CN102964436B - 植物抗盐抗病相关蛋白NtNHX1及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物抗盐抗病相关蛋白NtNHX1及其编码基因与应用。所述蛋白来源于本生烟草（Nicotiana benthamiana），由SEQ ID NO：1所示的536个氨基酸组成，具有调控植物抗病性、耐盐性、调节液泡H+运输、调节液泡内pH值、调节细胞还原力和/或调节细胞氧化还原池容量的功能。实验证明，将含有SEQ ID NO：2中第1321位至第1583位所示DNA分子的病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1转化烟草得到的当代沉默植株，与转空载体对照相比，液泡H+外流明显降低；液泡内pH值降低；细胞还原力和氧化还原池容量的降低；耐盐性和抗病性能力降低。本发明在增强植物耐盐性的同时提高抗病性方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物抗盐抗病相关蛋白NtNHX1及其编码基因与应用。
背景技术
植物在进化过程中发展出各种机制，通过自身生化和生理调节来适应和应对各种环境和胁迫。无论在盐生植物还是甜土植物中，都存在液泡区隔化钠离子的能力；即通过液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白，将胞质中的钠离子区隔化进入液泡，从而减少有毒的钠离子对胞质中各种酶的毒害。到目前为止，尚未从烟草中克隆到液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白基因，也没有证据证明植物Na+/H+逆向转运蛋白与植物抗病性或生物胁迫相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗盐抗病相关蛋白NtNHX1及其编码基因与应用。
本发明所提供的植物抗盐抗病相关蛋白来源于本生烟草（Nicotianabenthamiana），名称为NtNHX1，该蛋白质是如下a）或b）的蛋白质：
a）由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b）将SEQ ID NO：1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐盐性和/抗病性相关的由（a）衍生的蛋白质。
SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列由536个氨基酸残基组成。
为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6（通常为5个） | RRRRR |
| Poly-His | 2-10（通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO：2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明保护所述蛋白的编码基因。
所述编码基因具体可为如下1）或2）或3）的基因：
1）其核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子；
2）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；
3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
SEQ ID NO：2由1611个脱氧核苷酸组成，编码SEQ ID NO：1所示的蛋白。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。
本发明所提供的所述蛋白及其编码基因可用于调控目的植物的下述至少一种性状，或调节所述蛋白质表达量或调节所述编码基因表达的物质用于调控目的植物的下述至少一种性状：抗病性、耐盐性、液泡H+运输、液泡内pH值、细胞还原力和细胞氧化还原池容量；
本发明的另一个目的是提供下述a）或b）的DNA分子，该DNA分子可用于制备降低所述蛋白质表达量或降低所述编码基因表达的物质：
a）其核苷酸序列为SEQ ID NO：2的第1321位至第1583位核苷酸段；
b）在严格条件下与a）限定的DNA序列杂交的DNA分子。
本发明保护含有上述任一所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
所述重组载体具体可为pTRV2-NtNHX1，即在载体pTRV2的EcoRI和KpnI位点间插入SEQ ID NO：2的第1321位至第1583位所示DNA片段。
本发明保护上述任一所述DNA分子在制备抑制或下调目的植物的SEQ ID NO：1所示蛋白表达的物质中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是抑制目的植物中SEQID NO：1所示蛋白的表达，得到与所述目的植物相比具有如下1）-6）中至少一种表型的转基因植物：
1）抗病性降低；
2）耐盐性降低；
3）液泡H+外流减少；
4）液泡内pH值降低；
5）细胞还原力降低；
6）细胞氧化还原池容量降低。
所述细胞还原力为细胞的NADH值/NAD值，和/或NADPH值/NADP值；
所述细胞氧化还原池容量为细胞的NADH值+NAD值，和/或NADPH值+NADP值。
在上述方法中，所述抑制目的植物中所述蛋白质的表达包括将向所述目的植物中导入所述pTRV2-NtNHX1的步骤。
上述应用或方法中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为烟草；所述抗病性的致病菌具体可为烟草黑胫病菌（Phytophthoraparasitica var．nicotianae）
实验证明，将含有SEQ ID NO：2中第1321位至第1583位所示DNA分子的病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1转化烟草得到的当代沉默植株，与转空载体对照相比，液泡H+外流明显降低；液泡内pH值降低；细胞还原力和氧化还原池容量的降低；耐盐性和抗病性能力降低。本发明在提高植物耐盐性和抗病性方面具有重要意义。
附图说明
图1为烟草的NHX1（NtNHX1）与拟南芥的NHX1（AtNHX1）和盐角草的NHX1（SeNHX1）蛋白氨基酸序列比对及跨膜结构域预测结果。其中，TM1—12为12个跨膜结构域，黑框部分序列为阿米洛利结合位点。
图2为NtNHX1蛋白的定位分析图。其中，第一排为AtNHX1蛋白定位图（正对照），第二排为NtNHX1蛋白定位图；第1列为烟草叶片表皮细胞液泡隔膜的绿色荧光图，箭头所指为液泡隔膜；第2列为原生质体的绿色荧光图，第3列为经FM4-64染料染色后的原生质体，第4列为将第2列图与第3列图整合后的图，箭头所指为绿色荧光和红色荧光不重叠的区域；标尺均代表20μm。
图3为载体pTRV1、pTRV2、pTRV2-NtNHX1和pTRV2-PDS的T-DNA区结构示意图。
图4为转pTRV2-PDS的烟草的白化表型。
图5为荧光定量RT-PCR检测转基因烟草中NtNHX1基因的相对表达量。其中，Control为转空载体pTRV2的烟草，N1—N34为转病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草。
图6为转基因烟草中的液泡H+流测定结果。其中，A图为用不含NaCl或KCl的测试液测定液泡H+流的结果，B图为用含NaCl浓度分别为0、25mM和50mM的测试液测定液泡H+流的结果，C图为用含KCl浓度分别为0、25mM和50mM的测试液测定液泡H+流的结果。
图7为转基因烟草细胞中液泡内的pH值测定。其中，A图为标准曲线，B图为液泡内的pH值测定结果，C图为pH值的原位渲染图，其中第一列为488nm下的荧光图，第二列为458nm下的荧光图，第三列为488nm/458nm下的原位渲染图；其中，Control为对照，Nt为转病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草。
图8为转基因烟草的细胞还原力（A）和氧化还原池容量（B）测定结果。
图9为转基因烟草的耐盐性鉴定结果。其中，A图为叶盘在0mM和200mMNaCl溶液中的表型；B图上为叶盘经0mM和200mMNaCl处理后的叶绿素含量测定结果；B图下为叶盘经0mM和200mM NaCl处理后的叶盘细胞死亡分析（用细胞死亡染料Evansblue的吸光度表示）。
图10为转基因烟草的抗病性鉴定结果。其中，A图为接种黑胫病后的0、48、72小时的叶片表型；B图为枯萎斑的直径统计结果；C图为叶片细胞死亡统计结果（用细胞死亡染料Evansblue的吸光度表示）；D图为叶片过氧化氢含量测定结果。
图5—10中的“*”表示相同条件下转病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1烟草的测定结果与对照转空载体pTRV2烟草相比在P﹤0.05差异显著；图6—10中的白色柱形图代表转病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1烟草的结果，阴影柱形图代表对照转空载体pTRV2烟草的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本生烟草（Nicotiana benthamiana）、载体pTRV2和pTRV1：文献：Liu Y,NakayamaN,Schiff M,Litt A,Irish VF,Dinesh-Kumar SP(2004)Virus induced genesilencing of a DEFICIENS ortholog in Nicotiana benthamiana.Plant Mol Biol 54:701-711；中国科学院植物研究所。
实施例1、NtNHX1蛋白及其编码基因的获得
1、取本生烟草（Nicotiana benthamiana）种子种植在含有蛭石、泥炭和腐殖质（v:v:v=1:1:1）的塑料盆中在温度25/20±2℃,16小时光照，50±10%相对湿度条件下培养，苗期每周浇1/2Hoagland营养液一次。
2、利用Trizol法提取经步骤1培养至50日龄的本生烟草叶片总RNA，反转录获得第一链cDNA，以该cDNA为模板，用引物P1（5'-ATGGCGTCTGAGCTAGCTTCT-3'）和P2（5'-TCATGGTTCCTGTTCCGTT-3'）和高保真Taq聚合酶进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳并切胶回收1.6kb的片段进行测序。
3、步骤2的测序结果显示该片段的序列如SEQ ID NO：2所示，长1611bp，编码SEQ ID NO：1所示的蛋白，该蛋白由536个氨基酸组成。将SEQ ID NO：1所示蛋白命名为NtNHX1蛋白，SEQ ID NO：2所示基因命名为NtNHX1基因。
4、SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列含有阿米洛利结合位点（图1中的黑框序列）。使用生物信息学软件TopPred（http://mobyle.pasteur.fr）对该氨基酸序列进行跨膜结构域预测，结果表明NtNHX1蛋白包含有12个跨膜结构域（图1），该预测与已经确定的拟南芥的NHX1（AtNHX1）和盐角草的NHX1（SeNHX1）蛋白结构域相同。
实施例2、NtNHX1蛋白的定位分析
将表达NtNHX1和绿色荧光蛋白GFP融合基因的载体、表达AtNHX1和绿色荧光蛋白GFP融合基因的载体分别电击法转化农杆菌GV1301（北京天象邦定生物医学科技有限公司）后，分别注射按实施例1步骤1方法培养4周的本生烟草从上至下的第三和第四片叶，3天后观察烟草叶片的表皮细胞，并提取叶片原生质体进行观察。
结果如图2所示：第1列为烟草叶片的表皮细胞，显示NtNHX1具有与AtNHX1相似的核周围液泡隔膜。同时，观察原生质体（第2列），发现原生质体膜上具有强烈的绿色荧光。为了区别液泡膜和质膜，向原生质体悬浮液中加入FM4-64染料，浸泡10分钟（FM4-64染料可以迅速染色质膜，并随时间的延长，不断地渗入细胞从而将细胞的内膜系统染色(Bolte et al.,2004)，要完全染上整个细胞的内膜系统，需要1个小时甚至更久的时间）后观察（第3列），FM4-64已经完成细胞膜的染色，并进入细胞，开始染色内膜系统。将绿色荧光与FM4-64的红色荧光共定位，如果绿色荧光与红色荧光完全重合，即只体现出黄色荧光（不出现绿色荧光），说明蛋白是定位在细胞膜上；但如果依然有绿色荧光存在，说明蛋白不是质膜蛋白，而是液泡膜蛋白，如第4列所示，绿色荧光与红色荧光没有完全重合，说明NtNHX1是定位在液泡膜上的蛋白，与阳性对照AtNHX1相同。
实施例3、NtNHX1基因沉默烟草的获得
1、病毒诱导基因沉默载体（简称为病毒沉默载体）的构建
以实施例1获得的本生烟草（Nicotiana benthamiana）的cDNA为模板，用上游引物5’-GAATTCCTTATAAGTCTCCTGCTGCCACC-3’和下游引物5’-GGTACCGGAGCAAGAGGAGTAAACCCCCG-3’进行PCR扩增，回收275bp大小的片段，用EcoRI和KpnI酶切后连入载体pTRV2的EcoRI和KpnI酶切位点间，获得NtNHX1基因的病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1，经测序证实，载体pTRV2-NtNHX1为载体pTRV2的EcoRI和KpnI酶切位点间插入了序列表序列2的第1321位至1583位所示的DNA片段。
同时，将Genbank号为U19262.1的第1—369位所示的DNA片段插入载体pTRV2的EcoRI和KpnI酶切位点间，获得重组载体pTRV2-PDS（阳性对照），并经测序证实。
2、转化烟草
1）重组农杆菌的获得
将pTRV2-NtNHX1和辅助质粒pTRV1共同转化农杆菌GV1301（北京天象邦定生物医学科技有限公司），获得含pTRV2-NtNHX1和pTRV1的农杆菌GV1301，命名为重组农杆菌A；
将pTRV2-PDS（阳性对照）和辅助质粒pTRV1共同转化农杆菌GV1301，获得含pTRV2-PDS和pTRV1的农杆菌GV1301，命名为重组农杆菌B；
将pTRV2（阴性对照）和辅助质粒pTRV1共同转化农杆菌GV1301，获得含pTRV2和pTRV1的农杆菌GV1301，命名为重组农杆菌C。
2）侵染液的制备
将步骤1）获得的重组农杆菌A、B和C分别用LB液体培养基（含卡那霉素100mg/L）培养至OD600为1.0，获得侵染液A、B和C。
3）转化烟草
按照文献“Liu et al.,2004”的方法，将步骤2）的三种侵染液分别注射4周龄本生烟草（Nicotiana benthamiana）叶片（即从顶端往下第三和第四片叶），获得三种转基因烟草，即转化pTRV2-NtNHX1的烟草，转化pTRV2-PDS的烟草和转化pTRV2的烟草。将转基因烟草在正常条件下培养4周后，当转化pTRV2-PDS的烟草出现白化现象时（图4），将转化pTRV2-NtNHX1的烟草进行NtNHX1基因表达量分析，以转化pTRV2的烟草为对照，结果如图5所示，转化pTRV2-NtNHX1的烟草植株N1—N34中NtNHX1表达量明显降低。
上述NtNHX1基因表达量分析的方法如下：
取待检测的烟草叶片，提取总RNA，经DNase消化，反转录后，利用SYBR GreenRealtime PCR Master Mix(Toyobo，Japan)进行荧光定量RT-PCR检测。以Actin基因作为内参，通过2-ΔΔCt的方法对NtNHX1基因表达进行相对定量。
荧光定量RT-PCR中所用引物序列如下：
内标Actin基因引物：
Actin1:5'-GGAACACCCTGTTCTCCTGACTG-3'；
Actin2：5'-CAGAGAAAGCACAGCCTGGATAG-3'；
烟草NtNHX1基因特异引物：
NtNHX1up:5'-GTTCAAGAGTTACTACAAGGCACG-3'(对应于SEQ ID NO：2的第890-913位)
NtNHX1down:5'-CAATGGTAATGGTGCTGGTAATC-3'(对应于SEQ ID NO：2的第1256-1279位)
实施例4、NtNHX1基因沉默烟草的鉴定
一、液泡H+流和pH值测定
1、液泡H+流测定（非损伤微测技术）
取实施例3获得的病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草株系N11-N16注射叶片以上的新生叶片，按照文献“Chen,et al.AnalyticalBiochemi stry,2011,418:295–297”中的液泡H+流测定体系进行液泡H+净流（外流）测定，结果取平均值，以转化pTRV2的烟草注射叶片以上的叶片为对照，为了研究NaCl或者KCl对液泡H+流的影响，在测定开始2分钟后，在测试液中加入终浓度为0、25mM和50mM的NaCl或KCl按照相同方法测定液泡H+净流（外流）。非损伤测定数值，用正值表示阳离子外流，反之亦然。
液泡H+净流（外流）测定的具体方法如下：
从Yakult公司购买纤维素酶（货号：L0012）与离析酶R-10（货号：L0021）。从美国Amresco公司购买SDS,MES,KOH,甘露醇,Ficoll-400,Tris等药品。多聚赖氨酸购买于美国Sigma公司（货号：P4707）。试验中所有步骤都使用双蒸水。光学显微镜使用Zeiss IM-35倒置相差显微镜。普通离心使用Sigma 3-18K离心机；超速离心使用BECKMAN Opt ima L-80XP超速离心机。
1）制备原生质体
取1g烟草叶片，剪成2mm×2mm的方块,放进细胞裂解缓冲液中，28℃轻微摇晃（40r/min）6-8小时，得到的混合物即为细胞裂解液。细胞裂解液通过一层纱布过滤，取滤液；滤液通过平转头4℃，100g离心2分钟，离心结束，丢弃上清液，留下沉淀。
1升细胞裂解缓冲液的配制方法：是将15g离析酶R-10、20g纤维素酶、0.05gMES、和0.5mol甘露醇用水混匀并定容至1升，用KOH调pH值至5.7。
2）裂解原生质体
将步骤1）得到的沉淀加入原生质体裂解缓冲液中，轻轻吸打10分钟，得到烟草叶片的原生质体裂解溶液（即液泡初提液）；
1升原生质体裂解缓冲液的配制方法：将36.43g甘露醇和3g Tris加入1L水，混匀，并用HCl调节pH值至7.5。
3）分离纯化液泡
将步骤2得到的液泡初提液加入8%Ficoll-400溶液的顶层（8%Ficoll-400溶液在下层，液泡初提液在上层）。利用Sigma 3-18K冷冻离心机，使用平转头500g普通离心50min，4℃，收集第一层溶液（从上数第一层溶液），即得到液泡提取液。
每1升所述8%Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的：将25mmol的Tris、0.4mol甘露醇和80g相对分子重量为400000的聚蔗糖混合均匀，用水定容至1升，再用HCl调pH至7.5。
4）取步骤3）获得的液泡提取液先在含有0.008%(w/v)的多聚赖氨酸盖玻片上固定15分钟，然后加入4ml的测试液。
每1升测定液的配制方法：将0.05mmol的2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES）、500mmol甘露醇、0.1mmol NaCl、0.1mmol CaCl2和100mmol KCl混合均匀，用水定容至1升，再用KOH调节pH至7.0。
5)待测试液扩散均匀后使用非损伤微测系统(BIO-001A,Younger USA Sci.&Tech.Corp.,USA)以静态和动态的方式选择性地测定离子浓度。测定所用非损伤微电极（XY-H-01型）由旭月（北京）科技有限公司提供。电解液：由NaCl、KH2PO4和水组成，NaCl在电解液中的浓度为15mM，KH2PO4在电解液中的浓度为40mM，pH 7.0。数据采集软件：Aset1.05；流速计算软件：Mageflux：http://xuyue.net/mageflux。H+选择性微电极前端灌充有20μm的选择性的氢离子的液态交换剂（LIX，Sigma，产品目录号为Hydrogen ionophore I-cocktail B,95293），H+选择性微电极后端灌充有1cm的电解液柱。将电极固定器(EHB-1;World Preci sion Instruments)上的Ag/AgCl丝从电极后面插入，使其与电解液接触。接地参比电极（DRIREF-2;World PrecisionInstruments）为固体电极。H+选择性微电极在使用前经过校正，能斯特斜率（Nernstianslopes）为58mV/decade，校正液为pH 5.5和pH 6.5的PBS缓冲液。选择性微电极在预先确定距离（5–30μm）的两点间重复运动，从而测得氢离子的绝对浓度或浓度梯度，微电极的运动频率通过编程设定在0.3–0.5Hz的范围内。
结果如图6所示。转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草中细胞液泡H+外流明显低于转空载体pTRV2的烟草（图6A）；施加不同浓度的NaCl和KCl后，转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草中细胞液泡的H+流没有明显的变化，而转空载体pTRV2的烟草随着NaCl浓度的升高，液泡H+外流出现明显增加（图6B和C）。图6的结果说明NtNHX1基因沉默使H+外流的降低，即NtNHX1蛋白参与液泡H+的运输。
2、液泡pH值测定
取实施例3获得的病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草株系N11-N16注射部位以上的叶片进行液泡pH值测定，结果取平均值，以转化pTRV2的烟草注射部位以上的叶片为对照，具体方法如下：
取50日龄的野生型本生烟草注射部位以上的叶片切割成5mm×5mm方块，放置到含染料BCECF-AM的不同pH值（5.0—7.4)的溶液（50mM醋酸铵，50mM HEPES或MES）中浸泡45min。用蔡司共焦显微镜(LSM 510META)收集荧光。将样品在458和488nm波长下分别激发，然后在525和550nm区间内收集荧光强度。根据不同pH值下的488nm/458nm荧光比率做成标准曲线（图7A）。
取50日龄的转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草株系和对照的注射部位以上的叶片用含染料BCECF-AM的pH值为6.0的溶液(含0.5%蔗糖和10mM MES)浸泡45min，用蔡司共焦显微镜(LSM 510META)收集荧光。将样品在458和488nm波长下分别激发，然后在525和550nm区间内收集荧光强度，算出488nm/458nm的荧光比值；根据标准曲线，换算出相应的pH值（图7B）。同时，利用MATLAB软件，绘制比率图片，即将在488nm或者458nm激发下得到的图片，进行所有像素点的原位比值，然后对于这些点赋予相应的颜色，最后进行原图的全图渲染。其中，每个pH值的测定选择了6个组织块，每个组织块选择10个液泡区域进行原位比色，结果如图7C所示。
图7A和B的结果表明，NtNHX1沉默植株（即转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草）细胞内pH值为5.8，对照植株pH为6.5；通过pH值原位渲染图7C所示，从图中选取的三个液泡区域，NtNHX1沉默植株所表现出来的pH显著比对照植株pH低。
步骤1和2的结果表明，NtNHX1蛋白参与液泡H+的运输，并调节液泡内的酸度。
二、细胞还原力和氧化还原池容量测定
取实施例3获得的转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草株系N11-N16注射部位以上的叶片进行细胞还原力（即NAD(P)H的值/NAD(P)的值）和氧化还原池容量（即NAD(P)H的值+NAD(P)的值）的测定（这两个参数对缓解氧化伤害具有重要的作用），以转化pTRV2的烟草注射部位以上的叶片为对照，具体方法如下：
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的提取与测定：取10g叶片，在冰浴下用10ml提取液（50mmol·L -1 HCl或50mmol·L -1 NaOH 溶液）研磨，在4℃、39000g离心30min，取0.1ml上清液，加入200μl混合液（1mol·L-1tricine-NaH、40mmol·L-1EDTA、4.2mmol·L-1噻唑蓝（MTT）、16.6mmol·L-1吩嗪硫酸甲酯（PES）、25mmol·L -1 6-磷酸葡萄糖（G-6-P）或5.0mol·L -1 乙醇），再加入150μl 0.1mol·L-1NaCl，于37℃怛温水浴中保温5min，取出放入冰浴中加入50μl 6-磷酸葡萄糖脱氢酶或乙醇脱氢酶，再于37℃恒温水浴中培养40min，取出加入200μl 6mol·L-1NaCl溶液终止反应，接着离心（12600g，常温15min），弃掉上清液，沉淀用1.5ml 95%乙醇溶解，待沉淀振荡完全溶解后于570nm处测定OD值。
其中，上述三处下划线处的试剂分别为50mmol·L-1HCl溶液、5.0mol·L-1乙醇及乙醇脱氢酶得到的OD570值为NAD值；分别为50mmol·L-1HCl溶液、25mmol·L-1G-6-P及6-磷酸葡萄糖脱氢酶得到的OD570值为NADP值；分别为50mmol·L-1NaOH溶液、5.0mol·L-1乙醇及乙醇脱氢酶得到的OD570值为NADH值；分别为50mmol·L-1NaOH溶液、25mmol·L-1G-6-P及6-磷酸葡萄糖脱氢酶得到的OD570值为NADPH值。
计算比率NADH值/NAD值（即NADH/NAD）和NADPH值/NADP值（即NADPH/NADP），用来表征细胞还原力；
计算总和NADH值+NAD值（即NADH+NAD）和NADPH值+NADP值（即NADPH+NADP），用来表征细胞氧化还原池容量；
结果如图8所示，对于NtNHX1沉默烟草（即转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草），细胞还原力与对照烟草相比出现显著下降；同时细胞氧化还原池容量也比对照烟草有明显的下降。结果表明，NtNHX1的沉默降低了细胞还原力和氧化还原池容量。
三、耐盐性鉴定
从实施例3获得的转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草株系N11-N16注射部位以上的叶片取叶盘，每叶以叶脉为中轴左右各取一个叶盘分别放置于含0和200mMNaCl水溶液的玻璃皿中，室温25℃光照条件下放置三天后，对叶盘进行拍照，并测定叶盘的叶绿素含量、细胞死亡，以转化pTRV2的烟草注射部位以上的叶片为对照。
上述叶绿素含量测定的具体方法如下：
取叶盘称取0.1g研磨，用80%丙酮溶液4℃浸提30min，获得叶绿素溶液，用分光光度计以80%丙酮溶液为空白调零对照，检测样品在波长663nm和645nm处的吸光度值，记为D663和D645，按以下公式计算叶绿素含量：CT=20.29D645+8.05D663。
上述细胞死亡测定的具体方法如下：
用伊文思蓝（Evans Blue）染色来测定细胞死亡(Harding and Roberts,1998)。首先，将处理后的叶盘浸泡于0.1%(w/v)伊文思蓝中，真空渗透15分钟并保持8小时。染色后，用蒸馏水反复冲洗组织表面，直到将表面残余冲洗干净。然后，用1ml的研磨液（50%(v/v)的甲醇和1%SDS）对组织进行研磨，2000g离心10分钟，取上清。用分光光度计测定600nm和680nm处的吸光值A600和A680，用A600/A680（即相对吸光度）来衡量细胞死亡，比值越大，则细胞死亡数越多；计算细胞死亡倍数（即相对吸光度与对照的相对吸光度的比值）。
结果如图9所示，浸泡在0mM NaCl溶液中的叶盘，无论是来自NtNHX1沉默烟草（即转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草）还是对照，都没有显著的区别；但是，浸泡在200mM NaCl溶液中的叶盘，来自于NtNHX1沉默烟草的表现出更严重的白渍斑（图9A）；同时，叶绿素含量测定结果显示，NtNHX1沉默烟草叶盘在盐处理3天后，与对照相比叶绿素含量明显降低；对叶盘进行细胞死亡测定结果显示，盐处理后沉默烟草叶盘细胞死亡对照相比明显增加（图9B），即NtNHX1沉默烟草的耐盐性降低。结果表明，NtNHX1蛋白参与调控植物的耐盐性。
四、抗病性鉴定
从实施例3获得的转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草植株选取N1-N30植株注射部位以上的叶片接种烟草黑胫病菌0号生理小种（Phytophthoraparasitica var．nicotianae race 0）（文献：Rance I,Fournier J,Esquerre-Tugaye MT(1998)Theincompatible interaction between Phytophthora parasitica var．nicotianae race0 and tobacco is suppressed in transgenic plants expressing antisenselipoxygenase sequences.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnitedStares of America 95:6554-6559），在接种后的0、48和72小时分别拍照，并测定叶片上枯萎斑的平均直径、细胞死亡分析和叶片中积累的H2O2含量。
上述H2O2含量测定的具体方法如下：
另外，我们也使用DAB(1mg/ml)来对组织中的H2O2进行指示，具体方法参照如下：。
1）取0.1g植物材料在液氮中研磨成精细的粉末，加入0.6ml反应液I（100mlpH6.5的50mM磷酸钾缓冲液中加入3-氨基-1,2,4-三氮唑0.06816g），充分震荡混匀；
2）4℃、12000rpm离心15min，吸上清100μL至96孔平底检测板中，每个样品重复三个孔；
3）然后用排枪每孔加入100μL反应液II（取100ml含500μM硫酸亚铁铵、200mM 山梨醇和50mM H2SO4的溶液加入0.01513g二甲酚橙得到的溶液），反应10min；
4）高通量分光光度计检测560nm处的吸光值，再根据H2O2的标准曲线得到相应样品中的H2O2浓度，单位是μmol/g FW。
上述细胞死亡测定的具体方法如下：取接种烟草黑胫病菌后叶片病斑附近的区域按步骤三的细胞死亡测定方法测定A600/A680（即相对吸光度），计算细胞死亡倍数（由各个时期的相对吸光度与0小时的相对吸光度比值得到）。
结果如图10所示，在0hpi（接菌后的0小时），NtNHX1沉默烟草（即转化病毒沉默载体pTRV2-NtNHX1的烟草）和对照并没有表现出任何表型上的区别；但是在48和72hpi，NtNHX1沉默烟草表现出更严重的病斑（图10A和B）。同时，我们在48和72hpi测定烟草叶片的细胞死亡和H2O2含量，结果显示，NtNHX1沉默烟草表现出更严重的细胞死亡，同时积累更多的H2O2（图10，C和D），即NtNHX1沉默烟草的抗病性降低。结果表明，NtNHX1蛋白具有调控植物抗病性的功能。
Claims (14)
1.一种蛋白质，是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因；所述编码基因为核苷酸序列是SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
3.权利要求1所述蛋白质及权利要求2所述基因在调控目的植物的下述至少一种性状中的应用：抗病性、耐盐性、液泡H+运输、液泡内pH值、细胞还原力和细胞氧化还原池容量。
4.一种DNA分子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2的第1321位至第1583位核苷酸段。
5.含有权利要求4所述DNA分子的重组载体；所述重组载体为pTRV2-NtNHX1，即在载体pTRV2的EcoRI和KpnI位点间插入SEQ ID NO：2的第1321位至第1583位所示DNA片段得到的重组载体。
6.含有权利要求4所述DNA分子的表达盒。
7.含有权利要求4所述DNA分子的重组菌。
8.含有权利要求4所述DNA分子的重组病毒。
9.权利要求4所述DNA分子在制备抑制或下调目的植物中权利要求1所述蛋白质表达的物质中的应用。
10.根据权利要求3或9所述的应用，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述抗病性的致病菌为烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）；所述双子叶植物为烟草。
12.一种培育转基因植物的方法，包括抑制目的植物中权利要求1所述蛋白质的表达，得到与所述目的植物相比具有如下1）-6）中至少一种表型的转基因植物：
1）抗病性降低；
2）耐盐性降低；
3）液泡H+外流减少；
4）液泡内pH值降低；
5）细胞还原力降低；
6）细胞氧化还原池容量降低；
所述抑制目的植物中所述蛋白质的表达包括将向所述目的植物中导入权利要求5中的所述pTRV2-NtNHX1的步骤。
13.权利要求12所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述抗病性的致病菌为烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica var.nicotianae）；所述双子叶植物为烟草。
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