CN102940635A - 一类茚并异喹啉类血管内皮细胞生长因子-2受体抑制剂的抗乳腺癌用途 - Google Patents

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严明
向华
张陆勇
苗靖姗
唐智超
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Abstract

本发明涉及式(I)的血管内皮细胞生长因子-2受体抑制剂或其药学上可接受的盐。此类化合物可以抑制血管内皮细胞生长因子-2受体的活性，有效地产生抗乳腺癌等作用。此类化合物具有很强的体外拮抗血管内皮细胞生长因子-2受体的作用，可以有效的抑制血管内皮细胞生长因子-2受体的作用，拮抗血管生成过程，从而治疗依赖血管生成的乳腺癌。

Description

一类茚并异喹啉类血管内皮细胞生长因子-2受体抑制剂的抗乳腺癌用途
技术领域
本发明涉及一类茚并异喹啉类的血管内皮细胞生长因子-2受体抑制剂，可以在拮抗血管内皮细胞生长因子-2受体后产生抗血管生成作用，从而用于抗乳腺癌治疗。
背景技术
近年来，乳腺癌已在女性中成为排名第一的常见恶性肿瘤，抗乳腺癌药物研究具有重要的学术和现实意义。
研究发现，乳腺癌的生长、浸润和转移均有赖于肿瘤血管的生成(Angiogenesis)。在肿瘤的血管生成过程中，由瘤细胞产生的血管内皮细胞生长因子-2(Vascular endothelial growthfactor，VEGF-2)是启动并调控血管生成的重要介质。大量的资料表明VEGF-2在肿瘤血管的形成中发挥中心作用。VEGF-2是内皮细胞特异的强效有丝分裂原，并有增加血管通透性、诱导内皮细胞迁移、成型和维持内皮细胞的存活等功能。血管内皮细胞生长因子-2受体激酶(KDR)是VEGF-2的受体，因此能够有效控制VEGF-2及其受体KDR的表达对控制内皮细胞增殖及抗血管生成具有重要的意义。
目前很多公司、科研机构都开展了针对KDR激酶抑制剂的研究，对KDR的分子生物学功能的研究文献日益增多，相关专利也不断出现。1971年，Folkman首次提出肿瘤的生长和转移具有血管依赖性，他认为是新生血管的形成为肿瘤提供了充足的营养物质而使其迅速生长和增殖，并提出了“抗血管生成”的假说。其中VEGF-2/KDR在肿瘤血管生成起主要作用，成为研究的主要靶点。目前已进入临床研究的KDR激酶抑制剂有SU5416，SU11248，PTK787等。Sugen公司(现被Pfizer公司收购)研发的SU5416是最早进入临床试验的KDR激酶小分子抑制剂，是重要的KDR酪氨酸激酶抑制剂。但因在III临床试验中发生严重不良反应而终止研究。SU5416是Flk-1/KDR酪氨酸激酶的ATP竞争性抑制剂(K＝0.16μmol/L)，能自由通过细胞膜，通过与ATP竞争结合定位在KDR酪氨酸激酶的腺嘌呤结合(adenine-bindingpocket)，抑制KDR激酶活性，从而抑制KDR的信号转导，IC50为1.04mol/L。临床实验表明，SU5416对乳腺癌的增殖具有明显的抑制作用。在体外实验中，对肿瘤细胞的毒性作用很弱，说明了肿瘤与新生血管之间的密切关系，同时说明药物不是直接杀死肿瘤细胞，而是通过抑制新生血管生成阻止肿瘤的恶性增殖。新一代多靶点酪氨酸激酶舒尼替尼使以KDR为靶点抗肿瘤治疗有了新的进展。舒尼替尼在半抑制浓度时可抑制两种受体酪氨酸激酶即VEGFR-2及血小板衍生生长因子受体β(PDGFR β)磷酸化，抑制效应较其他药物强10-30倍。2006年，FDA批准本品用于治疗胃肠道间质瘤和晚期肾细胞癌。在乳腺癌、食管癌、胃癌等其他实体瘤的临床研究中，也观察到了可喜的结果。
现有KDR激酶小分子抑制剂较少，而其在血管生成抑制方面及通过拮抗血管生成过程来抗乳腺癌方面研究结果提示通过开发KDR激酶抑制剂来治疗乳腺癌越来越具有潜在价值与重要意义。
发明内容
本发明的目的在于开发一类KDR激酶抑制剂在抗肿瘤血管新生中的应用。本发明筛选的化合物为一批定向合成的可抑制KDR激酶靶点的化合物，利用均相时间分辨荧光方法建立的高通量筛选模型对该批化合物进行体外筛选，通过功能性验证寻找先导化合物和候选药物，同时对筛选所得活性化合物进行初步药效学和机制研究，找到一类茚并异喹啉类结构的KDR激酶抑制剂，为抗肿瘤血管新生提供候选药物。该类化合物由中国药科大学药物化学实验室合成，其中待测化合物001672和001626合成方法可从专利向华，王天麟，肖红，尤启冬，姚瑶，李骁博，廖清江.茚并异喹啉酮衍生物、其制备方法及其医药用途.ZL 2009 1 0233991.7和Hua Xiang，Tianlin Wang，Hong Xiao，Qidong You，Yao Yao，Xiaobo Li，Qingjiang Liao.Indenoisoquinolinone derivatives，manufacturing method and medical use thereof.WO 2011047515A1.中获得。
本发明的技术方案为：建立KDR激酶靶向抑制剂筛选模型，初筛，复筛，构效关系分析，得到一类具有抗肿瘤血管新生作用的候选药物。具体步骤如下：
步骤一：KDR激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。
步骤二：阳性药验证模型可靠性。
步骤三：使用KDR调节剂高通量筛选模型对待测化合物进行初筛、复筛，绘制待测化合物拮抗KDR激酶的抑制曲线并测定IC50值。
本发明提供上述化合物或其药学上可接受盐及其药用组合物的医疗用途，尤其是在预防、延缓或治疗KDR激酶参与介导的疾病，特别是抗肿瘤血管新生药物中的用途。以上提及的定向合成的化合物在抗肿瘤血管新生中的作用属于本发明的保护范围。
附图说明：
图1：KDR激酶浓度梯度优化实验结果。n＝3，
Figure BSA00000823804700021
图2：KDR激酶温孵时间优化实验结果。n＝3，
Figure BSA00000823804700022
图3：KDR激酶底物浓度优化实验结果。n＝3，
图4：KDR激酶ATP浓度优化实验结果。n＝3，
Figure BSA00000823804700031
图5：KDR激酶Biotin/SA信噪比优化实验结果。n＝3，
图6：阳性药SU5416拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA00000823804700033
图7：高通量筛选Z′值分布。
图8：待测化合物001672拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA00000823804700034
图9：待测化合物001626拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
图10：待测化合物000394拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA00000823804700036
图11：待测化合物000356拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA00000823804700037
图12：待测化合物000331拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA00000823804700038
图13：待测化合物000337拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA00000823804700039
图14：待测化合物001955拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA000008238047000310
图15：待测化合物LF08拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA000008238047000311
图16：待测化合物LF19拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA000008238047000312
图17：待测化合物LF04拮抗KDR激酶的抑制曲线图。n＝3，
Figure BSA000008238047000313
具体实施方式
以下结合附图说明本发明的具体实施方式：
1.待测化合物拮抗拮抗KDR激酶活性测试
1)实验材料
KDR激酶(Invitrogen，USA)、HTRF KinEASE-TK(Cisbio，USA)、ATP、MgCl2、MnCl2、DTT(国产)、384低体积白板(Corning，USA)、进口枪头(Axygen，USA)。
2)实验步骤
●进行KDR激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度、Biotin/SA信噪比优化实验，见图1-5。
●绘制阳性药SU5416量效曲线并测定其IC50值，见图6。
●建立KDR激酶抑制剂高通量筛选模型并通过Z’值确定模型的可靠性，见图7。
●待测化合物每种精确称量，加入DMSO溶剂成母液，然后使用ES2Screening Buffer配制待测化合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1×10-3mol/L。
●在反应容器中每孔加入KDR激酶溶液2μl，底物溶液2μl，缓冲液或待筛化合物4μl，ATP 2μl。反应1小时。
●每孔加入TK-Ab 5μl，SA-XL665 5μl，室温孵育1小时。
●利用美国贝克曼库尔特(Beckman Coulter)公司检测平台HTRF模块进行检测。
2.数据处理
1)根据公式计算每个待测化合物对KDR激酶的抑制率；
2)使用抑制率和对数浓度值作图求算IC50，见图8-17。
复筛实验结果
KDR激酶筛选模型优化结果：最佳KDR激酶浓度梯度为0.1ng/μl(见图1)，最佳温孵时间为1小时(见图2)，最佳底物浓度为94.90nM(见图3)，最佳ATP浓度为0.75μM(见图4)，最佳Biotin/SA信噪比为4/1(见图5)。用阳性药SU5416验证模型，测得IC50为1028nM(见图6)，并通过Z’值确定模型的可靠性(见图7)。
筛选得到的化合物可以根据母核的结构总结为一类，结构式与IC50如下：
Figure BSA00000823804700041
1：6-芳基-5H-茚并-[1，2-c]异喹啉-5，11(6H)-二酮
Figure BSA00000823804700042
Figure BSA00000823804700043

Claims (3)

1.下式化合物或其药学上可以接受的盐：
Figure FSA00000823804600011
其中：
R1、R2各自独立的表示H、-OH、Cl、Br、C1-C4烷氧基或C1-C6烷氧羰基；
R3、R4各自独立的表示CO(CH2)2CH3、CO(CH2)3CH3或C1-C6烷基；或R3和R4及与其相连的氮原子结合成哌啶基、2-甲基哌啶基、高哌啶基、吗啉基、吡咯烷基、3-甲基吡咯烷基、3，3-二甲基吡咯烷基、3，4-二甲基吡咯烷基、哌嗪基、N-甲基哌嗪基、N-乙基哌嗪基、N-苯基哌嗪基或N-苄基哌嗪基；
X表示O、S、NH、CH2或-CO-；
m＝0或1；
n＝2或3。
2.权利要求1要求保护的式(I)的化合物或其药学上可以接受的盐用于制备血管内皮细胞生长因子-2受体抑制剂的用途。
3.按照权利要求2的用途，作为血管内皮细胞生长因子-2受体抑制剂，用于治疗乳腺癌。
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严明等: "血管内皮生长因子受体-2抑制剂高通量筛选模型的建立和应用", 《中国药学杂志》, vol. 47, no. 11, 30 June 2012 (2012-06-30), pages 894 - 898 *

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