CN102899325A

CN102899325A - 一种针对trappc4基因靶点的小干扰rna及用途

Info

Publication number: CN102899325A
Application number: CN2011102171862A
Authority: CN
Inventors: 赵树靓; 房静远
Original assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Current assignee: Renji Hospital Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2011-07-29
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2031-07-29
Also published as: CN102899325B

Abstract

本发明提供了一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA，其正义链的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，反义链的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。本发明还提供了上述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。本发明还提供了一种siRNA的靶向分子运输蛋白微粒复合体及其在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。本发明通过实验证明将针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA转染人大肠癌细胞，使其中的TRAPPC4表达沉默，进而可以抑制ERK-MAPK信号通路的激活，从而抑制大肠癌细胞的增殖，诱导其凋亡，因此可用于大肠癌的治疗。

Description

一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA及用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种小干扰RNA，特别是一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA及用途。

背景技术

目前大肠癌的治疗主要采用外科治疗、化疗和放射治疗，但是可以接受手术者比例较小，而后两者是副作用大。RNA干扰(RNA interference，RNAi)也称转录后基因静默(post transcriptional gene silencing，PTGS)，是小片段双链RNA(20-30bp)(small interfering RNA，siRNA)分子阻断或降低同源基因表达的现象，可涉及到生命各阶段基因表达的关闭和调控。目前RNAi已成为一门独立的技术，作用靶点特异性高、对细胞毒性小、相对安全，主要用于反向功能基因组学研究和特异性基因治疗研究，其临床应用也已经收到越来越广泛的关注。而选择特异有效的靶点，是其疗效的关键。

大肠癌是世界范围内发病率和死亡率均排第三位的肿瘤，随着国人饮食习惯的西化，我国大肠癌的发病率呈上升趋势，目前已占恶性肿瘤发病率的四到六位。鉴于多数大肠癌被发现时已届中晚期，疗效往往不尽人意，故大肠癌的预防至关重要。目前的内镜筛查手段，和现有的药物(COX-抑制剂等)虽然有一定的效果，但医疗条件、药物副作用等原因使其使用受限。因此，有必要而且有可能在深入研究大肠发生机制的基础上发现新的防治靶点，并进行特异靶向性治疗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA及用途，所述的这种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA及用途要解决现有技术中的外科治疗、化疗和放疗手段治疗大肠癌效果不佳的技术问题。

本发明提供了一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA(本发明的名称为TRAPPC4-siRNA.)，其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了上述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。

本发明还提供了上述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因。

进一步的，上述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因，其核苷酸序列分别为5′-ccggtgtccattcgatttg-3′(SEQ ID NO：4)，或5′-caaatcgaat ggacaccgg-3′(SEQ ID NO：5)。

本发明还提供了上述的编码基因在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。

本发明的还提供了一种抑制大肠癌细胞ERK-MAPK信号通路的方法，是将上述的这种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA转染大肠癌细胞，使TRAPPC4的表达沉默，ERK-MAPK信号通路的激活得到抑制。

本发明还提供了一种siRNA的靶向分子运输蛋白微粒复合体(Trafficking protein particle complex，TRAPPC4)，其碱基序列如SEQ IDNO：3所示。

本发明还提供了上述的这种siRNA的靶向分子运输蛋白微粒复合体在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。

TRAPPC4，又称Synbindin或HSPC172，属于TRAPPC家族一员。后者是一种大型的多蛋白复合体，涉及内质网-高尔基体以及高尔基体内的运输。目前发现，TRAPPC4存在于树突，突触，高尔基体，内质网等细胞结构内。它能和多配体聚糖的羟基末端结合，参与蛋白的运输。在海马神经元中TRAPPC4涉及突触膜的运输从而调节树突棘的形成。也有研究发现其在造血细胞中的表达有异常，但是关于其在肿瘤中的作用几乎未见报道。

本发明还通过实验证明将本发明TRAPPC4-siRNA转染人大肠癌细胞，使其中的TRAPPC4基因表达沉默，进而可以抑制ERK-MAPK信号通路的激活，从而抑制大肠癌细胞的增殖，诱导其凋亡。因此可以将TRAPPC4作为分子靶点，将TRAPPC4-siRNA的编码基因作为活性成分制备成药物，用于大肠癌的治疗。

本发明和已有技术相比，其技术效果是显著的。本发明可以有效且特异的抑制大肠癌细胞的增殖，诱导大肠癌细胞的凋亡，从而起到肿瘤治疗的作用。

附图说明

图1是免疫共沉淀实验，用于证明TRAPPC4与ERK2的相互结合。

图2是GST Pull-down实验，用于证明TRAPPC4与ERK2的相互结合。

图3组织芯片结果显示TRAPPC4在正常大肠上皮(a)、大肠腺瘤(b)、大肠腺癌(c)中的表达情况；d为相应的统计图。

图4组织芯片结果显示ERK1/2在正常大肠上皮(a)、大肠腺瘤(b)、大肠腺癌(c)中的表达情况；d为相应的统计图。

图5组织芯片结果显示pERK1/2在正常大肠上皮(a)、大肠腺瘤(b)、大肠腺癌(c)中的表达情况；d为相应的统计图。

图6显示了TRAPPC4-siRNA干扰大肠癌细胞株SW1116 48小时后，a)总ERK1/2表达没有显著改变而pERK1/2表达水平明显减少；b)凋亡相关蛋白；c)TRAPPC4蛋白表达水平明显下降。

图7显示了用CCK-8方法检测细胞增殖情况，发现24、48、72、96小时，细胞增殖能力降低，在第48小时达到最低点。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用小干扰RNA由上海吉玛生物技术公司合成。

实施例1 TRAPPC4与ERK2的相互作用及其在大肠癌中的特异表达

1 TRAPPC4与ERK2相互作用的发现与验证

1.1 TRAPPC4与ERK2相互作用的发现

用PCR方法扩增ERK2基因(引物及反应条件见附)；酶切及胶回收后行连接反应得到重组质粒，转化入感受态细胞，接菌培养后抽提质粒，采用膜检的方法，检测Laz基因表达情况，即ERK2基因的自激活检测。用400ug人Hela cDNA酵母双杂交文库质粒DNA转化已含有pGB-ERK2的Y190酵母感受态细胞，涂布SC/-Trp-Leu-His+3AT的筛选平板。同时用不同的浓度梯度1∶1000，1∶10000，1∶100000各涂布100μl菌液于3个SC/-Trp-Leu培养平板，作为计数板以检测转化效率，生长60h后计数。将转化平板在30℃培养60h后，用绒布对所有筛选平板进行影印清除，至完全看不到菌落为止。再将平板放入30℃培养60h以上，挑取长出的阳性克隆转入SC/-Trp-Leu板上划线培养18h。将平板重新影印到SC/-Trp-Leu-His+3AT平板上以检测报告基因His3的表达与否。挑取该平板上长出的菌体做膜检，检测报告基因LacZ的表达情况。将显色变蓝的克隆送测序，将测序结果进行Blast比对，发现TRAPPC4基因。

PCR引物：

ERK2-F：

5’-GTA TCG CCG GCC AAT CCG GCC ATG GCG GCG GCG GCG GCG GC-3’(SEQ ID NO：6)

ERK2-R：

5’-CGC TGC AGG GCC TCT AAG GCC TTA AGA TCT GTA TCC TGG CTG GCTGGA ATC TAG C-3’(SEQ ID NO：7)

.PCR反应条件

表1.PCR扩增ERK2基因反应程序

2 TRAPPC4与ERK2存在直接相互作用

2.1 免疫共沉淀法验证

用PCR法扩增TRAPPC4基因(引物及反应条件见下)，用酶切法将ERK2基因从已构建的pGB-ERK2载体(见酵母菌双杂交部分)中扩增出来，通过连接反应将TRAPPC4基因构建入pCDEF-Myc质粒，并构建入pCDEF-Flag质粒中。并行重组质粒测序鉴定。送生工生物工程公司测序。将pCDEF-Myc-TRAPPC4，pCDEF-Flag-ERK2利用脂质体转染方法共转染293T细胞。按转染试剂盒使用方法制备含4μg质粒DNA转染复合物。转染48小时后收集细胞。提取总蛋白行Western blotting法检测。结果如图1所示。说明TRAPPC4与ERK2存在直接相互作用。

●引物：

TRAPPC4_f1：

5’-AAGAGGATCTGAAGGCCAATCCGGCCATGGCGATTTTTAGTGTGTATGTGGTG-3’(SEQ ID NO：8)

TRAPPC4_r1：

5’-ATCTCGAGGAATTCGGCCTCTAAGGCCCTATGACCCAGGTCCAAAAGTTCCAGC-3’(SEQ ID NO：9)

反应体系

表5.PCR扩增TRAPPC4基因反应体系

2.2 Glutathione S transferase(GST)Pull-down实验验证

TRAPPC4以His-tag fusion protein表达纯化，采用pET-28a-1，pGEX-5x-1质粒(上海市消化疾病研究所保存)构建pET-28a-TRAPPC4载体，ERK2片段直接从pCDEF-ERK2-flag(见免疫共沉淀部分)中用sfiI酶切回收。以GST-tag fusion protein表达纯化，构建pGEX-5x-ERK2载体。表达和纯化TRAPPC4-6his fusion protein，ERK2-GST fusion蛋白，同时表达和纯化了GST作为对照(图2b)。行GST pull down和western blot验证(图2a)。结果显示TRAPPC4和ERK2能在体外相互结合。

TRAPPC4引物设计如下：

TRAPPC4_f2：5’-TTGGCCATTACGGCCATGGCGATTTTTAGTGTGTATG-3’(SEQ ID NO：10)

TRAPRC4_r2：5’-TTGGCCGAGGCGGCCCTATGACCCAGGTCCAA-3’(SEQ IDNO：11)

3 TRAPPC4在大肠癌发生中的特异性表达及其与ERK1/2表达相关。

收集原发性大肠癌存档病例共40例，内镜下腺瘤切除术并经病理证实存在LIN(Low grade intraepithelial Neoplasia，低级别上皮内瘤变)及HIN(High grade intraepithelial Neoplasia，高级别上皮内瘤变)的存档病例共44例，按常规方法制备组织芯片，使用特异性抗体(anti-TRAPPC4抗体购自美国Abcam公司，)及IHC检测用试剂盒(VectorLaboratories，Ltd.，England)按说明书方法进行免疫组织化学检测。SABC法检测阳性产物呈蓝色或紫蓝色，阴性产物为红色或粉红色。为便于定量分析，参照Rojo F等的研究方法，根据10个高倍视野下(400×)阳性细胞的比例和染色强度进行组织学评分(Histo score，Hscore)。染色强度评分标准如下：0，未见阳性细胞；1，与基质细胞相比较呈弱阳性；2，中度阳性；3，强阳性。将阳性细胞的比例与染色强度评分的乘积作为最终的Hscore，为0～300。将Hscore＞20者判定为阳性表达。组织芯片的结果显示：TRAPPC4在正常上皮中分布于胞浆，大肠腺瘤，腺癌中则弥散于胞浆和胞核；各组间总体阳性率并无显著区别，但核阳性率按正常上皮、腺瘤、腺癌顺序增加(图3)，这种变化与pERK1/2，ERK1/2的变化存在相关性(图4和图5)。从而说明TRAPPC4在大肠癌中存在特异性表达，并且这种表达而与pERK1/2、ERK1/2的表达相关。

实施例3 TRAPPC4-siRNA对人大肠癌细胞SW1116中TRAPPC4表达的抑制。

根据人运输蛋白微粒复合体4(TRAPPC4)NM 016146.3序列(SEQ ID NO：3)设计模板链与编码链(设计原则见附)，经过筛选，获得干扰效果最为显著的本发明的TRAPPC4干扰片段序列如下：

5’-CCGGUGUCCAUUCGAUUUGTT-3’(SEQ ID NO：1)

5’-CAAAUCGAAUGGACACCGGTT-3’(SEQ ID NO：2)

附：siRNA设计原则

1.siRNA双链末端的热稳定性，即

的值

2.siRNA双链的反义链末端最后两个碱基的选择，即：20，21位置碱基的选择

3.siRNA双链的反义链第1和第19位置的碱基的选择

4.siRNA反义链的G+C的含量

5.siRNA反义链的第2位和第18位置的碱基的选择

6.siRNA反义链的第2位到17位局部稳定性的选择

7.siRNA双链的正义链为基准，整个双链稳定性的分布为，5’末端稳定性强，双链中间段，以断裂位点周围为例，稳定性较弱，3’段稳定性较弱

将TRAPPC4-siRNA干扰片段以DharmaFECT^TM转染人大肠癌细胞株SW1116，并以不影响蛋白表达的Negtive siRNA为阴性对照(吉玛生物技术公司合成)(细胞培养方法及siRNA转染方法详见附)。48小时候收集各组细胞提取总蛋白，用抗TRAPPC4的特异性抗体(购自Abgent生物技术公司)做免疫印迹实验，以GAPDH为内参，结果如图6c所示。结果表明，转染TRAPPC4-siRNA的人结肠癌细胞株SW1116比对照组TRAPPC4蛋白水平明显降低。

附：细胞培养及siRNA转染

1)SW1116细胞的培养基为RPMI1640MEDIUM完全培养液(10％胎牛血清，100U/ml青/链霉素)，培养条件为95％空气、5％CO2、95％湿度、37℃恒温。

2)siRNA转染

①以0.125％胰蛋白酶消化HCT116细胞成单细胞悬液，接种于直径6cm的细胞培养皿，培养20h，使细胞融合度达到50％。

②取20uM siRNA 80μl，加入720μl 1×SiRNA Buffer，800μl无血清培养基，共1600μl，混匀。室温放置5分钟。

③以同上方法溶解阴性对照序列。

④取DharmaFECT^TM 4 192μl(16×12)，加入4608μl(384×8)无血清培养基，共4800μl，混匀。室温放置5分钟。

⑤将DharmaFECT^TM 4与siRNA等体积混合，室温放置20分钟。

⑥弃培养皿内的液体，以PBS洗涤后加入3.2ml含血清的完全培养液，800μl DharmaFECT^TM 4与siRNA的混合物，使siRNA终浓度为100nM。溶剂对照组(Vehicle Control，VC)只加DharmaFECT^TM 4，终浓度与RNA干扰组相同(4μl/ml)。

⑦按常规条件继续培养，在相应的时间点收集细胞检测蛋白。

实施例4 TRAPPC4-siRNA对人大肠癌细胞SW1116中ERK-MAPK信号通路活性的抑制

将TRAPPC4-siRNA干扰片段以DharmaFECT^TM转染人大肠癌细胞SW1116，并以不影响蛋白表达的Negtive siRNA为阴性对照(吉玛生物技术公司合成)。48小时候收集各组细胞提取总蛋白，用抗ERK1/2及磷酸化ERK1/2(pERK1/2)的特异性抗体(购自Cell signaling公司)做免疫印迹实验，以GAPDH为内参，结果如图6a所示。结果表明，转染TRAPPC4-siRNA48小时后，作为ERK-MAPK信号通路的关键蛋白的ERK1/2，其总表达量没有明显变化，而磷酸化ERK1/2的表达明显下降，后者表示活化的ERK1/2的水平，说明其活性被明显抑制。

实施例5 TRAPPC4-siRNA诱导人大肠癌细胞SW1116凋亡

将TRAPPC4-siRNA干扰片段以DharmaFECT^TM转染人大肠癌细胞SW1116，并以不影响蛋白表达的Negtive siRNA为阴性对照(吉玛生物技术公司合成)。48小时候收集各组细胞提取总蛋白，用抗TRAPPC4的特异性抗体(购自Cell signaling公司)做免疫印迹实验，以GAPDH为内参，结果如图6b所示。结果表明，转染TRAPPC4-siRNA48小时后凋亡抑制因子Caspase 3出现明显减少，而其剪接体明显增加，说明细胞出现显著凋亡现象。

实施例6 TRAPPC4-siRNA抑制人大肠癌细胞SW1116增殖

SW1116细胞按照siRNA瞬时转染方法，转染后24h、48h、72h，96h进行Cell Counting Kit(CCK)-8检测(检测方法见附)。发现各个时间点细胞增殖能力均降低，且在48小时达到最低点，结果如图7所示。该结果表明，转染TRAPPC4-siRNA能抑制大肠癌细胞株SW1116的增殖。

附：CCK-8方法检测细胞增殖情况

1)接种细胞：用含10％小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔5000个

细胞接种到96孔板，每孔体积100μl.

2)分组：

瞬时转染TRAPPC4siRNA组

瞬时转染阴性对照siRNA组

细胞培养：SW1116细胞按照siRNA瞬时转染方法，转染后24h、48h、72h进行CCK-8检测

3)呈色：每孔加CCK-8溶液10μl，孵育1～2小时，小心转移培养上清液入另一新的96孔板中。

4)比色：选择450nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值

5)结果计算：

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院

<120> 一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA及用途

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccggugucca uucgauuugt t 21

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

caaaucgaau ggacaccggt t 21

<210> 3

<211> 983

<212> DNA

<213> TRAPPC4

<400> 3

accagtttcc gagcggcaag gcagcgatgg cgatttttag tgtgtatgtg gtgaacaaag 60

ctggcggctt gatttaccag ttggacagct acgcgccacg ggctgaggct gagaaaactt 120

tcagttatcc gctggatctg ctgctcaagc tacacgatga gcgtgtgttg gttgctttcg 180

gccagcggga cggcatccga gtgggtcatg cagtgctggc catcaatggc atggacgtga 240

atggcaggta cacggccgac gggaaagagg tgctggagta tctgggtaac cctgctaatt 300

acccggtgtc cattcgattt ggccggcccc gcctcacttc taatgagaag cttatgctgg 360

cctccatgtt tcactcgctc tttgccatcg gctcccagct gtctcctgaa cagggaagct 420

caggcattga gatgctggag acagacacat tcaaattgca ctgctaccag acactgacag 480

ggatcaagtt tgtggttcta gcagatccta ggcaagctgg aatagattct cttctccgaa 540

agatttatga gatttactca gactttgccc tcaagaatcc attctattcc ttagaaatgc 600

ctatcaggtg tgagctcttt gaccagaacc tgaagctagc tctggaggtg gcagagaagg 660

ctggaacttt tggacctggg tcataggctg aacctgttat ggacccccaa attctgagag 720

ttcctgcaac aagaatactg ctgttgacac tccagtggaa atcccagcag ccttgttagt 780

gcacttgaaa gtgggagaat gctgaccctg atgacttgta ctgattcctg agccttaaca 840

ctgtgctctt tccttctgta tatgccatgg tcttactttc caactctgta cagatttatt 900

tatggaggag ctaggtccat aaatgttgta ataaatattc ctttgatctt gaaaaaaaaa 960

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 983

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccggtgtcca ttcgatttg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caaatcgaat ggacaccgg 19

<210> 6

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtatcgccgg ccaatccggc catggcggcg gcggcggcgg c 41

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgctgcaggg cctctaaggc cttaagatct gtatcctggc tggctggaat ctagc 55

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagaggatct gaaggccaat ccggccatgg cgatttttag tgtgtatgtg gtg 53

<210> 9

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atctcgagga attcggcctc taaggcccta tgacccaggt ccaaaagttc cagc 54

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ttggccatta cggccatggc gatttttagt gtgtatg 37

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ttggccgagg cggccctatg acccaggtcc aa 32

Claims

1.一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA ，其特征在于：其正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。

3.权利要求1所述的一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因。

4.如权利要求3所述的一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5所示。

5.权利要求3或4所述的一种针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA的编码基因在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。

6.一种抑制大肠癌细胞ERK-MAPK信号通路的方法，其特征在于：将权利要求1所述的针对TRAPPC4基因靶点的小干扰RNA转染大肠癌细胞，使TRAPPC4的表达沉默，ERK-MAPK信号通路的激活得到抑制。

7.一种siRNA的靶向分子运输蛋白微粒复合体，其特征在于：其碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

8.权利要求7所述的一种siRNA的靶向分子运输蛋白微粒复合体在制备预防或治疗大肠癌的药物中的应用。