CN102958512A - 控释肽制剂 - Google Patents

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Abstract

本文描述了通过直接修饰生物活性剂的等电点和/或净电荷来调节聚合物递送系统所包封生物活性剂的释放和/或药物加载特征的方法和组合物。

Description

控释肽制剂
领域
本发明涉及肽制剂，更具体地说，涉及修饰此类制剂的释放和/或药物加载特征的方法和组合物。
发明背景
生物相容和/或生物可降解的聚合物作为活性治疗剂运载体的重要性众所周知。含有生物活性剂的生物相容、生物可降解和相对惰性的聚合物，例如聚(丙交酯)(PL)或(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLGA)通常用于控释递送系统(综述参见M.Chasin，“用于控制药物递送的生物可降解的聚合物”(Biodegradablepolymers for controlled drug delivery).刊于J.O.Hollinger编，《合成的生物可降解聚合物在生物医学中的应用》(Biomedical Applications of SyntheticBiodegradable Polymers)CRC，Boca Raton，Fla.(1995)，第1-15页；T.Hayashi，“生物医学应用的生物可降解聚合物”(Biodegradable polymers forbiomedical uses).Prog.Polym.Sci.194(1994)，第663-700页；和HarjitTamber，Pal Johansen，Hans P.Merkle和Bruno Gander，“用于抗原递送的生物可降解聚合物微球制剂”(Formulation aspects of biodegradable polymericmicrospheres for antigen delivery)，《药物递送最新综述》(Advanced DrugDelivery Reviews)，第57卷，第3期，2005年1月10日，第357-376页)。
然而，特别是对于递送治疗性肽，设计出能有效控释聚合物递送的系统仍有许多困难。此类递送系统的基本要求是需要适当控制所包封活性剂的释放，各聚合物系统的释放动力学差异造成该目标错综复杂。整个聚合物系统经初始扩散性或爆发性释放期之后是较慢的迟滞期，随着聚合物系统开始降解进入腐蚀释放期(erosional release phase)。将肽分子浓度在两个主要的肽释放期中维持在治疗有效窗口内并避免可能导致不利副作用或不良结果的浓度过高，特别是扩散释放期初始的爆发释放至关重要。然而，就此而言，不同肽分子极为不同的大小、电荷及构象至今妨碍着建立对它们进行有效包封的更统一方法。
现有技术描述了各种方案来改善聚合物递送系统的控释递送，包括采用新型聚合物材料和聚合物掺混物，和/或将添加剂掺入此类系统以帮助药物递送。例如，美国专利第7,326,425号描述了含有第一聚合物和第二聚合物的掺混聚合物递送系统，所述第一聚合物能与所需生物活性剂形成氢键而防止爆发释放，而所述第二聚合物的降解产物能触发第一聚合物释放活性剂。此外，美国专利公布号2007/0092574描述了将某些有机离子加入包封水溶性生物活性剂的聚合物递送系统可减少生物活性剂的爆发释放和降解，其中所选择的有机离子能中和特定生物活性剂的总电荷。
然而，在各个这些实例和现有技术中，此类方案通常主要的关注点是操控聚合物递送系统使之适合特定生物活性剂的要求，而不是操控或改进生物活性剂本身。
发明概述
与操控聚合物递送系统使之适合所包封制剂的常规配制方法相反，本发明提供的方法和组合物通过直接修饰生物活性剂本身来调节所包封生物活性剂的释放和/或药物加载特征。如本文所述，修饰生物活性剂，如肽分子的等电点，例如改变肽的总电荷，预计能以临床上有意义的方式修饰聚合物递送系统的释放和/或加载特征，包括降低或增强聚合物递送系统的肽初始扩散释放，调节生物可降解系统的侵蚀性释放速率和/或提高此类肽的包封效率。
一方面，提供提高聚合物递送系统中生物活性剂加载效率的方法，包括先修饰该生物活性剂的等电点，再将其包封入聚合物递送系统。在一个实施方式中，修饰所述生物活性剂的等电点使之在所需的聚合物递送系统环境中携带比母体分子更多的正电荷。
在一个实施方式中，提供提高聚合物递送系统中生物活性剂加载效率的方法，包括在母体分子上加入增加的正电荷。
一方面，提供调节生物活性剂自生物可降解聚合物递送系统的侵蚀性释放速率的方法，包括先改变该生物活性剂的等电点，再将其包封入聚合物递送系统。在一个实施方式中，定量提高或降低生物活性剂的等电点使之在所需的聚合物递送系统环境中携带比母体分子更多的净正电荷或净负电荷。
在一个实施方式中，提供了增加生物活性剂自生物可降解聚合物递送系统侵蚀性释放速率的方法，包括在母体分子上加入增加的正电荷或负电荷，从而分别产生化学计量比母体分子更多或更少的净电荷。在一个实施方式中，将增加的正电荷加入中性或阳离子母体分子以提高其侵蚀性释放速率。在另一实施方式中，将增加的负电荷加入中性或阴离子母体分子以提高其侵蚀性释放速率。在一优选实施方式中，为增强效应采用酸端接的聚合物递送系统。
出乎意料的是，本发明人测定到，与降低或中和净电荷以增加生物活性剂自生物可降解聚合物递送系统的侵蚀性释放速率相比，相对于阳离子性母体分子增加生物活性剂的净正电荷起相同作用，甚至更好。更有意义的是，本文还首次证明，使产生的荷电生物活性剂的电荷密度比母体分子越高，提供的效果越好。
一方面，还提供调节生物活性剂自聚合物递送系统的初始扩散释放的方法，包括先改变该生物活性剂的等电点，再将其包封入聚合物递送系统。在一个实施方式中，提高或降低该生物活性剂的等电点使之在所需的聚合物递送系统环境中分别携带比母体分子更多的净正电荷或净负电荷。
在一个实施方式中，提供增加生物活性剂自聚合物递送系统初始扩散释放的方法，包括在母体分子上加入增加的正电荷，从而产生化学计量比母体分子更多的净电荷。在一优选的实施方式中，为增强效应采用酯端接的聚合物递送系统。
在一个实施方式中，提供降低生物活性剂自聚合物递送系统初始扩散释放的方法，包括在母体分子上加入增加的负电荷，从而产生化学计量比母体分子更少的净电荷。在一优选的实施方式中，为增强效应采用酯端接聚合物递送系统。
修饰生物活性剂等电点的任何合适方法可与本发明方法联用，例如化学修饰、氨基酸取代、与带正电或负电的辅助分子、更优选可切割性辅助分子偶联，等等。增加的正电荷或负电荷可均匀或非均匀地分布在生物活性剂中，优选分布在距离母体分子的一个或多个已知作用位点，例如结合位点等的远处位置。在一个实施方式中，所述增加的电荷分布聚集在氨基或羧基末端。在另一实施方式中，所述增加的电荷与氨基酸侧链偶联。
本文所述的等电点修饰也可与更常规的技术，例如转变为水不溶性加成盐(例如，美国专利第5,776,886号)、PEG化(美国专利第6,706,289号)等联用，以进一步改善释放动力学和/或加载效率。在还有一方面，提供包含按照上述方法修饰并包封在聚合物递送系统中的生物活性剂的控释药物组合物。
在一个实施方式中，所述控释药物组合物包含聚合物包封的经修饰的生物活性剂，其中所述经修饰的生物活性剂的等电点比母体分子高，从而提高了药物加载效率，和/或提高了所述修饰生物活性剂自(优选)酸端接聚合物系统的侵蚀性释放速率，和/或增加了所述修饰生物活性剂优先自酯端接聚合物系统的扩散性释放。在一个此类实施方式中，所述母体分子是中性或阳离子分子。
在另一实施方式中，所述控释药物组合物包含生物可降解聚合物包封的经修饰的生物活性剂，其中所述经修饰的生物活性剂的等电点比母体分子低，从而与母体分子相比，提高了所述修饰生物活性剂自(优选)酸端接聚合物系统的侵蚀性释放速率，和/或降低了所述修饰生物活性剂优先自酯端接聚合物系统的扩散性释放速率。在一个此类实施方式中，所述母体分子是中性或阴离子分子。
除非另有指定，本文所述组合物可包含非生物降解性聚合物递送系统，例如含有非生物降解性聚合物的聚合物系统。在一方面，所述非生物降解性聚合物选自下组：聚丙烯酸酯、乙烯乙酸乙烯酯和其它酰基取代的乙酸纤维素的聚合物、非降解性聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺酸聚烯烃、聚氧乙烯、它们的掺混物和共聚物。
在另一方面，本文所述的组合物可包含生物可降解的聚合物递送系统，例如含有生物可降解聚合物的聚合物系统。在另一方面，所述生物可降解聚合物选自以下均聚物构成的组：聚(乳酸)(PLA)、聚丙交酯(PL)或聚(乙醇酸)(PGA)、聚乙醇酸交酯(PG)、聚(乳酸)-(乙醇酸)共聚物(PLGA)、(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)、聚(原酸酯)和聚酐。PLGA和PLA因其生物相容性和临床应用历史久而最常使用。可采用的其它生物可降解聚合物包括聚己酸内酯、聚碳酸酯、聚酰胺酯、聚(氨基酸)、聚(二烷酮(dioxanone))、聚(亚烷基烷基化物(alkylene alkylate))、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、生物可降解的聚氨酯、和它们的掺混物及共聚物。
本发明组合物和方法优选与各种生物活性剂联用，包括治疗性蛋白、核酸、肽、多肽、寡核苷酸等。
在另一方面，本发明提供治疗需要治疗的患者的方法，包括给予该患者治疗有效量的本发明药物组合物。
附图简述
图1是可降解基质的假定三阶段药物释放示意图。
图2显示含有中性、正(+)或负(-)总电荷的5种肽(DP1、DP2、DP3、DP4和DP5)(x-轴)的实际加载(y-轴)。除非另有注释，各肽分子作为以其乙酸盐加载入该聚合物中。
图3显示含有中性、正(+)或负(-)总电荷的5种肽(DP1、DP2、DP3、DP4和DP5)(x-轴)的理论加载百分率(y-轴)。除非另有注释，各肽分子以其乙酸盐加载入该聚合物中。
图4显示含有中性、正(+)或负(-)总电荷的5种肽(DP1、DP2、DP3、DP4和DP5)(x-轴)的平均粒度(μM)。除非另有注释，各肽分子以其乙酸盐加载入该聚合物中。
图5显示含有中性、正(+)或负(-)总电荷的5种肽(DP1、DP2、DP3、DP4和DP5)在35天期间(x-轴)从微粒聚合物制剂的释放速率，以释放百分比表示(y-轴)，所述微粒聚合物制剂含有酸端接的50∶50(丙交酯-乙交酯)共聚物，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的固有粘度(i.v)约为0.2dL/g。除非另有注释，各肽分子以乙酸盐加载入该聚合物中。
图6显示含有中性、正(+)或负(-)总电荷的5种肽(DP1、DP2、DP3、DP4和DP5)在14天期间(x-轴)从微粒聚合物制剂的释放速率，以释放百分比表示(y-轴)，所述聚合物微粒制剂含有酸端接的50∶50(丙交酯-乙交酯)共聚物，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的固有粘度(i.v)约为0.2dL/g。除非另有注释，各肽分子以乙酸盐加载入该聚合物中。
图7显示含有中性、正(+)或负(-)总电荷的5种肽(DP1、DP2、DP3、DP4和DP5)在17天期间(x-轴)从微粒聚合物制剂的释放速率，以释放百分比表示(y-轴)，所述微粒聚合物制剂含有酯端接的50∶50(丙交酯-乙交酯)共聚物，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的固有粘度约为0.2dL/g。除非另有注释，各肽分子以乙酸盐加载入该聚合物中。
图8显示含有中性、正(+)或负(-)总电荷的5种肽(DP1、DP2、DP3、DP4和DP5)在29天期间(x-轴)从微粒聚合物制剂的释放速率，以释放百分比表示(y-轴)，所述微粒聚合物制剂含有酸端接的85∶15(丙交酯-乙交酯)共聚物，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的固有粘度约为0.25dL/g。除非另有注释，各肽分子以乙酸盐加载入该聚合物中。
图9显示含有中性、正(+)或负(-)总电荷的5种肽(DP1、DP2、DP3、DP4和DP5)在65天期间(x-轴)从微粒聚合物制剂的释放速率，以释放百分比表示(y-轴)，所述微粒聚合物制剂含有酯端接的85∶15(丙交酯-乙交酯)共聚物，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的固有粘度约为0.25dL/gL。除非另有注释，各肽分子以乙酸盐加载入该聚合物中。
图10显示含有中性、正(+)或负(-)总电荷的5种肽(DP1、DP2、DP3、DP4和DP5)在15天期间(x-轴)从微粒聚合物制剂的释放速率，以释放百分比表示(y-轴)，所述微粒聚合物制剂含有酯端接的85∶15(丙交酯-乙交酯)共聚物，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的固有粘度约为0.25dL/gL。除非另有注释，各肽分子以乙酸盐加载入该聚合物中。
详述
通过直接修饰生物活性剂提供的方法和制剂从聚合物递送系统控释所述生物活性剂。如本文所述，可改变经修饰的生物活性剂相对于母体分子的等电点，和/或改变经修饰的生物活性剂相对于母体分子的净电荷，等等。与包含母体分子的类似包封制剂相比，包含此类经修饰的生物活性剂的包封制剂的控释特性改善，例如初始扩散释放或爆发释放降低、侵蚀性释放速率提高、包封效率提高等等。
生物活性剂从聚合物，例如生物可降解的聚合物，如PLG微粒的释放通常遵循图1所示的三阶段释放模式。阶段1的特征一般是扩散释放或“爆发”效应，在此期间，经修饰肽分子的初始释放速率可能很快，取决于聚合物的水合(在数分钟内发生)、基质的溶胀(数小时)、经修饰肽分子的溶解(数分钟)和从基质中扩散(数小时)。
释放的第二阶段(阶段2，图1)称为诱导或迟滞期，其特征在于较慢释放或不释放的时期。阶段2可能与形成孔洞或通道所需时间或水充满聚合物基质中的孔洞或通道接近聚合物基质包埋的经修饰肽分子所需时间相关。
当采用生物可降解聚合物递送系统时，随着生物可降解聚合物的持续降解，经修饰的肽分子通过被侵蚀基质形成的扩散途径，沿浓度梯度移动而离开基质。该侵蚀性释放对应于图1所示释放的第三阶段。
生物活性剂从非生物降解性聚合物释放通常遵循两阶段释放模式，其中阶段1对应于生物活性肽的扩散释放，阶段2对应于迟滞期。因此，本领域技术人员通常熟悉生物活性剂从此类聚合物递送系统的典型释放速率。
在一个实施方式中，提供控释改善的组合物和方法，其中提高母体分子的等电点使产生的经修饰的生物活性制剂具有更多净正电荷和/或更高电荷密度，如本文所示，与母体分子相比，其药物加载效率提高，经修饰生物活性剂的侵蚀性释放速率提高，特别是酸端接聚合物系统的侵蚀性释放速率提高，和/或使经修饰的生物活性剂的扩散释放，特别是酯-端接聚合物系统的扩散释放增加。在一个此类实施方式中，所述母体分子是中性或阳离子分子。
在另一实施方式中，提供控释改善的组合物和方法，其中降低母体分子的等电点使产生的经修饰的生物活性制剂具有更多净负电荷和/或更高电荷密度，如本文所示，与母体分子相比，经修饰生物活性剂的侵蚀性释放率，特别是酸-端接聚合物系统的侵蚀性释放速率提高，和/或使经修饰的生物活性剂的扩散释放速率，特别是酯-端接聚合物系统的扩散释放速率降低。在一个此类实施方式中，所述母体分子是中性或阴离子分子。
本文所用的“生物活性剂”指给予对象的任何治疗性蛋白质、治疗性抗体、核酸、肽、多肽、寡肽、适体和其它生物活性化合物。
本文所用的“肽分子”表示包含通过肽键共价相连的至少两个氨基酸的多聚分子，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽分子可由天然产生的氨基酸和肽键构成，或是合成的肽模拟物结构(peptidomimetic structure)，即，“类似物”，例如类肽(参见通过引用纳入本文的Simon等.，1992，Proc Natl Acad SciUSA 89(20)：9367)。
本文所用的“氨基酸”和“氨基酸相同性”表示20种天然产生的氨基酸之一，或其存在于具体限定位置的任何非天然类似物。因此，本文所用的“氨基酸”或“肽残基”表示天然产生的和合成的氨基酸(包括天然产生的氨基酸的类似物)。例如，为本发明的目的，高苯丙氨酸(homophenylalanine)、瓜氨酸、2-氨基-3-胍基丙酸、2-氨基-3-脲基丙酸、Lys(Me)、Lys(Me)2、Lys(Me)3、鸟氨酸、ω-硝基-精氨酸、Arg(Me)2、α-甲基Arg、α-甲基Lys、β高赖氨酸(homolysine)、β高精氨酸(homoarginine)、正亮氨酸等视作氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基，例如脯氨酸和羟脯氨酸。侧链可以是(R)或(S)构型，可以是D-或L-异构体。在优选的实施方式中，氨基酸是(S)或L-构型，虽然可采用D-异构体来改善血清稳定性。如果采用非天然侧链，可采用非氨基酸取代基，例如以防止或延迟体内降解。
本文所用的“母体分子”指随后根据本发明说明对其进行修饰的生物活性剂，以产生“经修饰的生物活性剂”。在一些实施方式中，母体分子可以是需要控释的聚合物制剂以供治疗应用的任何生物活性剂分子。如本文所述，可通过修饰母体分子，例如修饰母体分子的等电点、净电荷、溶解度等来控制包封和从聚合物释放。
类似地，本文所用的“母体肽分子”、“母体多肽”、“母体蛋白质”等表示随后经修饰产生“修饰肽分子”的多肽、蛋白质等。例如，母体肽分子、母体多肽、母体蛋白质等可用作至少一种本文所述修饰，例如等电点修饰、净电荷修饰、溶解度修饰等的模板和/或基础。所述母体肽分子可以是天然产生的多肽、或天然产生多肽的变体或工程改造形式。母体多肽可以指多肽本身，包含母体多肽的组合物，或编码它的氨基酸序列。
本文所用的“等电点”、“pI”等表示肽分子不携带净电荷时的pH。可用熟知的方法，例如等电聚焦法测定等电点。
在肽分子较小时，还可计算出其近似的pI。肽分子的pI通常取决于其碱性和酸性基团的pKa值，例如，当只由编码的氨基酸形成肽时，其pI取决于N末端或赖氨酸侧链的伯胺、精氨酸侧链的胍基、组氨酸的咪唑环体系和肽C-末端、天冬氨酸侧链和谷氨酸侧链的羧酸基团的pKa值。
可通过，例如化学方法修饰母体肽分子的pI。此类修饰的非限制性例子包括N-末端氨基的酰化、烷化或其它化学修饰；C-末端羧酸基团的酰胺化、酯化或其它化学修饰；用非电离的氨基酸残基取代赖氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或含酸性或碱性基团的其它非编码氨基酸；赖氨酸、组氨酸、精氨酸的侧链基团或其它非编码氨基酸的碱性官能团的酰化、烷化或其它化学修饰；侧链羧酸基团的酰胺化、酯化或其它化学修饰，与能改变pI的辅助分子偶联，等等。在电离肽的情况中，其盐形式的pI还取决于抗衡离子的pKa。
本文所用的母体肽分子的“净电荷”取决于其pI和肽溶液的pH。可通过以下非限制性例子的任何一种修饰母体肽分子的净电荷：N-末端氨基的酰化、烷化或其它化学修饰；C-末端羧酸基团的酰胺化、酯化或其它化学修饰；用非电离的氨基酸残基取代赖氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或含酸性或碱性基团的其它非编码氨基酸；修饰母体肽的等电点；与带正电荷或负电荷的辅助分子偶联，等等。
如本文所述，修饰电荷的分布和/或密度也视作对母体肽的聚合物包封和释放特性的调节。增加的电荷密度可以均匀或非均匀地分布在修饰的肽分子中。在一个实施方式中，增加的负电荷或正电荷为非均匀分布，包括这种增加的负电荷或正电荷分别聚集在肽链内的一个或多个位置。增加的负电荷或正电荷可沿着肽的任何位置聚集，例如接近或在肽的末端，接近或在肽的中心等等，但优选位于距离肽活性位点的远处，通过参考母体分子的已知特征不难确定这点。或者，增加的负电荷或正电荷可沿着聚合物均匀分布。
在一个实施方式中，与母体肽分子相比，经修饰的肽分子可包含更多的负电荷或正电荷，例如通过合适的氨基酸取代。在一个实施方式中，用赖氨酸、精氨酸、组氨酸或其类似物取代母体肽分子中带负电和/或不可电离的氨基酸来加入正电荷。在另一实施方式中，用甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或其类似物(例如，任何α或β氨基链烷二酸，如氨基辛二酸)取代母体肽分子中带正电和/或不可电离的氨基酸来加入负电荷。
在一个实施方式中，与母体肽分子相比，经修饰的肽分子可包含更多的负电荷或正电荷，例如通过分别与一个或多个带负电荷的辅助分子或一个或多个带正电荷的辅助分子偶联。与仅是络合或其它紧密物理结合相反，本文所用的“偶联”指两个分子的共价连接。示范性带负电荷的辅助分子包括肽的任何常见化学官能团，例如酪氨酸、苏氨酸和丝氨酸侧链的羟基，半胱氨酸侧链的巯基或精氨酸和赖氨酸侧链的N-末端氨基或氨基与磷脂(磷酸酰胺结合)的单、双-和/或三-磷酸根、硫酸根、柠檬酸根、酒石酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和二酸(例如，草酸、丙二酸、琥珀酸等)的偶联。示范性带负电荷的结构还包括但不限于：聚(谷氨酸)、阴离子脂质、聚(天冬氨酸)和藻酸盐。在一些情况中，还可诱生或引入肽的化学官能团以促进偶联(例如，形成反应活性硫酯、醛、羟胺、烷基溴、马来酰亚胺等)。示范性带正电荷的辅助分子包括聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚(烯丙基胺)、聚(乙基亚胺)、壳聚糖或带正电荷的脂质结构。
辅助分子还可包含正或负氨基酸的“尾”，可通过更加中性的接头部分，例如聚乙二醇(PEG)、聚-CH2-等将其偶联于生物活性剂。
修饰的肽分子还可包含药学上可接受的抗衡离子，其代表性例子见下表1。
表1.潜在的抗衡离子
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还可联用修饰母体肽分子的水和/或有机溶剂溶解性以及改变其亲水性与本发明方法，来进一步调节肽在聚合物递送系统中的包封和释放特征。可通过改变肽治疗剂的盐形式或PEG化(如美国专利号5,776,885和6,706,289所述，二者的内容专门通过引用纳入本文)来调节其溶解性和/或亲水性。
本文所用的“与母体肽分子相比”指当在同一试验中经修饰的肽分子与母体肽分子的用量基本相同时，与母体肽分子(例如，随后经修饰产生修饰的肽分子的肽分子)相比，经修饰肽的(例如)等电点、净电荷等特征在数量上的改变(例如，增加或降低)。
本文描述了通过直接修饰肽分子本身从而调节用聚合物递送系统包封的肽分子释放和/或药物加载特征的方法和组合物。本文所述的聚合物递送系统通常是生物相容的聚合物递送系统。本文所述的聚合物递送系统可包含生物可降解或非生物降解的聚合物、它们的掺混物或共聚物。如果该聚合物和其任何降解产物对于受者无毒，对受者的身体也无明显的伤害或不利影响，则该聚合物递送系统或聚合物是生物相容的，
适合包封生物活性剂(例如，肽分子)的生物相容、非生物降解的聚合物包括但不限于选自下组的非生物降解性聚合物：聚丙烯酸酯、乙烯乙酸乙烯酯和其它酰基取代的乙酸纤维素的聚合物、非降解性聚氨酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺酸聚烯烃、聚氧乙烯、它们的掺混物和共聚物。
也可用生物可降解的聚合物包封生物活性剂(例如，肽分子)，例如用于控释制剂。在一个实施方式中，采用已知其降解产物无害或生物相容的生物可降解聚合物，因此，此类生物可降解聚合物在治疗结束时无需经外科手术除去。已对肽分子的控释作了研究的常用生物可降解聚合物包括以下均聚物：聚(乳酸)(PLA)、聚丙交酯(PL)或聚(乙醇酸)(PGA)、聚乙醇酸交酯(PG)、聚(乳酸)-(乙醇酸)共聚物(PLGA)、(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)、聚(原酸酯)和聚酐。PLGA和PLA因其生物相容性和长期的临床应用而最常用。可采用的其它生物可降解聚合物包括：聚己酸内酯、聚碳酸酯、聚酰胺酯、聚(氨基酸)、聚(二
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烷酮(dioxanone))、聚(亚烷基烷基化物)、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、生物可降解的聚氨酯、和它们的掺混物及共聚物。
在一方面，聚合物递送系统可以是微粒，包括但不限于：包含生物可降解的多聚赋形剂、非生物降解性多聚赋形剂或这些多聚赋形剂的混合物的微球、微囊、纳米球和纳米颗粒，或者此聚合物递送系统可以是(但不限于)包含生物可降解的多聚赋形剂、非生物降解性多聚赋形剂或它们的混合物的棒状或其它不同形状的植入体、晶片、纤维、薄膜、原位形成的大药丸等。这些系统可由一种多聚赋形剂或两种或多种多聚赋形剂的混合物或掺混物制成。
本文所用的术语“微粒”通常包括纳米颗粒、微球、纳米球、微囊、纳米微囊和颗粒。因此，术语“微粒”指具有各种内部结构和组织的颗粒，包括均质基质，例如微球(和纳米球)或异质核心-壳基质，例如微囊(和纳米微囊)、多孔颗粒、多层颗粒，等等。微粒是大小约10纳米至1000微米的颗粒。
可用本领域已知的各种技术制备微粒，包括，例如一个或两个乳化步骤，然后作溶剂去除。可通过抽提、蒸发或喷雾干燥等方法去除溶剂。
在溶剂抽提方法中，将聚合物溶解于有机溶剂中，该有机溶剂至少可部分溶解于抽提溶剂，例如水中。然后将经修饰的生物活性剂(可溶形式或分散成细微颗粒)加入该聚合物溶液，使混合液分散在含有表面活性剂(例如，聚(乙烯醇))的水相中。将得到的乳剂加入较大体积的水中，除去聚合物/生物活性剂中的有机溶剂形成硬化微粒。
在溶剂-蒸发方法中，将聚合物溶解于挥发性有机溶剂中。然后将生物活性剂(可溶形式或分散成细微颗粒)加入该聚合物溶液，使混合液悬浮在含有表面活性剂(例如，聚(乙烯醇))的水相中。搅拌得到的乳剂直到大多数有机溶剂蒸发，留下其中的固体微粒。
在喷雾干燥方法中，将聚合物溶解于合适溶剂，例如二氯甲烷中(例如，0.04g/mL)。然后将已知量的经修饰生物活性剂悬浮(例如不可溶)或共同溶解(如果可溶)于聚合物溶液中。然后喷雾干燥该溶液或分散液。根据所选的聚合物，可获得成形的直径1-10微米的微粒。
其它已知的方法，例如相分离和凝聚法及上述方法的改变形式是本领域已知的，也可用于本发明。
合适的多聚赋形剂包括但不限于：聚(二烯)，例如聚(丁二烯)等；聚(烯烃)，例如聚乙烯、聚丙烯等；聚(丙烯酸类)，例如聚(丙烯酸)等；聚(甲基丙烯酸类)，例如聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)等；聚(乙烯醚)；聚(乙烯醇)；聚(乙烯酮)；聚(卤乙烯)，例如聚(氯乙烯)等；聚(乙烯腈)、聚(乙烯酯)，例如聚(乙酸乙烯酯)等；聚(乙烯吡啶)，例如聚(2-乙烯吡啶)、聚(5-甲基-2-乙烯吡啶)等；聚(苯乙烯)；聚(碳酸酯)；聚(酯)；聚(原酸酯)，包括共聚物；聚(酰胺酯)；聚(酐)；聚(氨酯)；聚(酰胺)；纤维素醚，例如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等纤维素酯，例如乙酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、乙酸丁酸纤维素等；聚(糖)、蛋白质、明胶、淀粉、树胶、树脂等。这些材料可单独、作为物理混合物(掺混物)或共聚物使用。还考虑了上述任何一种聚合物的衍生物。
在一方面，该递送系统的多聚赋形剂包括生物相容、非生物降解性聚合物，例如硅酮、聚丙烯酸酯；乙烯乙酸乙烯酯的聚合物；酰基取代的乙酸纤维素；非降解性聚氨酯；聚苯乙烯；聚氯乙烯；聚氟乙烯；聚(乙烯基咪唑)；氯磺酸聚烯烃；聚氧乙烯；或它们的掺混物或共聚物。
在另一方面，所述多聚赋形剂包括生物相容、生物可降解的聚合物，例如聚丙交酯；聚(乙交酯)；(丙交酯-乙交酯)共聚物；聚(乳酸)；聚(乙醇酸)；(乳酸-乙醇酸)共聚物；聚(己酸内酯)；聚(原酸酯)；聚(膦腈(phosphazene))；聚(羟基丁酸酯)或含有聚(羟基丁酸酯)的共聚物；(丙交酯-己酸内酯)共聚物；聚碳酸酯；聚酰胺酯；聚酐；聚(二烷酮)；聚(亚烷基烷基化物)；聚乙二醇和聚原酸酯的共聚物；生物可降解的聚氨酯；聚(氨基酸)；聚醚酯(polyetherester)；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物，或它们的掺混物或共聚物。
在一方面，所述聚合物递送系统包含非生物降解性聚合物。在另一方面，所述聚合物递送系统包含生物可降解聚合物，其中所述肽包埋在该递送系统的聚合物内。在一方面，所述肽包封在以下构成的递送系统中：(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚己酸内酯、(丙交酯-己酸内酯)共聚物、(丙交酯-乙交酯-己酸内酯)共聚物、(乙交酯-己酸内酯)共聚物或它们的混合物。用于药物递送制剂的丙交酯/乙交酯聚合物通常经过丙交酯和乙交酯单体的开环反应融化聚合而制成。可采用现有的一些含或不含羧酸末端基团的聚合物。可采用现有的一些含聚乙二醇(PEG)嵌段的聚合物。当(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚(丙交酯)或聚(乙交酯)的末端基团不是羧酸时，例如是酯时，可将本文得到的聚合物称为封闭或加帽聚合物。相反，未封闭的聚合物含有末端羧基。
一方面，可采用线性丙交酯/乙交酯聚合物；然而，也可采用分支状聚合物。在某些方面，高分子量聚合物(例如，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的固有粘度＞1dL/g)可用于医疗装置，例如以强度要求。在其它方面，低分子量聚合物(例如，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的固有粘度＜1dL/g)可用于再吸收时间而非材料强度更为重要的药物递送和疫苗递送产品。此种聚合物的丙交酯部分含有不对称碳。可采用商品化的外消旋DL-、L-和D-聚合物。L-聚合物更易结晶，再吸收比DL-聚合物慢。除包含乙交酯和DL-丙交酯或L-丙交酯的共聚物外，可采用L-丙交酯和DL-丙交酯的共聚物。此外，可采用丙交酯或乙交酯的均聚物。丙交酯单体也可含有烷基。
当所述生物可降解聚合物是(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚(丙交酯)或聚(乙交酯)时，聚合物中丙交酯和乙交酯的含量可以不同。一方面，生物可降解的聚合物含有0-100摩尔％、40-100摩尔％、50-100摩尔％、60-100摩尔％、70-100摩尔％或80-100摩尔％的丙交酯，和0-100摩尔％、0-60摩尔％、10-40摩尔％、20-40摩尔％或30-40摩尔％的乙交酯，其中丙交酯和乙交酯的含量是100摩尔％。在一方面，所述生物可降解聚合物可以是聚(丙交酯)、85∶15(丙交酯-乙交酯)共聚物、75∶25(丙交酯-乙交酯)共聚物或65∶35(丙交酯-乙交酯)共聚物，其中所述比例是摩尔比。
在一方面，当所述生物可降解聚合物是(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚(丙交酯)或聚(乙交酯)时，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的该聚合物的固有粘度为0.15-1.5dL/g、0.25-1.5dL/g、0.25-1.0dL/g、0.25-0.8dL/g、0.25-0.6dL/g或0.25-0.4dL/g。
药物组合物
在本发明的进一步实施方式中，可将本发明的修饰肽和聚合物递送系统与适合给予灵长类，特别是人的合适药物载体相混合以提供药物组合物。
本发明药物组合物中所用的药学上可接受的载体可以是任何以及所有溶剂、分散介质、等渗试剂等。只要任何常规介质、试剂、稀释剂或载体对受者或聚合物递送系统或其中包封的治疗性肽或其它生物活性剂的疗效无害，其用于本发明药物组合物中是合适的。
所述载体可以是液体、半固体，例如糊剂或固体载体。载体的例子包括油、水、盐水溶液、醇、糖、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基质、粘合剂、充填剂、涂层、防腐剂等或它们的组合。
在本发明的进一步实施方式中，可不用载体而将本发明的修饰肽和聚合物递送系统作为粉末给予。
治疗方法
本发明的其它方面提供治疗脊椎动物(优选哺乳动物，更优选灵长类，特别优选人对象)疾病的方法，所述方法包括给予治疗此类疾病所需的本发明肽制剂。
实验
实施例1：模型肽制剂
制备过程：
采用标准的溶剂抽提方法制备加载肽的微粒。将约200mg肽溶解于2克DMSO中。另将2g(丙交酯-乙交酯)共聚物(PLG)溶解于10g二氯甲烷中。然后将肽溶液加入聚合物溶液，同时用IKA匀浆器以较高的每分钟转速(rpm)匀浆。然后用Silverson L4RT混合组件以700rpm匀浆，使肽/聚合物相分散入含3g聚(乙烯醇)(PVA)和2.7g二氯甲烷的150mL蒸馏水构成的连续相中。一旦液滴充分形成(3分钟)，用1升蒸馏水稀释乳液，用摇动台(stirplate)搅拌1小时二氯甲烷抽提和PLG微粒固化。随后，使悬液通过125微米筛网并用20-微米筛收集微粒来分离微粒。然后冷冻干燥收集的微粒除去残留的水。得到的产品是白色到灰白色自由流动的粉末，随后-20℃保存。
药物含量：
小心提取PLG微粒制剂中的肽测定药物含量。通常将PLG制剂溶解于合适的有机溶剂(或水解聚合物)，将药物提取入合适的水性缓冲液。然后用HPLC定量测定提取物中的药物。利用浓度值确定微粒中的药物含量，报告为重量百分比(wt％)。
体外释放：
体外释放分析包括将微粒制剂的样品置于合适的接受液体(PBS，pH 7.4)中，维持于37℃并温和搅拌。常规检测接受液体的pH以确保PBS维持在pH7.4。在不同时间点更换接受液体，用HPLC定量测定释放入接受液体中的肽含量。进行对照研究以确保肽释放后在接受液体中的稳定性。
微粒大小
用Beckman Coulter LS 13 320颗粒大小激光衍射分析仪测定微粒制剂的平均粒径和大小分布。
图2和3显示电荷对药加负载量和加载效率的影响。在各种数据范围内，药物加载量与加载效率相一致，中性肽与带正电荷的肽相似。而与研究的其它肽相比，带负电荷的肽(DP5)掺入(加载)效率较低。
图4显示掺入的肽不影响颗粒大小，除DP2以外，它包含在酯端接50∶50(丙交酯-乙交酯)共聚物的微粒制剂中，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的近似固有粘度为0.2dL/g。
图5和6显示肽电荷对酸-端接50∶50(丙交酯-乙交酯)共聚物微粒制剂所含肽的释放有所影响，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的近似固有粘度为0.2dL/g。带电荷肽的释放速度总是比中性肽快。还注意到，电荷密度较高的肽(DP3、DP4、DP5与DP2)释放更快。还注意到，该聚合物递送系统未观察到“爆发”释放。
图7显示类似的酯端接50∶50(丙交酯-乙交酯)共聚物微粒制剂的释放模式，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的近似固有粘度为0.2dL/g。虽然显示中性和带负电荷的肽在整个研究期间释放极少，但带正电荷的肽从制剂表现出明显爆发。此外，正电荷越多(电荷密度越高)对释放速率的影响越显著。
图8显示酸-端接85∶15(丙交酯-乙交酯)共聚物微粒制剂所含肽的释放情况，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的近似固有粘度为0.25dL/g。整个研究期间，未从任何微粒制剂观察到肽释放。
图9显示酯-端接85∶15(丙交酯-乙交酯)共聚物微粒制剂所含肽的释放情况，30℃在氯仿中0.5g/dL浓度时检测到的近似固有粘度为0.25dL/g。虽然显示在整个研究期间中性和带负电荷的肽释放极少，但带正电荷的肽从微粒制剂表现出明显释放。正电荷越多(电荷密度越高)对释放速率的影响越显著。
实施例2：母体肽的示范性修饰
降钙素
降钙素是用于治疗骨质疏松症的一种激素。人降钙素的氨基酸序列是Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro(示于SEQ IDNO：1)。
在N-末端加入三个赖氨酸部分(示于SEQ ID NO：2)来修饰降钙素的pI可提高其包封效率，增强其在控释制剂中的应用。或者，为增强其自酯端接聚酯中的初始爆发，用赖氨酸替代甘氨酸残基(示于SEQ ID NO：3)。为增强其自酸端接聚酯的侵蚀性释放，可用天冬氨酸替代甘氨酸残基(示于SEQ ID NO：4)。
醋酸亮丙瑞林(Leuprolide)
醋酸亮丙瑞林是用于治疗前列腺癌或子宫内膜异位的促性腺激素释放激素激动剂。醋酸亮丙瑞林的氨基酸序列是Glu-His-Trp-Ser-Tyr-DLeu-Leu-Arg-Pro-NHEt(示于SEQ ID NO：5)。
可用谷氨酰胺替换谷氨酸(示于SEQ ID NO：6)修饰醋酸亮丙瑞林的pI增强其自酯端接聚酯的扩散性释放，和/或用天冬氨酸替换精氨酸(示于SEQ IDNO：7)降低其自酯端接聚酯的扩散性释放，从而提高其在控释制剂中的应用。
奥曲肽(Octreotide)
奥曲肽是用作生长激素抑制剂和/或治疗肢端肥大症的一种八肽。奥曲肽的氨基酸序列是DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys-Thr-Cys-Thr(示于SEQ IDNO：8)。
可用赖氨酸替换苏氨酸(示于SEQ ID NO：9)修饰奥曲肽的pI，例如增强奥曲肽的包封效率和药物加载量，从而提高其在控释制剂中的应用。
所有引述的文章专门通过引用全文纳入本文。
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Claims (40)

1.一种控释药物制剂，其包含聚合物包封的经修饰的生物活性剂，其中与母体分子相比，所述经修饰的生物活性剂的等电点提高，从而提高了药物的加载效率。
2.如权利要求1所述的控释药物制剂，其特征在于，与母体分子相比，所述经修饰的生物活性剂包含增加的正电荷。
3.如权利要求2所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂偶联于带正电荷的辅助分子。
4.如权利要求2所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂包含带正电荷的氨基酸取代。
5.如权利要求3所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂是具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的肽。
6.如权利要求4所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂是具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的肽。
7.一种控释药物制剂，其包含生物可降解聚合物包封的经修饰的生物活性剂，其中与母体分子相比，所述经修饰的生物活性剂的等电点提高或降低，从而提高了其侵蚀性释放速率。
8.如权利要求7所述的控释药物制剂，其特征在于，与母体分子相比，所述经修饰的生物活性剂包含增加的正电荷。
9.如权利要求8所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂偶联于带正电荷的辅助分子。
10.如权利要求8所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂包含带正电荷的氨基酸取代。
11.如权利要求7-10中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述聚合物是酸端接聚合物。
12.一种控释药物制剂，其包含聚合物包封的经修饰的生物活性剂，其中与母体分子相比，所述经修饰的生物活性剂的等电点降低，从而降低所述生物活性剂自所述聚合物的初始扩散速率。
13.如权利要求12所述的控释药物制剂，其特征在于，与母体分子相比，所述经修饰的生物活性剂包含增加的负电荷。
14.如权利要求13所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂偶联于带负电荷的辅助分子。
15.如权利要求13所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂包含带负电荷的氨基酸取代。
16.如权利要求12-15中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述聚合物是酯端接聚合物。
17.一种控释药物制剂，其包含聚合物包封的经修饰的生物活性剂，其中与母体分子相比，所述经修饰的生物活性剂的等电点提高，从而提高了所述生物活性剂自所述聚合物的初始扩散速率。
18.如权利要求17所述的控释药物制剂，其特征在于，与母体分子相比，所述经修饰的生物活性剂包含增加的正电荷。
19.如权利要求18所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂包含带正电荷的辅助分子。
20.如权利要求18所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂包含带正电荷的氨基酸取代。
21.如权利要求18所述的控释药物制剂，其特征在于，所述经修饰的生物活性剂还包含乙酸根抗衡离子。
22.如权利要求17-21中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述聚合物是酯端接聚合物。
23.如权利要求1-6和12-22中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述聚合物是非生物降解性聚合物。
24.如权利要求1-6和12-22中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述聚合物是生物可降解聚合物。
25.如权利要求2-4、8-11和18-22中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述增加的正电荷均匀地分布于所述生物活性剂中。
26.如权利要求2-4、8-11和18-22中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述增加的正电荷非均匀地分布于所述生物活性剂中。
27.如权利要求13-16中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述增加的负电荷均匀地分布于所述生物活性剂中。
28.如权利要求13-16中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述增加的负电荷非均匀地分布于所述生物活性剂中。
29.如权利要求1-28中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述生物活性剂是肽分子。
30.如权利要求1-29中任一项所述的控释药物制剂，其特征在于，所述控释药物制剂是微粒。
31.一种提高聚合物递送系统中生物活性剂加载效率的方法，包括先修饰所述生物活性剂的等电点，再将其包封在聚合物递送系统中。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述生物活性剂的等电点提高，从而在所述聚合物递送系统的环境中携带了更多的正电荷。
33.一种调节生物活性剂从聚合物递送系统中侵蚀性释放速率的方法，包括先修饰所述生物活性剂的等电点，再将其包封在聚合物递送系统中。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，通过定量提高或降低所述生物活性剂的等电点使之在所述聚合物递送系统的环境中，与母体分子相比，分别携带更多的净正电荷或负电荷。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，与所述母体分子相比，通过在母体分子上加入增加的正电荷或负电荷，产生化学计量更多或更少的净电荷，从而提高或降低所述生物活性剂的等电点。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，将增加的正电荷加入中性或阳离子母体分子以提高其侵蚀性释放速率。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，将增加的负电荷加入中性或阴离子母体分子以提高其侵蚀性释放速率。
38.一种调节生物活性剂初始扩散释放的方法，包括先修饰所述生物活性剂的等电点，再将其包封在聚合物递送系统中。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，提高或降低所述生物活性剂的等电点使之在所需聚合物递送系统的环境中，与母体分子相比，分别携带更多的净正电荷或负电荷。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，与所述母体分子相比，通过在所述母体分子上加入增加的正电荷，产生化学计量更多的净电荷，从而提高初始扩散释放速率。
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