CN102901727A - 循环酶法乙醇浓度检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种循环酶法乙醇浓度检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0.5-1cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇氧化酶，乙醇脱氢酶，还原型辅酶I，辣根过氧化物酶，4-乙酰氧基氮杂环丁酮，苯胺类似物及呈色稳定剂，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。用该试剂盒进行检测乙醇浓度时简便卫生、速度快、灵敏度高、稳定性高，且该试剂盒易携带、尤其适合现场检测。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种循环酶法检测唾液中乙醇含量的试剂盒及其制备方法。
背景技术
近年来，酒后引起的刑事案件和交通事故案不断上升，2011年5月1日《中华人民共和国刑法修正案(八)》正式实施，醉酒驾驶作为危险驾驶罪被追究驾驶人刑事责任，有关酒驾的话题再次成为人们关注的焦点。
目前，许多国家都制定了血液中乙醇浓度与交通事故责任认定的关系，建立了多种能够检测血液中乙醇含量的方法，如GM/MS法等，虽然这些方法可以准确定量，但是存在着购买仪器价格昂贵，检测成本高，需专门培训，无法在案发现场快速检测等缺点。相比之下，唾液比血液容易获取，并且不存在交叉感染，因此基本不存在卫生安全隐患，同时唾液采集便捷，可避免采血导致的疼痛，属于无创诊断技术，因而人们更青睐于唾液乙醇检测。大量研究表明，人体在摄入乙醇后唾液和血液中的乙醇含量几乎相等，唾液/血液中乙醇的比值大约是1.07，因此检测唾液中的乙醇含量可以反映血液中的乙醇浓度。
目前市场上有很多便于携带的乙醇检测试剂条，但皆存在如下缺陷：(1)试剂反应后颜色会很快消褪；(2)反应灵敏度较低，且生成的产物堆积对反应起抑制作用，影响检测的准确度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种乙醇浓度检测试剂盒，用该试剂盒进行乙醇浓度检测时简便卫生、速度快、灵敏度高、稳定性高，且该试剂盒易携带、尤其适合现场检测。
一种乙醇浓度检测试剂盒，由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0.5-1cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇氧化酶、乙醇脱氢酶、辣根过氧化物酶、还原型辅酶I、4-乙酰氧基氮杂环丁酮(4-AAP)、苯胺类似物和呈色稳定剂，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。
根据唾液和血液中乙醇含量一致性的实验基础，该乙醇浓度检测试剂盒的反应原理为采用循环酶法进行乙醇浓度测定，具体为：在氧气的存在下，乙醇在乙醇氧化酶的作用下生成乙醛及过氧化氢，反应生成的乙醛在乙醇脱氢酶的作用下又能生成乙醇，形成循环反应，这个循环反应可以使检测信号明显放大，循环累计生成的过氧化氢在辣根过氧化物酶，4-AAP，苯胺类似物和呈色稳定剂的存在下显色，具体的反应原理如下：
H2O2+4-AAP+苯胺类似物→显色
在以上反应中，颜色深浅和唾液中乙醇的浓度成线性关系。将试剂条直接放入嘴中，或蘸取少量刚吐入器皿的唾液，等待1分钟后取出，挥干5分钟后，与标准比对卡进行比对，半定量测定唾液中的乙醇浓度。而根据人体唾液和血液中乙醇浓度一致性的实验基础，人体唾液中乙醇浓度即能代表人体血液中乙醇浓度。
本发明中所述呈色稳定剂为吐温20、吐温80、布里杰-35(Brij-35)、曲拉通100(曲拉通X-100)等非离子表面活性剂中的一种。
本发明中所述的苯胺类似物为N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐，N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺钠盐中的一种。
作为优选，所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的五个显色比对区。
本发明的突出实质性特点及显著进步主要表现在：
1)采用循环酶法，反应速度快、灵敏度高，且成本较低，并通过循环方式，消除了产物堆积对反应的抑制作用。
2)将酶和底物固定在试纸条上，使得质量更加稳定。
3)通过加入稳定剂，使反应后的色泽在避光封闭条件下稳定。
4)该试剂盒为试剂条，一人一条，非常卫生。由试剂条和标准比对卡组成的试剂盒携带方便，适合现场检测。
本发明还提供该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法，用该制备方法制得的试剂盒在保证检测精确和准确性的同时，成本低廉。
该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中：
试剂条的制备包括以下步骤：
(1)配制乙醇氧化酶、辣根过氧化物酶和乙醇脱氢酶液
将乙醇氧化酶溶于pH7.0-9.0的0.1-1M三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升的缓冲液中酶的总活性为100-200U，再加入100-200U/ml的辣根过氧化物酶，搅拌均匀，充分溶解后，再加入乙醇脱氢酶100-500U/ml。
(2)配制4-AAP和苯胺类似物溶液
将10-500mg4-AAP溶于50-500ml水中，再加入50-1000mg苯胺类似物，搅拌均匀，充分溶解后，再加入呈色稳定剂5-15g。
(3)配制还原型辅酶I溶液
将1-10g还原型辅酶I溶于50-500ml水中。
(4)酶和底物的固相化
将滤纸浸入(1)酶混合液中取出滤纸干燥；将(2)溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥；将(3)溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥。
(5)制备试剂条
把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0.5-1cm的长条，即成检测试剂条。
标准比对卡的制备步骤为：
将浓度为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的乙醇分别滴加到上述制备成的试纸条上，30℃热风、避光下干燥10min，用扫描仪输入电脑中，用photoshop软件吸管测量颜色信息(RGB模式)，根据每个浓度梯度颜色值用Photoshop6.0软件制成5个梯度(0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml)的标准比色卡，即成标准比对卡。
该试剂盒的制备方法按照上述循环酶法的原理进行制备，保证了试剂盒检测的灵敏度和准确性，所用试剂全部进行固相化于滤纸，故易于保存、稳定性好。另外，该试剂盒用常规的实验手段进行制备，且无需用到价格昂贵的仪器，故该试剂盒的制备方法成本低。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
实施例1：
本实施例乙醇浓度检测试剂盒由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0.5-1cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇氧化酶，乙醇脱氢酶，还原型辅酶I，辣根过氧化物酶，4-AAP，苯胺类似物及呈色稳定剂，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的五个显色比对区。
该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中：
试剂条的制备包括以下步骤：
(1)配制乙醇氧化酶、辣根过氧化物酶和乙醇脱氢酶液
将乙醇氧化酶溶于pH7.0的0.1M三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升的缓冲液中酶的总活性为100U，再加入150U/ml的辣根过氧化物酶，搅拌均匀，充分溶解后，再加入乙醇脱氢酶200U/ml。
(2)配制4-AAP和苯胺类似物溶液
将10mg4-AAP溶于50ml水中，再加入100mg N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，搅拌均匀，充分溶解后，再加入5g吐温80。
(3)配制还原型辅酶I溶液
将2g辅酶溶于50ml水中。
(4)酶和底物的固相化
将滤纸浸入(1)酶混合液中，取出滤纸在30℃热风、避光下干燥30min；将(2)溶液均匀地滴在已干燥的滤纸上，再经30℃热风、避光下干燥30min；将(3)溶液均匀地滴在已干燥的滤纸上，再经30℃热风、避光下干燥30min；。
(5)制备试纸条
把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0.5cm的长条，即制成检测试剂条。
标准比对卡的制备步骤为：将浓度为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的乙醇分别滴加到上述制备成的试纸条上，30℃热风、避光下干燥10min，用扫描仪输入电脑中，用photoshop软件吸管测量颜色信息(RGB模式)，根据每个浓度梯度颜色值用Photoshop6.0软件制成5个梯度(0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml)的标准比色卡，即成标准比对卡。
实施例2：
本实施例乙醇浓度检测试剂盒由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0.5-1cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇氧化酶，乙醇脱氢酶，还原型辅酶I，辣根过氧化物酶，4-AAP，苯胺类似物及呈色稳定剂，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的五个显色比对区。
该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中：
试剂条的制备包括以下步骤：
(1)配制乙醇氧化酶、辣根过氧化物酶和乙醇脱氢酶液
将乙醇氧化酶溶于pH8.0的0.2M三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升的缓冲液中酶的总活性为200U，再加入100U/ml的辣根过氧化物酶，搅拌均匀，充分溶解后，再加入乙醇脱氢酶100U/ml。
(2)配制4-AAP和苯胺类似物溶液
将100mg4-AAP溶于100ml水中，再加入200mg N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，搅拌均匀，充分溶解后，再加入10g Brij-35。
(3)配制还原型辅酶I溶液
将3g辅酶溶于100ml水中。
(4)酶和底物的固相化
将滤纸浸入(1)酶混合液中，取出滤纸在30℃热风、避光下干燥60min；将(2)溶液均匀地滴在已干燥的滤纸上，再经30℃热风、避光下干燥60min；将(3)溶液均匀地滴在已干燥的滤纸上，再经30℃热风、避光下干燥60min；。
(5)制备试纸条
把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0.5cm的长条，即制成检测试剂条。
标准比对卡的制备步骤同实施例1。
实施例3：
本实施例乙醇浓度检测试剂盒由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0.5-1cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇氧化酶，乙醇脱氢酶，还原型辅酶I，辣根过氧化物酶，4-AAP，苯胺类似物及呈色稳定剂，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的五个显色比对区。
该乙醇浓度检测试剂盒的制备方法包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中：
试剂条的制备包括以下步骤：
(1)配制乙醇氧化酶、辣根过氧化物酶和乙醇脱氢酶液
将乙醇氧化酶溶于pH9.0的1M三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升的缓冲液中酶的总活性为200U，再加入200U/ml的辣根过氧化物酶，搅拌均匀，充分溶解后，再加入乙醇脱氢酶500U/ml。
(2)配制4-AAP和苯胺类似物溶液
将500mg4-AAP溶于100ml水中，再加入1000mg N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺钠盐)，搅拌均匀，充分溶解后，再加入15g曲拉通100。
(3)配制还原型辅酶I溶液
将10g辅酶溶于200ml水中。
(4)酶和底物的固相化
将滤纸浸入(1)酶混合液中，取出滤纸在30℃热风、避光下干燥60min；将(2)溶液均匀地滴在已干燥的滤纸上，再经30℃热风、避光下干燥60min；将(3)溶液均匀地滴在已干燥的滤纸上，再经30℃热风、避光下干燥60min；。
(5)制备试纸条
把干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0.5cm的长条，即制成检测试剂条。
标准比对卡的制备步骤同实施例1。
实施例所用的原料，除另有说明外，均为市售工业品。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (5)
1.一种乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于：由试剂条和标准比对卡组成，其中试剂条为宽0.5-1cm的滤纸条，滤纸条上含有固相化的乙醇氧化酶、乙醇脱氢酶、辣根过氧化物酶、还原型辅酶I、4-乙酰氧基氮杂环丁酮、苯胺类似物和呈色稳定剂，标准比对卡包括不同乙醇浓度的显色比对区。
2.根据权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于：所述苯胺类似物为N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐(二水合物)，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐，N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺钠盐，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺钠盐中的一种。
3.根据权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于：所述呈色稳定剂为吐温20、吐温80、布里杰-35(Brij-35)、曲拉通100(曲拉通X-100)等非离子表面活性剂中的一种。
4.根据权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒，其特征在于：所述标准比对卡包括乙醇浓度分别为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的五个显色比对区。
5.权利要求1所述的乙醇浓度检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括试剂条的制备和标准比对卡的制备，其中：
试剂条的制备包括以下步骤：
(1)配制乙醇氧化酶、辣根过氧化物酶和乙醇脱氢酶液：将乙醇氧化酶溶于pH7.0-9.0的0.1-1M三羟甲基氨基缓冲液中，使每毫升的缓冲液中酶的总活性为100-200U，再加入100-200U/ml的辣根过氧化物酶，搅拌均匀，充分溶解后，再加入乙醇脱氢酶100-500U/ml。
(2)配制4-AAP和苯胺类似物溶液：将10-500mg4-AAP溶于50-500ml水中，再加入50-1000mg苯胺类似物，搅拌均匀，充分溶解后，再加入呈色稳定剂5-15g。
(3)配制还原型辅酶I溶液：将1-10g还原型辅酶I溶于50-500ml水中。
(4)酶和底物的固相化：将滤纸浸入(1)酶混合液中取出滤纸干燥；将(2)溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥；将(3)溶液滴在已干燥的滤纸上，干燥。
(5)制备试剂条：将步骤(4)中干燥后的滤纸贴在单面含胶的白色聚酯板的前端，用切纸机切成宽0.5-1cm的长条，即成检测试剂条；
标准比对卡的制备步骤为：
将浓度为0mg/ml、0.2mg/ml、0.8mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml的乙醇分别滴加到制备成的试纸条上，30℃热风、避光下干燥10min，用扫描仪输入电脑中，用photoshop软件吸管测量颜色信息，根据每个浓度梯度颜色值用Photoshop6.0软件制成5个梯度的标准比色卡，即成标准比对卡。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20130130 |