CN102893155A - 联合疗法和用于评估对治疗的抗性的方法 - Google Patents

联合疗法和用于评估对治疗的抗性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于测定受试者对用2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺治疗的抗性的方法，其通过测量自受试者获得的生物样品中存在的一种或多种生物标志的水平来进行，所述生物标志是IL6和/或IL8。本发明还涉及一种用于患有增殖性病症的患者的联合疗法，包括对患者施用2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺和抗IL6和/或抗IL8剂。

Description

联合疗法和用于评估对治疗的抗性的方法
本发明涉及用于测定受试者对用2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺（2,2-dimethyl-N-((S)-6-oxo-6,7-dihydro-5H-dibenzo[b,d]azepin-7-yl)-N′-(2,2,3,3,3-pentafluoro-propyl)-malonamide）治疗的抗性的方法和试剂盒。本发明还涉及用于治疗患有增殖性病症的患者的联合疗法，包括施用抗IL6剂和抗IL-8剂中的至少一种和2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺。
发明背景
蛋白质刻缺蛋白(Notch)是一种存在于大多数生物体，包括哺乳动物中的跨膜蛋白，其在调节基因表达中具有作用。在配体结合刻缺蛋白的胞外域时，蛋白质刻缺蛋白正好在膜外部被肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)切割，释放仍然在与配体相互作用中的胞外域。然后，γ-分泌酶正好在膜内部切割该蛋白质，释放胞内域（称为活性胞内刻缺蛋白或“ICN”）。ICN移位至细胞核，并激活转录因子CSL，如此诱导基因转录。
错误的刻缺蛋白信号传导牵涉多种病症，包括增殖性病症。因此，对刻缺蛋白信号传导的抑制是肿瘤学中很感兴趣的领域。γ-分泌酶抑制阻断刻缺蛋白信号传导途径，并且因此，γ-分泌酶抑制剂具有抗增殖活性。
2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺（在本文中又称为“化合物I”）是一种有力的且选择性的γ-分泌酶抑制剂，其抑制肿瘤细胞中的刻缺蛋白信号传导。已知用化合物I处理的异种移植物显示与血管发生有关的基因表达降低，这与化合物I抑制肿瘤血管发生的能力一致。Luistro等,Cancer Research,69:7672-80(2009)。令人感兴趣地，这些研究在H460a异种移植物方面显示血管生成基因概况(profile)的很小变化。
白介素-6(IL6)和白介素-8(IL8)是在此类多种多样的病症，诸如感染和免疫、炎症、自身免疫性疾病、和癌症中发挥重要作用的有力细胞因子。申请人已经发现了IL6和IL8之每种的表达升高对用化合物I的治疗赋予抗性。
发明概述
本发明涉及用于测定受试者对用2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺治疗的抗性的方法，包括测量自所述受试者获得的生物样品中存在的生物标志的水平，所述生物标志是IL6或IL8。
本发明还涉及在帮助测定受试者对用化合物2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺治疗的抗性中使用的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于检测生物标志IL6或IL8的药剂。
本发明进一步涉及治疗患有增殖性病症的患者的方法，包括对患者施用：(A)化合物I；和(B)抗IL6或抗IL8剂。
本发明进一步涉及(A)化合物I；和(B)抗IL6和/或抗IL8剂的序贯或同时组合，其作为药物，特别是作为用于在治疗增殖性病症诸如癌症，特别是实体瘤，更特别是乳腺、结肠直肠、肺、和前列腺肿瘤中使用的药物使用。
本发明的又一个方面是包含：(A)化合物I；和(B)抗IL6或抗IL8剂的试剂盒。
在又一个方面，本发明涉及(A)化合物I；和(B)抗IL6和/或抗IL8剂的组合用于制造用于治疗增殖性病症，特别是癌症，更特别是实体瘤诸如乳腺、结肠直肠、肺、和前列腺肿瘤的药物的用途。
附图简述
图1描绘了对NCI-H460a和A549细胞系实施的细胞因子阵列测定法的结果。
图2描绘了分泌性IL6和IL8的量，如使用ELISA自各种细胞系测量的。
图3描绘了编码IL6和IL8的mRNA的量，如使用qRT-PCR自各种细胞系测量的。
图4描绘了分泌性IL6和IL8的量，如使用ELISA自H460a细胞、A549亲本细胞、A549对照细胞、A549IL6过表达细胞和A549IL8过表达细胞测量的。
图5描绘了接受下列各项的异种移植物模型中用化合物I处理和用泰素
Figure BDA00002404086200031
处理对肿瘤生长的影响：H460a细胞、A549亲本细胞、A549对照细胞、A549IL6过表达细胞、A549IL8过表达细胞、和A549IL6过表达细胞和A549IL8过表达细胞的1:1混合物。
图6描绘了编码IL8的mRNA的量和分泌性IL8的量，如自亲本H460a细胞、接受对照载体的H460a细胞、和IL8敲低H460a细胞测量的。
图7描绘了化合物I处理对肿瘤生长的影响，如在H460a和IL-8敲低H460a异种移植物模型中测量的。
图8描绘了用化合物I处理、用抗IL8抗体处理、和用化合物I和IL-8抗体的联合疗法对H460a异种移植物模型中肿瘤生长的影响。
图9描绘了用化合物I处理、用抗IL6抗体处理、和用化合物I和IL-6抗体的联合疗法对H460a异种移植物模型中肿瘤生长的影响。
图10描绘了IL6和IL8编码mRNA在各种细胞系中的水平，如使用qRT-PCR测量的。
图11描绘了由各种细胞系分泌的IL6和IL8水平，如使用ELISA测量的。
图12描绘了用化合物I处理后U87MG和LOX细胞中HesI mRNA的下调。
图13描绘了化合物I处理对U87MG和LOX细胞中肿瘤生长的影响。
图14描绘了使用ELISA测量的，在H460a细胞、用化合物I处理的H460a细胞、IL8敲低H460a细胞、用化合物I处理的IL8敲低H460a细胞、U87MG细胞、和用化合物I处理的U87MG细胞中分泌性IL6和IL8的量。
发明详述
定义
除非另有叙述，本申请（包括说明书和权利要求书）中使用的下列术语具有下文给出的定义。必须注意，如说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一种”、“一个”和“所述/该”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。
如本文中所使用的，“化合物I”指可用作γ-分泌酶抑制剂的2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺。化合物I具有以下结构。
术语“生物标志”指一种充当生物状态的指示物的客观可测量的实体。
术语“生物样品”指自受试者获得的，可以自其测量生物标志的部分（例如，血液、血清、组织、痰、尿液、唾液）。
就生物标志而言的术语“水平”指存在的生物标志的浓度、活性、表达水平、或量的测量。可以例如通过测量样品中存在的生物标志的浓度或质量，或者例如通过测定相关细胞群或组织中表达的编码生物标志的mRNA的量定量测定所述水平。或者，所述水平可以更为定性地测定为例如高于或低于设定的阈值水平。阈值水平可以对应于健康受试者中生物标志的平均或中值水平，或者可以对应于做出疾病诊断的水平。若测量的水平高于设定的阈值水平，则生物标志被说成是以“升高的水平”存在。
“受试者”包括哺乳动物和鸟。“哺乳动物”意指哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于人；非人灵长类诸如黑猩猩和其它猿和猴物种；牲畜动物诸如牛、马、绵羊、山羊、和猪；家畜动物诸如家兔、犬、和猫；实验室动物，包括啮齿类，诸如大鼠、小鼠、和豚鼠；等等。术语“受试者”不表示特定的年龄或性别。
如本文中所使用的，术语“药学可接受载体”指示考虑到要治疗的疾病或状况和相应的施用路径，指定的载体没有会引起适度谨慎的医学从业人员避免其对患者施用的特性。
如本文中所使用的，术语“治疗有效的”意指化合物、或组合或组合物在对患者施用后有效产生期望的治疗效果，例如，阻止癌性肿瘤的生长，或导致收缩，或者延长患者的寿命的量。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与某种程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，增殖性病症是癌症。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征的生理状况。癌症的例子包括但不限于结肠直肠癌、黑素瘤、和甲状腺癌。
“抑制细胞生长或增殖”意指将细胞生长或增殖降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或100%，并且包括诱导细胞死亡。
如本文中所使用的，短语“实质性降低的”或“实质性不同的”指两个数值值（一般地，一个与某种分子有关，而另一个与参照/比较分子有关）间足够高的差异程度，使得本领域技术人员会认为两个数值间的差异在由所述数值测量的生物特征的背景内是统计学显著的。
术语“肿瘤”指所有新生物细胞生长和增殖（不管是恶性的还是良性的），和所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”、和“肿瘤”不互相排斥，如本文中提及的。
用于测定抗性的方法
本发明部分涉及一种用于测定受试者对用2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺（本文中又称为“化合物I”）治疗的抗性的方法，包括测量自所述受试者获得的生物样品中存在的生物标志的水平，所述生物标志是IL6或IL8。
在本发明的一个实施方案中，将所述样品中存在的生物标志的水平与所述生物标志的阈值水平比较，且若更大的话，则认为所述受试者对用化合物I的治疗具有体内抗性。出于本文中（包括权利要求书中）的目的，“体内抗性”指用化合物I治疗的体内有效效果降低。
在本发明的一个实施方案中，生物标志是IL6，且IL6的所述阈值水平是约500pg/ml。
在本发明的一个实施方案中，生物标志是IL8，且IL8的所述阈值水平是约50pg/ml。
生物标志的水平可以基于蛋白质自身或通过其相应的mRNA的量测定。
可以通过物理/化学技术诸如凝胶电泳、HPLC、质谱术、和蛋白质组技术；免疫测定法技术，诸如ELISA、竞争性测定法、三明治式测定法，等等；以及通过生物活性（例如，作为配体和/或酶）的测定法，通过本领域中已知的方法测量生物样品中的所述活性，经由双杂交测定系统，等等直接测量蛋白质。商业测定法对于许多或大多数上文所提及的生物标志是可得的，或者是本领域中已有描述的。合适的生物样品包括血液、血清、尿液，等等。
或者，可以测定与上文所提及的蛋白质生物标志对应的mRNA水平。可以使用任何合适的定量或半定量方法，包括但不限于Northern印迹；微阵列技术；RT-PCR、qRT-PCR和其它定量和半定量DNA和mRNA扩增方法；等等来实施mRNA转录水平的测定。例如，为了实施RT-PCR，可以自生物样品提取总RNA，用DNA酶1对其处理，并使用逆转录酶诸如Multiscribe逆转录酶(Applied Biosystems Inc.,Foster City,Calif.)将其转化成cDNA。然后，可以使用cDNA作为模板来实施cDNA“SYBR绿”实时定量PCR测定法，并使用ABIPRISM 7900序列检测仪分析。
在本发明的一个实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人。
在本发明的一个实施方案中，测量的生物标志是IL6。
在本发明的一个实施方案中，测量的生物标志是IL8。
在本发明的一个实施方案中，测量IL6和IL8两者。
在本发明的一个实施方案中，生物样品是血液。
在本发明的一个实施方案中，生物样品是血清。
在本发明的一个实施方案中，生物样品是尿液。
在本发明的一个实施方案中，通过测量所述样品中存在的蛋白质量来测量生物标志。
在本发明的一个实施方案中，通过测量编码生物标志的mRNA的水平来测量生物标志。
用于测定抗性的试剂盒
本发明还涉及一种在帮助测定受试者对用化合物2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺治疗的抗性中使用的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于检测在自所述受试者获得的生物样品中生物标志IL6或IL8的药剂。
联合疗法
在一个实施方案中，本发明涉及治疗患有增殖性病症的患者的方法，包括对患者施用：(A)化合物I；和(B)抗IL6或抗IL8剂。在本发明的一个实施方案中，施用抗IL6和抗IL8剂两者。
在又一个实施方案中，本发明涉及(A)化合物I；和(B)抗IL6和/或抗IL8剂的序贯或同时组合，其作为药物，特别是作为用于在治疗增殖性病症诸如癌症，特别是实体瘤，更特别是乳腺、结肠直肠、肺、和前列腺肿瘤中使用的药物使用。
增殖性病症的治疗应当理解为包括维持或降低肿瘤大小、诱导肿瘤消退（部分的或完全的）、抑制肿瘤生长、和/或延长患有所述病症的患者的寿命。
本发明还涉及一种试剂盒，其包含：(A)化合物I；和(B)抗IL6或抗IL8剂。在本发明的一个实施方案中，试剂盒包含抗IL6剂和抗IL8剂两者。
在本发明的一个实施方案中，增殖性病症是实体瘤。
在本发明的另一个实施方案中，实体瘤选自下组：脑、肝、前列腺、卵巢、胰腺、皮肤、乳腺、结肠直肠、肺、和前列腺肿瘤。
在本发明的另一个实施方案中，实体瘤选自下组：乳腺、结肠直肠、肺、和前列腺肿瘤。
在本发明的一个实施方案中，以有效降低患者中IL6水平的量施用抗IL6剂。
在本发明的一个实施方案中，以有效降低患者中IL8水平的量施用抗IL8剂。
在本发明的一个实施方案中，抗IL6剂是抗IL6抗体。
在本发明的一个实施方案中，抗IL8剂是抗IL8抗体。
在本发明的一个实施方案中，抗IL6剂是干扰编码IL6的核酸表达的核酸。干扰编码IL6的核酸表达的核酸可以例如是反义RNA。所述核酸也可以是例如shRNA或siRNA。
在本发明的一个实施方案中，抗IL8剂是干扰编码IL8的核酸表达的核酸。干扰编码IL8的核酸表达的核酸可以例如是反义RNA。所述核酸也可以是例如shRNA或siRNA。
在本发明方法的一个实施方案中，以对于治疗增殖性病症治疗有效的量施用化合物I。所述量可以例如是约400ng-hr/ml至约9000ng-hr/ml、约1100ng-hr/ml至约4100ng-hr/ml、或约1380ng-hr/ml至约2330ng-hr/ml。在本发明的实施方案中，可以以在多至约21天的时段里施用约400ng-hr/ml至约9000ng-hr/ml、在多至约21天的时段里施用约1100ng-hr/ml至约4100ng-hr/ml、在多至约21天的时段里施用约1380ng-hr/ml至约2330ng-hr/ml的量施用化合物I。
在本发明方法的一个实施方案中，在21天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天、和第10天每天施用化合物I一次。在另一个实施方案中，可以在21天周期的第1天至第7天每天施用一次。在又一个实施方案中，可以按天计每天施用一次。
在本发明的方法和试剂盒的实施方案中，化合物I为药用口服单位剂量形式。
在本发明方法的一个实施方案中，患者还进行放射疗法。
在本发明方法的一个实施方案中，在21天周期的第1天、第2天、第3天、第8天、第9天和第10天以约400ng-hr/ml至约9000ng-hr/ml的量每天施用化合物I一次。
在本发明方法的一个实施方案中，在21天周期的第1天-第7天以约400ng-hr/ml至约9000ng-hr/ml的量每天施用化合物I一次。
在本发明的一个实施方案中，以有效降低患者中IL6水平的量施用抗IL6抗体。
在本发明方法的一个实施方案中，以约1至约100mg/kg的量每周施用抗IL6抗体两次。
在本发明方法的一个实施方案中，以约1至约50mg/kg的量每周施用抗IL6抗体两次。
在本发明方法的一个实施方案中，以约10至约30mg/kg的量每周施用抗IL6抗体两次。
在本发明方法的一个实施方案中，以约20mg/kg的量每周施用抗IL6抗体两次。
在本发明的一个实施方案中，以有效降低患者中IL8水平的量施用抗IL8抗体。
在本发明方法的一个实施方案中，以约1至约100mg/kg的量每周施用抗IL8抗体两次。
在本发明方法的一个实施方案中，以约1至约50mg/kg的量每周施用抗IL8抗体两次。
在本发明方法的一个实施方案中，以约10至约30mg/kg的量每周施用抗IL8抗体两次。
在本发明方法的一个实施方案中，以约20mg/kg的量每周施用抗IL8抗体两次。
在本发明的一个实施方案中，以有效降低患者中IL6水平的量施用抗IL6shRNA。
在本发明的一个实施方案中，以有效降低患者中IL8水平的量施用抗IL8shRNA。
在本发明的一个实施方案中，以有效降低患者中IL6水平的量施用抗IL6siRNA。
在本发明的一个实施方案中，以有效降低患者中IL8水平的量施用抗IL8siRNA。
根据患者的需要，和患者对治疗的反应，内科医生可以将化合物I、抗IL6剂、和/或抗IL8剂的剂量水平修改为低于或高于本文中所述的。
实施例
给出以下制备物和实施例以使本领域技术人员能够更清楚地理解并实施本发明。不应认为它们限制本发明的范围，而仅为其例示性和代表性的。
实施例1
本实施例显示各种不同异种移植物模型对用化合物I处理的响应。
在自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)获得的雌性nu/nu（裸）小鼠或雌性SCID-米色小鼠(Taconic,Germantown,NY)为约8至14周龄，并且重量为约23至25克时使用它们（10只小鼠/组）。依照得到罗氏动物护理和使用委员会(Roche Animal Care and Use Committee,RACUC)批准的方案实施所有动物实验。
人癌细胞系LOVO、BxPC3、HCT-116、A549、AsPC-1、MiaPaCa-2、和Calu-6购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。H460a细胞系是来自Jack Roth博士(M.D.Anderson Medical Center)的赠品。
对于异种移植物植入，使用0.05%胰蛋白酶收获细胞，将其在培养基中清洗并离心，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)和基质胶(Matrigel)的1∶1混合物(BxPC-3)或单独的PBS（A549、H460a、LOVO、Calu-6、HCT-116、MiaPaca-2、和AsPC-1）中以每mL为1.5-5×107个细胞的浓度重悬。给每只小鼠在右体侧中皮下植入0.2mL体积细胞悬浮液（对于A549为7.5x 106个细胞，对于H460a为1x107个细胞，对于Calu-6和HCT116为3x106个细胞，对于BxPC3和AsPC-1为5x106个细胞，对于MiaPaca-2为6x106个细胞，而对于LOVO为5x106个）。除了BxPC3（其植入SCID-米色小鼠中）外，将所有异种移植物模型植入裸鼠中。容许肿瘤在植入后生长8至26天，此时均值体积达到约100-150mm3，之后将动物随机化入处理组中。
将化合物I（依照记载于WO2005/023772的规程合成）作为含0.2%的水中1.0%Klucel中的悬浮液配制以口服(po)施用。每周制备配制好的化合物和媒介物，并于4°C贮存。
在Calu-6异种移植物模型中，每隔一周每天以60mg/kg服用化合物I达4周（7+/7-x 2个周期）。给所有其它异种移植物模型每天以10mg/kg服用化合物I。
每周采集肿瘤测量和小鼠重量两次。通过Mann-Whitney秩和检验、单因素ANOVA、和事后Bonferroni t-检验(post hoc Bonferroni t-test)(SigmaStat,第2.0版,Jandel Scientific,San Francisco,CA)测定统计学分析。在概率值(p)小于等于0.05时，认为各组间的差异是显著的。
开始处理后21天测量肿瘤生长抑制(TGI%)。下文在表1中显示了结果。
表1
Figure BDA00002404086200102
如可以看出的，H460a异种移植物在用化合物I处理后展现出到目前为止最小量的肿瘤生长抑制(8%)。
实施例2
在实施例1中鉴定H460a异种移植物模型在用化合物I处理后展现出到目前为止最小量的肿瘤生长抑制后，对H460a和A549NSCLC细胞系两者进行细胞因子阵列测定法以测定是否存在着分开H460a细胞系的任何生物标志。
细胞因子阵列购自RayBiotech,Inc.(Norcross,GA.)，并依照制造商的方案使用。将细胞培养5天，收获细胞培养液，并通过离心除去脱离的细胞。将4毫升培养液与阵列一起温育过夜，接着进行多次PBS/Tween清洗，接着显现信号。
测定的是H460a细胞系比A549或血清对照表达更高水平的IL6和IL8两者。见图1。
实施例3
然后，使用ELISA通过测量分泌性IL6和IL8蛋白水平在BxPC3、HCT-116、A549、AsPC-1、MiaPaCa-2、和Calu-6细胞系中量化IL6和IL8的表达。
IL6ELISA试剂盒购自Bender MedSystems（BMS213/2或BMS213INST）。IL8ELISA试剂盒购自Bender MedSystems(BMS204/3INST)或R&D Systems(D8000C)。为了测量组织培养基中的分泌性IL6和IL8，将细胞以50万的密度在35mm板中接种。次日，将细胞用2ml PBS清洗，然后补充1ml新鲜培养基。24小时后，将培养基收获，并立即用于ELISA分析。
如从结果看出的（见图2），H460a细胞比测试的其它细胞系分泌更高的IL6和IL8蛋白量，包括与A549细胞相比，高4倍的IL6蛋白和高10倍的IL8蛋白。
实施例4
然后，使用qRT-PCR通过测量mRNA的水平在BxPC3、HCT-116、A549、AsPC-1、MiaPaCa-2、和Calu-6细胞系中量化IL6和IL8的表达。使用标准实验室技术来完成RNA分离和逆转录-PCR(RT-PCR)。每个探针组的产品目录编号是Hes1(Hs00172878_m1)、ACTB(4333762F)、IL6(Hs00174131_m1)、IL8(Hs00174103_m1)和18S(4319413E)。
如从结果看出的（见图3），H460a细胞比测试的其它细胞系表达更高的IL6和IL8mRNA量，包括与A549细胞相比，高12倍的IL6mRNA和高8倍的IL8mRNA。
实施例5
为了测试IL6或IL8的表达是否调控化合物I处理的效力，将过表达IL6或IL8的A549细胞系工程化改造，并用于生成异种移植物模型，对该异种移植物模型进行研究以测定此类过表达是否改变细胞对化合物I处理的敏感性。
分别使用IL6和IL8质粒（购自Genecopoeia,Rockville,Maryland,USA）生成IL6和IL8慢病毒。将A549细胞分成三组，其中一组接受载体对照，一组用IL6慢病毒感染，而第三组用IL8慢病毒感染。后两组分别形成稳定表达外源IL6和IL8的细胞集合。
通过ELISA量化IL6和IL8蛋白的过表达。见图4。过表达IL6的A549细胞比H460a分泌高7倍的IL6。过表达IL8的A549细胞比H460a分泌略少的IL8蛋白。过表达IL6或IL8的A549细胞与A549载体对照细胞具有相似的形态学。
然后，组合IL6过表达A549细胞的和IL8过表达A549细胞的一部分以形成含有此类细胞的1∶1混合物的第四组。
将接受载体对照的A549细胞、过表达IL6的A549细胞、过表达IL8的A549细胞、和过表达IL6的A549细胞和过表达IL8的A549细胞的1∶1混合物在6孔板上接种，其中每组在第0天以每孔约1x105在孔中接种。在第4天、第6天、第10天和第12天，将所有细胞进行胰蛋白酶处理并计数，然后再分配以在相同稀释时进一步增殖。将对照细胞任意设置为100%生长。所有其它细胞类型的生长表示为与对照细胞生长的比率。测试的所有细胞系展示相似的生长率。见表2。
表2
第0天 第4天 第6天 第10天 第12天
A549对照 100±25 100±2 100±1 100±2 100±17
A549+IL6 90±5 109±6 112±20 98±5 97±6
A549+IL8 84±12 91±12 118±6 77±6 78±4
A549+IL6&8 64±14 74±14 72±17 71±1 77±5
对这些细胞组之每组评估IL6和IL8过表达对化合物I效力的体内影响。
使用实施例1中所描述的规程，使用来自上述四组的细胞和亲本A549和H460a细胞生成异种移植物模型。
将小鼠随机化入不同处理组（10只小鼠/组）：每天接受媒介物（Klucel和Tween）一次的亲本A549小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次的亲本A549小鼠、每天以30mg/kg接受泰素
Figure BDA00002404086200121
四次的亲本A549小鼠、每天接受媒介物（Klucel和Tween）一次的载体对照A549小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次的载体对照A549小鼠、每天以30mg/kg接受泰素四次的载体对照A549小鼠、每天接受媒介物（Klucel和Tween）一次的IL6过表达A549小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次的IL6过表达A549小鼠、每天以30mg/kg接受泰素
Figure BDA00002404086200132
四次的IL6过表达A549小鼠、每天接受媒介物（Klucel和Tween）一次的IL8过表达A549小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次的IL8过表达A549小鼠、每天以30mg/kg接受泰素
Figure BDA00002404086200133
四次的IL8过表达A549小鼠、每天接受媒介物（Klucel和Tween）一次的含有IL-6和IL-8过表达A549细胞的1:1异种移植物混合物的A549小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次的含有IL-6和IL-8过表达A549细胞的1:1异种移植物混合物的A549小鼠、和每天以30mg/kg接受泰素
Figure BDA00002404086200134
四次的含有IL-6和IL-8过表达A549细胞的1:1异种移植物混合物的A549小鼠、每天接受媒介物（Klucel和Tween）一次的H460a小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次的H460a小鼠、和每天以30mg/kg接受泰素
Figure BDA00002404086200135
四次的H460a小鼠。
每天用10mg/kg化合物I处理一次的来自H460a的异种移植物肿瘤（高水平的IL6和IL8两者）在21天后产生9%TGI。此抗性与对A549肿瘤观察到的71%TGI和对A549载体对照肿瘤（低水平的IL6和IL8）观察到的61%TGI形成明显的对比，这与先前的实验一致。A549中IL6或IL8的过表达分别将TGI降低至32%和45%。用过表达IL6或IL8的A549的1:1混合物启动的肿瘤表明对化合物I的完全抗性(8%TGI)，这与亲本H460a异种移植物的抗性一致。包括泰素
Figure BDA00002404086200136
作为阳性药物对照，其在各种模型间显示一致的TGI。见图5。
过表达IL6或IL8的A549对化合物I的抗性不是由刻缺蛋白抑制损失引起的，因为体外化合物I处理后Hes1 mRNA的下调（刻缺蛋白信号传导阻断的标志）在这些细胞中得到适当维持。
实施例6
本实施例描述了为了探索IL8表达是否为维持H460a细胞抗性需要进行的研究。
使用基于pLKO.1的抗IL8shRNA（购自Open Biosystems）生成慢病毒，并用于稳定地敲低H460a细胞中的IL8表达。如图6中所显示的，与H460a亲本细胞相比，shRNA给出对IL8表达（mRNA和蛋白质两者）的75%敲低。然而，IL8敲低H460a细胞仍具有比A549细胞高超过2倍的IL8水平。
然后，使用实施例1中所描述的规程将亲本H460a细胞和IL8敲低H460a细胞作为异种移植物在小鼠中植入。然后，将小鼠随机化入不同处理组（10只小鼠/组）：每天接受媒介物一次的H460a异种移植物小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次的H460a异种移植物小鼠、每天接受媒介物一次的IL8敲低H460a异种移植物小鼠、和每天以10mg/kg接受化合物I一次的IL8敲低H460a异种移植物小鼠。
如图7中显示的，在每天以10mg/kg用化合物I处理一次达21天时，与来自亲本H460a细胞的肿瘤相比，自IL8敲低H460a细胞衍生的肿瘤显示改善的响应性（5%TGI对24%TGI）。
实施例7
本实施例描述了为了探索IL8表达是否为维持H460a细胞抗性需要进行的进一步研究。
中和性抗IL8抗体购自R&D systems（产品目录编号：MAB208）。首先，在体外测试此抗体，并且自用此抗体处理的H460a细胞没有观察到生长抑制。
使用实施例1中所描述的规程生成H460a异种移植物模型。然后，将小鼠随机化入不同处理组（10只小鼠/组）中：每周接受媒介物两次的H460a异种移植物小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次的H460a异种移植物小鼠、每周以20mg/kg接受抗IL8抗体两次的H460a异种移植物小鼠、和每天以10mg/kg接受化合物I一次的且每周以20mg/kg接受抗IL8抗体两次的H460a异种移植物小鼠。
抗体与化合物I的组合改善H460a肿瘤对化合物I的敏感性（10%TGI对43%TGI）。这与利用IL8shRNA的先前数据一致。见图8。
实施例8
本实施例描述了为了探索IL6表达是否为维持H460a细胞抗性需要进行的研究。
中和性抗IL6抗体购自R&D systems（产品目录编号：MAB2061）。首先，在体外测试此抗体，并且自用此抗体处理的H460a细胞没有观察到生长抑制。
使用实施例1中所描述的规程生成H460a异种移植物模型。然后，将小鼠随机化入不同处理组（10只小鼠/组）中：每周接受媒介物两次的H460a异种移植物小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次的H460a异种移植物小鼠、每周以20mg/kg接受抗IL6抗体两次的H460a异种移植物小鼠、和每天以10mg/kg接受化合物I一次的且每周以20mg/kg接受抗IL6抗体两次的H460a异种移植物小鼠。
抗体与化合物I的组合改善H460a肿瘤对化合物I的敏感性（43%TGI对47%TGI）。见图9。
实施例9
任何响应标志物的一个重要方面是成功前瞻性鉴定响应者和非响应者肿瘤类型的能力。在此实施例中，分析不同细胞系以测定它们是否具有高表达水平的IL6和/或IL8。然后，使用表达高水平的IL6和IL8的细胞生成异种移植物（并且如此预测为是对化合物I处理的非响应者）。然后，用化合物I处理异种移植物模型以察看高水平的IL6和IL8对处理的效力是否具有任何影响。
通过qRT-PCR对多种肿瘤类型间约100种细胞系筛选IL6和IL8的表达。约13%的细胞系比A549具有高至少10倍的IL6或IL8表达。选择两种细胞系U87MG（成胶质细胞瘤）（其表达高水平的IL6（比A549高35倍的IL6mRNA）和IL8（比A549高85倍的IL8mRNA）和LOX（黑素瘤）（其相对于A549表达更高水平的IL8（比A549高50倍的IL8mRNA）和IL6（比A549高2倍的IL6mRNA）（图10）以进一步研究。通过ELISA进一步确认来自这两种细胞系的较高的IL6和/或IL8表达水平（图11）。
人癌细胞系U87MG和LOX购自美国典型培养物保藏中心。
然后，使用U87MG和LOX细胞系生成异种移植物模型。
在自Charles River Laboratories(Wilmington,MA)获得的雌性nu/nu（裸）小鼠（10只小鼠/组）为约8至14周龄，并且重量为约23至25克时将异种移植物在其中植入。依照得到罗氏动物护理和使用委员会(RACUC)批准的方案实施所有动物实验。
对于异种移植物植入，使用0.05%胰蛋白酶收获细胞，将其在培养基中清洗并离心，并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)和基质胶的1:1混合物(U87MG)或单独的PBS(LOX)中以每mL为1.5-5×107个细胞的浓度重悬。给每只小鼠在右体侧中皮下植入0.2mL体积细胞悬浮液（对于U87MG为5x 106个细胞，对于LOX为2x106个细胞）。容许肿瘤在植入后生长8至26天，此时均值体积达到约100-150mm3，之后将动物随机化入处理组中：每天接受媒介物（Klucel和Tween）一次的U87MG异种移植物小鼠、每天以10mg/kg接受化合物I一次达21天的U87MG异种移植物小鼠、每天接受媒介物（Klucel和Tween）一次的LOX异种移植物小鼠、和每天以10mg/kg接受化合物I一次的LOX异种移植物小鼠，达11天。
如预测的，U87MG和LOX模型两者都证明对用化合物I治疗有抗性，其中对于U87MG肿瘤为-17%TGI，而对于LOX肿瘤为15%TGI。见图12。
U87MG和LOX细胞对化合物I的抗性不是由刻缺蛋白抑制损失引起的，因为体外化合物I处理后Hes1 mRNA的下调（刻缺蛋白信号传导阻断的标志）在这些细胞中得到适当维持。见图13。
实施例10
测量异种移植物模型中IL6和IL8的血清水平以测定它们是否反映在体外自细胞培养基观察到的表达差异。所得的数据提示血清收集可以是一种监测患者肿瘤IL6和IL8水平的临床可行的办法。
使用下列异种移植物模型自携带肿瘤的小鼠收集小鼠血清：A549、H460a、IL8敲低H460a、U87MG和LOX（使用上文所描述的方法生成模型）。这在BD Microtainer血清分离管（产品目录编号#365956,Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ）中通过眶后放血或心脏穿刺实现。容许血液凝结最少10分钟，并在微量离心机中以9000rpm旋转10分钟。将血清收集，并在1.5ml微量离心管中放置，并于-80°C贮存。
来自A549肿瘤的小鼠血清中的分泌性人IL6和IL8太低以致不能通过ELISA检出。然而，使用ELISA在血清中容易检出源自H460a、LOX和U87MG异种移植物模型的人IL6和IL8（图14）。另外，在IL8敲低H460a模型和H460a模型间观察到分泌性IL8血清水平的预期变化。
一般地，在体内在血清中观察到的IL6和IL8水平反映在体外自细胞培养物观察到的量。然而，我们确实观察到自小鼠血清对自细胞培养基测量的IL6和IL8间的一些差异。例如，在塑料上以相同细胞数目接种时，U87MG比H460a分泌高5-6倍的IL6和IL8水平；这在小鼠血清中没有得到反映。

Claims (28)

1.一种用于测定受试者对用化合物2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺治疗的抗性的方法，包括测量自所述受试者获得的生物样品中存在的生物标志的水平，所述生物标志是IL6或IL8。
2.依照权利要求1的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
3.依照权利要求1的方法，其中所述受试者是人。
4.依照权利要求1的方法，其中所述生物标志是IL6。
5.依照权利要求1的方法，其中所述生物标志是IL8。
6.依照权利要求1的方法，其中测量IL6和IL8两者的水平。
7.依照权利要求1的方法，其中所述生物样品是血液。
8.依照权利要求1的方法，其中所述生物样品是血清。
9.依照权利要求1的方法，其中所述生物样品是尿液。
10.依照权利要求1的方法，其中通过测量所述样品中存在的蛋白质量来测量所述生物标志。
11.依照权利要求1的方法，其中通过测量编码所述生物标志的mRNA水平来测量所述生物标志。
12.依照权利要求1的方法，其中将所述样品中存在的生物标志水平与所述生物标志的阈值水平比较，且若更大的话，则认为所述受试者对用2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺的治疗具有体内抗性。
13.依照权利要求12的方法，其中所述生物标志是IL6，且IL6的所述阈值水平是约500pg/ml。
14.依照权利要求12的方法，其中所述生物标志是IL8，且IL8的所述阈值水平是约50pg/ml。
15.一种在帮助测定受试者对用化合物2,2-二甲基-N-((S)-6-氧-6,7-二氢-5H-二苯并[b,d]氮杂卓-7-基)-N’-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺治疗的抗性中使用的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测自所述受试者获得的生物样品中生物标志IL6或IL8的药剂。
16.(A)化合物I；和(B)抗IL6和/或抗IL8剂的序贯或同时组合，其作为药物使用，特别用于在治疗增殖性病症诸如癌症中使用。
17.依照权利要求16的组合，其中所述组合包含抗IL6和抗IL8剂两者。
18.依照权利要求16或17的组合，其中所述抗IL6剂是抗IL6抗体。
19.依照权利要求16或17的方法，其中所述抗IL8剂是抗IL8抗体。
20.依照权利要求16至18中任一项的组合，其中所述抗IL6剂是干扰编码IL6的核酸表达的核酸。
21.依照权利要求20的组合，其中所述干扰编码IL6的核酸表达的核酸是反义RNA。
22.依照权利要求20的组合，其中所述干扰编码IL6的核酸表达的核酸是shRNA或siRNA。
23.依照权利要求16、17或19的组合，其中所述抗IL8剂是干扰编码IL8的核酸表达的核酸。
24.依照权利要求23的组合，其中所述干扰编码IL8的核酸表达的核酸是反义RNA。
25.依照权利要求23的组合，其中所述干扰编码IL8的核酸表达的核酸是shRNA或siRNA。
26.一种试剂盒，其包含：(A)化合物I；和(B)抗IL6和/或抗IL8剂。
27.(A)化合物I；和(B)抗IL6和/或抗IL8剂的组合用于制造用于治疗增殖性病症，特别是癌症的药物的用途。
28.新的方法、组合、用途和试剂盒，基本上如本文中所描述的。
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