CN102920692A

CN102920692A - (e)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用

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Publication number: CN102920692A
Application number: CN2012104132922A
Authority: CN
Inventors: 张卫东; 单磊; 黎丽; 李洪林; 苏娟; 曾华武; 黄瑾; 孙青龑; 沈云亨
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2012-10-25
Filing date: 2012-10-25
Publication date: 2013-02-13

Abstract

本发明提供了(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。所述(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯的结构式如下：

本发明将(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯进行动物药效试验，结果显示(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯明显抑制CIA的发病程度和发病率，并能降低CIA大鼠血浆和关节部位LTB₄水平，下调关节部位5-LOX mRNA和蛋白的表达量，减少关节部位炎症细胞的聚集和滑膜的破坏，特别是对骨损伤具有很好的保护作用。因此，可用于制备治疗类风湿关节炎的药物。本发明所述药物为以(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。包括片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。有较大的临床应用价值。

Description

(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用

技术领域

本发明涉及中药，具体涉及(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。

背景技术

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。该病好发于手、腕、足等小关节，易反复发作，并呈对称性分布。患病早期有关节红肿热痛和功能障碍表现，到达晚期时，关节可出现不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎缩，极易致残。从病理改变的角度来看，类风湿性关节炎是一种主要累及关节滑膜（以后可波及到关节软骨、骨组织、关节韧带和肌键），其次为浆膜、心、肺及眼等结缔组织的广泛性炎症性疾病。类风湿性关节炎的全身性表现除关节病变外，还有发热、疲乏无力、心包炎、皮下结节、胸膜炎、动脉炎、周围神经病变等。但是，类风湿性关节炎至今尚无特效疗法，仍处于对炎症及后遗症的治疗阶段。

紫葳科角蒿属植物Incarvillea L．全球共有15种，中国有11种，多分布于西南地区，此外东北、华北、西北等地区也有分布，本属5种植物常供药用，在民间主要用于治疗肝炎、菌痢等疾病。其化学成分主要有单萜生物碱、大环精胺类生物碱、环烯醚萜苷类、黄酮类、神经酰胺类、甾醇类和三萜类等成分等。其中角蒿和毛子草的化学成分和药理活性研究较多，其他均少有报道。

角蒿(Incarvillea sinensis)在中国北方和东北地区被用做“透骨草”,称谓“羊角透骨草”,具有消肿止痛之功效,主要用于治疗跌打损伤和风湿关节痛等症。

大花鸡肉参Incarvillea mairei var.grandiflora(Wehrhahn)Grierson,又名滇川角蒿，为紫葳科角蒿属(Incarvillea Juss)波罗花亚属(Incarvillea Subgen.Pteroscleris)植物，主要分布于中国云南(中甸、丽江)、四川、青海。生于高山草坡,海拔2500-3650米地带。根、叶入药,性甘、淡,温。用来治疗产后乳少,久病虚弱,头晕、贫血。本发明人对采自中国云南省香格里拉县的大花鸡肉参全草进行了系统的化学成分研究，以期明确其化学成分，发现大花鸡肉参全草的提取物(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯具有治疗类风湿性关节炎的良好活性，宜进一步研究开发新药。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究设计大花鸡肉参的提取物(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯在治疗类风湿性关节炎药物中的作用，设计制备治疗类风湿性关节炎药物。

本发明提供了(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。

(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯的结构式如下：

(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯

本发明所述(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯是通过下列方法制备得到的：

将干燥的大花鸡肉参（Incarvillea Mairei var.Grandiflora）干燥全草（云南省香格里拉县），用80%乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩至近干得总提取物浸膏。总提取物浸膏以水混悬,加2%HCl,调pH值至2~3，过滤，滤渣放置。滤液加氨水调pH值至11，用氯仿萃取，去除氯仿部位。剩余水液调pH值至7，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位及水部位。取乙酸乙酯部位经硅胶(200~300目)柱色谱，以石油醚：乙酸乙酯(100:1~5:1)和氯仿：甲醇(100:1~1:1)梯度洗脱及Sephadex LH-20柱色谱，薄层色谱跟踪检测，最后经液相色谱制备，得到(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯。

本发明将提取制得的的(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯进行动物药效试验，结果显示(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对CIA（Collagen-Induced Arthritis，胶原诱导的关节炎）有显注的疗效。

白三烯B₄(LTB₄)是一种促炎反应的脂质介质，由花生四烯酸（AA）经5-脂氧合酶（5-LOX）路径衍生而来,5-LOX是花生四烯酸代谢合成白三烯的关键酶。大量研究证明LTB₄是白细胞（尤其是中性粒细胞和T细胞）的一种强效的趋化因子和激动剂，能够召集中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎细胞，也可以激活中性粒细胞，增加血管渗透性。被认为是许多炎症和过敏性疾病的重要介质，也被认为与心血管疾病和癌症密切相关。在很多炎症疾病，例如炎症性肠病、慢性阻塞性肺病、牛皮癣、风湿性关节炎、哮喘等疾病中都观察到了LTB₄水平的提高。因此，通过抑制5-LOX的活性或表达，减少白三烯合成，有望对内风湿性关节炎发挥潜在的治疗作用。实验结果表明，(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对5-LOX酶活活有一定的抑制作用；在大鼠腹腔巨噬细胞细胞里，对AA代谢通路中5-LOX相关代谢产物LTB₄和5-HETE有较好的抑制作用；同时，在人全血系统中，(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对LTB₄水平呈很强的剂量依赖性抑制作用。在胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎体内药效模型中，(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯可较大程度降低关节炎大鼠血浆和关节部位LTB₄水平，降低关节部位5-LOX的表达量。从Ｈ&Ｅ染色切片中，我们观察到(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯可以减少关节部位炎症细胞的聚集和滑膜的破坏，特别是对骨损伤具有很好的保护作用

上述说明，(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯不但在纯酶，大鼠原代腹腔巨噬细胞细胞，人全血系统对5-LOX或者其相关代谢产物表现出不同程度的抑制活性，而且在胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎体内药效模型中，(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯可明显抑制CIA临床发病率和严重程度，CIA大鼠血浆及关节部位LTB₄的生成，降低关节部位5-LOX的表达，对关节部位炎症细胞的聚集和滑膜的破坏，特别是对骨损伤具有很好的保护作用。因此，(E)-2-(1- 羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对CIA有显注的疗效，可用于制备治疗类风湿关节炎的药物。

本发明所述(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯在制备防治类风湿性关节炎的药物为由(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。

所述药物组合物可以是片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。有较大的临床应用价值。

附图说明

图1(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对5-脂氧合酶活性影响图

纵坐标：(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯（HOEC）对5-LOX的百分抑制率；横坐标：HOEC的浓度（μM）

图2、(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对大鼠原代腹腔巨噬细胞花生四烯酸代谢通路中5-LOX相应产物LTB₄水平影响图

图3(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对大鼠原代腹腔巨噬细胞花生四烯酸代谢通路中5-LOX相应产物5-HETE水平影响图

图2、图3纵坐标分别表示大鼠腹腔巨噬细胞反应体系中LTB₄,5-HETE比内标PGB₂的相对量（10^-1）；横坐标：柱1：溶剂对照组，柱2：刺激组：加花生四烯酸（AA）50μM、A231875μM，柱3-8：药物处理组：加AA50μM、A231875μM、(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯（HOEC）1.6，6.2，13，25，50，100μM；柱9：阳性对照组：加AA50μM、A231875μM、齐留通1.6μM；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001（以下同）

图4(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对人全血中LTB₄水平影响图

纵坐标：人全血反应体系中LTB₄产生量（ng/ml）；柱1：溶剂对照组，柱2：刺激组A231875μM，柱3-8：药物刺激组：加A231875μM、(E)-2-(1-羟基4-环己酮)乙基咖啡酸酯（HOEC）6.1，3.2，1.6，0.8μM；柱9：阳性对照组：加A231875μM、齐留通10μM

图5(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对大鼠关节炎的临床评分

图6(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对大鼠关节炎的发病率影响图

图5、图6纵坐标分别表示关节炎临床评分及发病率（评分标准：0分:无红肿，1分:小趾关节红肿，2分:趾关节和足跖肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀，4分:包括踝关节在内的全部足爪肿胀）；

横坐标：第一次免疫后天数，点1-9分别表示第一次免疫后10，12，14，16，18，20，22，24，26天，（

正常组，

模型组，

阳性药组（zileuton），

(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯（HOEC）1mg/kg组，

HOEC0.2mg/kg组）

图7大鼠血浆中LTB₄含量测定结果图；

纵坐标：关节炎大鼠血浆中LTB₄产生量（pg/ml）；

横坐标：柱1：正常组，柱2：模型（胶原刺激）组，柱3，4：给药组：(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯（HOEC）1，0.2mg/kg，柱5：阳性对照组：齐留通10mg/kg

图8大鼠关节中LTB₄含量测定结果图；

纵坐标：关节炎大鼠关节中LTB₄产生量（pg/ml）；横坐标：柱1：正常组，柱2：模型（胶原刺激）组，柱3，4：给药组：(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯（HOEC）1，0.2mg/kg，柱5：阳性对照组：齐留通10mg/kg

图9大鼠关节中5-LOX mRNA（real-time PCR）测定结果图

纵坐标：关节炎大鼠关节中5-LOX mRNA表达量；横坐标：柱1：正常组，柱2：模型（胶原刺激）组，柱3，4：给药组：(E)-2-(1-羟基-4环己酮)乙基咖啡酸酯（HOEC）1、0.2mg/kg，柱5：阳性对照组：齐留通10mg/kg

图10大鼠关节中5-LOX表达结果及灰度扫描（western blot）图

上图关节炎大鼠关节中蛋白表达western扫描图，第一条：5-LOX蛋白表达图，第二条：β-actin蛋白表达图；

下图：5-LOX蛋白表达光密度扫描图，纵坐标：5-LOX比β-actin相对蛋白表达量；

横坐标：柱1：正常组，柱2：模型（胶原刺激）组，柱3，4：给药组：(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯1，0.2mg/kg，柱5：阳性对照组：齐留通10mg/kg；

图11大鼠关节部位照片（上）及H&E染色切片（下）代表图

实验大鼠关节照片（上）及H&E染色切片（下）代表图，从左至右分别表示正常组，模型（胶原刺激）组，给药组：(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯1mg/kg

图12大鼠关节部位Micro-CT扫描代表图

实验大鼠关节Micro-CT拍片图，从左至右分别表示正常组，模型（胶原刺激）组，给药组：(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯1mg/kg

具体实施方式

实施例1(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯的制备

将大花鸡肉参（Incarvillea Mairei var.Grandiflora）干燥全草（150kg），用80%乙醇加热回流提取3次，每次2小时(每次750升)，合并提取液，浓缩（减压真空浓缩）得总提取物浸膏（17kg）（(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯占浸膏总含量的0.0007%）。总提取物浸膏以水（15升）混悬,加2%HCl,调pH值至2~3，过滤，滤渣放置。滤液加氨水（28%）调pH值至11，用氯仿萃取(3次，每次15升)，去除氯仿部位。剩余水液用2%HCl调pH值至7，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位及水部位。将乙酸乙酯部位经硅胶(200~300目)柱色谱，以石油醚：乙酸乙酯(100:1~5:1)和氯仿：甲醇(100:1~1:1)梯度洗脱及Sephadex LH-20柱色谱，薄层色谱跟踪检测，最后经液相色谱制备，得到(E)-2-(1-羟基4-环己酮)乙基咖啡酸酯。（得到的化合物先采用质谱测定分子量320，分子式C₁₇H₂₀O₆，再进行核磁共振分析得到碳谱、氢谱以及二维谱数据，进行结构解析，与已知化合物(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯的数据一致）。

实施例2(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对5-LOX的影响

一、实验材料

5-脂氧酶及试剂盒：lipoxygenase inhibitor screening assaykit，固相萃取柱

二、仪器：酶标检测仪，恒温振荡器

三、实验过程

通过Lipoxygenase Inhibitor Screening AssayKit测定药物对纯化的5-LOX的抑制作用。96孔板内，空白组加入50μL缓冲液，100%酶活性组加入49.5μL酶液和0.5μL DMSO，药物组加入49.5μL酶液和0.5μL药物（实施例1制得的(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯）溶于DMSO（二甲基亚砜）；每孔加入5μL底物亚麻酸（亚麻酸278μg量溶于乙醇25μL，终浓度40mM,置于-20℃，用之前加入等体积的25μL，40mM氢氧化钾，随后用水稀释20倍用于反应），25℃震荡孵育5min，加入显色剂（色原体染料）50μL/孔，25℃震荡孵育5min终止反应显色，在酶标仪（Biotek Elx800）上检测波长505nm处的OD值；计算抑制率：

抑制率=（A100%酶活性-A药物）/A100%酶活性×100%

四、实验结果

(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯一定程度上抑制5-LOX的酶活，IC5034.6μM（如图1）

实施例3(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对SD大鼠腹腔巨噬细胞中花生四烯酸代谢的影响

一、实验材料

巯基乙酸盐肉汤培养基、花生四烯酸、钙离子载体A23187、前列腺素B2、动物：SD大鼠（雄性，160-200g）

二、仪器：QQQ质谱检测仪，恒温振荡器，离心机

三、实验过程：

SD大鼠腹腔注射巯基乙酸盐肉汤3mL/每只，用于刺激巨噬细胞的产生，3d后处死。腹腔注入10mL的磷酸缓冲盐,轻揉腹部，吸出含有腹腔巨噬细胞的PBS液至50mL离心管内，置于冰上，离心倒掉清液，破除红细胞，再加入1mLPBS离心。离心后倒去上清液，加入5mL PBS，细胞计数，按照浓度2×10⁷/mL或1×10⁷/mL进行稀释，并按总体积的1%分别加入0.2M CaCl₂和50mM的MgCl₂，分装1mL/管，所有管分为三组，按照实验设计第一组加入DMSO,第二组加入DMSO和钙离子载体A23187，第三组加入药物和A23187，然后在37℃下孵育5min，每管加入1μL浓度50mM的AA（花生四烯酸），随后加入1μL浓度5mM的A23187。孵育15min后每管加入2mL冰乙醇终止反应存于-20℃过夜。每管加入50μL1N盐酸，加入内标（前列腺素B₂）PGB₂200ng，震荡混匀，离心，取上清液至15mL玻璃管，加入灭菌水至10mL,混匀,用固相萃取小柱（Sep-pak，Waters）提取样品，用QQQ质谱检测仪测定。以PGB₂为内标，计算各组分的相对含量结果是以A23187模型组的相对结果来表示。

四、实验结果

(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯显著降低SD大鼠腹腔巨噬细胞中花生四烯酸代谢途径中5-LOX相应产物LTB₄和5-HETE的水平，IC₅₀分别约为8.0和9.7μM（如图2、3）。

实施例4(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对人全血系统中花生四烯酸代谢的影响

一、实验材料

人全血：购于上海市长海医院

试剂盒：Leukotriene B4EIA Kit

二、仪器：恒温振荡器，离心机

三、实验过程

代谢产物制备过程同上实施例3（但不加AA）。代谢产物中的白三烯B4（LTB₄）的含量通过Leukotriene B4EIAKit（白三烯B₄酶联免疫试剂盒）测定，实验依据酶联免疫吸附原理在事先包被了蛋白和老鼠的单克隆抗血清的96孔板上进行，通过Ellman’s（埃尔曼试剂）试剂显色，在酶联仪上检测波长410nm处的OD值（吸光度值）。用四参数曲线拟合计算LTB₄（白三烯B₄）浓度。

四、实验结果

(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯显著降低人全血中LTB₄的水平，IC₅₀为2.8μM（如图4）

实施例5(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯动物药效试验

一、实验材料

(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯：实施例1制得，牛II型胶原(CII)；不完全弗氏佐剂（CFA）；1ml旋口注射器；匀浆机；吲哚美辛片。

试剂盒：Leukotriene B4EIAKit

动物：SD大鼠，雄性，160克左右

二、仪器

酶标仪；高速台式离心机，倒置显微镜；Micro-CT仪器，超净台；电热恒温鼓风干燥箱；湿度CO₂培养箱，恒温水浴锅。

三、实验过程

抗原的乳化：使用匀浆器将(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯：实施例1制得，牛II型胶原(CII)；不完全弗氏佐剂（CFA）；吲哚美辛片各成分充分混匀成乳化状态，以滴入水中不扩散为宜。

模型的诱导：第0天，SD大鼠尾根部给予200μl/只乳化好的CⅡ抗原注射免疫；第7天，加强免疫

实验分组和给药方案：大鼠随机分为5组，每组16只，分别为正常组、CIA模型组、阳性对照组（齐留通，10mg·kg-1灌胃）、(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯组(1g·kg-1、0.2mg·kg-1)。于第一次免疫当天至第28天给药组连续给药，正常组和模型组给予等量的生理盐水。

多发性关节炎指数(arthritis index，AI)评分：造模后第10天开始定期观察并记录全身关节病变程度,每3天一次，具体评分标准如下：0分：无红肿;1分：小趾关节红肿；2分：趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4 分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的AI，每只动物最大为8分。

取材：

（1）取血：10%戊巴比妥麻醉（0.15ml/100g）后，腹主动脉取血并抗凝，3000rpm离心20min后取血血浆，-80℃冰冻保存备用。

（2）取关节：大鼠处死，取下踝关节，膝关节及其周围组织，迅速在液氮中研碎，匀浆并离心取上清，-80℃冰冻保存备用。

血浆及关节LTB₄含量测定：

血浆及关节匀浆上清中LTB₄的含量通过Leukotriene B₄EIAKit测定

组织病理学检查H&E（苏木精—伊红）染色：

踝关节，膝关节及其周围组织用10％甲醛固定12小时，用10%EDTA-2Na（200g EDTA-2Na溶于2000mlPBS中，用NaOH调节pH值至7.2-7.4）脱钙处理，每周换两次，脱钙两个月，不同浓度梯度乙醇逐级脱水，石蜡包埋，切片（4μm），HE染色，显微镜下观察大鼠踝关节，膝关节病理组织学的改变并摄片。

Micro-CT（微计算机断层扫描技术）分析：大鼠处死，取踝关节，膝关节及其周围组织用10％甲醛固定后用Micro-CT仪进行检测

实验结果

1(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对5-LOX酶活活有一定的抑制作用，IC₅₀为34.6μM（如图1）

2在大鼠腹腔巨噬细胞细胞里，对ＡＡ代谢通路中5-LOX相关代谢产物LTB₄和5-HETE有较好的抑制作用，IC₅₀分别为8.0和9.7μM（如图2,3）

3在人全血系统中，(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯对LTB₄水平呈很强的剂量依赖性抑制作用，IC₅₀为2.8μM（如图4）

4在胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎关节炎模型中，(E)-2-(1-羟基4-环己酮)乙基咖啡酸酯能降低大鼠的发病率和发病程度（如图5,6）

5(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯能下降低血浆及关节部位LTB₄水平，从而对CIA疾病具有保护作用（如图7，8，9）

6(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯能下调CIA大鼠关节中5-LOX mRNA和蛋白表达的含量（如图10）

7(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯能显著改善CIA大鼠肿胀程度。改善关节部位病理切片中炎症细胞的浸润，滑膜损伤，特别是对骨损伤有很明显的改善（如图11，12）

实施例6

制备方法：将(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯、乳糖和淀粉混合，用水均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重300mg，(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯含量为25mg。

实施例7

注射液：(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯 5g

葡萄糖 50g

制备方法：将(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯和葡萄糖溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入输液瓶中，每瓶含(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯5mg。

实施例8

注射用冻干粉针剂：(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯 10g

甘露醇 30g

制备方法：将(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯和甘露醇溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入西林瓶中，冻干，每支含(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯10mg。

Claims

1.(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用，其特征在于，所述(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯的结构式如下：

1(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯是通过下列方法制备得到的：

将干燥的大花鸡肉参Incarvillea Mairei var.Grandiflora干燥全草，用80%乙醇加热回流提取3次，每次2小时，合并提取液，浓缩至干得总提取物浸膏；总提取物浸膏以水混悬,加2%HCl,调pH值至2~3，过滤，滤渣放置；滤液加氨水调pH值至11，用氯仿萃取，去除氯仿部位；剩余水液调pH值至7，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位及水部位；取乙酸乙酯部位经硅胶200~300目柱色谱，以石油醚：乙酸乙酯100:1～5:1和氯仿：甲醇100:1~1:1梯度洗脱及Sephadex LH-20柱色谱，薄层色谱跟踪检测，最后经液相色谱制备，得到(E)-2-(1-羟基-4环己酮)乙基咖啡酸酯。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为由(E)-2-(1-羟基-4-环己酮)乙基咖啡酸酯作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物为片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂。