CN102977196A - 新苏云金芽孢杆菌晶体多肽、多核苷酸及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了涉及改组的苏云金芽孢杆菌Cry1多肽的杀昆虫多肽。还提供了编码本发明的多肽的核酸。包含了关于使用本发明的多肽和核酸增强植物对于昆虫捕食的抗性的方法。

Description

新苏云金芽孢杆菌晶体多肽、多核苷酸及其组合物
本申请是申请日为2007年12月10日，申请号为200780050977.2的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
D.切尔夫
R.聪
M.弗里曼
K.麦布赖德
山本敬司
本申请是于2006年12月8日提交的美国专利申请系列号60/873,849的非临时申请，所述专利申请的内容整体在此引入作为参考。
技术领域
总的来说，本发明涉及害虫控制领域，并且提供了与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)Cry1多肽相关的杀昆虫(insecticidal)多肽和编码其的多核苷酸。本发明还涉及用于改变植物对昆虫捕食的抗性的方法和组合物，包括但不限于转基因植物生产。
背景技术
众多有商业价值的植物，包括常见的农业作物，易受昆虫和线虫害虫的攻击。这些害虫可以引起农作物产量和品质中的相当大减少。一般地，农民已在很大程度上依赖于化学杀虫剂以对抗害虫损害。然而，化学杀虫剂的使用引起其自己的一套问题，包括应用杀虫剂的成本和不便。此外，化学残余物引起环境和健康关注。为了这些和其他原因，存在关于可替代的杀昆虫剂的需要。
控制害虫的环境友好的方法是使用衍生自土壤细菌苏云金芽孢杆菌(“Bt”)的杀虫晶体蛋白质，通常称为“Cry蛋白质”。Cry蛋白质是在苏云金芽孢杆菌的孢子形成后期过程中以结晶形式作为毒素原积聚的球状蛋白质分子。由害虫摄入后，晶体在幼虫的碱性中肠环境中溶解以释放毒素原。毒素原(～130kDa)由肠蛋白酶转变为成熟的毒性片段(～66kDa N末端区域)。这些蛋白质中的许多对于特定靶昆虫是相当毒性的，但对于植物和其他非靶生物是无害的。一些Cry蛋白质已在农作物植物中重组表达，以提供抗虫性转基因植物。在这些中，Bt-转基因棉花和玉米已进行广泛栽培。
许多Cry蛋白质已得到分离、表征且基于氨基酸序列同源性进行分类(Crickmore等人，1998，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，62：807-813)。这个分类方案提供了用于命名且分类新近发现的Cry蛋白质的系统机制。Cry1分类法是最为人所知的，并且包含目前总数超过130个的最高数目的cry基因。
一般已发现个别Cry蛋白质具有相对窄的活性谱。例如，Cry1Ac是在转基因棉花中用于控制烟芽夜蛾(H.virescens)和谷实夜蛾(H.zea)昆虫害虫中采用的第一种毒素。这种毒素因其针对烟芽夜蛾的高水平毒性而已知。然而，它在其控制谷实夜蛾的能力方面略微不足，并且对于灰翅夜蛾属(Spodoptera)物种几乎没有活性。此外，Cry1Ab毒素对于谷实夜蛾具有比Cry1Ac略微更少的活性，但针对甜菜夜蛾(S.exigua)具有优良得多的活性。
第二代转基因农作物可以对昆虫更有抗性，如果它们能够表达多重和/或新Bt基因的话。因此，具有宽活性谱的新杀昆虫蛋白质将是高度需要的。
发明内容
本发明涉及衍生自苏云金芽孢杆菌Cry1多肽(例如Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ad、Cry1Ae、Cry1Ag和Cry1Ca)的Cry多肽，包括但不限于，SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28的Cry1衍生多肽。除了Cry1衍生多肽的多肽序列之外，应当认识到本发明的多肽还包含其变体，包括但不限于，任何片段包括肠激活的成熟毒素片段、类似物、同源物、天然存在的等位基因、或其突变体。本发明的多肽还包含由本发明的任何Cry1衍生核酸编码的那些多肽。在一个实施方案中，改组多肽具有至少一种Cry1功能活性(例如杀昆虫活性)，并且与SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28中任何一种或其变体的多肽序列的成熟毒素部分至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％等同。在另一个实施方案中，多肽具有至少一种Cry1功能活性(例如杀昆虫活性)，并且与SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28中任何一种或其变体的多肽序列的成熟毒素部分至少99％or 99.5％等同。还提供了例如通过重组方法生产本发明多肽的方法。还包括了包含本发明的一种或多种多肽的组合物。
本发明还涉及SEQ ID NOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27的Cry1衍生的核酸分子。本发明还包含了编码多肽的片段和类似物，所述多肽是至少部分功能活性的，即，它们能够显示与野生型Cry1多肽相关的一种或多种已知的功能活性。在一个实施方案中，它包含与SEQ ID NOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27中的任何一种或其互补体(compliment)至少至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％等同的分离的改组核酸分子。在另一个实施方案中，它包含分离的核酸分子，其与SEQ ID NOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27中的任何一种或其互补体的多肽序列的成熟毒素部分至少99％或99.5％等同。还包括了包含本发明的核酸的载体。还包括了包含本发明载体的细胞或植物。
本发明还涉及表达本发明的核酸和/或多肽的转基因植物。转基因植物可以以本领域已知的任何方式表达转基因，包括但不限于组成型表达、发育调节的表达、组织特异性表达等。还包含了得自本发明的转基因植物的种子。
附图说明
图1显示了从Cry1Ab单基因改组分离的变体针对谷实夜蛾的杀昆虫活性。将每种纯化的毒素原引入昆虫的饮食内，并且测定各自的EC50。随后将EC50值转变成相对的倒数值。野生型Cry1Ca针对谷实夜蛾的EC50给出1.0的值。剩余毒素原的EC50指定相对值。
图2显示由改组的变体AR6编码的毒素原与野生型Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1Ca对烟芽夜蛾、谷实夜蛾和甜菜夜蛾的相对活性的比较。将每种纯化的毒素原引入昆虫的饮食内，并且测定各自的EC50。随后将EC50值转变成相对的倒数值。对于每个昆虫类型显示最低EC50(最高比活性)的毒素原给出1.0的值。剩余毒素原的EC50指定较低的相对值。
图3显示Cry1Ca改组的变体针对甜菜夜蛾的相对功效。将每种纯化的毒素原引入昆虫的饮食内，并且测定各自的EC50。随后将EC50值转变成相对的倒数值。野生型Cry1Ca针对甜菜夜蛾的EC50给出1.0的值。剩余毒素原的EC50指定相对值。
图4显示合成AR6(SEQ ID NO：5)、MR8′(SEQ ID NO：11和CR62(SEQ ID NO：9)基因在瞬时叶测定中的表达。合成基因使用土壤杆菌属(Agrobacterium)叶浸润测定在本氏烟草(Nicotianabenthamiana)叶中进行表达。所产生的叶提取物的蛋白质印迹证实来自AR6、MR8′和CR62合成基因的毒素原的产生。泳道如下：分子量标记、100ng Cry1Ca毒素原标准、200ng Cry1Ca毒素原标准、来自表达合成MR8′的叶的提取物、来自表达合成AR6的叶的提取物、来自表达合成CR62的叶的提取物。针对纯化的Cry1Ca蛋白质产生的兔多克隆抗血清用于探测蛋白质印迹(已预先确定Cry1Ca多克隆抗血清与AR6、CR62和MR8′蛋白质强交叉反应)。
图5A-5B显示合成AR6、MR8′和CR62基因在植物中(in planta)的杀昆虫活性。每种变体使用土壤杆菌属浸润在本氏烟草中进行表达。将每个叶盘饲喂给(A)谷实夜蛾或(B)甜菜夜蛾。24小时温育时间段后，摄食活性通过目视观察进行测定。关于谷实夜蛾活性和甜菜夜蛾活性的阳性对照分别是Cry2Ab样多肽(SEQ ID NO：35)和Cry1Ca改组的基因CR62。对于每个实验对象组显示的比指包含目的基因的测试土壤杆菌属与不包含测试基因的土壤杆菌属的相对量。这个稀释物有效减少所产生的测试蛋白质的水平。应当注意到用不包含测试基因的土壤杆菌属浸润的阴性对照叶在测定时间段期间由昆虫幼虫完全消耗(未显示)。
图6显示MR8′改组的变体针对谷实夜蛾的在植物中活性。所示变体使用土壤杆菌属浸润在本氏烟草叶中进行表达，随后为4天共培养时间段。将每个所产生的叶盘饲喂给谷实夜蛾。24小时温育时间段后，摄食活性通过叶盘的视频捕捉进行测定。y轴是捕捉的叶盘图像中存在的像素数目。像素数目越大，剩余的未吃的(受保护的)叶量越大。x轴是测试的变体。测定如所示的对于每种变体重复2-4次。
图7显示MR8′改组的变体针对甜菜夜蛾的在植物中活性。所示变体使用土壤杆菌属浸润在本氏烟草叶中进行表达，随后为4天共培养时间段。将每个所产生的叶盘饲喂给甜菜夜蛾。24小时温育时间段后，摄食活性通过叶盘的视频捕捉进行测定。y轴是捕捉的叶盘图像中存在的像素数目。像素数目越大，剩余的未吃的(受保护的)叶量越大。x轴是测试的变体。实验重复3次。
具体实施方式
本发明提供了与芽孢杆菌属(Bacillus)Cry1多肽(例如，Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ad、Cry1Ae、Cry1Ag和Cry1Ca)相关的杀昆虫多肽。还提供了编码本发明多肽的核酸分子。还包括了关于使用本发明的多肽和核酸以增强植物对昆虫捕食的抗性的方法。
本发明的多肽
本发明涉及衍生自苏云金芽孢杆菌Cry1多肽(例如，Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ad、Cry1Ae、Cry1Ag和Cry1Ca)的Cry多肽。在优选实施方案中，Cry1衍生多肽代表成熟的δ-内毒素区域，并且选自SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28。本发明的多肽还包含由本发明的任何Cry1衍生核酸编码的那些多肽。
除了Cry1衍生多肽的多肽序列之外，应当认识到本发明的多肽还包含其变体，包括但不限于，任何基本上相似的序列、任何片段、类似物、同源物、天然存在的等位基因、或其突变体。由本发明包含的变体是至少部分功能活性的多肽，即，它们能够显示与野生型Cry 1多肽相关的一种或多种已知的功能活性。此种功能活性包括但不限于，生物活性，例如杀昆虫活性；抗原性，即结合或与野生型Cry1竞争结合抗Cry1抗体的能力；免疫原性，即产生与野生型Cry1多肽结合的抗体的能力。在一些实施方案中，变体具有与其亲本多肽基本上相似的至少一种功能活性(例如，Cry1衍生多肽的变体将具有它与之最相似的Cry1衍生多肽基本上相似的至少一种功能活性)。如本文所使用的，变体的功能活性将被视为与其亲本多肽“基本上相似”，如果它在亲本的一个标准差内的话。
在一个实施方案中，本发明包含了改组的成熟δ-内毒素多肽，其具有至少一种Cry1功能活性(例如，杀昆虫活性)，并且与SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28中的任何一种的多肽序列至少至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％等同。
如本文所使用的，当序列定义为与参考序列“至少X％等同”时，例如，“与SEQ ID NO：2至少95％等同的多肽”，应当理解除非另有说明，“X％等同”指绝对百分比同一性。术语“绝对百分比同一性”指通过将相同的氨基酸或核酸评分为1和任何置换评分为0而测定的序列同一性百分比，而不考虑错配氨基酸或核酸的相似性。在一般的序列比对中，2个序列的“绝对百分比同一性”呈现为氨基酸或核酸“同一性”的百分比。在其中2个序列的最佳比对需要序列中的一个或两个中的缺口的插入的情况下，为了测定百分比同一性的目的，与另一个序列中的缺口比对的一个序列中的氨基酸残基计数为错配。缺口可以是内部的或外部的，即，截短。绝对百分比同一性可以使用例如Clustal W程序，版本1.8，1999年6月，使用缺省参数容易地确定(Thompson等人，1994，Nucleic Acids Research 22：4673-4680)。
在另一个实施方案中，具有至少一种Cry1功能活性(例如，杀昆虫活性)的成熟的δ-内毒素多肽与SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28中的任何一种的多肽序列至少99％或99.5％等同，并且由在严格条件下与这样的核酸杂交的多核苷酸编码，所述核酸编码SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28中的任何一种。
在具体实施方案中，本发明的片段对应于所加工的毒素原的长度。毒素对应于全长Cry1多肽的N末端部分。在优选实施方案中，N末端～50kDa-75kDa片段对应于毒素。在更优选的实施方案中，N末端～66kDa片段对应于毒素。对应于这种加工的Cry1片段的多肽可以在本发明直接避免毒素原加工需要的方法中提供。
完全毒素原核苷酸或多肽序列由在毒素原5′或N末端和3′或C末端毒素原区域的背景中的结构域I、II和III毒素区域组成。在一些情况下，毒素原和毒素区域衍生自相同Cry1型分子，例如CR62完全衍生自Cry1Ca。在其他情况下，5′或N末端区域主要衍生自一种分子，而C末端毒素原区域衍生自另一种，例如关于AR6、MR8′和衍生物，其中5′或N末端区域主要衍生自Cry1Ab，而对应于毒素原区域的3′或C末端区域来自Cry 1Ca。公认在衍生自其他Cry1分子的毒素原序列的不同组的背景中，分子的活性δ-内毒素区域可以保留确切活性。
在另一个具体实施方案中，本发明的片段对应于Cry1结构域。成熟的Cry1毒素多肽具有3个结构域，包括i)涉及插入昆虫顶端中肠膜内且影响离子通道功能的结构域I，ii)涉及在昆虫中肠上皮细胞膜上的受体结合的结构域II，和iii)涉及离子通道功能、受体结合和插入膜内的结构域III(Schnepf等人，1998，Microbiol.Molec.Biol.Rev.62：775-806)。
在另一个实施方案中，本发明包含了类似物多肽。类似物多肽可以具有已进行修饰的残基，即通过任何类型的分子与Cry1衍生多肽的共价附着。例如，但非限制性地，本发明的类似物多肽可以通过下述进行修饰：例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化(pegylation)、磷酸化、酰胺化、经由已知保护/封闭基衍生化、蛋白酶剪切、与细胞配体或其他蛋白质连接等。本发明的类似物多肽可以通过化学修饰进行修饰，其中使用本领域技术人员已知的技术，包括但不限于特定化学切割、乙酰化、甲酰化、在衣霉素(N联糖基化和N-糖苷蛋白质-碳水化合物键形成的抑制剂)的存在下的合成等。此外，本发明多肽的类似物可以包含一个或多个非经典氨基酸。
还提供了例如通过重组方法生产本发明多肽的方法。
还包括了包含本发明的一种或多种多肽的组合物。本发明的组合物可以进一步包含另外的试剂，包括但不限于，展布剂-粘着剂佐剂、稳定剂、其他杀昆虫添加剂、稀释剂、最优化组合物的流变学性质或稳定性的试剂，例如表面活性剂、乳化剂、分散剂和/或聚合物。
本发明的核酸
本发明还涉及Cry1衍生的核酸分子。在优选实施方案中，Cry1衍生的核酸分子选自SEQ ID NOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27。本发明的核酸分子还包含编码本发明的任何Cry1衍生多肽的核酸分子。
除了Cry1衍生的核酸分子的核酸分子外，应当认识到本发明的核酸也包含其变体，包括但不限于任何基本上相似的序列、任何片段包括毒素片段、同源物、天然存在的等位基因、或其突变体。由本发明包含的变体核酸分子编码至少部分功能上活性的多肽，即，它们能够显示与野生型Cry1多肽相关的一种或多种已知功能活性。此种功能活性包括但不限于，生物活性，例如杀昆虫活性；抗原性，即结合或与野生型Cry1竞争结合抗Cry1抗体的能力；免疫原性，即产生与野生型Cry1多肽结合的抗体的能力。在一些实施方案中，变体具有与其亲本核酸分子基本上相似的至少一种功能活性(例如，Cry1衍生的核酸分子的变体将编码这样的多肽，所述多肽将具有所述变体与之最相似的Cry1衍生的核酸分子编码的多肽基本上相似的至少一种功能活性)。如本文所使用的，变体的功能活性将被视为与其亲本多肽“基本上相似”，如果它在亲本的一个标准差内的话。
在一个实施方案中，本发明包含了改组的核酸分子，其与SEQ IDNOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27中的任何一种核酸分子至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％等同。在另一个实施方案中，本发明包含了这样的核酸分子，其与SEQ ID NOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27中的任何一种核酸分子至少99％或99.5％等同。
为了测定2种核酸分子的百分比同一性，序列就最佳比较目的进行比对(例如，缺口可以在第一种核酸分子的序列中引入以用于与第二种或核酸分子的最佳比对)。随后比较在相应核苷酸位置处的核苷酸。当第一种序列中的位置由与第二种序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，那么分子在那个位置处是等同的。2个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置数目的函数(即，％同一性＝相同重叠位置数目/位置总数目x100％)。在一个实施方案中，2个序列是相同长度的。
2个序列之间的百分比同一性的测定也可以使用数学算法来完成。用于比较2个序列的数学算法的非限制性例子是Karlin和Altschul的算法(Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.87：2264-2268，如在Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.90：5873-5877中修改的)。此种算法并入NBLAST和XBLAST程序内(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403和Altschul等人，1997，Nucleic Acid Res.25：3389-3402)。用于执行BLAST分析的软件是例如可通过国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得的。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，其匹配或满足一些正值阈值评分T。T指的是邻近字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些起始邻近字命中充当种子用于起始搜索以发现包含其的更长HSPs。字命中随后沿着每个序列在2个方向上延伸，至累积比对得分可以增加的程度。对于核苷酸序列，使用参数M(关于匹配残基对的奖励得分；总是＞0)和N(关于错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵以计算累积得分。每个方向中的字命中的延伸在下述情况时停止：累积比对得分与其最大达到的值下降量X；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积得分变为零或零以下；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)10、截止值100、M＝5、N＝-4和2条链的比对作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵作为缺省值(参见Henikoff&Henikoff，1989，PNAS，89：10915)。
比对的Clustal V方法也可以用于测定百分比同一性(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)，并且在LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序中发现。“缺省参数”是由程序的制造商预先设定的参数，并且对于多重比对，它们对应于GAP PENALTY＝10和GAP LENGTH PENALTY＝10，而对于逐对比对，它们是KTUPLE 1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5和DIAGONALS SAVED＝5。序列比对后，使用Clustal V程序，通过察看相同程序上的“序列距离”表可能获得“百分比同一性”。
2个序列之间的百分比同一性可以使用类似于上文描述的那些的技术进行测定，其中允许或不允许缺口。在计算百分比同一性中，一般仅计算确切匹配。
在另一个实施方案中，本发明包含整合了任何本文描述的Cry1衍生的核酸分子的核酸分子的核酸分子。包含具有至少一种Cry1功能活性(例如杀昆虫活性)的核酸分子。在这点上，所描述的编码毒素的序列将与来自其他Cry蛋白质的结构域组合，以形成完整Cry蛋白质。
在具体实施方案中，组合对应于编码完整Cry蛋白质的核酸分子。毒素对应于全长Cry1多肽的N末端部分。编码结构域I的核酸分子和编码结构域II的核酸分子随后可以与所述核酸分子组合，以形成编码成熟Cry蛋白质的核酸分子。
在另一个具体实施方案中，本发明的片段编码对应于成熟Cry1毒素的结构域I、II或III中的任何一个的多肽。
在另一个实施方案中，本发明包含了在严格条件下与SEQ IDNOS：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27中的任何一种杂交的核酸分子。短语“严格条件”指这样的杂交条件，在该条件下核酸将与其靶核酸杂交，一般在核酸的复杂混合物中，但基本上不与其他核酸杂交。严格条件是序列依赖性的，并且在不同环境下将是不同的。更长的核酸在更高的温度下特异性杂交。关于核酸杂交的广泛指导可以在本领域中发现(例如，Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，″Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993))。一般地，高严格条件选择为在限定离子强度和pH下比特定核酸的热解链温度(Tm)低约5-10℃。低严格条件一般选择为低于Tm约15-30℃。Tm是在其下与靶互补的50％探针在平衡状态中(因为靶核酸过量存在，所以在Tm下，50％的探针在平衡状态中被占据)与靶核酸杂交的温度(在限定离子强度、pH和核酸浓度下)。杂交条件一般是其中在pH 7.0-8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子、一般约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)的那些，并且温度对于短探针(例如，10-50个核苷酸)是至少约30℃和对于长探针(例如，超过50个核苷酸)是至少约60℃。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来达到。对于选择性或特定杂交，阳性信号是至少2倍背景，且优选10倍背景杂交。在一个实施方案中，严格条件包括在0.2X SSC中于至少约50℃、通常约55℃、或有时60℃或65℃的温度至少1次洗涤(通常2次)，进行20分钟，或基本上等价的条件。在具体实施方案中，本发明的核酸分子与编码SEQ ID NOS：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28中的任何一种的多肽的多核苷酸特异性杂交，遵循在0.2X SSC中于55℃至少洗涤1次，进行20分钟。在另一个实施方案中，严格条件包括在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45℃杂交，随后在0.2X SSC，0.1％SDS中于50-65℃洗涤1次或多次。
短语“特异性杂交”指当序列存在于复杂混合物(例如总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与特定核苷酸序列结合、形成双链体或杂交。
还包括了包含本发明核酸的载体。还包括了包含本发明载体的细胞或植物。
术语“核酸”或“核酸分子”在本文中指从5′向3′末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单或双链聚合物。它包括发挥主要结构作用的染色体DNA、自我复制的质粒和DNA或RNA。术语“编码”指编码一种或多种氨基酸的多核苷酸序列。该术语不需要起始或终止密码子。氨基酸序列可以在由多核苷酸序列及其互补体提供的6个不同读框中的任何一个中编码。
表1公开了Cry1衍生序列和相应的序列标识号。
Cry1-衍生序列
本发明的Cry1衍生多肽和核酸分子可以通过下述来产生：将一种或多种核苷酸置换、添加和/或缺失引入野生型Cry1(例如，Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ad、Cry1Ae、Cry1Ag和Cry1Ca)或相关核酸的核苷酸序列内，从而使得将一种或多种氨基酸置换、添加和/或缺失引入所编码的蛋白质内。一般地，产生Cry 1衍生序列，以强调野生型Cry1多肽的所需特征或减少其不希望有的特征。在一个实施方案中，Cry1衍生多肽具有超过相应野生型Cry1的改善的杀昆虫活性，包括但不限于，更大的效力和/或增加的昆虫害虫范围。在另一个实施方案中，Cry1衍生的多肽在微生物宿主或植物宿主中比相应的野生型Cry1更好地表达，包括但不限于，增加的半衰期、对降解更不易感、和/或更有效的转录或翻译。
在一个实施方案中，苏云金芽孢杆菌衍生的Cry1Ab(SEQ ID NO：33)或Cry1Ca(SEQ ID NO：29，编码区：47-3616)核酸分子用作模板以产生改组的cry1核苷酸片段。在另一个实施方案中，从一轮改变中分离的变体可以用作模板用于进一步的改变轮次(例如，AR6、CR62或MR8′)。在另一个实施方案中，待改变或改组的编码Cry1蛋白质的模板可以重新合成，以具有不同的核酸序列，以提供在宿主细胞中改善的表达用于筛选和/或商业化目的。本文描述的每种Cry1型分子无论衍生自Cry1Ab还是Cry1Ca的5′或N末端区域都包含Cry1Ca的毒素原3′或C末端区域。
序列改变可以通过标准技术引入，例如定向分子进化技术，例如DNA改组方法(参见例如，Christians等人，1999，Nature Biotechnology17：259-264；Crameri等人，1998，Nature，391：288-291；Crameri，等人，1997，Nature Biotechnology 15：436-438；Crameri等人，1996，Nature Biotechnology 14：315-319；Stemmer，1994，Nature 370：389-391；Stemmer等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.，91：10747-10751；美国专利号5,605,793；6,117,679；6,132,970；5,939,250；5,965,408；6,171,820；国际公开号WO 95/22625；WO 97/0078；WO 97/35966；WO 98/27230；WO 00/42651；和WO 01/75767)；位点定向诱变(参见例如，Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，82：488-492；Oliphant等人，1986，Gene44：177-183)；寡核苷酸指导的诱变(参见例如，Reidhaar-Olson等人，1988，Science 241：53-57)；化学诱变(参见例如，Eckert等人，1987，Mutat.Res.178：1-10)；易错PCR(参见例如，Caldwell&Joyce，1992，PCR Methods Applic.2：28-33)；和盒式诱变(参见例如，Arkin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，1992，89：7871-7815)；(一般参见例如，Arnold，1993，Curr.Opinion Biotechnol.4：450-455；Ling等人，1997，Anal.Biochem.，254(2)：157-78；Dale等人，1996，Methods Mol.Biol.57：369-74；Smith，1985，Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein等人，1985，Science，229：1193-1201；Carter，1986，Biochem.J.237：1-7；Kramer等人，1984，Cell 38：879-887；Wells等人，1985，Gene 34：315-323；Minshull等人，1999，Current Opinion in Chemical Biology 3：284-290)。
在一个实施方案中，DNA改组用于产生Cry1衍生的核酸分子。DNA改组可以在体外、在体内、在计算机芯片上或其组合上完成。可以执行在计算机芯片上的重组方法，其中在计算机中使用遗传算法，以重组相应于同源(或甚至非同源)核酸的序列串。所产生的重组序列串通过合成对应于重组序列的核酸任选转变成核酸，例如，与寡核苷酸合成基因重装配技术一致。这种方法可以产生随机、部分随机或设计的改变。关于下述的许多细节在本领域中描述(参见例如，国际公开号WO 00/42560和WO 00/42559)：在计算机芯片中重组，包括遗传算法、遗传操作符等在计算机系统中的使用，其与相应核酸的产生组合以及设计的核酸(例如，基于交换位点选择)的组合以及设计的、伪随机或随机重组方法。
在另一个实施方案中，靶向的诱变用于产生Cry1衍生的核酸分子，这通过选择相应野生型Cry1或相关核酸分子的特定核苷酸序列或位置用于改变来实现。此种靶向的突变可以在核酸的任何位置处引入。例如，人们可以制备核苷酸置换，从而导致在“非必需”或“必需”氨基酸残基处的氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可以由野生型序列改变而不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是多肽的至少一种生物活性所需的。例如，在各个物种的同源物中非保守或仅半保守的氨基酸残基对于活性可能是非必需的。可替代地，在各个物种的同源物中保守的氨基酸残基对于活性可能是必需的。
此种靶向的突变可以是保守的或非保守的。“非保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基由具有不同侧链的氨基酸残基替换的那种。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中得到定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺)，不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
可替代地或除了非保守氨基酸置换外，此种靶向的突变可以是保守的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基由具有相似侧链的氨基酸残基替换的那种。诱变后，可以重组表达所编码的蛋白质，并且可以测定蛋白质的活性。
在另一个实施方案中，随机诱变用于制备Cry1衍生的核苷酸。突变可以沿着所有或部分编码序列随机引入(例如，通过饱和诱变或通过易错PCR)。在某些实施方案中，编码其他相关多肽的核苷酸序列可以在诱变过程中用于产生序列的多样性，所述其他相关多肽具有相似结构域、结构基序、活性位点，或与本发明的Cry1的部分比对具有错配或不完美的匹配。
应当理解对于上文提及的一些技术中的每个诱变步骤，可以执行任何或所有步骤的许多迭代循环，以最优化序列的多样性。上文描述的方法可以以任何所需顺序组合使用。在许多情况下，该方法导致改变的核酸序列库或包含改变的核酸序列的重组宿主细胞库。改变的核酸序列或表达具有所需特征的改变的核酸序列的宿主细胞，可以通过用本领域已知的一种或多种测定筛选进行鉴定。测定可以在就具有所需物理或化学特征的多肽选择的条件下进行。核酸序列中的改变可以通过测序编码变体中的改变多肽的核酸分子进行测定。
此外，Cry1衍生的核酸分子可以是整体或部分密码子最优化的。因为任何一种氨基酸(除甲硫氨酸和色氨酸外)由许多密码子编码(表2)，所以可以改变核酸分子的序列而不改变所编码的氨基酸。密码子最优化是当一种或多种密码子在核酸水平上改变，从而使得氨基酸未改变，但在特定宿主生物中的表达增加。本领域普通技术人员将认识到密码子表和提供关于广泛生物的偏爱信息的其他参考文献是本领域可用的。
测定杀昆虫活性的方法
如本文所使用的，术语“杀昆虫活性”指在多肽摄入后多肽减少或抑制昆虫进食和/或增加昆虫死亡率的能力。尽管可能影响任何昆虫，但优选影响鳞翅目(Lepidopteran)的昆虫，包括铃夜蛾属(Helicoverpa)、实夜蛾属(Heliothis)或灰翅夜蛾属的昆虫。
多种测定可以用于测定本发明的具体多肽是否具有杀昆虫活性，并且如果具有的话，那么到何种程度。一般地，给昆虫害虫提供可以摄入的任何形式的本发明多肽。观察昆虫害虫对本发明的多肽摄入的反应(例如，约1-3天)。在摄入本发明的多肽后，进食的减少或抑制和/或昆虫害虫死亡率中的增加是杀昆虫活性的指标。具有未知杀昆虫活性的本发明的多肽应与阳性和/或阴性对照进行比较，以更精确地评估测定的结果。
在一个实施方案中，本发明的多肽进行纯化(以可溶形式或晶体形式)且加入昆虫饮食中。
在另一个实施方案中，本发明的多肽可以在重组微生物(例如，大肠杆菌(E.coli))中进行表达。将重组微生物直接饲喂给昆虫害虫(参见Moellenbeck等人，2001，Nat.Biotechnol.19：668)。
在另一个实施方案中，本发明的多肽在植物中进行表达，并且将植物饲喂给昆虫害虫。温育时间段后，昆虫害虫的摄食活性可以通过正常将由昆虫害虫吃掉的植物部分的目测观察(例如，剩余叶面积的大约分数)或视频捕捉(例如，剩余叶面积中的像素数目)进行测定。在具体实施方案中，本发明的多肽在植物中的表达是瞬时的。在此种实施方案中，将编码本发明的多肽的核酸克隆到植物表达载体内，并且转染到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)内。转化的细菌培养物与来自本氏烟草的叶进行共培养，并且使用强制浸润，叶表达本发明的多肽。然而，多肽的表达在叶共培养物之间是可变的。在另一个具体实施方案中，本发明的多肽在植物中的表达是稳定的。在此种实施方案中，制备表达本发明多肽的转基因植物。
在另一个实施方案中，本发明的多肽的杀昆虫活性通过使用培养的细胞测量细胞死亡和/或细胞生长进行测定。此种测定一般涉及培养的昆虫细胞或细胞的使用，所述培养的昆虫细胞对被筛选的特定毒素易感，所述细胞天然地或由于异源基因的表达而表达关于特定毒素的受体。因此，除了昆虫细胞外，哺乳动物、细菌和酵母细胞在体外测定中有用的那些细胞中。测量针对培养的细胞的毒性的体外生物测定在本领域中进行描述(例如，Johnson，1994，J.Invertebr.Pathol.63：123-129)。
在另一个实施方案中，本发明的多肽的杀昆虫活性通过在靶昆虫衍生的中肠上皮膜小泡中测量孔形成进行测定(Juttner和Ebel，1998，Biochim.Biophys.Acta 1370：51-63.；English等人，1991，Insect Biochem.21：177-184)。此种测定可以构成来自膜小泡的腔的配体激活底物的毒素条件性释放。这要求配体位于小泡的外侧上。可替代地，可以利用相反情况，由此配体在小泡腔中且现成用于激活的底物位于小泡的外侧上。毒素活性越高，形成的孔数目或尺寸越大。
增强植物中的昆虫抗性的方法
本发明提供了通过使用Cry1衍生的杀昆虫多肽增强植物对于昆虫害虫的抗性的方法，所述昆虫害虫包括但不限于铃夜蛾属物种(例如，谷实夜蛾和烟芽夜蛾)和/或灰翅夜蛾属物种(例如，甜菜夜蛾、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))的成员。本领域已知的任何方法都可以用于促使昆虫害虫在以植物为食的过程中摄入本发明的一种或多种多肽。同样，昆虫害虫将摄入杀昆虫量的本发明的一种或多种多肽，并且可能停止以植物为食。在一些实施方案中，昆虫害虫通过摄入本发明的一种或多种多肽而被杀死。在其他实施方案中，昆虫害虫被抑制或阻碍以植物为食而不被杀死。
在一个实施方案中，可以制备转基因植物以表达本发明的一种或多种多肽。转基因植物可以在所有组织中表达本发明的一种或多种多肽(例如，总体表达)。可替代地，本发明的一种或多种多肽可以仅在部分组织中表达(例如，组织特异性表达)，优选由昆虫害虫消耗的那些组织。本发明的多肽可以在植物中组成型表达或处于诱导型启动子的控制下。本发明的多肽可以通过蛋白质靶向或通过叶绿体基因组的转化在植物细胞溶胶或在植物叶绿体中表达。
在另一个实施方案中，包含本发明的一种或多种多肽的组合物可以外部应用于对于昆虫害虫易感的植物。组合物的外部应用包括整体或部分直接应用于植物，和/或间接应用于例如植物周围的环境例如土壤。组合物可以通过本领域已知的任何方法进行应用，包括但不限于，喷雾、撒粉、喷洒等。一般而言，组合物可以在植物生长期间在任何时间进行应用。本领域技术人员可以使用本领域已知的方法，以凭经验测定关于施用组合物的最佳时间。影响最佳施用时间的因素包括但不限于，易感植物的类型、昆虫害虫的类型，本发明的哪一种或多种多肽在组合物中施用。
包含本发明的一种或多种多肽的组合物可以是基本上纯化的多肽、苏云金芽孢杆菌细胞的细胞悬浮液、细胞沉淀、细胞上清液、细胞提取物、或孢子-晶体复合物。包含本发明的一种或多种多肽的组合物可以是溶液、乳剂、悬浮液或粉末的形式。液体制剂可以是水性或非水性的，并且可以作为泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化浓缩物等提供。制剂可以包括除本发明的一种或多种多肽外的试剂。例如，组合物可以进一步包含展布剂-粘着剂佐剂、稳定剂、其他杀昆虫添加剂、稀释剂、最优化组合物的流变学性质或稳定性的试剂，例如表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
在另一个实施方案中，表达本发明的一种或多种多肽的重组宿主应用在植物上或植物附近，所述植物易于受昆虫害虫攻击。重组宿主包括但不限于，已由本发明的一种或多种核酸分子转化且表达本发明的一种或多种核酸分子(且因此多肽)的微生物宿主和昆虫病毒。在一些实施方案中，重组宿主将本发明的多肽分泌到其周围环境内，以便接触昆虫害虫。在其他实施方案中，重组宿主定居在对于虫害易感的一种或多种植物组织中。
重组表达
本发明的核酸分子和多肽可以使用本领域众所周知的标准重组DNA和分子克隆技术(例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989)进行重组表达。此外，重组DNA技术可以用于产生适合于用于制备转基因植物的核酸构建体。
因此，本发明的一个方面涉及包含本发明的核酸分子或其变体的载体，优选表达载体。如本文所使用的，术语“载体”指能够转运它已与之连接的另一种核酸的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，这指另外的DNA区段可以引入其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是其中另外的DNA区段可以引入病毒基因组内的病毒载体。
某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型载体)。其他载体(例如，非附加型载体)在引入宿主细胞内后整合到宿主细胞的基因组内，并且因此连同宿主基因组一起复制。一般而言，表达载体在重组DNA技术中的使用通常以质粒的形式(载体)。然而，本发明意欲包括此种其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒)。
本发明的重组表达载体包含适合于在宿主细胞中表达核酸分子的形式的本发明核酸分子。这意指重组表达载体包括基于待用于表达的宿主细胞选择的一种或多种调节序列，所述调节序列与待表达的多核苷酸可操作地结合。在重组表达载体内，“可操作地结合的”意指目的核苷酸序列与一种或多种调节序列以允许核苷酸序列表达的方式进行连接(例如，在体外转录/翻译系统中，或当载体引入宿主细胞内时，在宿主细胞中)。术语“调节序列”意欲包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。此种调节序列在本领域中得到描述(例如，Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology，1990，Academic Press，San Diego，CA)。调节序列包括指导核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些，和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中的表达的那些(例如，组织特异性调节序列)。本领域技术人员将认识到表达载体的设计可以依赖于此种因素，如待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质表达水平、在其中需要表达的生物的面积等。本发明的表达载体可以引入宿主细胞内，以由此生产由如本文描述的核酸分子编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽。
在一些实施方案中，充当启动子或增强子元件的分离的核酸可以引入非异源形式的本发明多核苷酸的合适位置中(一般是上游)，以便上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如，内源启动子可以通过突变、缺失和/或置换在体内加以改变(参见，美国专利号5,565,350；国际专利申请号PCT/US93/03868)，或分离的启动子可以以距离本发明多核苷酸的同族基因的正确方向和距离引入植物细胞内，以便控制基因的表达。基因表达可以在适合于植物生长的条件下进行调节，以便改变本发明多肽在植物细胞中的总浓度和/或改变其组成。
如果多肽表达在真核系统中是需要的，那么一般希望在多核苷酸编码区的3′末端处包括多腺苷酸化区域。用于植物表达的多腺苷酸化区域可以衍生自天然基因，多种植物基因，或土壤杆菌属T-DNA。待添加的3′末端序列可以衍生自例如，胭脂氨酸合酶或章鱼氨酸合酶基因，或可替代地衍生自另一种植物基因，或较不优选地衍生自任何其他真核基因。
本发明的重组表达载体可以设计用于在原核(例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如埃希氏菌属(Escherichia)；芽孢杆菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizoboceae)，例如根瘤菌属(Rhizobium)和根瘤杆菌属(Rhizobacter)；螺菌科(Spirillaceae)，例如发光杆菌属(photobacterium)；发酵单胞菌属(Zymomonas)；沙雷氏菌属(Serratia)；气单胞菌属(Aeromonas)；弧菌属(Vibrio)；脱硫弧菌属(Desulfovibrio)；螺菌属(Spirillum)；乳杆菌科(Lactobacillaceae)；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，例如假单胞菌属(Pseudomonas)和醋杆菌属(Acetobacter)；固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化杆菌科(Nitrobacteraceae))或真核细胞例如(使用杆状病毒表达载体的昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)中表达本发明多肽(关于合适宿主细胞的讨论参见Goeddel，同上。)。可替代地，重组表达载体可以在体外进行转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
蛋白质在原核生物中的表达最通常在大肠杆菌中进行，其中利用包含指导融合或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体。融合载体给其中编码的蛋白质，通常给重组蛋白质的氨基末端添加许多氨基酸。此种融合载体一般发挥至少3个用途：1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的可溶性；和/或3)通过充当亲和纯化中的配体帮助重组蛋白质纯化。通常，在融合表达载体中，蛋白酶剪切位点在融合部分和重组蛋白质的接头处引入，以使得在融合蛋白纯化后重组蛋白质能够与融合部分分开。此种酶及其同族识别序列，包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。一般的融合表达载体包括pGEX(PharmaciaBiotech Inc；Smith和Johnson，1988，Gene 67：31-40)、pMAL(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白与靶重组蛋白质融合。
在另一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于在酵母啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的例子包括pYepSec1(Baldari等人，1987，EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982，Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人，1987，Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)。
可替代地，表达载体是杆状病毒表达载体。可用于在培养的昆虫细胞(例如，Sf 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，1983，Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989，Virology 170：31-39)。
在另外一个实施方案中，本发明的核酸使用植物表达载体在植物细胞中进行表达，所述植物表达载体包括但不限于烟草花叶病毒和马铃薯病毒表达载体。
用于原核和真核细胞的其他合适表达系统是本领域已知的(参见，例如Sambrook等人1990，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY的第16和17章)。
许多启动子可以在本发明的实践中使用。启动子可以基于所需结果进行选择。核酸可以与组成型、组织特异性、诱导型或其他启动子组合用于在宿主生物中表达。
“组织特异性启动子”可以指导本发明核酸在特定组织、器官或细胞类型中的表达。组织特异性启动子可以是诱导型的。类似地，组织特异性启动子可以仅在那个组织内在某个时间范围或发育阶段内促进转录。其他组织特异性启动子可以在特定组织的生活周期自始至终是活性的。本领域普通技术人员将认识到组织特异性启动子可以驱动可操作地连接的序列在除靶组织外的组织中的表达。因此，如本文所使用的，组织特异性启动子是驱动优先在靶组织或细胞类型中的表达，但也可以导致在其他组织中的一些表达的那种。许多组织特异性启动子可以在本发明中使用。使用合适的启动子，可以靶向任何器官，例如枝条营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实。例如，指导核酸在叶、根或花中的表达的启动子用于增强对感染这些器官的害虫的抗性。对于本发明多核苷酸在植物的气生营养器官中的表达，可以使用光合器官特异性启动子，例如RBCS启动子(Khoudi等人，Gene 197：343，1997)。本发明多核苷酸的根特异性表达可以在根特异性启动子的控制下达到，例如，来自ANR1基因的启动子(Zhang和Forde，Science，279：407，1998)。其他示例性启动子包括来自大豆的根特异性谷氨酰胺合成酶基因(Hirel等人，1992，Plant Molecular Biology 20：207-218)和在菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件(Keller等人，1991，The Plant Cell 3：1051-1061)。
“组成型启动子”定义为将指导基因在所有组织中的表达且在大多数环境条件和发育或细胞分化的状态下是活性的启动子。组成型启动子的例子包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区，衍生自根癌土壤杆菌的T-DNA的1′-或2′-启动子，和来自本领域普通技术人员已知的各种植物基因的其他转录起始区。此种基因包括例如来自鼠耳芥属(Arabidopsis)的ACT11(Huang等人1996，Plant Mol.Biol.33：125-139)、来自鼠耳芥属的Cat3(GenBank登记号U43147，Zhong等人，1996，Mol.Gen.Genet.251：196-203)、来自欧洲油菜(Brassicanapus)的编码硬脂酰-酰基载体蛋白质去饱和酶的基因(Genbank登记号X74782，Solocombe等人1994，Plant Physiol.104：1167-1176)、来自玉蜀黍的GPc1(GenBank登记号X15596，Martinez等人，1989，J.Mol.Biol.208：551-565)、和来自玉蜀黍的Gpc2(GenBank登记号U45855，Manjunath等人，1997，Plant Mol.Biol.33：97-112)。任何强的组成型启动子例如CaMV 35S启动子，都可以用于在植物各处表达本发明多核苷酸。
术语“诱导型启动子”指在精确的环境或发育控制下的启动子。可能影响经由诱导型启动子的转录的环境条件的例子包括缺氧情况、升高的温度、光的存在、或用化学制品/激素喷雾。
用于在植物宿主细胞中使用的合适的组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子和其他相关组成型启动子(国际公开号WO99/43838和美国专利号6,072,050)；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，1985，Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，1990，Plant Cell 2：163-171)；泛蛋白(Christensen等人，1989，Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，1992，Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，1984，EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等(例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611)。
本发明的另一个方面涉及本发明的重组表达载体已引入其内的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用。应当理解此种术语不仅指特定受试者细胞，还指此种细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境影响某些修饰可能在随后世代中发生，所以事实上，此种后代可能不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文所使用的术语范围内。
因此，本发明提供了具有包含本发明核酸或其变体的表达载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核(例如，大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌或其他芽孢杆菌属物种)或真核细胞(例如昆虫细胞、酵母或植物细胞)。本发明还提供了用于表达本发明核酸从而产生所编码的多肽的方法，其包括步骤i)在允许所编码的多肽生产的条件下培养包含本发明核酸分子的细胞；和ii)分离所表达的多肽。
载体DNA可以经由常规转化或转染技术引入原核或真核细胞内。如本文所使用的，术语“转化”和“转染”意指用于将外来核酸分子引入宿主细胞内的多种领域公认技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在本领域中找到(例如，Sambrook等人，同上)。
此外，可能使特定DNA的表达靶向进入植物中的特定位置内。例如，植物中编码RUBISCO小亚基(SSU)的基因通常是高度表达的，光调节的，并且有时显示组织特异性。这些表达性质在很大程度上是由于这些基因的启动子序列。已可能使用SSU启动子在转化植物中表达异源基因。一般地，植物将包含多重SSU基因，并且不同SSU基因的表达水平和组织特异性将是不同的。SSU蛋白质在核中编码，并且在细胞质中作为包含称为叶绿体转运肽(CTP)的N末端延伸的前体进行合成。CTP将前体导向叶绿体，且促进SSU蛋白质摄入叶绿体内。在这个过程中，CTP从SSU蛋白质中切割。这些CTP序列已用于将异源蛋白质导入转化植物的叶绿体内。
SSU启动子可能具有用于在植物中表达异源基因的几个优点。一些SSU启动子是非常高度表达的，并且可以引起与用其他启动子观察到的那些一样高或比其更高的表达水平。因为来自SSU启动子的表达的组织分布不同，所以对于一些昆虫害虫的控制，将晶体蛋白质的表达导向其中SSU最高度表达的那些细胞内可以是有利的。
例如，尽管相对组成型的，在叶中CaMV35S启动子在维管组织中比叶的其他部分中更高度表达，而大多数SSU启动子在叶的叶肉细胞中最高度表达。一些SSU启动子也是更加高度组织特异性的，因此可能利用特定SSU启动子，以仅在植物组织的部分中表达本发明的蛋白质，如果例如发现此种蛋白质在某些细胞中的表达对于那些细胞是有害的话。例如，为了控制马铃薯中的科罗拉多薯虫，使用SSU启动子将晶体蛋白质表达导向叶而不是可食用的块茎，可以是有利的。
利用SSU CTP序列以使晶体蛋白质定位于叶绿体也可以是有利的。苏云金芽孢杆菌晶体蛋白质至叶绿体的定位可以保护这些不受细胞质中发现的蛋白酶的作用。这可以稳定蛋白质，并且导致活性毒素更高水平的积聚。包含CTP的cry基因可以与SSU启动子或其他启动子例如CaMV35S组合使用。
为了一些目的将Cry蛋白质导向植物细胞的其他区室也可以是有利的，因为这样可以导致蛋白质减少暴露于细胞质蛋白酶，依次导致更大的蛋白质积聚，这可以产生增强的杀昆虫活性。细胞外定位可以导致某些昆虫增加暴露于Cry蛋白质，这也可以导致增强的杀昆虫活性。如果发现特定Cry蛋白质损害植物细胞功能，那么定位至非细胞质区室可以保护这些细胞不受蛋白质的作用。
例如，在植物以及其他真核生物中，一般合成具有称为信号肽的N末端氨基酸延伸的蛋白质，其细胞外定位或定位于几个特定区室中。这种信号肽指导蛋白质进入区室化途径，并且它一般作为区室化的早期步骤从成熟蛋白质中切割。对于细胞外蛋白质，分泌途径一般涉及共翻译插入内质网内，伴随在这个阶段时发生的信号肽的切割。成熟蛋白质随后经过高尔基体进入与质膜融合的小泡内，从而使蛋白质释放到细胞外间隙内。前往其他区室的蛋白质遵循相似途径。例如，前往内质网或高尔基体的蛋白质遵循这个方案，但它们特异性保留在合适的区室中。在植物中，一些蛋白质也靶向液泡，许多植物细胞的细胞质中的另一个膜结合区室。液泡靶向蛋白质在高尔基体时偏离上述途径，在其中它们进入与液泡融合的小泡。
这种蛋白质靶向的共同特征是起始区室化过程的信号肽。使信号肽与蛋白质融合在许多情况下将导致那种蛋白质靶向内质网。这个步骤的效率可能也依赖于成熟蛋白质其自身的序列。将蛋白质导向特定区室而不是细胞外间隙的信号并未明确限定。看起来将蛋白质导向特定区室的许多信号包含在成熟蛋白质的氨基酸序列内。这已对于一些液泡靶向蛋白质显示，但仍不能精确限定这些序列。看起来分泌到细胞外间隙内是关于这样的蛋白质的“缺省”途径，所述蛋白质包含信号序列但不包含其他区室化信号。因此，将Cry蛋白质导出细胞质的策略是使关于合成Cry蛋白质的基因与编码已知植物信号肽的DNA序列融合。这些融合基因将产生进入分泌途径的cry蛋白质，且导致细胞外分泌或靶向液泡或其他区室。
关于几种植物基因的信号序列已得到描述。一个此种序列是先前已得到描述的关于烟草发病机理相关的蛋白质PR1b(Cornelissen等人，1986)。PR1b蛋白质正常定位于细胞外间隙。另一种类型的信号肽包含在豆类的种子储存蛋白质上。这些蛋白质定位于种子的蛋白质体，其是种子中发现的液泡样区室。关于刀豆(肾豆(Phaseolus vulgaris))的7S储存蛋白的β亚基的信号肽DNA序列，PvuB已得到描述(Doyle等人，1986)。基于所公开的这些公开序列，可以使用编码关于PR1b和PvuB的信号肽的寡核苷酸化学合成基因。在一些情况下，为了达到异源蛋白质的分泌或区室化，除信号肽的正常切割位点外可能必须包括一些氨基酸序列。这可能是确保信号肽的正确切割所必需的。
转基因植物的生产
本领域已知的任何方法都可以用来用本发明的核酸分子转化植物或植物细胞。核酸分子可以整合入植物DNA(例如基因组DNA或叶绿体DNA)或维持不插入植物DNA(例如通过使用人工染色体)。将核酸分子引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人，1986，Biotechniques 4：320-334)；电穿孔(Riggs等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.83：5602-5606；D′Halluin等人，1992，Plant Cell 4：1495-1505)；土壤杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840，Osjoda等人，1996，Nature Biotechnology 14：745-750；Horsch等人，1984，Science233：496-498，Fraley等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.80：4803，和Gene Transfer to Plants，Potrykus，ed.，Springer-Verlag，Berlin 1995)；直接基因转移(Paszkowski等人，1984，EMBO J.3：2717-2722)；冲击颗粒加速(ballistic particle acceleration)(美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes等人，1995，“Direct DNA Transferinto Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment，in Plant Cell， Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg andPhillips，Springer-Verlag，Berlin；和McCabe等人，1988，Biotechnology6：923-926)；病毒介导的转化(美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931)；花粉转化(De Wet等人，1985，inThe Experimental Manipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等人，Longman，New York，pp.197-209)；Lec 1转化(美国专利申请系列号09/435,054；国际公开号WO 00/28058)；whisker介导的转化(Kaeppler等人，1990，Plant Cell Reports 9：415-418；Kaeppler等人，1992，Theor.Appl.Genet.84：560-566)；和叶绿体转化技术(Bogorad，2000，Trendsin Biotechnology 18：257-263；Ramesh等人，2004，Methods Mol Biol.274：301-7；Hou等人，2003，Transgenic Res.12：111-4；Kindle等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88：1721-5；Bateman和Purton，2000，MolGen Genet.263：404-10；Sidorov等人，1999，Plant J.19：209-216)。
用来产生转基因植物和植物细胞的转化规程的选择可以根据靶向转化的植物或植物细胞类型，即单子叶植物或双子叶植物而变化。特别适于特殊植物类型的转化规程实例包括对于马铃薯(Tu等人，1998，Plant Molecular Biology 37：829-838；Chong等人，2000，TransgenicResearch 9：71-78)；大豆(Christou等人，1988，Plant Physiol.87：671-674；McCabe等人，1988，BioTechnology 6：923-926；Finer和McMullen，1991，In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182；Singh等人，1998，Theor.Appl.Genet.96：319-324)；玉蜀黍(Klein等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85：4305-4309；Klein等人，1988，Biotechnology6：559-563；Klein等人，1988，Plant Physiol.91：440-444；Fromm等人，1990，Biotechnology 8：833-839；Tomes等人，1995，“Direct DNATransfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment，”inPlant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg(Springer-Verlag，Berlin))；谷类(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984，Nature 311：763-764；美国专利号5,736,369)的那些。
在一些实施方案中，在产生转基因植物和植物细胞中，使用一个以上构建体进行转化。多个构建体可以以顺式或反式位置包括。在优选实施方案中，每个构建体都具有启动子和其它调节序列。
可以培养通过任何上述转化技术获得的转化植物细胞以产生具有转化基因型和由此具有所需表型的完整植物。这种再生技术依靠某些植物激素在组织培养生长培养基中的操作，一般依靠已与所需核苷酸序列一起引入的杀生物剂和/或除草剂标记。本领域描述了从培养的原生质体的植物再生(例如Evans等人，Protoplasts Isolation and Culture， Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，MacMillilan PublishingCompany，New York，1983；和Binding，Regeneration of Plants，PlantProtoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985)。还可以从植物愈伤组织、外植体、器官或其部分获得再生。本领域也描述了这种再生技术(例如Klee等人，1987，Ann.Rev.of Plant Phys.38：467-486)。
术语“植物”包括完整植物、枝条营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如维管组织、基本组织等等)和细胞(例如保卫细胞、卵细胞、毛状体等等)和其子代。本发明方法中可以使用的植物类别包括可进行转化技术的高等和低等植物，包括被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。还包括多种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子植物。
本发明的核酸分子可以用于给基本上任何植物赋予所需性状。因此，本发明已使用了广泛的植物，包括来自Agrotis、葱属(Allium)、凤梨属(Ananas)、腰果属(Anacardium)、Apium、落花生属(Arachis)、天门冬属(Asparagus)、Athamantha、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、箣竹属(Bambusa)、甜菜属(Beta)、芸苔属(Brassica)、雀麦属(Bromus)、Browaalia、山茶属(Camelia)、大麻属(Cannabis)、番木瓜属(Carica)、长角豆属(Ceratonia)、鹰嘴豆属(Cicer)、藜属(Chenopodium)、Chicorium、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、红蓝花属(Carthamus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、薏苡属(Coix)、香瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、曼陀罗属(Datura)、胡萝卜属(Daucus)、石竹属(Dianthus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、Eliusine、大戟属(Euphorbia)、羊茅属(Festuca)、榕属(Ficus)、草莓属(Fragaria)、老鹳草属(Geranium)、大豆属(Glycine)、禾本科(Graminae)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、Hevea、木槿属(Hibiscus)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、番薯属(Ipomoea)、莴苣属(Lactuca)、山黧豆属(Lathyrus)、兵豆属(Lens)、百合属(Lilium)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、百脉根属(Lotus)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、澳洲坚果属(Macadamia)、Macrophylla、苹果属(Malus)、芒果属(Mangifera)、木薯属(Manihot)、Majorana、苜蓿属(Medicago)、芭蕉属(Musa)、水仙属(Narcissus)、Nemesia、烟草属(Nicotiana)、驴食豆属(Onobrychis)、木犀榄属(Olea)、Olyreae、稻属(Oryza)、稷属(Panicum)、稷属(Panicum)、Panieum、Pannisetum、狼尾草属(Pennisetum)、碧冬茄属(Petunia)、天竺葵属(Pelargonium)、鳄梨属(Persea)、Pharoideae、菜豆属(Phaseolus)、梯牧草属(Phleum)、云杉属(Picea)、早熟禾属(Poa)、松属(Pinus)、黄连木属(Pistachia)、豌豆属(Pisum)、杨属(Populus)、黄杉属(Pseudotsuga)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、Pseutotsuga、番石榴属(Psidium)、栎属(Quercus)、毛莨属(Ranunculus)、萝卜属(Raphanus)、条藨子属(Ribes)、蓖麻属(Ricinus)、杜鹃花属(Rhododendron)、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属(Saccharum)、Salpiglossis、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、狗尾草属(Setaria)、北美红杉属(Sequoia)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、蜀黍属(Sorghum)、钝叶草属(Stenotaphrum)、Theobromus、胡芦巴属(Trigonella)、车轴草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、铁杉属(Tsuga)、郁金香属(Tulipa)、野蚕豆属(Vicia)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉蜀黍属(Zea)的物种。
在具体实施方案中，转基因植物是玉蜀黍、马铃薯、稻、大豆、苜蓿、向日葵、低芥酸菜子或棉花植物。
可以培养转基因植物并用相同转化的株系或不同的株系授粉。可以生长两代或更多代植物以确保稳定维持和遗传所需核酸分子、多肽和/或表型特征的表达。本领域普通技术人员将认识到本发明核酸分子稳定整合入转基因植物和证实可操作后，它可以通过有性杂交引入其它植物。可以使用众多标准育种技术的任何一种，这取决于待杂交的物种。
在某些实施方案中，实施方案的多核苷酸可以与目的多核苷酸序列的任何组合进行堆积，以产生具有所需性状的植物。例如，实施方案的多核苷酸可以与编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的任何其他多核苷酸进行堆积，所述多肽例如其他Bt毒性蛋白质(在例如美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene 48：109中描述)，凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.24：825，pentin(在美国专利号5,981,722中描述)等。所产生的组合还可以包括任何一种目的多核苷酸的多个拷贝。实施方案的多核苷酸也可以与任何其他基因或基因组合进行堆积，以产生具有多种所需性状组合的植物，包括但不限于，对于动物饲料所需的性状，例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡氨基酸(例如，hordothionins(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene 71：359；和Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；增加的可消化性(例如，改性的储存蛋白(于2001年11月7日提交的美国申请系列号10/053,410)；和硫氧还蛋白(于2001年12月3日提交的美国申请系列号10/005,429)；所述参考文献的公开内容引入本文作为参考。
实施方案的多核苷酸也可以与下述进行堆积：对于疾病或除草剂抗性所需的性状(例如，串珠镰孢菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性和疾病抗性基因(Jones等人(1994)Science 266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；编码对于谷氨酰胺合酶抑制剂例如膦丝菌素或草铵膦的抗性的基因(例如，bar或PAT基因)；和草甘膦抗性(EPSPS和GAT(草甘膦乙酰转移酶)基因(Castle等人(2004)Science 304：1151))；和对于加工或加工产物所需的性状，例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；改性油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、和淀粉脱支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(bioplastics)(例如，美国专利号5,602,321；β-酮硫解酶(ketothiolase)、聚羟基丁酸酯合酶、和促进聚羟基链烷酸酯(PHAs)表达的乙酰乙酸辅酶A还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847))；所述参考文献的公开内容引入本文作为参考。人们还可以使实施方案的多核苷酸与提供农业性状或转化技术性状的多核苷酸组合，所述农业性状例如雄性不育(参见，例如，美国专利号5,583,210)、茎强度、开花时间，所述转化技术性状例如细胞周期调节或基因靶向(例如，WO 99/61619、WO 00/17364和WO99/25821)；所述文献的公开内容引入本文作为参考。
这些堆积的组合可以通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何方便的或TopCross技术或遗传转化杂交育种植物。如果序列通过遗传转化植物进行堆积，那么目的多核苷酸序列可以在任何时间且以任何顺序进行组合。例如，包含一种或多种所需性状的转基因植物可以用作靶，以通过后续转化引入更多性状。性状可以在共转化规程中与由转化盒的任何组合提供的目的多核苷酸同时引入。例如，如果将引入2种序列，那么2种序列可以包含在分开的转化盒(反式)中或包含在相同的转化盒(顺式)上。序列的表达可以由相同启动子或不同启动子驱动。在某些情况下，可能希望引入将抑制目的多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合，以在植物中产生所需性状组合。进一步认识到多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统在所需基因组位置处进行堆积。参见，例如WO99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855和WO 99/25853，所述所有文献引入本文作为参考。
转基因植物中的表达的测定
本领域已知的任何方法都可以用于测定植物中本发明核酸分子或由其编码的多肽的表达水平。例如，在植物中由本发明核酸分子编码的多肽的表达水平可以通过免疫测定、定量凝胶电泳等进行测定。本发明核酸分子的表达可以通过从植物中分离的RNA的逆转录定量PCR(qRT-PCR)进行直接测量。此外，在植物中由本发明核酸分子编码的多肽的表达水平可以通过植物表型改变的程度进行测定。在具体实施方案中，增强的昆虫抗性是待测定的表型。
如本文所使用的，“增强的昆虫抗性”指与未表达本发明多肽的植物相比较，表达本发明多肽的转基因植物对于经由昆虫害虫消耗和/或侵袭增加的抗性。增强的抗性可以以许多方式进行测量。在一个实施方案中，增强的抗性通过在相同的昆虫温育时间段后，与未表达本发明多肽的植物相比较，对于表达本发明多肽的植物减少的损害进行测量。昆虫损害可以目测地进行评估。例如在棉花植物中，在侵袭后的损害可以通过就由昆虫消耗的痕迹在棉花植物棉桃处直接察看进行测量。在另一个实施方案中，增强的抗性通过在相同的昆虫温育时间段后，与未表达本发明多肽的植物相比较，来自表达本发明多肽的植物增加的农作物产量进行测量。在具体实施方案中，昆虫害虫来自鳞翅目昆虫，包括Heliothine、地老虎属(Agrotis)、尺夜蛾属(Pseudoplusia)、禾草螟属(Chilo)、灰翅夜蛾属物种等。
测定可以使用全植物、其组织或植物细胞培养物来进行。
本文引用的所有公开的文章、书、参考手册和摘要的内容整体在此引入作为参考，以更充分地描述本发明所属领域的状态。
因为可以在不背离本发明的范围和精神的情况下在上文描述的主题中进行各种改变，所以预期上文说明书包含和/或附加权利要求中限定的所有主题应解释为本发明的描述和举例说明。根据上文教导，本发明的修饰和改变是可能的。
实施例
实施例1：单基因改组
Cry1Ac毒素是目前已知控制棉花中的实夜蛾属昆虫最有效的毒素。然而，Cry1Ac对于灰翅夜蛾属种类的次要害虫具有极少活性。Cry1Ab毒素是用于棉花昆虫害虫控制的极佳起始活性，因为它对于谷实夜蛾具有比Cry1Ac略微更少的活性，但优良得多的甜菜夜蛾活性。为了应付这种产品缺陷，Cry1Ab样基因进行改组以获得Cry1衍生多肽，其具有改善Heliothine的活性，同时保留基本上完全的灰翅夜蛾属效力。用于产生Cry1衍生多肽的一种方法是‘单基因改组’(与改组相组合的诱变)。Cry1Ab的改组如下进行。Cry1Ab基因从翻译起始到kpnI位点的5′部分的2个重叠片段，通过2次分开的PCR反应由包含Cry1Ab1基因的苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(Bt kurstaki)菌株进行扩增。这些片段通过内切核酸酶进行进一步片段化，且在某些突变条件下进行装配，以产生一系列改组基因或改组基因文库。这种改组部分包含编码成熟毒素的区域。为了克隆且表达改组基因文库，我们构建了大肠杆菌-Bt穿梭载体，其包含四环素抗性基因和用于2种宿主的2个复制子。该载体还包含cry1Ca基因从KpnI位点到翻译结束的剩余(未改组的)3′部分连同cry1Ca转录启动子和cry1Ac终止子。当改组的基因文库克隆到这种载体中时，产生全长135-kDa蛋白质。改组的基因文库在称为BtG8的cry--Bt宿主中进行表达，所述BtG8通过质粒自愈(curing)衍生自HD1菌株。进行选择以确保通过电穿孔的高转化能力，这是制备多样化的改组文库所需的。所选择的宿主BtG8显示超过106转化体/1ug DNA的能力水平。改组的基因文库通过顺次转化大肠杆菌XL-1Blue、大肠杆菌GM2163和BtG8进行制备。XL-1Blue用于高转化效率。质粒由转化的XL-1Blue细胞进行制备，并且小部分通过凝胶电泳进行检查，以确保没有可见量的不含改组DNA的载体分子。GM2163用于制备未甲基化的DNA用于BtG8的电穿孔转化。通过自动机将在四环素板上生长的转化的BtG8挑取到96孔板上。这些板进行温育直至孢子形成，并且培养物用作种子用于测定样品生产。我们使用双重昆虫筛选以获得高通量。第一重是消除不含任何可检测活性的变体。第一重测定样品在浅96孔板中在CYS液体培养基中进行生产，如由Yamamoto的出版物(Identification of entomocidaltoxins of Bacillus thuringiensis by high-performance liquidchromatography.in Analytical chemistry of Bacillus thuringiensis.编辑Hickle，LA.和Fitch，W.L.，American Chemical Society，Washington DC，USA，46-60，1990)中描述的。在这个阶段时，包含晶体和孢子的培养液体培养基在包含人工昆虫饮食的96孔板中用新生谷实夜蛾幼虫进行测定。选择显示活性的那些变体用于下一个步骤。对于第二重筛选，通过在pH 10.5-pH 4.4之间的差异溶解，由深96孔板中生产的1ml培养液体培养基纯化晶体蛋白质。晶体在pH 10.5下用2％2-巯基乙醇进行溶解，并且溶解的晶体蛋白质在pH 4.4下进行沉淀。测定蛋白质浓度后，进行系列稀释，并且使用昆虫饮食掺入测定针对谷实夜蛾幼虫进行测定。筛选几千个变体后，我们发现显示超过亲本Cry1Ab的改善谷实夜蛾活性的相当大量蛋白质。这些改善的变体随后针对甜菜夜蛾进行测试。
起因于单基因改组的多肽就相对于野生型Cry1Ab增加的谷实夜蛾活性进行筛选。AR2(SEQ ID NOS：1和2)和AR6(SEQ ID NOS：3和4)鉴定为显示针对谷实夜蛾改善的活性的Cry1衍生多肽(图1)。AR6的活性通过比较关于AR6、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1Ca的毒素原对于烟芽夜蛾、谷实夜蛾和甜菜夜蛾的相对的倒数EC50值进行进一步研究(图2)。将纯化的Cry1Ab、AR6、Cry1Ac和Cry1Ca毒素原以6剂和24次重复引入人工饮食内，以测定每种毒素原针对3种昆虫的EC50。实验重复3次，并且EC50值表示为3次试验的平均值。随后将EC50值转变成相对的倒数值。因为Cry1Ac对于烟芽夜蛾和谷实夜蛾具有最低的EC50(最高的比活性)，所以对于那些分别的昆虫害虫各自给出1.0的值。其他毒素原样品对于烟芽夜蛾和谷实夜蛾具有更高的EC50值(更低的比活性)，并且转变成相对于Cry1Ac的那种的值。同样Cry1Ca对于甜菜夜蛾具有最低的EC50值，并且因此给出对于那种害虫‘1.0’的相对值。其他毒素原的EC50值更高(更低的比活性)，并且指定对于这种昆虫更低的相对值。这些数据显示AR6对于谷实夜蛾和甜菜夜蛾具有等于野生型Cry1Ab接近2倍的比活性(图2)。亲本毒素Cry1Ab和改组克隆之间的氨基酸序列差异的描述在表3中描述。
进行另外的单基因改组实验，以改善Cry1Ca的灰翅夜蛾属活性。如对于改组cry1Ab基因所进行的，对cry1Ca DNA模板实施诱变和DNA改组。由改组变体生产的蛋白质就改善的甜菜夜蛾活性进行筛选。发现与野生型Cry1Ca蛋白质相比较，变体之一CR62(SEQ ID NOS：7和8)具有～3倍改善的EC50(图3)。
实施例2：合成CR62基因的构建
CR62和亲本基因Cry1Ca的DNA序列使用随机密码子选择进行修改，以产生完全合成的植物可表达基因(分别为SEQ ID NO：9和SEQID NO：31。表4提供了这些基因之间所编码的氨基酸序列差异的描述。构建合成CR62和Cry1Ca基因后，将编码区克隆到二元载体内在强组成型植物病毒启动子后，并且将后续质粒转化到根癌土壤杆菌C58内。这些菌株就在植物中的功效进行测试，其中使用基于土壤杆菌属叶浸润的瞬时表达系统，随后为甜菜夜蛾的叶盘生物测定。使用这种测定，显示2种基因都表达杀昆虫活性，尽管改组的CR62基因比未改组的野生型亲本执行得更好(数据未显示)。
实施例3：合成MR8′和AR6基因的构建
AR6的DNA序列被靶向用于修饰，以产生合成形式的AR6编码区(SEQ ID NOS：5和6)，如部分6.2中对于CR62描述的。然而，在这种情况下仅AR6编码N末端毒素原和毒素结构域的5′末端被靶向用于再合成。这种N末端编码区剪接到来自合成CR62基因的已存在的合成C末端毒素原编码区，以形成完全毒素原基因用于植物表达。在生产合成AR6基因的过程中，构建前体基因。这种基因命名为MR8′(SEQ ID NO：11)，编码在毒素部分与AR6(SEQ ID NO：6)的那种的8氨基酸残基差异，和在蛋白质的毒素原部分中的4氨基酸差异(表3)。
实施例4：合成AR6基因的在植物中的测试
在构建合成MR8′和AR6基因后，将编码区克隆到具有强组成型植物病毒启动子的二元载体内，并且将后续质粒转化到根癌土壤杆菌C58内。这些菌株就在植物中的功效进行测试，其中使用基于土壤杆菌属叶浸润的瞬时表达系统，随后为叶盘昆虫生物测定。如由蛋白质印迹分析显示的，合成AR6和MR8′都在瞬时叶测定中表达(图4)。
为了就在植物中的活性进行测试，给害虫提供表达目的多肽的叶盘。24小时温育时间段后，害虫对于叶盘的摄食活性通过目测观察进行测定。关于谷实夜蛾和甜菜夜蛾活性的阳性对照分别是编码Cry2Ab-样(*)多肽和CR62的基因。结果显示合成AR6和MR8′都赋予对于谷实夜蛾(图5A)和甜菜夜蛾(图5B)的高水平抗性。用缺乏Cry基因的土壤杆菌属浸润的叶盘在测定时间段期间完全由昆虫幼虫消耗(未显示)。
实施例5：使用MR8′作为亲本的进一步改组
为了进一步改善MR8′的活性，使用MR8′作为亲本克隆进行第二轮DNA改组。通过用寡核苷酸指导添加的序列多样性在片段化的MR8′DNA模板上进行改组。因为MR8′基因编码毒素原，所以改组限于负责杀昆虫性质的活性毒素区域。2种序列多样性用于掺入改组反应内：系统发育和计算机产生的随机多样性。系统发育多样性源自比对第一轮命中AR6、MR8′以及野生型Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ad、Cry1Ae和Cry1Ag多肽。随机多样性通过选择随机氨基酸位置和指导在那些位置处的保守或非保守氨基酸改变来产生。通过结构域基础将2种多样性在结构域上掺入亲本MR8′基因和所编码的蛋白质内。构建了几个文库，各自集中于所选择类型的多样性，并且应用于分离的毒素结构域区域或整个毒素区域。DNA改组后，通过PCR缝合(stitching)将每个PCR扩增的文库片段再引入剩余的MR8′毒素原片段内。重构建的毒素原文库随后克隆到pUC样载体内，从而使得Cry1衍生多肽在大肠杆菌中由LacZ启动子表达。
为了评估Cry1衍生多肽针对谷实夜蛾的活性，以阵列形式进行使用人工饮食的高通量筛选，所述人工饮食包含表达每种Cry1衍生多肽的全部大肠杆菌细胞(数据未显示)。具有高水平活性的这些变体随后就在植物中的活性进行测试。所测试的变体中存在的氨基酸多样性显示于表5中。改组的毒素区域的氨基酸序列以及编码每种毒素原的核苷酸序列由SEQ ID NOS：11-28提供。
为了起始在植物中的测定，将所有高活性的Cry1衍生变体克隆到基于根癌土壤杆菌的植物表达载体内。随后将二元载体转化到宿主土壤杆菌属内。Cry1衍生多肽随后通过各自以4次重复与本氏烟草叶共培养进行筛选(使用每种分别培养物的强制浸润)。从浸润的叶区域中提取叶盘，并且用个别的三龄谷实夜蛾或四龄甜菜夜蛾幼虫侵袭。24小时后，摄食活性通过以像素表达的剩余叶面积的视频捕捉进行测定。
图6显示所示Cry1衍生多肽对于谷实夜蛾的活性。图7显示所示Cry1衍生多肽对于甜菜夜蛾的活性。所有测试的Cry1衍生多肽显示与亲本多肽MR8′相比较，针对谷实夜蛾改善的活性，同时保留至少与MR8′一样好的针对甜菜夜蛾的活性。
表1：Cry1和Cry1衍生序列
Figure BDA00002418064000351
关于所有参考基因和蛋白质的来源：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/index.html
关于苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白质的命名法的修正
N.Crickmore，D.R.Zeigler，J.Feitelson，E.Schnepf，J.Van Rie，D.Lereclus，J.Baum和D.H.Dean.Microbiology and Molecular BiologyReviews(1998)第62卷：807-813
表2：密码子表
Figure BDA00002418064000361
表3：Cry1Ab和第一轮改组命中之间的氨基酸序列差异的比较
Figure BDA00002418064000362
氨基酸比对衍生自所列出的DNA序列的翻译。在位置2处的缺口插入非合成衍生的氨基酸序列内，以适应在合成衍生的多肽序列中在那个位置处的甘氨酸残基的插入。因此，在SEQ IDNOs：1、3和33中匹配的氨基酸位置将比除位置1外的上文比对座标的每一个小1。
表4：Cry1Ca和改组命中克隆CR62之间的氨基酸序列差异的比 较
Figure BDA00002418064000371
氨基酸比对衍生自所列出的DNA序列的翻译。
表5：关于Cry1Ab和第二轮改组命中的δ-内毒素区域之间的氨基 酸序列差异的比较
Figure BDA00002418064000372
氨基酸位置相对于+1，是成熟毒素的第一个残基。
序列表
关于Cry1Ab、Cry1Ca和改组衍生物的毒素区域氨基酸序列：
>AR2(SEQIDNO：2)
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>AR6(SEQIDNO：4)
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>合成AR6(SEQIDNO：6)
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>CR62(SEQIDNO：8)
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>合成CR62(SEQIDNO：10)
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>MR8′(SEQIDNO：12)
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>变体41(SEQIDNO：14)
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>变体75(SEQIDNO：16)
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>变体80(SEQIDNO：18)
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>变体85(SEQIDNO：20)
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>变体88(SEQIDNO：22)
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>变体90(SEQIDNO：24)
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>变体5-40(SEQIDNO：26)
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>变体5-44(SEQIDNO：28)
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>Wt Cry1Ca SEQIDNO：30)
ISTGNSSIDISLSLVQFLVSNFVPGGGFLVGLIDFVWGIVGPSQWDAFLVQIEQLINERIAEFARNAAIANLEGLGNNFNIYVEAFKEWEEDPNNPETRTRVIDRFRILDGLLERDIPSFRISGFEVPLLSVYAQAANLHLAILRDSVIFGERWGLTTINVNENYNRLIRHIDEYADHCANTYNRGLNNLPKSTYQDWITYNRLRRDLTLTVLDIAAFFPNYDNRRYPIQPVGQLTREVYTDPLINFNPQLQSVAQLPTFNVMESSRIRNPHLFDILNNLTIFTDWFSVGRNFYWGGHRVISSLIGGGNITSPIYGREANQEPPRSFTFNGPVFRTTLSNPTLRLLQQPWPAPPFNLRGVEGVEFSTPTNSFTYRGRGTVDSLTELPPEDNSVPPREGYSHRLCHATFVQRSGTPFLTTGVVFSWTDRSATLTNTIDPERINQIPLVKGFRVWGGTSVITGPGFTGGDILRRNTFGDFVSLQVNINSPITQRYRLRFRYASSRDARVIVLTGAASTGVGGQVSVNMPLQKTMEIGENLTSRTFRYTDFSNPFSFRANPDIIGISEQPLFGAGSISSGELYIDKIEIILADATFEAESDLER
>合成Cry1Ca(SEQIDNO：32)
ISTGNSSIDISLSLVQFLVSNFVPGGGFLVGLIDFVWGIVGPSQWDAFLVQIEQLINERIAEFARNAAIANLEGLGNNFNIYVEAFKEWEEDPNNPETRTRVIDRFRILDGLLERDIPSFRISGFEVPLLSVYAQAANLHLAILRDSVIFGERWGLTTINVNENYNRLIRHIDEYADHCANTYNRGLNNLPKSTYQDWITYNRLRRDLTLTVLDIAAFFPNYDNRRYPIQPVGQLTREVYTDPLINFNPQLQSVAQLPTFNVMESSRIRNPHLFDILNNLTIFTDWFSVGRNFYWGGHRVISSLIGGGNITSPIGREANQEPPRSFTFNGPVFRTLSNPTLRLLQQPWPAPPFNLRGVEGVEFSTPTNSFTYRGRGTVDSLTELPPEDNSVPPREGYSHRLCHATFVQRSGTPFLTTGVVFSWTDRSATLTNTIDPERINQIPLVKGFRVWGGTSVITGPGFTGGDILRRNTFGDFVSLQVNINSPITQRYRLRFRYASSRDARVIVLTGAASTGVGGQVSVNMPLQKTMEIGENLTSRTFRYTDFSNPFSFRANPDIIGISEQPLFGAGSISSGELYIDKIEIILADATFEAESDLER
>Cry1Ab(SEQIDNO：34)
IETGYTPIDISLSLTQFLLSEFVPGAGFVLGLVDIIWGIFGPSQWDAFLVQIEQLINQRIEEFARNQAISRLEGLSNLYQIYAESFREWEADPTNPALREEMRIQFNDMNSALTTAIPLFAVQNYQVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSVFGQRWGFDAATINSRYNDLTRLIGNYTDHAVRWYNTGLERVWGPDSRDWIRYNQFRRELTLTVLDIVSLFPNYDSRTYPIRTVSQLTREIYTNPVLENFDGSFRGSAQGIEGSIRSPHLMDILNSITIYTDAHRGEYYWSGHQIMASPVGFSGPEFTFPLYGTMGNAAPQQRIVAQLGQGVYRTLSSTLYRRPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYRKSGTVDSLDEIPPQNNNVPPRQGFSHRLSHVSMFRSGFSNSSVSIIRAPMFSWIHRSAEFNNIIPSSQITQIPLTKSTNLGSGTSVVKGPGFTGGDILRRTSPGQISTLRVNITAPLSQRYRVRIRYASTTNLQFHTSIDGRPINQGNFSATMSSGSNLQSGSFRTVGFTTPFNFSNGSSVFTLSAHVFNSGNEVYIDRIEFVPAEVTFEAEYDLER
Cry2Ab-样(*)氨基酸全毒素原参考序列(SEQ ID NO：35)
MGNSVLNSGRTTICDAYNVAAHDPFSFQHKSLDTVQKEWTEWKKNNHSLYLDPIVGTVASFLLKKVGSLVGKRILSELRNLIFPSGSTNLMQDILRETEKFLNQRLNTDTLARVNAELTGLQANVEEFNRQVDNFLNPNRNAVPLSITSSVNTMQQLFLNRLPQFQMQGYQLLLLPLFAQAANLHLSFIRDVILNADEWGISAATLRTYRDYLKNYTRDYSNYCINTYQSAFKGLNTRLHDMLEFRTYMFLNVFEYVSIWSLFKYQSLLVSSGANLYASGSGPQQTQSFTSQDWPFLYSLFQVNSNYVLNGFSGARLSNTFPNIVGLPGSTTTHALLAARVNYSGGISSGDIGASPFNQNFNCSTFLPPLLTPFVRSWLDSGSDREGVATVTNWQTESFETTLGLRSGAFTARGNSNYFPDYFIRNISGVPLVVRNEDLRRPLHYNEIRNIASPSGTPGGARAYMVSVHNRKNNIHAVHENGSMIHLAPNDYTGFTISPIHATQVNNQTRTFISEKFGNQGDSLRFEQNNTTARYTLRGNGNSYNLYLRVSSIGNSTIRVTINGRVYTATNVNTTTNNDGVNDNGARFSDINIGNVVASSNSDVPLDINVTLNSGTQFDLMNIMLVPTNISPL
>Cry1Ac(SEQIDNO：36)
IETGYTPIDISLSLTQFLLSEFVPGAGFVLGLVDIIWGIFGPSQWDAFLVQIEQLINQRIEEFARNQAISRLEGLSNLYQIYAESFREWEADPTNPALREEMRIQFNDMNSALTTAIPLFAVQNYQVPLLSVYVQAANLHLSVLRDVSVFGQRWGFDAATINSRYNDLTRLIGNYTDYAVRWYNTGLERVWGPDSRDWVRYNQFRRELTLTVLDIVALFPNYDSRRYPIRTVSQLTREIYTNPVLENFDGSFRGSAQGIERSIRSPHLMDILNSITIYTDAHRGYYYWSGHQIMASPVGFSGPEFTFPLYGTMGNAAPQQRIVAQLGQGVYRTLSSTLYRRPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSAVYRKSGTVDSLDEIPPQNNNVPPRQGFSHRLSHVSMFRSGFSNSSVSIIRAPMFSWIHRSAEFNNIIASDSITQIPAVKGNFLFNGSVISGPGFTGGDLVRLNSSGNNIQNRGYIEVPIHFPSTSTRYRVRVRYASVTPIHLNVNWGNSSIFSNTVPATATSLDNLQSSDFGYFESANAFTSSLGNIVGVRNFSGTAGVIIDRFEFIPVTATLEAEYNLER
关于cry1Ab以及合成和改组衍生物的毒素原DNA序列
>AR2(SEQIDNO：1)
atgcataacaatccgaacaccaatgaatgcattccttataattgtttaagtaaccctgaagtagaagtattaggtggagaaagaatagaaactggttacaccccaatcgatatttccttgtcgctaacgcaatttcttttgagtgaatttgttcccggtgctggatttgtgttaggactagttgatataatatggggaatttttggtccctctcaatgggacgcatttcttgtacaaattgaacagttaattaaccaaagaataggggaattcgctaggaaccaagccatttctagattagaaggactaagcaatctttatcaaatttacgcagaatcttttagagagtgggaagcagatcctactaatccagcattaagagaagagatgcgtattcaattcaatgacatgaacagtgcccttacaaccgctattcctctttttgcagttcaaaattatcaagttcctcttttatcagtatatgttcaagctgcaaatttacatttatcagttttgagagatgtttcagtgtttggacaaaggtggggatttgatgccgcgactatcaatagtcgttataatgatttaactaggcttattggcaactatacagatcatgctgtacgctggtacaatacgggattagagcgtgtatggggaccggattctagagattggataagatataatcaatttagaagagaattaacactaactgtattagatatcgtttctctatttccgaactatgatagtagaacgtatccaattcgaacagtttcccaactaacaagggaagtttatacggacccagtattagaaaattttgatggtagttttcgaggctcggctcagggcatagaaggaagtattaggagtccacatttgatggatatacttaacagtataaccatctatacggatgctcatagaggagaatattattggtcagggcatcaaataatggcttctcctgtagggttttcggggccagaattcacttttccgctatatggaactatgggaaatgcagctccacaacaacgtattgttgctcaactaggtcagggcgtgtatagaacattatcgtccactttatatagaagaccttttaatatagggataaataatcaacaactatctgttcttgacgggacagaatttgcttatggaacctcctcaaatttgccatccgctgtatacagaaaaagcggaacggtagattcgctggatgaaataccgccacagaataacaacgtgccacctaggcaaggatttagtcatcgattaagccatgtttcaatgtttcgttcaggctttagtaatagtagtgtaagtataataagagctcctatgttctcttggatacatcgtagtgctgaatttaataatacaattgatccagagagaattaatcaaatacctttaacaaaatctactaatcttggctctggaacttctgtcgttaaaggaccaggatttacaggaggagatattcttcgaagaacttcacctggccagatttcaaccttaagagtaaatattactgcaccattatcacaaagatatcgggtaagaattcgctacgcttctaccacaaatttacaattccatacatcaattgacggaagacctattaatcaggggaatttttcagcaactatgagtagtgggagtaatttacagtccggaagctttaggactgtaggttttactactccgtttaacttttcaaatggatcgagtgtatttacgttaagtgctcatgtcttcaattcaggcaatgaattttatatagatcgaattgaatttgttccggcagaagtaacctttgaggcagaatatgatttagaaagagcacaaaaggcggtgagtgagctgcttacttcttccaatcaaatcgggttaaaaacagatgtgacggattatcatattgatcaagtatccaatttagttgagtgtttatctgatgaattttgtctggatgaaaaaaaagaattgtccgaggaagtcaaacatgcgaagcgacttantgatgagcggaatttacttcaagatccaaactttagagggatcaatagacaactagaccgtggctggaggggaagtacggatattaccatccaaggaggcgatgacgtattcaaagagaattacgttacgctattgggtaccgttgatgagtgctatccaacgtatttatatcagaaaatagatgagtcgaaattaaaagcttatacccgttatgaattaagagggtatatcgaagatagtcaagacttagaaatctatttgatccgttacaatgcaaaacacgaaatagtaaatgtgccaggcacgggttccttatggccgctttcagcccaaagtccaatcggaaagtgtggagaaccgaatcgatgcgcgccacaccttgaatggaatcctgatctagattgttcctgcagagacggggaaaaatgtgcacatcattcccatcatttcaccttggatattgatgttggatgtacagacttaaatgaggacttaggtgtatgggtgatattcaagattaagacgcaagatggccatgcaagactagggaatctagagtttctcgaagagaaaccattattaggggaagcactagctcgtgtgaaaagagcggagaagaagtggagagacaaacgagagaaactgcagttggaaacaaatattgtttataaagaggcaaaagaatctgtagatgctttatttgtaaactctcaatatgatagattacaagtggatacgaacatcgcgatgattcatgcggcagataaacgcgttcatagaatccgggaagcgtatctgccagagttgtctgtgattccaggtgtcaatgcggccattttcgaagaattagagggacgtatttttacagcgtattccttatatgatgcgagaaatgtcattaaaaatggcgatttcaataatggcttattatgctggaacgtgaaaggtcatgtagatgtagaagagcaaaacaaccaccgttcggtccttgttatcccagaatgggaggcagaagtgtcacaagaggttcgtgtctgtccaggtcgtggctatatccttcgtgtcacagcatataaagagggatatggagagggctgcgtaacgatccatgagatcgaagacaatacagacgaactgaaattcagcaactgtgtagaagaggaagtatatccaaacaacacagtaacgtgtaataattatactgggactcaagaagaatatgagggtacgtacacttctcgtaatcaaggatatgacgaagcctatggtaataacccttccgtaccagctgattacgcttcagtctatgaagaaaaatcgtatacagatggacgaagagagaatccttgtgaatctaacagaggctatggggattacacaccactaccggctggttatgtaacaaaggatttagagtacttcccagagaccgataaggtatggattgagatcggagaaacagaaggaacattcatcgtggatagcgtggaattactccttatggaggaa
>AR6(SEQIDNO：3)
atgcataacaatccgaacaccaatgaatgcattccttataattgtttaagtaaccctgaagtagaagtattaggtggagaaagaatagaaactggttacaccccaatcgatatttccttgtcgctaacgcaatttcttttgagtgaatttgttcccggtgctggatttgtgttaggactagttgatataatatggggaatttttggtccctctcaatgggacgcatttcttgtacaaattgaacagttaattaaccaaagaatagaagaattcgctaggaaccaagccatttctagattagaaggactaagcaatctttatcaaatttacgcagaatcttttagagagtgggaagcagatcctactaatccagcattaagagaagagatgcgtattcaattcaatgacatgaacagtgcccttacaaccgctattcctctttttgcagttcaaaattatcaagttcctcttttatcagtatatgttcaagctgcaaatttacatttatcagttttgagagatgtttcagtgtttggacaaaggtggggatttgatgccgcgactatcaatagtcgttataatgatttaactaggcttattggcaactatacagatcatgctgtacgctggtacaatacgggattagagcgtgtatggggaccggattctagagattggataagatataatcaatttagaagagaattaacactaactgtattagatatcgtttctctatttccgaactatgatagtagaacgtatccaattcgaacagtttcccaactaacaagggaagtttatacggacccagtattagaaaattttgatggtagttttcgaggctcggctcagggcatagaaggaagtattaggagtccacatttgatggatatacttaacagtataaccatctatacggatgctcatagaggagaatattattggtcagggcatcaaataatggcttctcctgtagggttttcggggccagaattcacttttccgctatatggaactatgggaaatgcagctccacaacaacgtattgttgctcaactaggtcagggcgtgtatagaacattatcgtccactttatatagaagaccttttaatatagggataaataatcaacaactatctgttcttgacgggacagaatttgcttatggaacctcctcaaatttgccatccgctgtatacagaaaaagcggaacggtagattcgctggatgaaataccgccacagaatgacaacgtgccacctaggcaaggatttagtcatcgattaagccatgtttcaatgtttcgttcaggctttagtaatagtagtgtaagtataataagagctcctatgttctcttggatacatcgtagtgctgaatttaataatacaattgatccagagagaattaatcaaatacctttaacaaaatctactaatcttggctctggaacttctgtcgttaaaggaccaggatttacaggaggagatattcttcgaagaacttcacctggccagatttcaaccttaagagtaaatattactgcaccattatcacaaagatatcgggtaagaattcgctacgcttctaccacaaatttacaattccatacatcaattgacggaagacctattaatcaggggaatttttcagcaactatgagtagtgggagtaatttacagtccggaagctttaggactgtaggttttactactccgtttaacttttcaaatggatcgagtgtatttacgttaagtgctcatgtcttcaattcaggcaatgaagtttatatagatcgaattgaatttgttccggcagaagtaacctttgaggcagaatatgatttagaaagagcacaaaaggcggtgagtgagctgtttacttcttccaatcaaatcgggttaaaaacagatgtgacggattatcatattgatcaagtatccaatttagttgagtgtttatctgatgaattttgtctggatgaaaaaaaagaattgtccgagaaagtcaaacatgcgaagcgacttagtgatgagcggaatttacttcaagatccaaactttggagggatcaatagacaactagaccgtggctggaggggaagtacggatattaccatccaaggaggcgatgacgtattcaaagagaattacgttacgctattgggtaccgttgatgagtgctatccaacgtatttatatcagaaaatagatgagtcgaaattaaaagcttatacccgttatgaattaagagggtatatcgaagatagtcaagacttagaaatctatttgatccgttacaatgcaaaacacgaaatagtaaatgtgccaggcacgggttccttatggccgctttcagcccaaagtccaatcggaaagtgtggagaaccgaatcgatgcgcgccacaccttgaatggaatcctgatctagattgttcctgcagagacggggaaaaatgtgcacatcattcccatcatttcaccttggatattgatgttggatgtacagacttaaatgaggacttaggtgtatgggtgatattcaagattaagacgcaagatggccatgcaagactagggaatctagagtttctcgaagagaaaccattattaggggaagcactagctcgtgtgaaaagagcggagaagaagtggagagacaaacgagagaaactgcagttggaaacaaatattgtttataaagaggcaaaagaatctgtagatgctttatttgtaaactctcaatatgatagattacaagtggatacgaacatcgcgatgattcatgcggcagataaacgcgttcatagaatccgggaagcgtatctgccagagttgtctgtgattccaggtgtcaatgcggccattttcgaagaattagagggacgtatttttacagcgtattccttatatgatgcgagaaatgtcattaaaaatggcgatttcaataatggcttattatgctggaacgtgaaaggtcatgtagatgtagaagagcaaaacaaccaccgttcggtccttgttatcccagaatgggaggcagaagtgtcacaagaggttcgtgtctgtccaggtcgtggctatatccttcgtgtcacagcatataaagagggatatggagagggctgcgtaacgatccatgagatcgaagacaatacagacgaactgaaattcagcaactgtgtagaagaggaagtatatccaaacaacacagtaacgtgtaataattatactgggactcaagaagaatatgagggtacgtacacttctcgtaatcaaggatatgacgaagcctatggtaataacccttccgtaccagctgattacgcttcagtctatgaagaaaaatcgtatacagatggacgaagagagaatccttgtgaatctaacagaggctatggggattacacaccactaccggctggttatgtaacaaaggatttagagtacttcccagagaccgataaggtatggattgagatcggagaaacagaaggaacattcatcgtggatagcgtggaattactccttatggaggaa
>合成AR6(SEQIDNO：5)
atgggacacaacaatccaaataccaatgaatgcatcccctataattgcttgagcaaccctgaagttgaagttctgggaggtgagaggatagaaactggatatacccctattgatatctctctgtctttgactcagttcctcctgagtgagtttgttccaggtgcaggatttgtgttgggtttggtagacattatctggggaatctttggaccatcccaatgggatgcctttctggtccaaatagagcaactcataaaccagcgcattgaggaatttgcacgtaaccaggcaatctcccgacttgagggattgtcaaacttgtaccagatatatgctgaaagtttcagagagtgggaagctgacccaaccaaccctgcattgagggaagagatgaggattcagttcaatgatatgaactcagcactgaccactgccatacccttgtttgcagtacagaactatcaagtcccattactatcagtctatgtgcaagcagcaaacctacatttgagtgtcctccgagatgtatcagtttttggtcaacgttggggatttgatgctgctaccatcaacagtcgttacaatgacctcacacgactgattgggaactacacagatcacgcagtccgttggtacaatactggattggagagagtttggggacctgatagtcgtgattggattcgttacaatcagtttcgtcgggaacttaccctgactgtcttggatatagtgtcactgtttcctaactatgatagtcgtacatatccaatacgaacagtaagtcagctgactcgtgaagtctacacggaccctgtcctggagaactttgatggtagcttccgtggatcagcacaaggcatagagggttccatccggagtcctcatctcatggacatcctgaacagcattacaatctacacagatgctcatcgaggtgagtattactggtcaggacaccaaatcatggcatccccagttggattttctggtccagagttcactttccccttgtatggaacaatgggtaatgctgctccacagcaacgaatagttgctcaattgggacaaggggtatatcgaaccttatcatcaacactgtatcgacgtccattcaacattgggataaacaatcaacagttgtctgtactagatgggacagagtttgcttatggaacttcctccaacctcccttcagcagtttatcggaagtctgggactgtagactcactagatgagatacctccacagaatgacaatgtacctccaagacaaggattctcccaccgtctctctcatgtgtctatgttccgtagtggctttagtaacagcagtgtgagcatcatacgtgcacctatgttttcatggattcaccgtagtgcagagttcaataacaccattgaccctgaacgaatcaatcaaatcccacttaccaaaagcaccaaccttggtagcggaaccagcgttgtgaagggtcctggtttcactggtggggatattctgcgacgtaccagccctggacagattagcacactgcgtgtgaacatcaccgctccactgagtcagcgctatcgagtgaggattcgctatgctagcactaccaaccttcagttccataccagcattgatggtcgtccaattaaccaaggcaacttcagcgctaccatgtccagcggctcaaacctgcaaagtggatcattccgcaccgttggctttaccactccattcaacttcagcaacggcagtagcgtgttcaccctttccgcacatgtgttcaacagtggcaacgaagtgtacatcgatagaatcgagtttgtgccagcggaagtgacttttgaagctgagtacgaccttgaacgtgcccaaaaggccgttagcgagctcttcacttcttccaaccagatcggattgaaaacagatgttacagactaccacattgaccaggtgtccaatcttgtggattgcttgtctgatgagttctgtctcgatgagaagcgagaactctctgaaaaggttaagcacgctaagagactcagcgatgaacgaaaccttcttcaggacccaaatttcaggggaattaatagacaaccagatagaggttggcgtggatcaacagacatcactatccaaggtggagacgatgtttttaaggagaactacgtgacccttcctggtactgttgacgagtgctatcctacctacctttaccagaagattgacgaatcaaagctcaaagcatacactcgttatgagcttcgtggttacatcgaagattcacaagatcttgaaatctacctcatcagatacaacgctaaacacgaaatcgtcaacgttccaggtactggatctctgtggccactctctgcacagtcacctattggcaagtgcggtgagccaaatagatgtgcaccacacctggagtggaatcccgatctggactgtagttgtcgtgacggggagaagtgcgctcatcacagccatcacttcactcttgatatcgatgttggatgtaccgaccttaatgaagacctgggcgtttgggttatcttcaagattaagacccaggatggtcatgccagacttggtaatctggagttccttgaagagaaacccttgttgggtgaagctctggccagagtcaagcgtgctgagaagaaatggcgtgataaacgtgaaaagttgcaattggagactaacattgtctacaaagaggcaaaggagtctgtggatgccttgttcgtgaactctcagtacgaccgactccaagtggataccaacattgctatgattcatgctgctgacaaacgtgttcaccgtatcagagaagcctatctccctgaactgtcagtgatcccaggagtcaacgctgcaatcttcgaggagcttgaaggtcgaatcttcactgcctattcactttacgatgcacgaaacgtgattaagaatggggattttaataacgggttgttgtgctggaatgtgaaggggcacgtggatgttgaggaacaaaacaaccaccgttccgtgcttgttattcctgagtgggaagcagaggtgtctcaggaggttagggtgtgtcctggtagaggatatatcttgagagtgactgcctataaggaaggctatggtgaaggttgcgtgacaatccacgagatcgaagacaacacagatgagcttaagttctctaactgcgttgaggaggaagtctacccaaacaataccgtcacttgtaacaattacacaggcacacaagaagagtacgaaggaacctacacctcccgaaatcagggttatgatgaggcctatggtaataatccttctgtgcctgccgattatgcttctgtttacgaggaaaagtcttacactgatggccgtcgtgagaacccttgcgaatccaaccgtggatacggtgattacactccacttccagcaggatacgttactaaggatcttgagtactttccagagactgataaagtttggatcgaaatcggagagactgaaggcacattcatcgtggattctgtggagctcttgctcatggaggaa
>CR62(SEQIDNO：7)
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>合成CR62(SEQIDNO：9)
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>MR8′(SEQIDNO：11)
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>变体41(SEQIDNO：13)
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>变体75(SEQIDNO：15)
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>变体80(SEQIDNO：17)
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>变体5-40(SEQIDNO：25)
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Claims (34)

1.多肽，其包含与SEQ ID NOS：8、10或12中的任一具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，其中，所述的多肽具有杀昆虫活性。
2.权利要求1的多肽，其进一步包含另外的氨基酸，其中所述的另外的氨基酸与所述多肽结合表达，以产生毒素原。
3.权利要求2的多肽，其中所述另外的氨基酸在昆虫中与所述多肽分开。
4.权利要求1的多肽，其中，所述的多肽序列包含SEQ ID NOS：8、10或12中的任一的氨基酸序列。
5.权利要求1的多肽，其中所述的多肽序列包含与SEQ ID NOS：8、10或12中的任一具有至少95％同一性的氨基酸序列。
6.核酸分子，其包含编码与SEQ ID NOS：8、10或12中的任一具有至少90％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中，所述的多肽具有杀昆虫活性。
7.权利要求6的核酸分子，其进一步包含另外的核苷酸，所述另外的核苷酸编码另外的氨基酸，所述另外的氨基酸与所述多肽结合表达，以产生毒素原。
8.权利要求7的核酸分子，其中所述另外的氨基酸在昆虫中与所述多肽分开。
9.权利要求6的核酸分子，其中，所述的核苷酸序列包含SEQ IDNOS：7，9或11中的任一，或与SEQ ID NOS：7，9或11中的任一具有至少90％序列同一性的序列。
10.权利要求6的核酸分子，其中，所述的核酸分子编码与SEQ IDNOS：8、10或12中的任一具有至少95％序列同一性的多肽，其中，所述的多肽具有杀昆虫活性。
11.权利要求6的核酸分子，其中，所述的核酸分子编码具有SEQID NOS：8、10或12中任一的氨基酸序列的多肽。
12.载体，其包含权利要求6的核酸分子。
13.表达盒，其包含权利要求6的核酸分子，所述核酸分子与启动子有效连接。
14.重组宿主细胞，其包含编码与SEQ ID NOS：8、10或12中的任一具有至少90％序列同一性的多肽的核酸分子，其中，所述的多肽具有杀昆虫活性。
15.权利要求14的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是植物细胞。
16.转基因植物细胞，其包含稳定地整合入其基因组的转基因，其中所述的转基因包含与在所述植物细胞中具有功能性的启动子有效连接的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含：
a)多核苷酸，其包含编码SEQ ID NOS：8、10或12中的任一的氨基酸序列的核苷酸序列；
b)多核苷酸，其包含SEQ ID NOS：7，9或11中的任一的核苷酸序列；
c)多核苷酸，其编码与SEQ ID NOS：8、10或12中任一的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽，其中，所述的多肽具有杀昆虫活性；
d)多核苷酸，其包含与SEQ ID NOS：7，9或11中任一的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码包含杀昆虫活性的多肽。
17.权利要求16的转基因植物细胞，其中，所述的植物细胞是单子叶植物细胞。
18.权利要求17的转基因植物细胞，其中，所述的单子叶植物细胞是玉米、甘蔗、小麦、稻、大麦、高粱、稷或黑麦植物的细胞。
19.权利要求16的转基因植物细胞，其中，所述的植物细胞是双子叶植物细胞。
20.权利要求19的转基因植物细胞，其中，所述的双子叶植物细胞是大豆、芸苔属(Brassica)，苜蓿、菠菜、烟草、番茄、马铃薯、向日葵、棉花或低芥酸菜子植物细胞。
21.权利要求16的转基因植物细胞，其中，与非转基因的植物细胞相比，所述的转基因植物细胞具有针对鳞翅目昆虫害虫增加的抗性。
22.权利要求16的转基因植物细胞，其中，所述的转基因植物细胞是种子细胞。
23.用于生产具有增加的昆虫抗性的植物的方法，所述方法包括：
a.将包含与在植物细胞中起作用的启动子可操作地连接的多核苷酸的构建体引入植物细胞内，所述多核苷酸编码杀昆虫多肽，以产生转化的植物细胞，并且其中编码所述多肽的所述多核苷酸选自：
i)多核苷酸，其包含编码SEQ ID NOS：8、10或12中的任一的氨基酸序列的核苷酸序列；
ii)多核苷酸，其包含SEQ ID NOS：7，9或11中的任一的核苷酸序列；
iii)多核苷酸，其编码与SEQ ID NOS：8、10或12中任一的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽，其中，所述的多肽具有杀昆虫活性；
iv)多核苷酸，其包含与SEQ ID NOS：7，9或11中任一的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列编码包含杀昆虫活性的多肽。
b.由所述转化的植物细胞再生转基因植物，其中所述昆虫抗性多肽以足以增加所述转基因植物相对于对照植物的昆虫抗性的水平表达。
24.权利要求23的方法，其中，编码所述多肽的所述多核苷酸组成型表达。
25.权利要求23的方法，其中，所述的植物是单子叶植物。
26.权利要求25的方法，其中，所述的单子叶植物是玉米、甘蔗、小麦、稻、大麦、高粱、稷或黑麦植物。
27.权利要求23的转基因植物，其中，所述的植物是双子叶植物。
28.权利要求27的转基因植物，其中，所述的双子叶植物是大豆、芸苔属(Brassica)，苜蓿、菠菜、烟草、番茄、马铃薯、向日葵、棉花或低芥酸菜子植物。
29.组合物，其包含一种或多种包含具有下述序列的氨基酸序列：
a)与SEQ ID NO：8或10至少90％序列同一性；或
b)与SEQ ID NO：12至少90％序列同一性；
和试剂，其中，所述的试剂包含展布剂-粘着剂佐剂、稳定剂、杀昆虫剂、稀释剂、表面活性剂、乳化剂，或分散剂。
30.提高植物对昆虫害虫抗性的方法，该方法包括向对所述昆虫害虫敏感的植物施用一种或多种杀昆虫有效量的下述的多肽，所述多肽具有：
a)与SEQ ID NO：8或10所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性；
b)与SEQ ID NO：8或10所示的氨基酸序列至少99％序列同一性；
c)与SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列至少90％序列同一性；
d)与SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列至少99％序列同一性；
其中，所述的一种或多种多肽的杀昆虫量是对所述的昆虫害虫具有足够的杀昆虫活性。
31.权利要求30的方法，其中，所述的植物是单子叶植物。
32.权利要求31的方法，其中，所述的单子叶植物是玉米、甘蔗、小麦、稻、大麦、高粱、稷或黑麦植物。
33.权利要求30的转基因植物，其中，所述的植物是双子叶植物。
34.权利要求33的转基因植物，其中，所述的双子叶植物是大豆、芸苔属(Brassica)，苜蓿、菠菜、烟草、番茄、马铃薯、向日葵、棉花或低芥酸菜子植物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410660A (zh) * 2013-08-08 2022-04-29 先锋国际良种公司 具有广谱活性的杀昆虫多肽及其用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009262153B2 (en) * 2008-06-25 2014-02-27 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Toxin genes and methods for their use
US8729336B2 (en) 2009-01-23 2014-05-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc Protein mixtures for maize insect control
US20100322977A1 (en) * 2009-06-05 2010-12-23 The Ohio State University Research Foundation Biomaterials, compositions, and methods
BR112012014746B1 (pt) 2009-12-16 2024-03-05 Dow Agrosciences Llc Método para controlar o desenvolvimento da resistência de um inseto à uma proteína inseticida derivada de um bacillus thuringiensis, bem como composição e método para o controle de pragas de lepidópteros
BR112013003135A2 (pt) 2010-08-13 2017-11-07 Pioneer Hi Bred Int polinucletídeo e polipeptídeo isolado ou recombinante, construto de ácido nucleico, célula, planta, explante vegetal, semente transgênica, método para produção de célula vegetal para controle de plantas daninhas e para detecção de um polipeptídeo hppd e um polinucleotídeo.
BR112013030638A2 (pt) * 2011-03-30 2018-08-07 Univ Mexico Nac Autonoma polipeptídeo cry mutante, polinucleotídeo, cassete de expressão, célula hospedeira, planta, semente transgênica, método para proteger uma planta contra uma praga de inseto, composição pesticida, micro-organismo, método para controlar uma praga de inseto de uma área de cultivo
WO2013166113A1 (en) 2012-05-04 2013-11-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods comprising sequences having meganuclease activity
CA2886787A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 Dow Agrosciences Llc Use of cry1ea in combinations for management of resistant fall armyworm insects
CN104884625A (zh) 2012-10-15 2015-09-02 先锋国际良种公司 增强cry内毒素的活性的方法和组合物
WO2014071182A1 (en) 2012-11-01 2014-05-08 Massachusetts Institute Of Technology Directed evolution of synthetic gene cluster
WO2014159306A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate application for weed control in brassica
CA2906445C (en) * 2013-03-14 2019-08-13 J.R. Simplot Company Turfgrass varieties having desirable looking turf when mowed infrequently
US20160053277A1 (en) 2013-03-14 2016-02-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions Having Dicamba Decarboxylase Activity and Methods of Use
EP2970363B1 (en) 2013-03-14 2020-07-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
BR112015023286A2 (pt) 2013-03-14 2018-03-06 Arzeda Corp polipeptídeo recombinante com atividade da dicamba descarboxilase, construto de polinucleotídeo, célula, método de produção de uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo tendo atividade da dicamba descarboxilase, método para descarboxilar dicamba, um derivado de dicamba ou um metabolito de dicamba, método para a detecção de um polipeptideo e método para a detecção da presença de um polinucleotideo que codifica um polipeptideo tendo atividade da dicamba descarboxilase
US10023877B2 (en) 2013-03-15 2018-07-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. PHI-4 polypeptides and methods for their use
EP2986725A4 (en) 2013-04-19 2016-11-09 Agres Ltd METHOD AND MATERIALS FOR THE SECULATION OF PROTEINS
EP3032942B1 (en) 2013-08-16 2020-03-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP3043635B1 (en) 2013-09-13 2020-02-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP3102684B1 (en) 2014-02-07 2020-05-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2015120276A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 Pioneer Hi Bred International Inc Insecticidal proteins and methods for their use
EP3122882A4 (en) 2014-03-28 2018-02-28 Monsanto Technology LLC Pesticidal toxin proteins active against coleopteran insects
CN106464750A (zh) * 2014-04-09 2017-02-22 安德烈亚斯·韦斯特梅尔 用于经由VoIP平台和移动电话装置选择电话号码的系统和方法
WO2016000237A1 (en) 2014-07-03 2016-01-07 Pioneer Overseas Corporation Plants having enhanced tolerance to insect pests and related constructs and methods involving insect tolerance genes
WO2016044092A1 (en) 2014-09-17 2016-03-24 Pioneer Hi Bred International Inc Compositions and methods to control insect pests
ES2739948T3 (es) 2014-10-16 2020-02-04 Monsanto Technology Llc Proteínas variantes con secuencias de aminoácidos Cry1Da1 activas contra lepidópteros
US10316329B2 (en) 2014-10-16 2019-06-11 Monsanto Technology Llc Proteins toxic or inhibitory to lepidopteran insects
SG10201913870RA (en) 2014-10-16 2020-03-30 Monsanto Technology Llc Novel chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests
US10487123B2 (en) 2014-10-16 2019-11-26 Monsanto Technology Llc Chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests
US10435706B2 (en) 2014-10-16 2019-10-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP3221454B1 (en) 2014-11-20 2020-12-23 Monsanto Technology LLC Novel insect inhibitory proteins
US11130964B2 (en) 2014-11-20 2021-09-28 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory proteins
US20170359965A1 (en) 2014-12-19 2017-12-21 E I Du Pont De Nemours And Company Polylactic acid compositions with accelerated degradation rate and increased heat stability
EA038923B1 (ru) 2015-03-11 2021-11-10 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидная днк-конструкция и способы её применения
RU2017144238A (ru) 2015-05-19 2019-06-19 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
AU2016278142A1 (en) 2015-06-16 2017-11-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods to control insect pests
MX2018000615A (es) 2015-07-13 2018-08-01 Pivot Bio Inc Metodos y composiciones para mejorar atributos de plantas.
MX2018001523A (es) 2015-08-06 2018-03-15 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas derivadas de plantas y metodos para su uso.
US10036037B2 (en) 2015-08-18 2018-07-31 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory proteins
UA126328C2 (uk) 2015-08-27 2022-09-21 Монсанто Текнолоджі Елелсі Молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, що проявляє інгібуючу активність відносно комах
EP3341483B1 (en) 2015-08-28 2019-12-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Ochrobactrum-mediated transformation of plants
WO2017062412A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Nitrogen fixation using refactored nif clusters
US20180325119A1 (en) 2015-12-18 2018-11-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN117003840A (zh) 2016-04-14 2023-11-07 先锋国际良种公司 具有改善的活性谱的杀昆虫多肽及其用途
US11028407B2 (en) 2016-04-19 2021-06-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
EP3960863A1 (en) 2016-05-04 2022-03-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
US20190185867A1 (en) 2016-06-16 2019-06-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
US20190194676A1 (en) 2016-06-24 2019-06-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
EP3954202A1 (en) 2016-07-01 2022-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins from plants and methods for their use
US20210292778A1 (en) 2016-07-12 2021-09-23 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods to control insect pests
EP4050021A1 (en) 2016-11-01 2022-08-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN110088123B (zh) 2016-12-14 2023-10-20 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
CA3046226A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN110799474B (zh) 2017-01-12 2022-07-26 皮沃特生物公司 用于改良植物性状的方法及组合物
WO2018140214A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nematicidal protein from pseudomonas
WO2018148001A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Pioneer Hi-Bred International Inc Insecticidal combinations of plant derived insecticidal proteins and methods for their use
EP3622076A1 (en) 2017-05-11 2020-03-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
BR112019024827A2 (pt) 2017-05-26 2020-06-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Construto de dna, planta transgênica ou progênie da mesma, composição e método para controlar uma população de pragas de insetos
US20200165626A1 (en) 2017-10-13 2020-05-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Virus-induced gene silencing technology for insect control in maize
US11993778B2 (en) 2017-10-25 2024-05-28 Pivot Bio, Inc. Methods and compositions for improving engineered microbes that fix nitrogen
EP3728294A4 (en) 2017-12-19 2021-12-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides and uses thereof
EP3755797A1 (en) 2018-02-22 2020-12-30 Zymergen, Inc. Method for creating a genomic library enriched for bacillus and identification of novel cry toxins
WO2019169227A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Zymergen Inc. Insecticidal protein discovery platform and insecticidal proteins discovered therefrom
US20210002657A1 (en) 2018-03-02 2021-01-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant health assay
CA3096516A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
US11963530B2 (en) 2018-06-27 2024-04-23 Pivot Bio, Inc. Agricultural compositions comprising remodeled nitrogen fixing microbes
EP3844283A1 (en) 2018-08-29 2021-07-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
WO2021076346A1 (en) 2019-10-18 2021-04-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize event dp-202216-6 and dp-023211-2 stack
WO2021221690A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Pivot Bio, Inc. Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
TW202142114A (zh) 2020-02-04 2021-11-16 美商陶氏農業科學公司 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關之方法
CA3172322A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Karsten TEMME Modified bacterial strains for improved fixation of nitrogen
US20230235352A1 (en) 2020-07-14 2023-07-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP4192848A1 (en) 2020-08-10 2023-06-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant regulatory elements and methods of use thereof
WO2022125639A1 (en) 2020-12-08 2022-06-16 Monsanto Technology Llc Modified plant-associated bacteria and methods of their use
AU2021409634A1 (en) 2020-12-21 2023-07-06 Monsanto Technology Llc Novel insect inhibitory proteins
UY39585A (es) 2020-12-23 2022-07-29 Monsanto Technology Llc Proteínas que exhiben actividad inhibidora de insectos frente a plagas con importancia agrícola de plantas de cultivo y semillas
CA3206691A1 (en) 2020-12-31 2022-07-07 Monsanto Technology Llc Novel insect inhibitory proteins
WO2023278804A1 (en) 2021-07-02 2023-01-05 Pivot Bio, Inc. Genetically-engineered bacterial strains for improved fixation of nitrogen
TW202345696A (zh) 2022-05-18 2023-12-01 美商科迪華農業科技有限責任公司 具有殺有害生物效用之組成物及與其相關的方法
WO2024092330A1 (pt) * 2022-11-04 2024-05-10 Empresa Brasileira De Pesquisa Agropecuária - Embrapa Proteínas inseticidas quiméricas truncadas

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5254799A (en) * 1985-01-18 1993-10-19 Plant Genetic Systems N.V. Transformation vectors allowing expression of Bacillus thuringiensis endotoxins in plants
GB8823068D0 (en) * 1988-09-30 1988-11-09 Ici Plc Recombinant dna
EP0440581A1 (de) * 1990-01-31 1991-08-07 Ciba-Geigy Ag Temperaturstabiles Bacillus thuringiensis-Toxin
US6403865B1 (en) * 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US6780408B1 (en) * 1993-09-02 2004-08-24 Syngenta Participations Ag Genes encoding hybrid bacillus thuringiensis toxins
US5593881A (en) 1994-05-06 1997-01-14 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis delta-endotoxin
US5530195A (en) * 1994-06-10 1996-06-25 Ciba-Geigy Corporation Bacillus thuringiensis gene encoding a toxin active against insects
US6110668A (en) 1996-10-07 2000-08-29 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Gene synthesis method
ID25530A (id) * 1996-11-20 2000-10-12 Ecogen Inc δ-ENDOTOKSIN BERSPEKTRUM-LEBAR
US5942664A (en) * 1996-11-27 1999-08-24 Ecogen, Inc. Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants
WO2002015701A2 (en) 2000-08-25 2002-02-28 Syngenta Participations Ag Bacillus thuringiensis crystal protein hybrids

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410660A (zh) * 2013-08-08 2022-04-29 先锋国际良种公司 具有广谱活性的杀昆虫多肽及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
US7858849B2 (en) 2010-12-28
US20090226998A1 (en) 2009-09-10
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US20120117690A1 (en) 2012-05-10
WO2008073877A9 (en) 2008-07-31
EA200970559A1 (ru) 2009-12-30
US20080172762A1 (en) 2008-07-17
AR064216A1 (es) 2009-03-18
CL2007003582A1 (es) 2008-06-20
WO2008073877B1 (en) 2008-12-18
CN101600801A (zh) 2009-12-09
US8575433B2 (en) 2013-11-05
ZA200903784B (en) 2010-10-27
US8530411B2 (en) 2013-09-10

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