CN102965331A - 一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，栉孔扇贝担轮幼虫专用细胞培养基中添加维持细胞代谢需求的少量营养因子，即实现了栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的良好生长状态，随着细胞的分裂能够实现细胞的稳定传代培养，操作简单且成本低廉，同时采用栉孔扇贝担轮幼虫专用无钙海水等渗缓冲液浸泡与机械法结合的方式实现了对细胞的完全解离，无需经任何酶类的消化，该培养方法对栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的损伤小，成本低效率高，具有可重复性，本发明建立了一种稳定的海洋无脊椎动物细胞体外培养的方法，能够实现细胞的体外增殖和传代培养，是首个海洋贝类的连续细胞系，对除栉孔扇贝之外的其他贝类细胞建系具有重要的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法。
背景技术
截至目前国内外尚无人建立海洋双壳类细胞的体外培养体系，将范围扩展至软体动物门类，目前仅有一个细胞系成功建立，来自一种淡水蜗牛。
细胞的取材：体外培养的细胞多取材于动物胚胎、成年动物组织、人体手术活体材料，幼虫细胞是兼具胚胎细胞和幼虫期特有细胞性质的高分裂能力的细胞，是一类具有体外培养前景的细胞来源。
虾夷扇贝担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献：Primary cell culture fromembryos of the Japanese scallop Mizuchopecten yessoensis(Bivalvia)(1991Cytotechnology)
贻贝面盘幼虫细胞的体外培养。(备注：面盘幼虫是担轮幼虫下一个发育阶段。)参考文献：Isolation and partial characterization of myogeniccellsfrom mussel larvae in vitro(2000Tissue Cell.)
紫贻贝担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献：Comparative Characteristicof Mytilus Muscle Cells Developed In Vitro and In Vivo.(2003Journalof Experimental Zoology.)
油黑菜蛤担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献：Muscle and neuronaldifferentiation in primary cell culture of larval Mytilus trossulus(Mollusca：Bivalvia)(2010Cell Tissue Research)
幼虫细胞的解离方式：上述幼虫细胞均采用无钙水浸泡后再经0.25％或0.125％胶原酶解离的方式获得单个的细胞。
幼虫细胞的除菌方法：虾夷扇贝，紫外线消毒海水并添加500U/ml青霉素和40μg/ml庆大霉素，培养基中添加40mg/l庆大霉素；油黑菜蛤，Percoll密度梯度离心法。
细胞传代方式：目前尚无关于幼虫细胞的传代方法的报道，传代培养的核心工作有两方面，一是分割培养物，二是再次接种。把贴壁依赖型细胞从培养基质上解离下来的方法主要有：1).胰蛋白酶溶液消化；2).对于贴壁不牢的细胞可采用机械的振荡法。
幼虫培养基的优化：虾夷扇贝幼虫细胞培养基：L15基础培养基；添加如下盐离子使渗透压达到1100毫渗透摩尔浓度：NaCl(18.05克/升)，KCI(0.29克/升)，CaCl2·2H2O(1.205克/升)，MgCl2·6H2O(5.481克/升)，MgSO4·7H2O(4.28克/升)。另添加如下成分：牛磺酸(25毫克/升)，葡萄糖(50毫克/升)，谷氨酰胺(100毫克/升)，胎牛血清(2％体积比)，庆大霉素(40毫克/升)。
担油黑菜蛤幼虫细胞培养基：L-15基础培养基；胎牛血清(2％体积比)，胰岛素(50毫克/升)，维生素E(1.75毫克/升)。
现有技术的缺点是无法实现贝类细胞的传代培养。
发明内容
本发明提供了一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，旨在解决现有技术无法实现贝类细胞的传代培养的问题。
本发明的目的在于提供一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，该培养方法包括以下步骤：
将单个栉孔扇贝担轮幼虫细胞均匀分布在含有0.5毫升栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养液的直径为35毫米细胞培养皿中，并放置到20-23℃的生化培养箱中培养，16-24小时后得贴壁的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞；
根据栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基的颜色变化，每3-7天替换栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用培养基2毫升，当栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞形成克隆时，挑取出来实现早期传代；
当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
进一步，栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液中添加有2500-25000单位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升链霉素。
进一步，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基由L15基础培养基、5％胎牛血清、1％栉孔扇贝血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素构成。
进一步，步骤五，当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养的实现方法为：
当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，用移液管轻轻吹打或用细胞刮刀刮取获得解离的单个细胞，在1000转/分钟的条件下离心5分钟，再平均分散在两个细胞培养瓶中完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
进一步，体外培养的细胞取自栉孔扇贝晚期胚胎、担轮幼虫、D型幼虫的细胞，同时该培养方法也可应用在其他种类贝类生物胚胎和幼虫细胞的培养中。
进一步，栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞时，在4℃下培养1-2天，原代培养的栉孔扇贝担轮幼虫细胞可存活且可抑制细菌污染，再转到17-25℃培养箱中，细胞也可实现稳定传代培养。
进一步，在栉孔扇贝担轮幼虫细胞培养早期，使用栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液，青霉素浓度为2500单位/毫升至25000单位/毫升，链霉素浓度为2500微克/毫升至25000微克/毫升链霉素。(与前一段重复)
进一步，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中添加物的最宽范围：胎牛血清添加量2％-20％，扇贝血清1％-10％，青霉素100-500单位/毫升、链霉素100-500微克/毫升。
本发明提供的栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙消毒海水渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；将得到的单个栉孔扇贝担轮幼虫细胞均匀分布在含有0.5毫升栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液的直径为35毫米细胞培养皿中，并放置到20-23℃的生化培养箱中培养，16-24小时后得贴壁的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞；根据栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基的颜色变化，每3-7天替换栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用培养基2毫升，当栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞形成克隆时，挑取出来实现早期传代；当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养，本发明建立了一种稳定的海洋无脊椎动物细胞体外培养的方法，能够实现细胞的体外增殖和传代培养，是首个海洋贝类的连续细胞系，对除栉孔扇贝之外的其他贝类细胞建系具有重要的指导意义。
附图说明
图1是本发明实施例提供的栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法的实现流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
图1示出了本发明实施例提供的栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法的实现流程。
该培养方法包括以下步骤：
步骤S101，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；
步骤S102，使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；
步骤S103，将步骤S102得到的单个栉孔扇贝担轮幼虫细胞均匀分布在含有0.5毫升栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液的直径为35毫米细胞培养皿中，并放置到20-23℃的生化培养箱中培养，16-24小时后得贴壁的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞；
步骤S104，根据栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基的颜色变化，每3-7天替换栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用培养基2毫升，当栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞形成克隆时，挑取出来实现早期传代；
步骤S105，当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
在本发明实施例中，在步骤S102中，栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液为含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌过滤海水的高渗透压磷酸盐缓冲溶液。
在本发明实施例中，在步骤S102中，机械解离法的实现方法为：手动摇晃含有栉孔扇贝担轮幼虫的容器，并用移液管反复吹打含有栉孔扇贝担轮幼虫的液体1分钟以上，以1000转/分钟的速度离心5分钟后，收集得到解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞。
在本发明实施例中，栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液中添加有2500-25000单位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升链霉素。
在本发明实施例中，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基由L15基础培养基、5％胎牛血清、1％栉孔扇贝血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素构成。
在本发明实施例中，步骤S105，当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养的实现方法为：
当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，用移液管轻轻吹打或用细胞刮刀刮取获得解离的单个细胞，在1000转/分钟的条件下离心5分钟，再平均分散在两个细胞培养瓶中完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
在本发明实施例中，体外培养的细胞取自栉孔扇贝晚期胚胎、担轮幼虫、D型幼虫的细胞，同时该培养方法也可应用在其他种类贝类生物胚胎和幼虫细胞的培养中。
在本发明实施例中，栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞时，在4℃下培养1-2天，原代培养的栉孔扇贝担轮幼虫细胞可存活且可抑制细菌污染，再转到17-25℃培养箱中，细胞也可实现稳定传代培养。
在本发明实施例中，在栉孔扇贝担轮幼虫细胞培养早期，使用栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液，青霉素浓度为2500单位/毫升至25000单位/毫升，链霉素浓度为2500微克/毫升至25000微克/毫升链霉素。
在本发明实施例中，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中添加物的最宽范围：胎牛血清添加量2％-20％，扇贝血清1％-10％，青霉素100-500单位/毫升、链霉素100-500微克/毫升。
下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
本发明的技术方案：首先将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；配制栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液，配方是含有2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素的高压灭菌过滤海水的高渗透压磷酸盐缓冲溶液；使用上述栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，仅仅采用机械解离法即手动摇晃含有栉孔扇贝担轮幼虫的容器并用移液管反复吹打含有栉孔扇贝担轮幼虫的液体1分钟以上，以1000转/分钟的速度离心5分钟后收集得到解离的栉孔扇贝担轮幼虫细胞，均匀分布在含有0.5毫升栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液(添加2500-25000单位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升链霉素)的直径为35毫米的细胞培养皿中，再置于20-23℃的生化培养箱中进行培养，16-24小时后得到贴壁的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞。根据栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基的颜色变化，每3-7天替换栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用培养基2毫升，以维持栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞正常生长。当栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞形成克隆时，将其挑取出来实现早期传代。当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，仅使用机械传代法即用移液管轻轻吹打或用细胞刮刀刮取得解离的单个细胞，在1000转/分钟的条件下离心5分钟，再平均分散在两个细胞培养瓶中完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
所述的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基，其中含有：L15基础培养基、5％胎牛血清、1％栉孔扇贝血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素。
所述的机械解离法为手动剧烈晃动盛有栉孔扇贝担轮幼虫个体的容器，以获得分散的单个细胞的方法。
所述的机械传代法为通过移液管的吹打或细胞刮刀使体外培养的栉孔扇贝担轮幼虫细胞无损伤地从培养基质上脱离的方法。
栉孔扇贝担轮幼虫专用细胞培养基中添加维持细胞代谢需求的少量营养因子，即实现栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的良好生长状态，随着细胞的分裂能够实现细胞的稳定传代培养，该方法操作简单且成本低廉。
采用栉孔扇贝担轮幼虫专用无钙海水等渗缓冲液浸泡与机械法结合的方式不经任何酶类的消化实现对细胞的完全解离，该方法对栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的损伤小，成本低效率高，具有可重复性。
细胞取材：取自栉孔扇贝晚期胚胎、担轮幼虫、D型幼虫的细胞均可在体外实现稳定培养。理论上，该培养方法是可以应用在其他种类贝类生物胚胎和幼虫细胞的培养中。
细胞培养温度：在4℃下培养1-2天，原代培养的栉孔扇贝担轮幼虫细胞可存活且可抑制细菌污染。随后再转到17-25℃培养箱中，细胞也可实现稳定传代培养。
抗生素的使用：在细胞培养早期使用栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液，其浓度在2500单位/毫升青霉素、2500微克/毫升链霉素至25000单位/毫升青霉素、25000微克/毫升链霉素均可抑制污染且得到稳定传代的细胞系。
培养基添加物的最宽范围：胎牛血清添加量2％-20％；扇贝血清1％-10％；青霉素100-500单位/毫升、链霉素100-500微克/毫升。
机械法方法进行细胞的传代培养：由于细胞贴壁能力较低，除了用细胞刮刀和移液管吹打法，一切可以将细胞机械摇晃下的办法均可行。
本发明实施例提供的栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，将栉孔扇贝担轮幼虫用正压滤器过滤的无菌海水在500目筛绢上流水冲洗半小时以上，去除表面的微生物；使用栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用无钙海水等渗缓冲液浸泡栉孔扇贝担轮幼虫30分钟以上，采用机械解离法解离得到分散的单个的栉孔扇贝担轮幼虫细胞；将得到的单个栉孔扇贝担轮幼虫细胞均匀分布在含有0.5毫升栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液的直径为35毫米细胞培养皿中，并放置到20-23℃的生化培养箱中培养，16-24小时后得贴壁的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞；根据栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基的颜色变化，每3-7天替换栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用培养基2毫升，当栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞形成克隆时，挑取出来实现早期传代；当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养，本发明建立了一种稳定的海洋无脊椎动物细胞体外培养的方法，能够实现细胞的体外增殖和传代培养，是首个海洋贝类的连续细胞系，对除栉孔扇贝之外的其他贝类细胞建系具有重要的指导意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，其特征在于，该培养方法包括以下步骤：
将单个栉孔扇贝担轮幼虫细胞均匀分布在含有0.5毫升栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液的直径为35毫米细胞培养皿中，并放置到20-23℃的生化培养箱中培养，16-24小时后得贴壁的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞；
根据栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基的颜色变化，每3-7天替换栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用培养基2毫升，当栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞形成克隆时，挑取出来实现早期传代；
当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液中添加有2500-25000单位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升链霉素。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基由L15基础培养基、5％胎牛血清、1％栉孔扇贝血清、2毫摩尔谷氨酰胺、100单位/毫升青霉素、100微克/毫升链霉素构成。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤五，当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养的实现方法为：
当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，用移液管轻轻吹打或用细胞刮刀刮取获得解离的单个细胞，在1000转/分钟的条件下离心5分钟，再平均分散在两个细胞培养瓶中完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，体外培养的细胞取自栉孔扇贝晚期胚胎、担轮幼虫、D型幼虫的细胞，同时该培养方法也可应用在其他种类贝类生物胚胎和幼虫细胞的培养中。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞时，在4℃下培养1-2天，原代培养的栉孔扇贝担轮幼虫细胞可存活且可抑制细菌污染，再转到17-25℃培养箱中，细胞也可实现稳定传代培养。
7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，在栉孔扇贝担轮幼虫细胞培养早期，使用高浓度的青链霉素双抗液，青霉素浓度为2500单位/毫升至25000单位/毫升，链霉素浓度为2500微克/毫升至25000微克/毫升链霉素。
8.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基中添加物的最宽范围：胎牛血清添加量2％-20％，扇贝血清1％-10％，青霉素100-500单位/毫升、链霉素100-500微克/毫升。
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