CN102935066A - 一种伊立替康脂质体制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种伊立替康长循环脂质体及其制备方法，采用伊立替康与mPEG-COOH化学交联后的修饰物作为主药，与氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、PEG-DSPE通过主动载药或被动载药的方式制备而成。本发明的伊立替康长循环脂质体具有药物包封率高、脂质体稳定性好、药物体内半衰期长等优点，有利于实现工业化生产。

Description

一种伊立替康脂质体制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种抗肿瘤药物伊立替康的脂质体制剂及其制备方法。

背景技术

伊立替康(Irinotecan Hydrochloride，CPT-11)是日本Daiichi Seiyaku公司和Yakult Honsha公司联合开发的半合成水溶性喜树碱类衍生物，1994年在日本首次上市，作为转移性结直肠癌的有效药物引起全世界广泛关注。其抗癌活性强，以盐酸盐三水合物的形式存在，水溶性较好。在临床作为一线药物与氟尿嘧啶、亚叶酸联合用于治疗代谢性结肠或直肠癌，也可用于经氟尿嘧啶治疗后无效、复发的代谢性结肠或直肠癌。除以上适应证外，该药对不同类型的肿瘤均具有抑制作用。目前，该药已获得美国FDA和欧盟的共同批准，在全球100多个国家上市，它是美国FDA 40多年来继氟尿嘧啶(5-FU)以后再次批准用于转移性结直肠癌一线治疗的化疗药物。现已上市的剂型主要有注射液和冻干粉针。但该药在剂量较大时，可引起严重的腹泻和骨髓抑制，这两种不良反应被认为是与剂型相关的毒性。另外，因其结构中的内酯环具有pH依赖性，在碱性、中性甚至弱酸性(如pH大于6时)溶液中会形成无活性的羧酸盐形式，因此在药物进入体内后会有相当一部分药物转化为无活性的羧酸盐形式，从而降低了药效。由此看来，目前上市剂型在安全性、有效性及患者顺应性方面均存在较大的改进空间，这无疑限制了其在临床上更为广泛地应用。

对伊立替康现有上市剂型进行改进，提高药物的安全性及有效性研究已经取得了较多进展。其中，脂质体制剂的研发进展最快，如日本Yakult Honsha公司开发的伊立替康脂质体制剂IHL305目前已经进入临床研究，伊立替康的活性代谢产物SN-38的脂质体制剂也已经在美国开展相关临床研究，Celator公司开发的伊立替康与氟脲苷的复方脂质体制剂正在美国开展I期临床研究。

脂质体具有类似于细胞膜的结构，构成双分子层的类脂亲水性的头部形成膜的内表面，而亲脂性的尾部则处于膜的中间。正由于脂质体的这种类膜结构使其能够携带各种亲水的、疏水的和两亲的物质，它们被包入脂质体内部水相、插入类脂双分子层或吸附连接在脂质体的表面。脂质体作为药物载体，既起到了对药物的保护作用，又提高了药物对机体特定部位的靶向性，因此在提高药效方面具有很多优越的特性。普通脂质体进入体内后很快被网状内皮系统吞噬，而主要靶向在肝、脾、骨髓等网状内皮系统较为丰富的器官中，对其他部位的靶向性较差。而且其在体内易受蛋白、酶等的作用而发生渗漏，影响疗效并使毒性增大。通过在脂质体中加入两亲性的PEG的二硬脂酸磷脂酰胺的衍生物-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(PEG-DSPE)等大分子能减少脂质体与血浆中调理素的结合，增加其血液稳定性，延长半衰期和药物在血液中的时间。常用的脂质体制备方法有薄膜分散法、注入法、跨膜梯度主动载药法、超声波分散法、冷冻干燥法、逆向蒸发法等。

国际申请WO2005117878公开了一种伊立替康脂质体的处方和制备方法，该制剂通过离子梯度的方法主动将伊立替康药物以较高的浓度载入由磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂、心磷脂、胆固醇等构成的脂质体中。显著提高了药物在血液中的滞留性，提高了药物制剂的稳定性。但制备工艺较为复杂，首先需要制备具有脂质体内外离子梯度的空白脂质体，然后才能进行药物装载。从工艺的复杂程度及工业化放大的角度来看均不利于产品的批量制备，且工艺中需要控制的质量指标较多，任何指标的变化都可能会导致药物包封率的降低或脂质体稳定性下降。另外，按照此发明的描述，药物能否以较高的包封率包入脂质体内部不得而知，如果包封率较低，则还需要采用必要的纯化手段将未包封的药物去除，进一步增加了工艺的复杂程度。

国际申请WO2011066684公开了一种伊立替康或盐酸伊立替康脂质体的制剂处方及其制备方法，该制剂限定了中性磷脂与胆固醇的比例，通过现有技术硫酸铵梯度法将药物载入脂质体内。此申请同样采用了离子梯度的方法制备伊立替康脂质体，除工艺复杂、难以工业化生产外，此申请还对磷脂与胆固醇的比例进行了限定。认为胆固醇的用量对脂质体的粒径和稳定性有一定影响，当胆固醇与中性磷脂的重量比例控制在1∶3-5时脂质体的稳定性等指标明显提高。但从现有的公开文件中并没有获得足够的证据支持此申请的论点，包括目前已经上市销售的多个脂质体产品，其胆固醇的重量比例均超过了此申请的限定值，而粒径及稳定性均较好。本发明人也开展过相关研究，并未得出此结论。

CN1994279A也公开了一种伊立替康脂质体的制剂处方及制备工艺，该制剂处方由磷脂酰胆碱、鞘磷脂、心磷脂、胆固醇和聚乙二醇衍生物组成，通过pH梯度法将药物包封于脂质体内部。此申请处方中含有鞘磷脂和心磷脂，此二种磷脂价格较高，难以获得，造成制剂成本较高。工艺方面，通过pH梯度法载药，需要通过超滤法去除有机溶剂，制备工艺较为复杂，难以实现工业化。此申请中使用了浓度较高的柠檬酸钠缓冲液及其他多种缓冲盐来调节pH值，这些缓冲盐的临床使用安全性存在较大隐患。另外，pH梯度法载药会随着放置时间的增长而导致药物泄露，难以保证制剂的体内外稳定性。

虽然上述专利文献中述及的脂质体处方与现有上市注射液相比已经具有了一定优势，但是在处方的经济性、合理性，制剂的稳定性，工艺的可放大性、操作简便性，以及药物的安全性及有效性方面仍然存在较多问题。

发明内容

针对现有技术存在的经济性、稳定性、工艺可放大性及药物的安全性有效性等方面存在的问题，本发明提供一种伊立替康脂质体制剂及其制备方法。

发明概述

首先，本发明提供一种包封率高、药物稳定性好、体内半衰期长、疗效显著的抗肿瘤药物长循环脂质体制剂，该制剂中最终在体内发挥肿瘤治疗作用的药物是伊立替康。该制剂在体内能够逃避网状内皮系统(RES)的吞噬作用，明显延长伊立替康药物的体内半衰期，是一种可注射制剂，此制剂具有肿瘤被动靶向作用，与普通注射液相比能够显著提高肿瘤治疗效果，同时在安全性方面也具有优势。

本发明还提供上述制剂的制备方法，包括伊立替康药物本身的修饰方法及长循环脂质体制剂的制备方法。与现有的制备方法相比，本发明所提供的制备方法具有工艺简单、药物包封率高、脂质体稳定性好、药物体内半衰期长等优点，有利于实现工业化生产。

术语说明

脂质体：本发明所述脂质体具有药剂学上的一股含义，系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体；以磷脂为主要膜材。

多室脂质体和小单室脂质体：脂质体按照所包含的类脂质双分子层的层数不同，分为单室脂质体和多室脂质体。多层双分子层的泡囊称为多室脂质体。单一双分子层的泡囊称为单室脂质体。小单室脂质体是指粒径小于200nm的单室脂质体。

mPEG-COOH：分子两个末端分别为甲氧基和羧基的聚乙二醇，mPEG2000-COOH、mPEG5000-COOH中2000、5000的含义是修饰物中连接的聚乙二醇(PEG)的分子量为2000道尔顿、5000道尔顿。这是本领域的通用表示。各种PEG分子量的mPEG-COOH均可市场购得。

聚乙二醇的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)：也称PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，是一种长循环膜材；

mPEG₂₀₀₀-DSPE：甲氧基聚乙二醇分子量为2000道尔顿的PEG化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；可市场购得，也可按现有技术自行制备。

发明详述

本发明的技术方案如下：

一种伊立替康长循环脂质体制剂，主要包含mPEG-COOH修饰的伊立替康药物、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和长循环膜材，其中：所述mPEG-COOH修饰的伊立替康为伊立替康与mPEG-COOH按摩尔比1∶1的交联产物；所述长循环膜材为聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)或单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM-1)。

根据本发明优选的，上述的伊立替康长循环脂质体中，所述的mPEG-COOH修饰的伊立替康中聚乙二醇(PEG)的分子量介于500～50000道尔顿之间，进一步优选聚乙二醇分子量为2000～5000道尔顿。

根据本发明优选的，上述的伊立替康长循环脂质体中，以伊立替康计，mPEG-COOH修饰的伊立替康与氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)的质量比为1∶3～10，进一步优选1∶4～6。

根据本发明优选的，上述的伊立替康长循环脂质体中，胆固醇与氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)的质量比为1∶3～10，进一步优选1∶5～7。

根据本发明优选的，上述的伊立替康长循环脂质体中，聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)或单唾液酸四己糖神经节苷酯(GM-1)与氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)的质量比为1∶5～20，进一步优选1∶10～15。

根据本发明优选的，所述mPEG-COOH修饰的伊立替康是聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康按现有技术交联制得，例如采用CN1852740B中描述的方法；或者直接将伊立替康分子与mPEG-COOH通过酯化反应交联在一起。

进一步优选的，mPEG-COOH修饰的伊立替康按以下方法1或方法2制备：

方法1：按摩尔比1∶1的比例将伊立替康与叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)进行交联，得到叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康；通过加入三氟乙酸将叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康转化为甘氨酸-伊立替康；按摩尔比1∶1的比例将甘氨酸-伊立替康与分子量为500～5000道尔顿的mPEG-COOH通过现有公知的方法进行交联，即可得到mPEG-COOH修饰的伊立替康药物。

方法2：按摩尔比为1∶1的比例将伊立替康与分子量为500～5000道尔顿的mPEG-COOH溶解于适量冰的无水二氯甲烷中，称取适量二甲基氨基吡啶(DMAP)和二异丙基碳二酰亚胺(DCC)加入后，置于室温条件下搅拌反应12-24h。通过砂芯漏斗过滤去除固体，所得溶液于分液漏斗中用0.1N的盐酸洗2-3次。无水硫酸镁干燥后旋蒸去除溶剂，产物进一步真空干燥。加入少量无水二氯甲烷复溶后，冰浴条件下加入无水乙醚进行结晶。将得到的固体进行过滤，干燥后即得到mPEG-COOH修饰的伊立替康药物。

本发明制剂进入人体后最终发挥抗肿瘤作用的为伊立替康，上述的伊立替康长循环脂质体，其中所述的mPEG-COOH修饰的伊立替康是伊立替康分子与mPEG-COOH分子之间通过化学键连接而提高了伊立替康的体内稳定性及循环半衰期，其中伊立替康分子中的羟基与mPEG-COOH分子中的末端羧基通过酯键直接连接或者通过交联剂如叔丁氧基羰基甘氨酸(t-boc-glycine)而连接在一起。进入体内后，在体内广泛存在的酯酶等蛋白酶的作用下此连接键被破坏而释放出伊立替康。胆固醇作为脂质体制剂中的一种重要组成物质具有调节磷脂双分子层流动性的作用，不同的胆固醇含量具有不同的体内药物释放特性。胆固醇含量高则磷脂双分子层流动性强，小分子药物容易泄漏，胆固醇含量低则磷脂双分子层的刚性强，药物不宜泄漏，但脂质体稳定性会稍差。

由于药物被包封于由磷脂双分子层组成的脂质体内部及磷脂双分子层中，因此载有药物的脂质体制剂进入人体后能够有效避免网状内皮系统的吞噬作用，延长了药物的体内半衰期。当药物从脂质体中释放出来之后，由于修饰剂mPEG-COOH的作用保护了药物分子不被破坏，延长了药物与肿瘤部位的作用时间，因此药物半衰期被进一步延长，从而起到了长效作用。加上肿瘤部位的血管渗透性较高，能够使更多的伊立替康集中于肿瘤部位，达到被动靶向作用，提高肿瘤治疗效果。

根据本发明，修饰后的伊立替康可通过被动方式或主动方式载入脂质体内部。以被动方式载药时，将药物和磷脂溶于有机溶剂中，之后进行水化、挤压并去除游离药物后即可得到脂质体制剂。以主动方式载药时，首先按照现有公开技术制备含有硫酸铵内水相的空白脂质体，去除外水相中的硫酸铵后，加入药物溶液，加热载药后即可得到脂质体制剂；硫酸铵的浓度范围为50-500mM。

根据本发明，硫酸铵在脂质体的制备时加入，但在制备过程中大部分被去除，因此只有很少量保存到最终制剂中。硫酸铵以硫酸根和铵根的形式存在于空白脂质体内部，当载药后铵根变成氨气挥发掉而硫酸根与药物结合。

根据不同的制备工艺，以上所述的脂质体制剂中还含有少量缓冲盐及渗透压调节剂。常用的缓冲盐包括枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液等；渗透压调节剂可以选择蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、氯化钠中的一种或多种；所述缓冲盐溶液的pH介于4.0-6.5之间，渗透压调节剂的浓度范围为10-100mM。

根据本发明，优选的方案之一，所述的伊立替康长循环脂质体制剂为注射液制剂，其中每1000ml制剂中含有mPEG-COOH修饰的伊立替康1～10g，氢化大豆磷脂酰胆碱3～50g，PEG-DSPE 0.1～5g，胆固醇0.6～10g。

本发明所述的伊立替康长循环脂质体制剂的制备方法，采用被动载药的方式制备伊立替康脂质体，步骤如下：

(1)将聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康交联，得到mPEG-COOH修饰的伊立替康；

(2)将mPEG-COOH修饰的伊立替康、HSPC、胆固醇、PEG-DSPE或GM-1溶解于有机溶剂中，充分溶解；

(3)配制pH为4.0-6.5的缓冲液，并将其加入至步骤(2)中制备的溶液中，充分水化，得到多室脂质体；

(4)采用高压均质、挤出、超声或冻融的方法将步骤(3)得到的多室脂质体的平均粒径降低至50-200纳米；

(5)去除未包封的游离药物，即可得到伊立替康长循环脂质体制剂。

本发明所述的伊立替康长循环脂质体制剂的制备方法，采用主动载药的方式制备伊立替康脂质体，步骤如下：

(1)将聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康交联，得到mPEG-COOH修饰的伊立替康；

(2)按配方称取HSPC、胆固醇、PEG-DSPE或GM-1溶于适量有机溶剂中，充分溶解；

(3)配制含有50-500mM浓度的硫酸铵的水溶液，并将其加入至步骤(2)中制备的溶液中，在40-70℃温度条件下搅拌反应10-60分钟，得到多室脂质体；

(4)采用高压均质、挤出、超声或冻融的方法将步骤(3)得到的多室脂质体的平均粒径降低至20-200纳米；通过超滤方式去除脂质体外水相中的硫酸铵，得到具有脂质体内外铵离子梯度的空白脂质体；

(5)将步骤(1)制备的mPEG-COOH修饰的伊立替康溶解于pH4.0-6.5的缓冲液中，与步骤(4)得到的空白脂质体共同加热，去除未包封的游离药物，即可得到伊立替康长循环脂质体制剂。

以上所述的伊立替康长循环脂质体的制备方法，所述聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康的交联可以通过现有技术来实现，如可以采用CN1852740B中描述的方法，首先将伊立替康与叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)进行酯化反应，三氟乙酸水解去除叔丁氧羰基后，将分子量为500～5000道尔顿道尔顿的mPEG-COOH与之进行交联，即可得到mPEG-COOH修饰的伊立替康。也可以不使用叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)，而直接将伊立替康分子与mPEG-COOH通过酯化反应交联在一起。

以上所述的伊立替康长循环脂质体的制备方法，所述有机溶剂可以选自乙醇、甲醇、氯仿或二氯甲烷；所述pH4.0-6.5的缓冲液选自枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。

上述方法制备的伊立替康长循环脂质体注射液制剂不可避免的还含有在制备过程中加入的少量残留的枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、乙醇、甲醇等。

根据本发明所述的伊立替康长循环脂质体的制备方法，优选方案之一：

(1)mPEG-COOH修饰的伊立替康的制备

按照摩尔比为1∶1的比例将伊立替康与叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)进行交联，得到叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康；使用三氟乙酸将上步中得到的叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康中的叔丁氧羰基水解并去除，得到甘氨酸-伊立替康；

按照摩尔比1∶1的比例称取甘氨酸-伊立替康和分子量为500～5000道尔顿的mPEG-COOH，酯化反应后得到mPEG-COOH修饰的伊立替康药物。

(2)称取上步中制备的mPEG-COOH修饰的伊立替康药物溶于无水乙醇中，加热溶解后，加入HSPC、胆固醇和PEG-DSPE，伊立替康与HSPC的质量比为1∶4～1∶6；溶解后，通过旋蒸方式去除大部分乙醇。

(3)配制含5-10％(w/v)蔗糖的pH为4.0-6.5的组氨酸缓冲液(组氨酸浓度为10-100mM)，将组氨酸溶液预热至40-60℃后加入至膜材及药物混合物中，40-60℃条件下搅拌反应10-40min，得到多室脂质体。

(4)分别通过孔径为200nm和80nm的聚碳酸酯滤膜挤出多次后，得到平均粒径为50-200nm的小单室脂质体。以现有公知的方法检测包封率大于80％。

(5)通过切向流超滤器对此脂质体进行超滤后去除大部分游离药物，得到包封率大于95％的脂质体制剂。以0.22um的除菌滤膜过滤除菌后分装，即得到伊立替康长循环脂质体注射液。

优选方案二：

(1)mPEG-COOH修饰的伊立替康的制备

按照摩尔比为1∶1的比例将伊立替康与分子量为500～5000道尔顿的mPEG-COOH溶解于适量冰的无水二氯甲烷中，称取适量二甲基氨基吡啶(DMAP)和二异丙基碳二酰亚胺(DCC)加入后，置于室温条件下搅拌反应过夜。固体通过砂芯漏斗过滤去除。溶液与分液漏斗中用0.1N的盐酸洗2-3次。无水硫酸镁干燥后旋蒸去除溶剂，产物进一步真空干燥。加入少量无水二氯甲烷复溶后，冰浴条件下加入无水乙醚进行结晶。将得到的固体进行过滤，干燥后即得到修饰后的伊立替康药物。

(2)称取HSPC、胆固醇及GM-1，质量比为5～7∶1∶0.3～0.7，以适量乙醇加热溶解。

(3)配制浓度为50-500mM的硫酸铵溶液并加入至(2)步的乙醇溶液中，50-70℃水浴水化30-60分钟，得到多室脂质体。

(4)高压均质降低平均粒径至50-200纳米。切向流超滤法除去外水相硫酸铵，得硫酸铵梯度空白脂质体。

(5)将(1)步修饰后得到的药物溶解于0.9％的氯化钠溶液中并与脂质体混合，其中伊立替康重量为氢化大豆磷脂1/6-1/4；30-60℃水浴保温载药20-40分钟，得到药物包封率大于80％的脂质体。通过切向流超滤器去除外水相中游离药物并置换外水相为pH4.0-6.5的组氨酸蔗糖溶液(蔗糖含量5-10％，w/v，组氨酸浓度10-100mM)。除菌过滤后分装，即得伊立替康长循环脂质体注射液。测定包封率为95％以上。

伊立替康为水溶性抗肿瘤药物，而水溶性药物采用被动载药的方法制备的脂质体其包封率和载药量均比较低。本发明采用将伊立替康进行修饰的方法，将聚乙二醇大分子与药物交联。交联后的药物不仅水溶性较好，而且在乙醇等有机溶剂中也能溶解。因此可以使用被动载药的方式将药物与磷脂一起溶解之后进行水化。令人意想不到的是，由此得到的脂质体包封率非常高，大于80％，药物不但能够包入脂质体内部，而且部分药物还可以嵌插在磷脂双分子层上。与主动载药方式相比，此工艺简单且容易放大，因此非常适合于工业化生产。

同时，本发明还发现，修饰后的伊立替康药物同样可以用目前公知的离子梯度法以主动载药的方式进行药物包封。与被动载药方式相比，两种载药工艺得到的脂质体的药物包封率、粒径及分布、载药量、放置稳定性以及药物体内半衰期均无明显差异。

与现有技术相比，本发明的主要优点包括：

(1)脂质体膜材中胆固醇及PEG-DSPE的含量较低，有利于药物的包封及体内释放。

(2)药物通过聚乙二醇修饰后，一方面能够通过被动方式载入脂质体内部，同时修饰后的药物在体内不容易被网状内皮系统吞噬、药物分子本身也更加稳定，能够大大延长体内半衰期。使得脂质体制剂能够更有效的靶向至肿瘤部位，从而更好的发挥抗肿瘤作用。

(3)药物经大分子聚乙二醇修饰后体内稳定性得到明显改善。由于伊立替康药物稳定性较差，在接近中性pH条件下内酯环很容易发生破坏而形成开环产物，此开环产物不具有抗肿瘤活性。伊立替康药物进入正常人体血液循环系统中后会有很大一部分药物以开环形式存在，导致药效学下降。经修饰后的药物稳定性大为提高，在中性pH条件下药物分子不会被破坏，不产生开环产物。

(4)经修饰后的药物制成脂质体制剂，通过动物药效学评价可以发现，抗肿瘤效果显著提高。与普通伊立替康注射液相比抑瘤率可以提高3倍以上，抑瘤率也明显高于未经修饰的伊立替康药物制成的脂质体制剂。

(5)药物毒副作用降低：由于药物经修饰后被包入脂质体内部，给药后与普通注射液相比改变了药物的组织分布和药代动力学性质，因此降低了普通注射液临床使用中常见的血液学毒性及胃肠道毒性等毒副作用。

附图说明

图1伊立替康长循环脂质体对人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤的抑制效果，横坐标表示时间(单位为天)，纵坐标表示相对肿瘤体积。六条曲线分别对应六组：A阴性对照组、B盐酸伊立替康注射液组、C伊立替康修饰产物组(按照实施例1方法1制备)、D伊立替康脂质体组1(通过硫酸铵梯度法直接将伊立替康包入脂质体内部，按照实施例2方法制备)、E伊立替康脂质体组2(通过直接水化法将修饰后的伊立替康药物包入脂质体内部，按照实施例3方法制备)和F伊立替康脂质体组3(通过离子梯度法将mPEG-COOH修饰的伊立替康包入脂质体中，按照实施例4方法制备)。

图2伊立替康长循环脂质体对裸鼠体重的影响。横坐标表示时间(单位为天)，纵坐标表示动物体重(单位为克)。六条曲线分别对应六组：A阴性对照组、B盐酸伊立替康注射液组、C伊立替康修饰产物组(按照实施例1方法1制备)、D伊立替康脂质体组1(通过硫酸铵梯度法直接将伊立替康包入脂质体内部，按照实施例2方法制备)、E伊立替康脂质体组2(通过直接水化法将修饰后的伊立替康药物包入脂质体内部，按照实施例3方法制备)和F伊立替康脂质体组3(通过离子梯度法将mPEG-COOH修饰的伊立替康包入脂质体中，按照实施例4方法制备)。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，但不限于实施范围。本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

包封率的计算：包封率＝[脂质体中包封的药物/(脂质体中包封的药物+脂质体外部游离的药物)]×100％，常采用葡聚糖凝胶、超速离心法、透析法等分离方法将溶液中游离药物和脂质体分离，分别测定，计算包封率。

多分散指数(PDI)：反应了脂质体粒径的分布情况，数值越小表明粒径分布越集中。实施例1、伊立替康分子的修饰

(1)方法1

称取100毫克盐酸伊立替康及59毫克叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)溶解于30毫升无水二氯甲烷中，充分溶解。称取21毫克二甲基氨基吡啶(DMAP)和7毫克二异丙基碳二酰亚胺(DCC)加入后，置于室温条件下搅拌反应过夜。固体通过砂芯漏斗过滤去除。溶液与分液漏斗中用0.1N的盐酸洗2-3次。硫酸钠干燥后旋蒸去除溶剂，产物进一步真空干燥，得到叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康。

称取上步反应产物100mg溶于7ml无水二氯甲烷中，加入0.53ml三氟乙酸，室温搅拌反应1h，旋转蒸发去除溶剂。粗产物溶于0.1ml甲醇中，加入25ml乙醚沉淀。混悬液在冰浴中搅拌30min。产物过滤收集，真空干燥，得到甘氨酸-伊立替康。

称取甘氨酸-伊立替康516mg和分子量为2000道尔顿的mPEG-COOH约2g溶解于100ml无水二氯甲烷中。称取60mg DMAP溶于无水二氯甲烷中，加入282mg DCC，混合后，室温条件下搅拌反应过夜。混合物通过砂芯漏斗过滤，溶剂通过旋蒸方式去除。加入500ml异丙醇，冰浴中沉淀。固体过滤，真空干燥，得到mPEG2000-COOH修饰的伊立替康药物。

(2)方法2

称取677mg伊立替康与分子量为5000道尔顿的mPEG-COOH约5g，溶解于100ml冰的无水二氯甲烷中，称取50mg二甲基氨基吡啶(DMAP))，量取40ul二异丙基碳二酰亚胺(DCC)加入上述二氯甲烷中后，置于室温条件下搅拌反应过夜。固体通过砂芯漏斗过滤去除。溶液与分液漏斗中用0.1N的盐酸洗2-3次。无水硫酸镁干燥后旋蒸去除溶剂，产物进一步真空干燥。加入5ml无水二氯甲烷复溶后，冰浴条件下加入500ml无水乙醚进行结晶。将得到的固体进行过滤，干燥后即得到mPEG5000-COOH修饰的伊立替康药物。

实施例2、硫酸铵梯度法制备伊立替康脂质体

空白脂质体的制备

称取氢化大豆卵磷脂1000克，mPEG2000-DSPE 100克，胆固醇300克溶于800ml无水乙醇中，60℃加热充分溶解。配制250mM的硫酸铵水溶液10L，加入上述膜材中，并于70℃水化20分钟。之后，将其加入微射流仪器中，以18000psi的压力循环5次，得到粒径100nm左右的空白脂质体。通过切向流超滤方法将脂质体外水相中的硫酸铵去除，并置换为pH6.0的蔗糖-组氨酸缓冲液。

载药过程

配制10mg/ml的盐酸伊立替康水溶液。取上述空白脂质体10ml，加入盐酸伊立替康水溶液20ml加入上述脂质体中，于50℃孵育30分钟后即可得到载药的盐酸伊立替康长循环脂质体。通过切向流超滤方法将脂质体外水相中未包封的游离药物去除，并置换为pH6.0的蔗糖-组氨酸缓冲液。

检测脂质体包封率为99％，平均粒径为110nm。

实施例3mPEG-COOH修饰的伊立替康长循环脂质体的制备

称取按照实施例1之方法1中制备的mPEG2000-COOH修饰的伊立替康100mg，溶解于10ml无水乙醇中。称取HSPC 2000mg、胆固醇200mg及mPEG2000-DSPE 100mg加入至上述乙醇溶液中，65℃条件下加热充分溶解。配制pH为5.0的蔗糖-组氨酸溶液20ml，65℃条件下加入至乙醇溶液中，充分搅拌水化30分钟。依次通过孔径为200nm和100nm的聚碳酸酯膜，高压挤出5次后得到脂质体。进一步通过切向流超滤的方法将脂质体外水相中游离的药物去除。

检测药物包封率为98.5％，平均粒径为125nm。

上述脂质体通过0.22um的除菌滤膜过滤后，无菌分装，即得到伊立替康长循环脂质体注射液。药物浓度为5mg/ml。

实施例4硫酸铵梯度法制备mPEG-COOH修饰的伊立替康长循环脂质体

空白脂质体的制备

称取氢化大豆卵磷脂1000克，mPEG2000-DSPE 50克，胆固醇150克溶于1000ml无水乙醇中，60℃加热充分溶解。配制250mMM的硫酸铵水溶液10L，加入上述膜材中，并于70℃水化20分钟。之后，将其加入微射流仪器中，以18000psi的压力循环5次，得到粒径100nm左右的空白脂质体。通过切向流超滤方法将脂质体外水相中的硫酸铵去除，并置换为pH6.0的蔗糖-组氨酸缓冲液。

载药过程

配制含伊立替康药物10mg/ml的mPEG2000-COOH修饰的伊立替康水溶液。取上述空白脂质体10ml，加入盐酸伊立替康水溶液20ml加入上述脂质体中，于60℃孵育30分钟后即可得到载药的盐酸伊立替康长循环脂质体。

通过切向流超滤方法将脂质体外水相中未包封的游离药物去除，并置换为pH6.0的蔗糖-组氨酸缓冲液。

检测脂质体包封率为97.5％，平均粒径为100nm。

实施例5mPEG-COOH修饰的伊立替康长循环脂质体的制备

称取按照实施例1的方法2中制备的mPEG5000-COOH修饰的伊立替康100mg，溶解于10ml无水乙醇中。称取HSPC 2000mg、胆固醇500mg及单唾液酸四己糖神经节苷脂100mg加入至上述乙醇溶液中，65℃条件下加热充分溶解。配制pH为5.5的蔗糖-组氨酸溶液20ml，65℃条件下加入至乙醇溶液中，充分搅拌水化30分钟。依次通过孔径为200nm和100nm的聚碳酸酯膜，高压挤出5次后得到脂质体。进一步通过切向流超滤的方法将脂质体外水相中游离的药物去除。

检测药物包封率为97.9％，平均粒径为115nm。

上述脂质体通过0.22um的除菌滤膜过滤后，无菌分装，即得到伊立替康长循环脂质体注射液。以伊立替康计，药物浓度为5mg/ml。

实施例6伊立替康脂质体的稳定性考察

将按照实施例2(样品1)、实施例3(样品2)和实施例4(样品3)方法制备的脂质体分别置于2-8℃条件和25℃条件下进行稳定性考察，结果如下表所示。

表1伊立替康脂质体在2-8℃下的稳定性考察

表2伊立替康脂质体在25℃下的稳定性考察

上述结果表明，按照本发明所制备的样品在稳定性较好，与按照现有常规硫酸铵梯度法制备的脂质体相比，稳定性方面无显著差异。

实施例7伊立替康脂质体的药效学研究

无菌条件下取处于生长良好的HT-29肿瘤组织，切割成2.0mm左右的均匀小块，用套管针给每只裸鼠右侧腋窝皮下接种一块，制备移植瘤模型，待肿瘤生长至约270mm³时(d0)按肿瘤体积大小随机分组，每组4只动物，分别为阴性对照组、盐酸伊立替康注射液组(齐鲁制药有限公司生产)、mPEG-COOH修饰的伊立替康组(按照实施例1方法1制备)、伊立替康脂质体组1(按照实施例2方法制备)、伊立替康脂质体组2(按照实施例3方法制备)和伊立替康脂质体组3(按照实施例4方法制备)共六组。各治疗组均采用q3d×4(每三天给药一次，连续给药4次)，iv(静脉注射)给予10mg/kg(以伊立替康计)的给药方案，阴性对照组采用同等方法等体积给予5％葡萄糖注射液。

于给药当天(d0)开始每周2～3次测量瘤径，考察各组肿瘤体积动态变化和相对肿瘤增殖率，试验过程以相对肿瘤生长抑制率(relative tumor inhibition，RTI)为动态观察的主要指标，并记录体重等一股状态。

经过q3d×4给药期及其后20d的停药期观察表明，给药结束时脂质体组1的RTI为33％，脂质体组2和脂质体组3的RTI分别为52.8％和50％，此后三组RTI均逐渐升高。试验终点时脂质体组1的RTI为45％，脂质体组2和脂质体组3的RTI分别为92.5％和89％。按照本发明制备的脂质体(脂质体组2和组3)明显抑制了肿瘤的生长，并使肿瘤消除。而按照常规硫酸铵法制备的脂质体组1虽然试验终点时也明显抑制了肿瘤的生长，但并未使肿瘤消除。同时也可以发现，按照本发明实施例1方法1制备的mPEG-COOH修饰的伊立替康对肿瘤生长也有一定抑制作用。具体试验结果见图1。

在对裸小鼠的体重影响方面，注射液组在末次给药后第12d(d21)降至最低点(-14.5％)。脂质体组1在第末次给药后第9天(d18)降至最低点(-6.1％)，此后恢复。脂质体组2在第2次给药时d3体重降至最低点(-1.2％)，此后恢复一直到观察期结束。脂质体组3在第3次给药时体重降至最低(-2.0％)，此后恢复。各组均无动物死亡。

试验结果表明，伊立替康脂质体各组均能抑制肿瘤生长，但按照本发明方法制备的脂质体抑瘤效果更加明显，且毒性更小。

Claims (10)

1.一种伊立替康长循环脂质体制剂，，其特征在于主要包含mPEG-COOH修饰的伊立替康药物、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和长循环膜材，所述mPEG-COOH修饰的伊立替康为伊立替康与mPEG-COOH按摩尔比1∶1的交联产物；所述长循环膜材为聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)或单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM-1)。

2.根据权利要求1所述的伊立替康长循环脂质体制剂，其特征在于所述的mPEG-COOH修饰的伊立替康中聚乙二醇(PEG)的分子量介于500～50000道尔顿之间，进一步优选聚乙二醇分子量为2000～5000道尔顿。

3.根据权利要求1所述的伊立替康长循环脂质体制剂，其特征在于以伊立替康计，mPEG-COOH修饰的伊立替康与氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)的质量比为1∶3～10，进一步优选1∶4～6。

4.根据权利要求1所述的伊立替康长循环脂质体制剂，其特征在于胆固醇与氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)的质量比为1∶3～10，进一步优选1∶5～7。

5.根据权利要求1所述的伊立替康长循环脂质体制剂，其特征在于聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)或单唾液酸四己糖神经节苷酯(GM-1)与氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)的质量比为1∶5～20，进一步优选1∶10～15。

6.根据权利要求1所述的伊立替康长循环脂质体制剂，其特征在于mPEG-COOH修饰的伊立替康是按以下方法1或方法2制得：

方法1：按摩尔比1∶1的比例将伊立替康与叔丁氧羰基甘氨酸(t-boc-glycine)进行交联，得到叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康；通过加入三氟乙酸将叔丁氧羰基甘氨酸-伊立替康转化为甘氨酸-伊立替康；按摩尔比1∶1的比例将甘氨酸-伊立替康和分子量为500～5000道尔顿的mPEG-COOH通过现有公知的方法进行交联，即可得到mPEG-COOH修饰的伊立替康药物；

方法2：按照摩尔比为1∶1的比例将伊立替康与分子量为500～5000道尔顿的mPEG-COOH溶解于适量冰的无水二氯甲烷中，称取适量二甲基氨基吡啶(DMAP)和二异丙基碳二酰亚胺(DCC)加入后，置于室温条件下搅拌反应过夜。所得固体通过砂芯漏斗过滤去除，溶液与分液漏斗中用0.1N的盐酸洗2-3次。无水硫酸镁干燥后旋蒸去除溶剂，产物进一步真空干燥。加入少量无水二氯甲烷复溶后，冰浴条件下加入无水乙醚进行结晶。将得到的固体进行过滤，干燥后即得到mPEG-COOH修饰的伊立替康药物。

7.根据权利要求1所述的伊立替康长循环脂质体制剂，其特征在于：所述的脂质体制剂为注射液制剂，其中每1000ml制剂中含有mPEG-COOH修饰的伊立替康1～10g，氢化大豆磷脂酰胆碱3～50g，PEG-DSPE 0.1～5g，胆固醇0.6～10g。

8.根据权利要求1-7任一项所述的伊立替康长循环脂质体制剂的制备方法，采用被动载药的方式制备伊立替康脂质体，步骤为：

(1)将聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康交联在一起，形成mPEG-COOH修饰的伊立替康；

(2)将mPEG-COOH修饰的伊立替康、HSPC、胆固醇、PEG-DSPE或GM-1溶解于有机溶剂中，充分溶解；

(3)配制pH为4.0-6.5的缓冲液，并将其加入至步骤(2)中制备的溶液中，充分水化，得到多室脂质体；

(4)采用高压均质、挤出、超声或冻融的方法将步骤(3)得到的多室脂质体的平均粒径降低至50-200纳米；

(5)去除未包封的游离药物，即可得到伊立替康长循环脂质体制剂。

9.根据权利要求6所述的伊立替康长循环脂质体制剂的制备方法，采用主动载药的方式制备伊立替康脂质体，步骤为：

(1)将聚乙二醇(mPEG-COOH)和伊立替康交联在一起，形成mPEG-COOH修饰的伊立替康；

(2)按配方称取HSPC、胆固醇、PEG-DSPE或GM-1溶于适量有机溶剂中，充分溶解；

(3)配制含有50-500mM浓度的硫酸铵的水溶液，并将其加入至步骤(2)中制备的溶液中，在40-70℃温度条件下搅拌反应10-60分钟，得到多室脂质体；

(4)采用高压均质、挤出、超声或冻融的方法将步骤(3)得到的多室脂质体的平均粒径降低至20-200纳米；通过超滤方式去除脂质体外水相中的硫酸铵，得到具有脂质体内外铵离子梯度的空白脂质体；

(5)将步骤(1)制备的mPEG-COOH修饰的伊立替康溶解于pH4.0-6.5的缓冲液中，与步骤(4)得到的空白脂质体共同加热，去除未包封的游离药物，即可得到伊立替康长循环脂质体制剂。

10.根据权利要求8或9所述的伊立替康长循环脂质体的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂可以选自乙醇、甲醇、氯仿、二氯甲烷；所述pH4.0-6.5的缓冲液选自枸橼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液。

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