CN102949719A

CN102949719A - 静脉注射免疫球蛋白抑制霍乱毒素和半乳糖凝集素-1结合到神经节苷脂gm1

Info

Publication number: CN102949719A
Application number: CN201210130585XA
Authority: CN
Inventors: 彭伟
Original assignee: XUHUI DISTRICT CENTRAL HOSPITAL SHANGHAI
Current assignee: XUHUI DISTRICT CENTRAL HOSPITAL SHANGHAI
Priority date: 2012-04-28
Filing date: 2012-04-28
Publication date: 2013-03-06

Abstract

本发明涉及静脉注射免疫球蛋白（IVIg）在制备治疗周围神经系统自身免疫性疾病药物中的应用，所述的自身免疫性疾病是抗神经节苷脂GM1抗体相关疾病，静脉注射免疫球蛋白通过抑制霍乱毒素（choleratoxin）和半乳糖凝集素(galectin)-1结合到GM1来治疗抗GM1抗体相关疾病。本发明优点在于：本发明研究发现IVIg不能抑制抗GM1抗体结合它的抗原和IVIg并未下降抗GM1抗体滴度，并显示IVIg抑制霍乱毒素和半乳糖凝集素-1结合到GM1；首次提出：静脉注射免疫球蛋白中正确比率的半乳糖基/无半乳糖基免疫球蛋白相互作用于巨噬细胞受体，从而下调巨噬细胞和周围神经系统自身免疫性疾病的炎症功能。

Description

静脉注射免疫球蛋白抑制霍乱毒素和半乳糖凝集素-1结合到神经节苷脂GM1

技术领域

本发明涉及周围神经系统自身免疫性疾病治疗领域，具体地说，是静脉注射免疫球蛋白抑制霍乱毒素和半乳糖凝集素-1结合到神经节苷脂GM1。

背景技术

静脉注射免疫球蛋白（IVIg）治疗一些神经自身免疫性疾病，包括多病灶性运动神经病（multifocal motor neuropathy，MMN），无传导阻滞的低运动神经病（lower motor neuropathy without conduction block，LMN），急性炎症脱髓鞘多神经根神经病（acute inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy，AIDP），急性运动轴索神经病（acute motor axonal neuropathy，AMAN），慢性炎症脱髓鞘多神经根神经病（chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy，CIDP）和多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）。静脉注射免疫球蛋白汇集了正常多特异性IgG的制备，可能通过多种机制作用于免疫介导的疾病，取决于他们的Fab或Fc部分，如抗独特型抗体的效应或Fc受体阻断。

MMN，LMN和AMAN经常关联于抗GM1IgM，IgG或IgA抗体。根据实验室的检测方法，这些抗体频率的不同。GM1呈现在运动神经元，背根神经节细胞和感觉轴突。它主要定位到和环绕在郎飞节附近的钠离子和钾离子通道。目前，抗GM1抗体的致病性仍存在争议和周围神经系统损伤的机制仍然不明。抗GM1抗体可能直接引起疾病是通过结合到GM1或与促炎症途径随之而来的激活发生交叉反应的神经元抗原或通过产生一个GM1依赖进程的功能性阻断: 例如，抗GM1抗体能够直接改变离子通道的功能。一些主张抗GM1抗体的攻击要求节点结构异常。霍乱毒素（cholera toxin）b-亚基被认为特异和有效地结合到GM1。不同的内源性GM1配体已经被提出：（i）使用抗独特型抗体，Riggott等人已确定在哺乳动物双分子层中4种GM1结合蛋白；（ii）VIP21(caveolin-1), caveolin（窖蛋白）的一个基本结构；和（iii）半乳糖凝集素(galectin)-1，一个b-半乳糖苷结合蛋白报告作为GM1的一个主要配体。最后一个是在炎症过程中活化的巨噬细胞和肿瘤生长的过度表达，除了半乳糖凝集素具有免疫调节和增长调节的活性。

IVIg在病理学相关于抗GM1抗体的作用机制还没有得到好的论述。通过呈现在IVIg的抗独特型抗体封闭抗体已被提出作为一个作用机理。最近，它被假设IVIg可减少抗-GM1抗体介导的补体沉积，可是这些机理并没有被令人信服地证明。再者，Yuki和Miyagi采用酶联免疫吸附试验（ELISA）描述：IVIg相互作用于霍乱毒素的肽表位和用这种方式抑制霍乱毒素结合到GM1。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种静脉注射免疫球蛋白(IVIg)治疗抗神经节苷脂GM1抗体相关疾病的作用机制。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：静脉注射免疫球蛋白在制备治疗周围神经系统自身免疫性疾病药物中的应用，所述的周围神经系统自身免疫性疾病是抗神经节苷脂GM1抗体相关疾病，所述的静脉注射免疫球蛋白通过抑制霍乱毒素和半乳糖凝集素-1结合到神经节苷脂GM1来治疗抗神经节苷脂GM1抗体相关疾病。

所述的周围神经系统自身免疫性疾病包括多病灶性运动神经病，无传导阻滞的低运动神经病，急性炎症脱髓鞘多神经根神经病，急性运动轴索神经病，慢性炎症脱髓鞘多神经根神经病和多发性硬化症。

所述的静脉注射免疫球蛋白中正确比率的半乳糖基/无半乳糖基免疫球蛋白相互作用于巨噬细胞受体，从而下调巨噬细胞和周围神经系统自身免疫性疾病的炎症功能。

本发明优点在于：

1、本发明研究发现静脉注射免疫球蛋白不能抑制抗GM1抗体结合它的抗原和静脉注射免疫球蛋白并未下降抗GM1抗体滴度，并显示静脉注射免疫球蛋白抑制霍乱毒素（cholera toxin）和半乳糖凝集素(galectin)-1结合到神经节苷脂GM1；

2、本发明首次提出：静脉注射免疫球蛋白中正确比率的半乳糖基/无半乳糖基（galactosyl/agalactosyl）免疫球蛋白相互作用于巨噬细胞受体，从而下调巨噬细胞和周围神经系统自身免疫性疾病的炎症功能。

附图说明

图1：静脉注射免疫球蛋白没有抑制抗神经节苷脂（GM1）IgG或IgM抗体结合GM1。A：病人的血清含有IgM抗-GM1抗体培养在未经处理的U229细胞中（空曲线）和在GM1处理的U229细胞缺少（全黑曲线）或存在20mg/ml静脉注射免疫球蛋白（粗灰曲线）。B：相同血清培养在SKN-MC细胞缺少（全黑色曲线）或存在（粗灰曲线）；空曲线为阴性对照血清。C：病人血清含有抗-GM1IgG抗体培养在SKN-MC细胞缺少（全黑色曲线）或存在20mg/ml静脉注射免疫球蛋白（粗灰曲线）；空曲线为阴性对照血清。D：除用F(ab′)₂（粗灰线）代替静脉注射免疫球蛋白，与B实验相同。E和F：静脉注射免疫球蛋白（全黑色曲线）培养在SKN-MC细胞和接着加FITC标记的抗IgG抗体（E）或FITC标记的抗IgM抗体（F）。

图2：运用流式细胞仪，静脉注射免疫球蛋白(IVIg)抑制霍乱毒素（TC）和半乳糖凝集素-1（galectin-1）结合到GM1表达的细胞（cells）。SKN-MC细胞孵育于连续稀释的生物素标记的霍乱毒素b-亚基或生物素标记的半乳糖凝集素-1在存在或缺乏静脉注射免疫球蛋白（20毫克/毫升）15分钟。在FITC标记的streptavidine或APC标记的streptavidine孵育15分钟后，配体结合被测定。

图3：SKN-MC细胞预孵育抗GM1 IgG阳性血清或IVIg缺乏抑制霍乱毒素b-亚基或半乳糖凝集素-1的结合。SK-N-MC细胞预孵育抗GM1 IgG阳性血清（1/20）或IVIg（20μg/ml）4℃ 15分钟。洗净后，生物素标记的霍乱毒素β-亚基或生物素标记的半乳糖凝集素-1再孵育15分钟。FITC标记的streptavidine或APC标记的streptavidine孵育15分钟后进行荧光分析。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例 1

为了探索抗GM1抗体相关疾病中IVIg的作用机理，我们测试了两个假设：（i）抗独特型抗体存在于不同的IVIg制剂中；（ii）使用流式细胞仪，IVIg抑制霍乱毒素和半乳糖凝集素-1结合GM1表达细胞。

材料和方法

1.1. 试剂和细胞系

人静脉注射免疫球蛋白（IVIg）（50mg/ml）三种不同的产品：Sandoglobuline (Novartis, Rueil Malmaison,法国），Tegeline （LFB, Paris，法国）和Endoglobuline（Baxter, Maurepas，法国）被采用。F(ab’)₂IVIg制剂由Srini V.Kaveri (INSERM U430, Paris, 法国)提供。从牛脑纯化的单唾液酰神经节苷脂GM1购自Sigma（St Quentin Fallavier，法国）和溶解在甲醇中。高亲和力GM1特异的配体生物素基的霍乱毒素β-亚基（0.5mg/l的）购自Sigma（St Quentin Fallavier，法国）。人生物素化半乳糖凝集素-1（0.5毫克/毫升）由HJ Gabius赠送（Munich,德国）。FITC结合的F(ab’)₂羊抗人IgG和抗人IgM（1mg/ml）购自Biorad (Ivry sur Seine,法国），辣根过氧化物酶连接的羊抗人IgM（Fcμ）和抗人IgG（FC）（1mg/ml）来自Beckman-Coulter（Paris,法国），streptavidine-allophycocyanin（Sav-APC）（0.2mg/ml）来自Becton Dickinson (Pont-de Claix,法国）和steptavidine-fluorescein-isothiocyanate（Sav-FITC）（1mg/ml）来自Dako (Trappes,法国）。

人神经母细胞瘤细胞系SKN-MC显著表达内源性GM1，处理或不处理外源性GM1的人胶质瘤细胞系U229从American Type Culture Collection (Manassas, VA)获得。这些细胞培养在Dulbecco’s Modified Eagle Medium补充10% 胎牛血清（FCS），2mM L-谷氨酰胺，100 UI/毫升青霉素，100微克/毫升链霉素。收获细胞使用0.05％trypsin-0.02％EDTA（Invitrogen，Cergy，Pontoise,法国）。

1.2. 病人血清

马赛两个神经病学科对病人进行临床和神经生理学的检查作出了诊断。大多数病人先前已报道。所有病人给予写知情同意书，当地伦理委员会批准了这项研究。所有血清被分装，冷冻和保存在-80℃直到使用。血清被细分成4组:MMN（n=13），AMAN（n=2），LMN（N=4）和原因不明的局部癫痫（cryptogenic partial epilepsies，CPE）（N=4）关联于抗GM1抗体。最后组血清在癫痫患者选择存在IgG或IgM抗GM1抗体。病人组和抗体测试总结在表1。

表1 病人的免疫学特征

注：MMN: multifocal motor neuropathy, 多病灶性运动神经病；

LMN: lower motor neuropathy without conduction block, 无传导阻滞的低运动神经病；

AMAN: acute motor axonal neuropathy, 急性运动轴索神经病；

CPE: cryptogenic partial epilepsies, 原因不明的局部癫痫。

1.3. 酶联免疫吸附试验（ELISA）

根据Adams等人描述的修改步骤进行ELISA试验。每个非照射微孔板（Sayag，Courtaboeuf，法国）充满了甲醇稀释成0.5微克GM1或不含GM1。在37℃甲醇完全蒸发后，它们饱和在4℃的洗涤缓冲液（PBS pH值7.2含0.05％吐温20）（Sigma,St Quentin Fallavier，法国）。所有的孵育用洗涤缓冲液做复管。阴性和阳性对照样品与病人样本一起稀释（1/20），接着在4℃孵育过夜。5次洗涤后，加入辣根过氧化物酶连接的羊抗人IgM（1/25000）或IgG（1/20000）在室温孵育2小时。ELISA板被洗涤和加入发展溶液（0.1M柠檬酸钠，0.1M柠檬酸，1mg/ml邻苯二胺和3％H₂O₂）。经过30 min，加4M硫酸终止反应。非GM1包被孔作为空白对照。在490 nm空白孔的光密度（OD）为正常值。对照平均值加上两个标准差定为阳性阈值。阈值以上的所有血清被连续稀释。连续稀释血清的最后管超过阈值为ELISA的结果。

对于竞争实验，用0.05％吐温PBS稀释血清为1/40或1/80，并与IVIg或骨髓瘤IgG孵育浓度从0.1毫克/毫升至25毫克/毫升。经37℃ 3小时孵育，在上述相同的条件下，用ELISA试验检测抗GM1抗体的存在。

1.4. 流式细胞仪分析

SK-N-MC和处理或不处理外源性GM1的U229孵育于稀释的正常人血清（1/20）作为阴性对照或1/20稀释的病人血清，生物素化霍乱毒素b-亚基（0.5微克/毫升）或生物素化半乳糖凝集素-1（20μg/ml）在单独50μl 0.01％BSA 0.02％叠氮化钠 PBS或加入IVIg或F（ab'）₂在4℃15分钟。洗净后，另一个15分钟的孵育步骤开始揭示抗GM1患者血清，霍乱毒素或半乳糖凝集素-1分别结合10μg/ml FITC标记的抗IgM，抗IgG，或streptavidin-FITC或streptavidin-APC 在50μl 0.01％BSA 0.02％叠氮化钠 PBS。经两次洗净，2％多聚甲醛PBS固定细胞。流式细胞分析仪（Becton Dickinson，Mountain View，CA）进行荧光分析。

结果

2.1. IVIg不能抑制抗GM1抗体结合它的抗原

在3个IVIg制剂中我们没有测到抗GM1IgG的反应性。再者，加IVIg没有增加非特异性ELISA信号。患有MMN，LMN，AMAN或CPE病人的所有血清与不同浓度的Sandoglobulin（0.1毫克/毫升至25毫克/毫升）用竞争ELISA测定。IVIg从未降低抗GM1IgG或IgM的反应性。通过使用来自其他公司的IVIg（Tegeline或Endoglobuline）与MMN，LMN或CPE患者的6份血清样品来确信这一观察。此外，用两个有代表性的MMN患者血清设计不同的ELISA实验条件：在预孵育步骤系列稀释血清，IVIg孵育的温度和时间，洗涤剂的存在或缺乏。在这些实验我们都没有能够证明通过结合IVIg抑制抗-GM1抗体血清。最后，在SKN-MC或在GM1处理和未经处理的U229细胞,用流式细胞仪也说明缺乏竞争。在带有或不带膜的IVIg，未见IgM抗体结合到GM1的区别（图1A和B）。对于IgG抗体结合，我们没有观察到一个竞争，但在完整的IVIg呈现中,代替一个平均荧光强度的增加（图1C），但不与F(ab')₂（图1D）。事实上，IVIg单独结合膜上给予检测抗IgG抗血清一个阳性的信号（图1E），但不是抗IgM（图1F）。我们发现无论病理或同型抗体，IVIg不干扰抗GM1抗体的结合。

2.2. IVIg灌注没有降低MMN患者血清的抗GM1抗体的滴度

我们评估10例MMN患者含高滴度抗GM1抗体经IVIg治疗后抗GM1抗体的滴度。研究设计是一个双盲和安慰剂-对照交叉试验：用IVIg（0.4g/kg/d）或生理盐水，静脉给药。第一试验治疗是连续5天给药和在第一次治疗后，第二次给药8周。治疗用药后，收集第1，第2，第3，第4，第5，第21和第56天静脉血液抽样调查。每个血清，连续稀释，通过ELISA试验检测。为了避免实验的变化，个别病人的所有样本在ELISA同一板上同时进行分析。虽然一些患者对IVIg治疗显示有益的反应，但IVIg治疗并没有影响抗GM1抗体的滴度。所有血清样本抗GM1 IgM的光密度测定是严格相同的。因此，我们认为IVIg不干扰MMN患者的抗GM1IgM的产生。

2.3. IVIg干扰霍乱毒素和galectin-1的膜结合

SKN-MC培养于不同浓度的生物素化的霍乱毒素β-亚基或galectin-1在存在或缺乏IVIg（图2，其中MFI (Mean Fluorescence Intersity)：平均荧光强度）。对于每个浓度，IVIg部分抑制配体的结合（60％至75％）。在100mM的乳糖存在，获得相同的结果。抑制的效率是剂量依赖的和F(ab')₂较完整的IVIg更有效。配体预孵育IVIg没有增加竞争。另一方面，细胞预孵育IVIg或阳性抗GM1血清，洗涤后没有减少霍乱毒素β-亚基或galectin-1的结合。相反，galectin-1的结合甚至略有增加（图3）。我们发现霍乱毒素和galectin-1相互作用于IVIg和仅剩下自由物质结合在细胞膜上。

讨论

IVIg的作用机制是错综复杂。他们可能涉及：（1）Fc受体介导的效应，（2）抗炎症效应作用于补体级联或细胞因子网络的调节和（3）T和B细胞的激活,分化和效应器功能的另一个效应。

有些作者描述在一些商业IVIg存在着抗GM1IgG。随后建议，IVIg灌注可能诱导一个抗GM1IgG血清水平的增加。在商业来源的IVIg中，抗GM1水平不同。使用不同商业来源的IVIg，我们发现抗体水平是低于我们的阴性对照。抗GM1IgG滴度能够被少量地改变。

我们接着能观察注射的免疫球蛋白在抗GM1自身抗体上起的作用。如果IVIg含有抗独特型抗体，它被认为它们能够中和循环自身抗体，从而阻止由这些自身抗体诱导的致病效果。通过抗独特型抗体直接中和B和T细胞表达的相同独特型，IVIg下调了抗体产生，从而下降自身抗体水平。在体外IgG和IgM抗体识别GM1缺乏竞争和MMN病例治疗期间缺乏抗GM1IgM的下降，从而丢弃这些作用机制。我们不能重现先前出版的结果，作者研究只有3位没有遭受MMN的病人血清，因而缺乏有说服力的数据。再者，作者没有排除抗GM1抗体相互作用于IVIg的糖表位的可能性。Lopez等人建议正常人体血浆中含有抗体，其抑制神经病患者的抗GM1IgG抗体的结合；但不抑制有相同精细特异性的兔抗GM1IgG抗体。仅显示一个血清中获得的唯一结果和没有观察抗GM1IgM。它已被推测IVIg在抗体介导的自身免疫性疾病中有益效果是基于加速自身抗体的降解代谢。对IgG降解代谢起作用的机制涉及Fc受体新生儿结合蛋白（FcRn）。IVIg影响IgG的半衰期，而IgM和IgA水平是不受影响。因此,这一作用机理不涉及到MMN。而且，这一作用机理在AMAN很难得到临床支持。也有证据表明对某个其他相关的自身抗体疾病，IVIg不包含抗独特型抗体。虽然抗GM1IgG水平确实减少，但难以识别是正常的自身抗体减少还是治疗的效果使抗GM1IgG水平下降。这一假说应使用GBS实验模型测试。在目前的研究中,一些患者显示抗GM1抗体相关的慢性病理学。在长期的随访没有发现抗体水平显著下降。

Yuki和Miyagi表明用ELISA检测出霍乱毒素抑制GM1的结合。因此，他们建议在抗体中存在表位肽，这可能会固定抗GM1。他们解释这些结果有利于抗独特型抗体的呈现。使用流式细胞仪，我们发现了相似的结果，尽管霍乱毒素抑制GM1的结合是不完全的。他们不排除霍乱毒素相互作用于IVIg的可能性和结合的毒素对GM1的固定仍是不可用的。这项工作给了我们想法去测试在结合其他GM1配体上IVIg的效果。我们显示IVIg抑制半乳糖凝集素1，它是一个结合到人类神经母细胞瘤细胞系的内源细胞相关的凝集素。半乳糖凝集素-1是一种糖结合蛋白，特异地相互作用于乳糖胺聚糖（LCGs）。它表达在发育的大脑，但没有在正常成熟大脑除了高再生组织如嗅球神经层，它可相互作用于轴突表达的LCGs。切片后，半乳糖凝集素-1表达在再生神经，主要由神经胶质细胞表达。半乳糖凝集素-1还能结合免疫系统的众多糖蛋白，如CD43，CD45，CD4和CD7。它不仅可以合作于TCR约束从而诱导细胞凋亡，而且在一个小鼠T细胞杂交瘤和新鲜分离的胸腺细胞中对抗TCR诱导的IL-2产生和增殖。有趣地，在APC提呈中，IVIg抑制抗原特异性T细胞的增殖，这是众所周知的表达高水平的半乳糖凝集素-1。在这种方式中，半乳糖凝集素-1的作用变得多样和经常自相矛盾。如果半乳糖凝集素-1是被外源地加到细胞培养，或内源地表达，或由半乳糖凝集素-1表达细胞提呈，其作用不同。因此，IVIg可直接作用在不同层面：中枢神经系统或免疫系统控制自身免疫性疾病。半乳糖凝集素-1结合到IVIg很可能是由于在免疫球蛋白上存在着半乳糖基部分。

巨噬细胞涉及周围神经系统炎症性疾病的病理生理学。自身免疫性疾病经常关联着无半乳糖基化IgG的增加。这些抗体表示一个Fcγ受体结合的下降带有一个尤其由巨噬细胞表达的甘露糖受体结合增加的特性。给予正常的IVIg，半乳糖基/无半乳糖基（galactosyl/agalactosyl）IgG的比率从而被纠正和注射的IgG竞争病人的IgG为了相互作用于巨噬细胞受体，从而下调巨噬细胞的炎症功能和下调周围神经系统自身免疫性疾病。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.静脉注射免疫球蛋白在制备治疗周围神经系统自身免疫性疾病药物中的应用，其特征在于，所述的周围神经系统自身免疫性疾病是抗神经节苷脂GM1抗体相关疾病，所述的静脉注射免疫球蛋白通过抑制霍乱毒素和半乳糖凝集素-1结合到神经节苷脂GM1来治疗抗神经节苷脂GM1抗体相关疾病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的周围神经系统自身免疫性疾病包括多病灶性运动神经病，无传导阻滞的低运动神经病，急性炎症脱髓鞘多神经根神经病，急性运动轴索神经病，慢性炎症脱髓鞘多神经根神经病和多发性硬化症。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的静脉注射免疫球蛋白中正确比率的半乳糖基/无半乳糖基免疫球蛋白相互作用于巨噬细胞受体，从而下调巨噬细胞和周围神经系统自身免疫性疾病的炎症功能。