C在制备抗污损剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的抗污损剂为海洋防污涂料。

8.一种曲霉菌Aspergillus sp. SCSGAF 0076，其保藏编号为CCTCC NO.M 2012397。

9.权利要求8所述的曲霉菌Aspergillus sp. SCSGAF 0076 CCTCC NO.M 2012397在制备环四肽化合物aspergillpeptide A、aspergillpeptide B或aspergillpeptide C中的应用。