CN102952784A - 用细胞系生产兔瘟疫苗的方法及其制品 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种使用常见易培养的细胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等细胞系生产RHD病毒及疫苗的方法。该方法包括以下步骤：接种兔瘟病毒并进行吸附后，加入孵育剂进行细胞的孵育，并用细胞维持液培养细胞，获得生产用兔瘟病毒种子；接种兔瘟病毒毒种吸附后，加入孵育剂进行细胞的孵育，重新加入细胞维持液培养细胞，获得制苗用兔瘟病毒；加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品兔瘟疫苗。该方法使用培养病毒的细胞系是成熟的商业化的细胞系，具有生产工艺简单稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明生产的兔瘟疫苗安全性好、免疫力高，对兔瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

Description

用细胞系生产兔瘟疫苗的方法及其制品

技术领域

本发明涉及一种用细胞系生产兔瘟疫苗的方法及其制品，属于兽用疫苗领域。

背景技术

兔病毒性出血症(rabbit heamorrhagic disease，RHD)是1984年由我国首次发现并报道的新病毒病。由于其发病急、传播快、发病率和死亡率都相当高，所以又俗称“兔瘟”，是兔的一种以全身性出血和多发性血管内凝血为主要症状的急性、烈性、病毒性传染病。目前，国内各省(市)均有流行。意大利、德国、法国、前捷克斯洛伐克、前苏联、西班牙、墨西哥、朝鲜和日本等国家也有发生。给全世界养兔业造成了巨大的经济损失，国际兽医局将该病列为B类传染病，我国农业部96号令颁布为二类疫病。RHD出现比较突然且流行速度极快，现有研究结果表明世界范围内的所有RHDV分离株均为同一血清型，无论是遗传特性还是抗原性都很稳定。

目前用兔病毒性出血症组织灭活疫苗免疫是预防该病的主要措施，疫苗的制备过程中必须以RHDV感染致死的兔内脏组织为原料。如中国专利CN88108859.5公开了一种用病兔肝组织培养RHD病毒及生产兔瘟疫苗的方法，但该方法疫苗的制备过程中必须以RHDV感染致死的兔内脏组织为原料，而用于制备组织灭活疫苗的非免疫兔的供应量却很不稳定，造成传统的组织灭活疫苗的成本不断增加，另外组织灭活疫苗存在散播强毒的潜在危险、批间差异大、产量不高等种种缺点。

近年来，随着兔产品等行业的兴起以及其他动物疫苗等对家兔的需求的增加，市场对兔病毒性出血症疫苗的需求量增加了许多，但是用于制备组织灭活疫苗的非免疫兔的供应量却很不稳定，造成传统的组织灭活疫苗的成本不断增加，加之组织灭活疫苗存在散播强毒的潜在危险、批间差异大、产量不高等种种缺点，组织灭活疫苗的广泛应用受到一定的限制。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处，提供一种用细胞系生产兔瘟疫苗的方法，特别是使用常见易培养的细胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等细胞系生产RHD病毒及疫苗的方法。该方法使用培养病毒的细胞系是成熟的商业化的细胞系，具有生产工艺简单稳定、易操作，病毒含量高，批间差异小，质量易控，可显著提高疫苗产量和质量。利用本发明生产的兔瘟疫苗安全性好、免疫力高，对兔瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

本发明的主要目的在于提供一种用细胞系生产兔瘟病毒的方法，包括以下步骤：

1)细胞的培养：将细胞系经消化传代，以细胞培养液进行培养，形成生长良好的细胞单层；

2)病毒接种与吸附：将兔瘟病毒接种于上述生长良好的细胞单层，进行病毒吸附；

3)细胞的孵育：换用细胞维持液培养后，加入孵育剂进行细胞的孵育；

4)病毒的繁殖：将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系以繁殖兔瘟病毒；

5)病毒的收获：收获含有兔瘟病毒的培养液。

优选地，本发明步骤2)中用于接种的兔瘟病毒为使用细胞系生产的兔瘟病毒。

优选地，本发明所述的细胞为：RK13细胞、ST细胞、VeroE6细胞、BHK-21细胞、PK-15细胞、IBRS-2细胞的任意一种或几种。

优选地，本发明所述的细胞系为：RK13细胞。

优选地，本发明所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖。

优选地，本发明所述的孵育时间为20-40分钟；更优选地，孵育时间为30分钟。

优选地，本发明所述的细胞生长液为含血清的培养液，其中血清含量为1％-7％v/v；更优选地，所述细胞生长液的血清含量为5％-6％，最优地，血清含量为6％。

优选地，本发明所述的细胞维持液为无血清的培养液。

本发明的另一主要目的在于提供如上述的方法制备的兔瘟病毒，其中，使用细胞系生产兔瘟病毒。

本发明的另一主要目的在于：提供一种用细胞系生产兔瘟疫苗的方法：使用上述方法生产的兔瘟病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为兔瘟疫苗。

本发明的另一主要目的还在于提供一种用细胞系生产的兔瘟疫苗，其中，使用了细胞系用于生产兔瘟疫苗。

由上可以看出，发明人意外地发现在兔瘟病毒繁殖时对细胞系进行细胞孵育可以帮助兔瘟病毒适应细胞系，特别是通过在生产用毒种和制苗用病毒中均使用孵育剂进行孵育，使得用细胞系繁殖兔瘟病毒成为了可能，从而实现了用细胞系生产兔瘟疫苗。而在现有技术中，国内外无论使用RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等何种细胞系，或者使用同步培养、带毒传代、兔血清培养等方法，都没有实现兔瘟病毒在细胞系中获得有效的增殖，并达到利用细胞系生产兔瘟疫苗的目的。

其次，发明人还发现在细胞的培养中使用低血清的细胞培养液，而在细胞的孵育和病毒的增殖中换用无血清的细胞维持液，可以帮助兔瘟病毒适应细胞系，促进病毒在细胞系的增殖，而在细胞生长阶段又不影响良好细胞单层的形成。

基于以上发现，本发明获得了一种使用细胞系生产的兔瘟病毒及兔瘟疫苗，本发明的兔瘟疫苗至少有以下优点：

1)用细胞系替代兔体组织制备兔瘟疫苗，可解决外源病原污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保疫苗的安全性；

2)采用本发明的兔瘟病毒及兔瘟疫苗的生产方法，病毒的培养原料是较为廉价的细胞系，使用也比兔体组织更加方便；

3)采用本发明培养的兔瘟细胞毒液病毒含量高，用高滴度的抗原制造的兔瘟疫苗可以大大提高疫苗的免疫力，经免疫攻毒试验结果显示，对兔瘟强毒攻击可100％保护；

4)用细胞系生产兔瘟疫苗各批间质量差异小，具有生产工艺稳定、易操作、产量大、成本低等特点，具备工业化大生产的可行性和可放大性，具有很好的经济效益和应用前景。

5)用细胞系代替兔体组织制备兔瘟疫苗，可解决组织苗在注射过程中易引起兔体精神不振、减食、注射部位过敏红肿等不良反应。

具体实施方式

本发明实施例中使用了常见的商业化的容易培养的细胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等细胞系生产RHD病毒及疫苗，其他的哺乳动物细胞，也可以应用本发明的方法生产RHD病毒及疫苗。

本发明实施例中接种用的兔瘟病毒优选使用细胞系生产获得的兔瘟病毒；但是使用细胞系生产的接种用的兔瘟病毒的目的仅为了提高接种用的兔瘟病毒的效价和使得接种用的兔瘟病毒更适应在细胞中生长，获得疫苗的效力更佳。因此，本发明的接种用兔瘟病毒并不限于使用经细胞系培养的兔瘟病毒，其他来源的兔瘟病毒如组织来源的兔瘟病毒液也可以用于接种细胞系生产兔瘟病毒及疫苗。

本发明的细胞培养液中血清为胎牛血清，其他的动物性血清如兔血清、羊血清等均可以作为细胞生长液，只要其血清含量比常规使用情况下的血清含量低，使得兔瘟病毒更容易适应在细胞中的生长，而又不影响细胞本身形成良好单层细胞即可。

本发明的疫苗为灭活疫苗，也可以使兔瘟病毒进行弱化后，使用弱化病毒制备活疫苗，或使用基因工程方法获得转基因病毒，使用本发明的在动物细胞中培养方法制备灭活疫苗或活疫苗。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1RK13细胞生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗

1.RK13细胞生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的方法

本实施例中，选择兔肾细胞系RK13(购自中国兽医药品监察所)作为生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的细胞系，兔瘟病毒AV33毒种购自中国兽医药品监察所，以下为生产兔瘟病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用兔瘟病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养RK13细胞至形成良好的细胞单层，接种兔瘟病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用兔瘟病毒种子，具体步骤为：

将兔肾RK13细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液(94％v/vDMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2)于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；其次，将兔瘟病毒AV33毒种(购自中国兽医药品监察所)用pH7.2磷酸盐缓冲液10倍稀释，接种体重1.5Kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。无菌采集接种后24-72小时濒死或刚死亡的家兔且有典型病理变化的肝组织作为病料，加入pH7.2磷酸盐缓冲液研磨制成10％v/v混悬液，再经3000rpm离心10分钟，取上清液作除菌过滤，作10倍稀释(稀释后的血凝效价为10log2)，接种生长良好的RK13单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液(100％v/vDMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2)在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

生产用兔瘟病毒毒种鉴定：血凝价为对人“O”型红细胞凝集价≥8log2。

对兔最小致死量：毒种10^-4稀释，接种体重1.55kg以上的家兔4只，每只1ml，4只全部死于兔瘟症状，具有明显的病理变化，主要为呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器淤血、肿大和出血。

2)制苗用兔瘟病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用兔瘟病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用兔瘟病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的RK13细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在RK13细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有兔瘟病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到兔瘟病毒液。

制苗用兔瘟病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。病毒液经测定对人“O”型红细胞凝集价≥8log2；将得到的兔瘟病毒液置于-15℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有兔瘟病毒的培养液加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品兔瘟疫苗，具体步骤如下：

将检验合格的兔瘟病毒液与经过121℃灭菌30min后冷却至室温的法国赛比克公司的疫苗佐剂ISA206，按1∶1的体积比混合，在500～800rpm的转速下搅拌10min，在终止搅拌前加入1％(W/V)硫柳汞溶液，使其终浓度为万分之一，充分振荡混匀，分装后2～8℃保存即可完成兔瘟灭活疫苗的制备。

2.对兔瘟疫苗的检验

1)物理性状检验：

a)外观：为乳白色或淡红色均匀乳剂。

b)剂型：为双向型，即水包油包水(W/O/W)。取清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水中，除第1滴外，均呈油滴状不扩散。

c)稳定性：取疫苗10ml加入离心管中，经3,000rpm离心15min，不分层，管底析出水相≤0.5ml；取疫苗在37℃左右放置21d，结果显示不分层，没有破乳现象。

d)黏度：用1ml清洁吸管(下口径1.2mm，上口径2.7mm)吸取25℃左右的疫苗1ml令其垂直自然流出，记录流出0.4ml所需时间，结果显示，3次流出时间均在8s内。

2)无菌检验：按《中国兽药典》附录进行，无菌生长。

3)支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无支原体生长。

4)甲醛及硫柳汞含量测定：按《中国兽药典》附录进行，甲醛及硫柳汞含量不超过规定的含量。

因此，本实施例获得兔瘟疫苗经过检验均符合国家兽药相关标准。

3.兔瘟疫苗的安全性与效力检验

1)安全性试验

将上述方法制备的3批疫苗(批号分别为1101、1102和1103)进行安全性试验。试验内容包括对体重1.5-3.0Kg的健康易感家兔20只分别进行1次单剂量接种、超剂量接种、单剂量重复接种的安全性试验。试验结果表明3批疫苗接种动物后，均未出现红肿、瘙瘁、破溃等局部反应，采食和精神状态正常，无全身反应。将部分免疫动物7天扑杀，取注射部分组织制备成切片，观察组织病变。结果显示，3批疫苗免疫动物后，对注射部位无损伤，表明疫苗安全性好。

2)效力试验

将试制的3批疫苗(批号分别为1101、1102和1103)分别进行了效力试验。试验内容包括对体重1.5-3.0Kg的健康易感家兔6只，每只颈部皮下注射1ml，并作不接种家兔为对照组6只。定期采血测定血凝抑制(HI)效价，于第18天以大剂量强毒攻击，每只家兔颈部皮下接种血凝价为14log2的肝组织兔瘟病毒1ml。

6只易感兔注射灭活疫苗后第7天，血清中HI效价升到5log2-7log2，第15天升高到9log2-12log2。这些兔在攻毒后均不表现任何症状，全部获得保护。而6只对照兔的HI仍为阴性，均于攻毒后48小时左右死亡。

因此，本发明的细胞系生产的兔瘟疫苗对兔瘟强毒攻击可100％保护，可以用于替代目前应用的兔体组织生产的兔瘟疫苗。4.细胞系生产兔瘟疫苗与兔体组织生产兔瘟疫苗的比较

1)兔体组织生产兔瘟疫苗的方法：

将AV33毒种用pH7.2磷酸盐缓冲液或生理盐水10倍稀释，接种体重1.5Kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。无菌采集接种后24-72小时濒死或刚死亡的家兔且有典型病理变化的肝、脾作为生产用毒种。

经毒种鉴定，毒种对人“O”型红细胞凝集价≥8log2。毒种对兔最小致死量：毒种10^-4稀释，接种体重1.5kg以上的家兔4只，每只1ml，4只全部死于兔瘟症状，具有明显的病理变化，主要为呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器淤血、肿大和出血。

取上述生产用种毒，用无菌生理盐水作10倍稀释，每只家兔皮下注射2ml。将接种后24-96小时内濒死或刚死亡的家兔，用无菌手术采取肝、脾、肾、心、肺作为制苗材料，并逐只进行病理检查，如有异常病变组织，应予以废弃。采毒后立即用于配苗或迅速冻结保存。在-10℃以下保存，不得超过15日；-20℃以下保存，不得超过50日。在无菌操作下，剔除各脏器的脂肪与结缔组织，称重，加适量的磷酸盐缓冲液(pH7.2)或生理盐水进行切碎或研磨，用5号筛过滤。组织与稀释液的最终比例为1∶19.在稀释液中亦可加入与组织等量的甘油，即组织∶甘油∶稀释液＝1∶1∶18.肺脏单独制苗，并另作安检和效检，合格后组批分装。按乳剂总量的0.4％加入甲醛溶液，充分混合后装入无菌容器中，密封后置37℃灭活48小时，间隔4-6小时振荡1次。灭活后经检验合格定量分装。获得了兔瘟组织苗3批，批号1111、1112、1113。

2)使用本实施获得批号为1101、1102和1103的兔瘟疫苗与上述批号1111、1112、1113的兔体组织兔瘟疫苗进行兔体注射不良反应比较：用体重1.5-3Kg家兔分三组，第一组12只，3批疫苗1111、1112、1113，每批注射4只，每只皮下注射疫苗0.5ml；第二组12只，3批疫苗1101、1102、1103，每批注射4只，每只皮下注射疫苗0.5ml；第三组4只，作为对照。

结果如下表显示：第一组在注射后1-3天内，出现不同程度的不良反应，精神不振，减食，注射局部出现红肿等。第二组均正常，无不良反应。第三组对照正常。

实施例2ST细胞系生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗

1.ST细胞生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的方法

本实施例中，选择兔肾细胞系ST细胞(购自中国典型培养物保藏中心)作为生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的细胞系，兔瘟病毒AV33毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：95％v/vα-MEM(Invitrogen公司生产)液，5％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％v/vα-MEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用ST细胞生产兔瘟病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用兔瘟病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养ST细胞至形成良好的细胞单层，接种兔瘟病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用兔瘟病毒种子，具体步骤为：

将兔肾ST细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液(94％v/vα-MEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2)于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；其次，将兔瘟病毒AV33毒种(购自中国兽医药品监察所)用pH7.2磷酸盐缓冲液10倍稀释，接种体重1.5Kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。无菌采集接种后24-72小时濒死或刚死亡的家兔且有典型病理变化的肝组织作为病料，加入pH7.2磷酸盐缓冲液研磨制成10％v/v混悬液，再经3000rpm离心10分钟，取上清液作除菌过滤，作10倍稀释(稀释后的血凝效价为10log2)，接种生长良好的ST单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液(100％v/vα-MEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2)在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

生产用兔瘟病毒毒种鉴定：血凝价为对人“O”型红细胞凝集价≥8log2。

对兔最小致死量：毒种10^-4稀释，接种体重1.5kg以上的家兔4只，每只1ml，4只全部死于兔瘟症状，具有明显的病理变化，主要为呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器淤血、肿大和出血。

2)制苗用兔瘟病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用兔瘟病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用兔瘟病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的ST细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在ST细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有兔瘟病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到兔瘟病毒液。

制苗用兔瘟病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。病毒液经测定对人“O”型红细胞凝集价≥8log2；将得到的兔瘟病毒液置于-15℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有兔瘟病毒的培养液加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品兔瘟疫苗，具体步骤如下：

将检验合格的兔瘟病毒液与经过121℃灭菌30min后冷却至室温的法国赛比克公司的疫苗佐剂ISA206，按1∶1的体积比混合，在500～800rpm的转速下搅拌10min，在终止搅拌前加入1％(W/V)硫柳汞溶液，使其终浓度为万分之一，充分振荡混匀，分装后2～8℃保存即可完成兔瘟灭活疫苗的制备。

2.安全性与效力检验：方法同实施例1，结果显示，ST细胞系生产的兔瘟疫苗免疫动物18只后，均未出现红肿、瘙瘁、破溃等局部反应，采食和精神状态正常，无全身反应。将部分免疫动物7天扑杀，取注射部分组织制备成切片，观察组织病变，对注射部位无损伤，表明疫苗安全性好；而效力检验6只接种疫苗，接种后第7天，血清中的HI效价升到5log2-7log2，第16天升高到9log2-12log2，在攻毒后6只家兔均不表现任何症状，全部获得保护。而6只对照兔的HI仍为阴性，均于攻毒后48小时左右死亡。

实施例3VeroE6细胞系生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗

1.VeroE6细胞生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的方法

本实施例中，选择兔肾细胞系VeroE6细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)作为生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的细胞系，兔瘟病毒AV33毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：94％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用VeroE6细胞生产兔瘟病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用兔瘟病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养VeroE6细胞至形成良好的细胞单层，接种兔瘟病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用兔瘟病毒种子，具体步骤为：

将兔肾VeroE6细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；其次，将兔瘟病毒AV33毒种(购自中国兽医药品监察所)用pH7.2磷酸盐缓冲液10倍稀释，接种体重1.5Kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。无菌采集接种后24-72小时濒死或刚死亡的家兔且有典型病理变化的肝组织作为病料，加入pH7.2磷酸盐缓冲液研磨制成10％v/v混悬液，再经3000rpm离心10分钟，取上清液作除菌过滤，作10倍稀释(稀释后的血凝效价为10log2)，接种生长良好的VeroE6单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液液，(不添加血清，pH值调整为7.2)在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

生产用兔瘟病毒毒种鉴定：血凝价为对人“O”型红细胞凝集价≥8log2。

对兔最小致死量：毒种10^-4稀释，接种体重1.5kg以上的家兔4只，每只1ml，4只全部死于兔瘟症状，具有明显的病理变化，主要为呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器淤血、肿大和出血。

2)制苗用兔瘟病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用兔瘟病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用兔瘟病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的VeroE6细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在VeroE6细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有兔瘟病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到兔瘟病毒液。

制苗用兔瘟病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。病毒液经测定对人“O”型红细胞凝集价≥8log2；将得到的兔瘟病毒液置于-15℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有兔瘟病毒的培养液加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品兔瘟疫苗，具体步骤如下：

在上述收获的兔瘟病毒液加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品兔瘟疫苗。将检验合格的兔瘟病毒液与经过121℃灭菌30min后冷却至室温的法国赛比克公司的疫苗佐剂ISA206，按1∶1的体积比混合，在500～800rpm的转速下搅拌10min，在终止搅拌前加入1％(W/V)硫柳汞溶液，使其终浓度为万分之一，充分振荡混匀，分装后2～8℃保存即可完成兔瘟灭活疫苗的制备。

2.安全性与效力检验：方法同实施例1，结果显示，VeroE6细胞系生产的兔瘟疫苗免疫动物18只后，均未出现红肿、瘙瘁、破溃等局部反应，采食和精神状态正常，无全身反应。将部分免疫动物7天扑杀，取注射部分组织制备成切片，观察组织病变，对注射部位无损伤，表明疫苗安全性好；而效力检验6只接种疫苗，接种后第7天，血清中的HI效价升到5log2-7log2，第15天升高到9log2-12log2，在攻毒后6只家兔均不表现任何症状，全部获得保护。而6只对照兔的HI仍为阴性，均于攻毒后48小时左右死亡。

实施例4BHK-21细胞系生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗

1.BHK-21细胞生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的方法

本实施例中，选择兔肾细胞系BHK-21细胞(购自中国兽医药品监察所)作为生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的细胞系，兔瘟病毒AV33毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：95％v/vDMEM(Invitrogen公司生产)液，5％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％v/v DMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用BHK-21细胞生产兔瘟病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用兔瘟病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养BHK-21细胞至形成良好的细胞单层，接种兔瘟病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用兔瘟病毒种子，具体步骤为：

将兔肾BHK-21细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液，pH值调整为7.2)于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；其次，将兔瘟病毒AV33毒种(购自中国兽医药品监察所)用pH7.2磷酸盐缓冲液10倍稀释，接种体重1.5Kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。无菌采集接种后24-72小时濒死或刚死亡的家兔且有典型病理变化的肝组织作为病料，加入pH7.2磷酸盐缓冲液研磨制成10％v/v混悬液，再经3000rpm离心10分钟，取上清液作除菌过滤，作10倍稀释(稀释后的血凝效价为10log2)，接种生长良好的BHK-21单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

生产用兔瘟病毒毒种鉴定：血凝价为对人“O”型红细胞凝集价≥8log2。

对兔最小致死量：毒种10^-4稀释，接种体重1.5kg以上的家兔4只，每只1ml，4只全部死于兔瘟症状，具有明显的病理变化，主要为呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器淤血、肿大和出血。

2)制苗用兔瘟病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用兔瘟病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用兔瘟病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的BHK-21细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在BHK-21细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有兔瘟病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到兔瘟病毒液。

制苗用兔瘟病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。病毒液经测定对人“O”型红细胞凝集价≥8log2；将得到的兔瘟病毒液置于-15℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有兔瘟病毒的培养液加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品兔瘟疫苗，具体步骤如下：

将检验合格的兔瘟病毒液与经过121℃灭菌30min后冷却至室温的法国赛比克公司的疫苗佐剂ISA206，按1∶1的体积比混合，在500～800rpm的转速下搅拌10min，在终止搅拌前加入1％(W/V)硫柳汞溶液，使其终浓度为万分之一，充分振荡混匀，分装后2～8℃保存即可完成兔瘟灭活疫苗的制备。

2.安全性与效力检验：方法同实施例1，结果显示，BHK-21细胞系生产的兔瘟疫苗免疫动物18只后，均未出现红肿、瘙瘁、破溃等局部反应，采食和精神状态正常，无全身反应。将部分免疫动物7天扑杀，取注射部分组织制备成切片，观察组织病变，对注射部位无损伤，表明疫苗安全性好；而效力检验6只接种疫苗，接种后第7天，血清中的HI效价升到5log2-7log2，第15天升高到8log2-12log2，在攻毒后6只家兔均不表现任何症状，全部获得保护。而6只对照兔的HI仍为阴性，均于攻毒后48小时左右死亡。

实施例5PK-15细胞系生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗

1.PK-15细胞生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的方法

本实施例中，选择兔肾细胞系PK-15细胞(购自中国兽医药品监察所)作为生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的细胞系，兔瘟病毒AV33毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：94％v/vDMEM(Invitrogen公司生产)液，6％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％DMEM(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用PK-15细胞生产兔瘟病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用兔瘟病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养PK-15细胞至形成良好的细胞单层，接种兔瘟病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用兔瘟病毒种子，具体步骤为：

将兔肾PK-15细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；其次，将兔瘟病毒AV33毒种(购自中国兽医药品监察所)用pH7.2磷酸盐缓冲液10倍稀释，接种体重1.5Kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。无菌采集接种后24-72小时濒死或刚死亡的家兔且有典型病理变化的肝组织作为病料，加入pH7.2磷酸盐缓冲液研磨制成10％v/v混悬液，再经3000rpm离心10分钟，取上清液作除菌过滤，作10倍稀释(稀释后的血凝效价为10log2)，接种生长良好的PK-15单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

生产用兔瘟病毒毒种鉴定：血凝价为对人“O”型红细胞凝集价≥8log2。

对兔最小致死量：毒种10^-4稀释，接种体重1.5kg以上的家兔4只，每只1ml，4只全部死于兔瘟症状，具有明显的病理变化，主要为呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器淤血、肿大和出血。

2)制苗用兔瘟病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用兔瘟病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用兔瘟病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的PK-15细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在PK-15细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有兔瘟病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到兔瘟病毒液。

制苗用兔瘟病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。病毒液经测定对人“O”型红细胞凝集价≥8log2；将得到的兔瘟病毒液置于-15℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有兔瘟病毒的培养液加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品兔瘟疫苗，具体步骤如下：

将检验合格的兔瘟病毒液与经过121℃灭菌30min后冷却至室温的法国赛比克公司的疫苗佐剂ISA206，按1∶1的体积比混合，在500～800rpm的转速下搅拌10min，在终止搅拌前加入1％(W/V)硫柳汞溶液，使其终浓度为万分之一，充分振荡混匀，分装后2～8℃保存即可完成兔瘟灭活疫苗的制备。

2.安全性与效力检验：方法同实施例1，结果显示，PK-15细胞系生产的兔瘟疫苗免疫动物18只后，均未出现红肿、瘙瘁、破溃等局部反应，采食和精神状态正常，无全身反应。将部分免疫动物7天扑杀，取注射部分组织制备成切片，观察组织病变，对注射部位无损伤，表明疫苗安全性好；而效力检验6只接种疫苗，接种后第8天，血清中的HI效价升到5log2-7log2，第15天升高到9log2-12log2，在攻毒后6只家兔均不表现任何症状，全部获得保护。而6只对照兔的HI仍为阴性，均于攻毒后48小时左右死亡。

实施例6IBRS-2细胞系生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗

1.IBRS-2细胞生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的方法

本实施例中，选择兔肾细胞系IBRS-2细胞(购自中国兽医药品监察所)作为生产兔瘟病毒与兔瘟疫苗的细胞系，兔瘟病毒AV33毒种为购自中国兽医药品监察所。所用细胞生长培养液的配方是：95％v/vMEM41500(Invitrogen公司生产)液，5％v/v胎牛血清(PAA公司生产)，pH值调整为7.2；所用细胞维持液的配方是：100％MEM41500(Invitrogen公司生产)液，不添加血清，pH值调整为7.2。

以下为使用IBRS-2细胞生产兔瘟病毒与疫苗的具体步骤：

1)生产用兔瘟病毒种的制备：使用上述细胞生长液培养IBRS-2细胞至形成良好的细胞单层，接种兔瘟病毒并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得生产用兔瘟病毒种子，具体步骤为：

将兔肾IBRS-2细胞系经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，以细胞生长液于37℃继续培养，形成良好单层时，用于继续传代或接种病毒；其次，将兔瘟病毒AV33毒种(购自中国兽医药品监察所)用pH7.2磷酸盐缓冲液10倍稀释，接种体重1.5Kg以上的家兔，每只皮下注射1ml。无菌采集接种后24-72小时濒死或刚死亡的家兔且有典型病理变化的肝组织作为病料，加入pH7.2磷酸盐缓冲液研磨制成10％v/v混悬液，再经3000rpm离心10分钟，取上清液作除菌过滤，作10倍稀释(稀释后的血凝效价为10log2)，接种生长良好的IBRS-2单层细胞培养中，37℃吸附1-2小时，然后加入细胞维持液在37℃中培养。6个小时后加入D-氨基葡萄糖孵育半小时，后用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，继续加入细胞维持液培养。逐日观察记录，接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)收毒，冻融3次后离心于-15℃保存，作为生产用毒种。

生产用兔瘟病毒毒种鉴定：血凝价为对人“O”型红细胞凝集价≥8log2。

对兔最小致死量：毒种10^-4稀释，接种体重1.5kg以上的家兔4只，每只1ml，4只全部死于兔瘟症状，具有明显的病理变化，主要为呼吸系统和肝、脾、肾、心等实质脏器淤血、肿大和出血。

2)制苗用兔瘟病毒的制备：使用细胞生长液培养细胞至形成良好的细胞单层，接种上述生产用兔瘟病毒毒种并进行病毒吸附后，换用细胞维持液培养，加入孵育剂进行细胞的孵育，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞，收获病毒液，即获得制苗用兔瘟病毒，具体步骤为：

将上述细胞生长液培养获得的生长良好的IBRS-2细胞单层，加入含3％v/v上述步骤获得的生产用毒种的细胞维持液，置37℃吸附1-2小时；吸附病毒后，在IBRS-2细胞系加入细胞维持液，在37℃中培养。6个小时后弃去细胞维持液，加入D-氨基葡萄糖孵育半小时。用pH7.2磷酸盐缓冲液冲洗三遍，将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系，并逐日观察。接毒后48-72小时(或细胞单层出现较多圆缩细胞时)，即可收获含有兔瘟病毒的培养液。冻融3次后离心即可得到兔瘟病毒液。

制苗用兔瘟病毒液的检验：按《中华人民共和国药典》(2005年版)附录进行检验，无细菌、霉菌、支原体生长。病毒液经测定对人“O”型红细胞凝集价≥8log2；将得到的兔瘟病毒液置于-15℃进行保存。

3)疫苗的制备：在上述收获的含有兔瘟病毒的培养液加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为成品兔瘟疫苗，具体步骤如下：

将检验合格的兔瘟病毒液与经过121℃灭菌30min后冷却至室温的法国赛比克公司的疫苗佐剂ISA206，按1∶1的体积比混合，在500～800rpm的转速下搅拌10min，在终止搅拌前加入1％(W/V)硫柳汞溶液，使其终浓度为万分之一，充分振荡混匀，分装后2～8℃保存即可完成兔瘟灭活疫苗的制备。

2.安全性与效力检验：方法同实施例1，结果显示，IBRS-2细胞系生产的兔瘟疫苗免疫动物18只后，均未出现红肿、瘙瘁、破溃等局部反应，采食和精神状态正常，无全身反应。将部分免疫动物7天扑杀，取注射部分组织制备成切片，观察组织病变，对注射部位无损伤，表明疫苗安全性好；而效力检验6只接种疫苗，接种后第7天，血清中的HI效价升到5log2-7log2，第15天升高到9log2-12log2，在攻毒后6只家兔均不表现任何症状，全部获得保护。而6只对照兔的HI仍为阴性，均于攻毒后48小时左右死亡。

实施例7兔瘟病毒的兔体回归试验

1.材料

1.1细胞毒：来自实施例1-6的细胞系培养获得的兔瘟病毒

1.2兔

本公司自繁自养的营养良好，体重1.5-3.0Kg的健康易感家兔，使用前先采血，取血清作红细胞凝集抑制试验，且证明红细胞凝集抑制抗体为阴性，方可使用。

2.方法与结果

用细胞毒(血凝价为10log2)接种易感兔8只，每只颈部皮下1ml。易感兔于接种前测定体温和血清血凝效价，接种后格里饲养，观察临床症状。定时测温和采血，死后剖检和做组织病理学检查，并测定各内脏器官的血凝效价。

8只易感兔在接种细胞毒后1-3天，血清中均出现病毒血凝，滴度为2log2-8log2，继而升高到达8log2-12log2，持续2-8天，濒死前急剧升高，可达17log2。均在5-11天死亡。8只对照兔用强毒(血凝价为14log2)攻击后，均于24-72小时内死亡。回归兔的剖检病变与强毒人工感染兔相似，肾病变尤为显著，变现肿大，淤血，出血和弥漫性坏死。组织病理学以肾、肝、脾、肺等器官的弥漫性血管内凝血为特征，毛细血管中充满大量的透明血栓，肾的病变比强毒感染兔更为严重，呈出血性坏死性肾小球肾炎病变。

结果说明，细胞毒回归易感兔时，病程显著延长，呈亚急性过程，病理变化与强毒感染的急性病例基本相似。说明RHDV在细胞培养适应后，毒力没有减弱，攻毒后，易感兔病理变化明显。说明通过细胞培养的兔瘟病毒在致病性和抗原性方面与组织毒或毒种没有发生变化，可以用于替代组织病毒液制备兔瘟灭活疫苗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用细胞系生产兔瘟病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)细胞的培养：将细胞系经消化传代，以细胞培养液进行培养，形成生长良好的细胞单层；

2)病毒接种与吸附：将兔瘟病毒接种于上述生长良好的细胞单层，进行病毒吸附；

3)细胞的孵育：换用细胞维持液培养后，加入孵育剂进行细胞的孵育；

4)病毒的繁殖：将上述孵育剂洗去，重新加入细胞维持液培养细胞系以繁殖兔瘟病毒；

5)病毒的收获：收获含有兔瘟病毒的培养液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中接种用的兔瘟病毒是使用细胞系生产的兔瘟病毒。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的细胞为：RK13细胞、ST细胞、VeroE6细胞、BHK-21细胞、PK-15细胞、IBRS-2细胞系的任意一种或几种。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的细胞为：RK13细胞系。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的细胞孵育时间为20-40min。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长液的血清含量为1％-7％v/v。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的细胞维持液为无血清的细胞培养液。

9.一种根据权利要求1-8任意一项所述的方法制备的兔瘟病毒，其特征在于，使用细胞系生产兔瘟病毒。

10.一种用细胞系生产兔瘟疫苗的方法，其特征在于，使用权利要求9所述的兔瘟病毒，加入灭活剂，灭活后加入兽药学上可接受的疫苗佐剂制备为兔瘟疫苗。

11.一种根据权利要求9所述的兔瘟疫苗，其特征在于，使用细胞系生产兔瘟疫苗。