CN102890066A - 一种检测总抗氧化能力的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测总抗氧化能力的试剂盒，其包括R1试剂和R2试剂，R1试剂和R2试剂的体积比为11:1：所述的R1试剂包括A液和B液，A液和B液的体积比为10:1；所述的A液包括醋酸盐，其余为双蒸水；所述的B液包括络合物TPTZ，酸，其余为双蒸水；R2试剂包括氧化剂FeCl3，其余为双蒸水。本发明采用FRAP方法，检测被检样品的总抗氧化能力，能够反应机体所有抗氧化能力，比单个的抗氧化测定能更好地反应抗氧化剂状态。可利用分光光度计、酶标仪或全自动生化分析仪分析，自动化程度高，有助于日常检验工作的推广。测定值与体内试验数据相关性程度高。且制作成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种检测总抗氧化能力的试剂盒。
背景技术
自由基，化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团。随着自由基学说和生物医学的发展，自由基与疾病的关系受到了广泛的重视。研究表明自由基诱导氧化应激，参与许多疾病的病理过程。当体内过量的自由基会损伤蛋白质、细胞膜，促使细胞组织DNA突变，从而诱发或加速人体多种疾患的产生与恶化。在辐射损伤、炎症和应急反应、肿瘤病变、再灌注损伤、衰老等多种情况下，多伴随自由基异常剧增。大量研究证明，机体内的抗氧化防御系统一旦失衡，就会产生氧化损伤。抗氧化物质是防病治病的关键，是减少机体氧化损伤最有效的方法。因此检测体内抗氧化能力就显得异常重要。总抗氧化能力的测定有利于掌握机体的防御能力，以调节机体的总抗氧化能力，提高机体对自由基的清除，可有效地控制各种疾病的不断恶化，为临床医生实施抗氧化辅助治疗提供依据。目前研究机体抗氧化能力(包括内源性与外源性氧自由基清除剂的抗氧化能力)是分析机体某种特定抗氧化成分和(或)自由基代谢产物的变化，如脂质过氧化物(LPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸、维生素E、p胡萝卜素等。常用的抗氧化能力检测方法有体内实验法和体外活性实验法。
虽然体内试验法接近生物体比较灵敏，但周期长，成本大，实验繁琐。结合国情，抗氧化活性应用体外活性试验法（化学分析法）比较适合。体外实验法中常检测的是单一的抗氧化成分，难以准确反映生物体实际抗氧化应激能力，因为单一成分的变化尚不能完全说明氧化损伤已经发生及其发生程度。由于机体抑制不同氧化物的效率不同，因此评价机体真正的抗氧化能力是很困难的。总的抗氧化能力能够反应机体所有抗氧化能力，比单个的抗氧化测定能更好地反应抗氧化剂状态。
发明内容
本发明的目的为提供可以检测羟自由基OH-、氧自由基O-、酯自由基ROO-以及所有坏境污染人体所产生的自由基的清除能力，供分光光度计、酶标仪以及全自动生化分析仪使用的一种检测总抗氧化能力的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
该检测总抗氧化能力的试剂盒，其包括R1试剂和R2试剂，R1试剂和R2试剂的体积比为11:1：
a、所述的R1试剂包括A液和B液，A液和B液的体积比为10:1；
所述的A液各组分及其在A液中的浓度范围为：
醋酸盐 1.5×10-2~2.5×10-2g/mL
其余为双蒸水；
调节A液的pH值至3.6；
所述的B液各组分及在B液中的浓度范围为：
络合物TPTZ 2.0×10-3~5.0×10-3 g/mL
30 ~60mmol/L酸 3.0×10-3~5.0×10-3 mL/mL
其余为双蒸水；
b、R2试剂包括氧化剂FeCl3，氧化剂FeCl3在R2试剂中的浓度范围为5×10-3~6×10-3 g/mL，其余为双蒸水。
所述的醋酸盐为醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵。
所述的酸为盐酸、氢碘酸、氢溴酸或醋酸中的一种或两种以上混合物。
本发明的制备方法为：
a、按照技术方案所述购买AR级别的试剂并经检验合格。
b、确定需制备的各试剂总体积，按技术方案计算并称量或量取各组分。
c、将R1试剂A液配成醋酸盐缓冲液，余量用双蒸水补足，搅拌至溶解；R1试剂B液将络合物TPTZ溶于用双蒸水稀释后的酸类溶液中充分搅拌至全溶；R2试剂配成氧化剂FeCl3溶液，余量用双蒸水补足。
以上所有步骤均在超净台完成。
FRAP法测定总抗氧化能力的原理是酸性条件下抗氧化物可以还Ferric-tripyridyltriazine (Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ，随后测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。由于反应在酸性条件下进行，可以抑制内源性的一些干扰因素。并且由于血浆等样品中的铁离子或亚铁离子的总浓度通常低于10μM，因此血浆等样品中的铁离子或亚铁离子不会显著干扰FRAP法的检测反应。由于反应体系中的铁离子或亚铁离子是和TPTZ螯合的，样品本身含有的少量金属离子螯合剂通常也不会显著影响检测反应。
本发明采用FRAP法，可以对血浆、血清、唾液、尿液等各种体液的各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力进行检测的试剂盒。检测的是总的抗氧化能力，能够反应机体所有抗氧化能力，比单个的抗氧化测定能更好地反应抗氧化剂状态。被检测样品为血清时可为新鲜样品或-80℃冻存一个月内的样品，其余样品储存在-20℃，溶解后置于4~8℃冰箱中可放置五天。
利用分光光度计、酶标仪或全自动生化分析仪分析，自动化程度高，有助于日常检验工作的推广。分析生物样品时，在比较大的样品终浓度范围内，总抗氧化能力测定值与样品稀释度呈线性关系。且测定值与体内试验数据相关性程度高。本发明的耗材仅消费90元/100mL，与进口总抗氧化能力试剂售价约为6000元/100mL相比，大大降低成本。
本发明采用以上技术方案：采用FRAP方法，检测被检样品的总抗氧化能力，能够反应机体所有抗氧化能力，比单个的抗氧化测定能更好地反应抗氧化剂状态。可利用分光光度计、酶标仪或全自动生化分析仪分析，自动化程度高，有助于日常检验工作的推广。测定值与体内试验数据相关性程度高。且制作成本低。
具体实施方式
检测总抗氧化能力的试剂盒，其包括R1试剂和R2试剂，R1试剂和R2试剂的体积比为11:1：
a、所述的R1试剂包括A液和B液，A液和B液的体积比为10:1；
所述的A液各组分及其在A液中的浓度范围为：
醋酸盐 1.5×10-2~2.5×10-2g/mL
其余为双蒸水；
调节A液的pH值至3.6；
所述的B液各组分及在B液中的浓度范围为：
络合物TPTZ 2.0×10-3~5.0×10-3 g/mL
30 ~60mmol/L酸 3.0×10-3~5.0×10-3 mL/mL
其余为双蒸水；
b、R2试剂包括氧化剂FeCl3，氧化剂FeCl3在R2试剂中的浓度范围为5×10-3~6×10-3 g/mL，其余为双蒸水。
所述的醋酸盐为醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵。
所述的酸为盐酸、氢碘酸、氢溴酸或醋酸中的一种或两种以上混合物。
本发明的制备方法为：
a、按照技术方案所述购买AR级别的试剂并经检验合格。
b、确定需制备的各试剂总体积，按技术方案计算并称量或量取各组分。
c、将R1试剂A液配成醋酸盐缓冲液，余量用双蒸水补足，搅拌至溶解，调节A液的pH至3.6；R1试剂B液将络合物TPTZ溶于用双蒸水稀释后的酸类溶液中充分搅拌至全溶；R2试剂配成氧化剂FeCl3溶液，余量用双蒸水补足。
以上所有步骤均在超净台完成。
实施例1
本发明所述的总抗氧化能力检测试剂盒，其包括R1试剂和R2试剂，R1试剂和R2试剂的体积比为11:1：
按下表成分称量和量取，
R1试剂A液
醋酸钠 3.75g
溶于双蒸水中，用醋酸调节PH至3.6，配成250mLA液。
R1试剂B液
TPTZ 0.05g
30 ~60mmol/L盐酸 0.075mL
双蒸水 25mL
搅拌溶解即可
R2试剂
FeCl3 0.125g
双蒸水 25mL
搅拌溶解即可
R1与R2即用即混型试剂
实施例2
本发明所述的总抗氧化能力检测试剂盒的配制方法为：按下表成分称量和量取，
R1试剂A液
醋酸钾 5.0g
溶于双蒸水中，用醋酸调节PH至3.6，配成250mLA液。
R1试剂B液
TPTZ 0.078g
30 ~60mmol/L氢碘酸 0.1mL
双蒸水 25mL
搅拌溶解即可
R2试剂
FeCl3 0.135g
双蒸水 25mL
搅拌溶解即可
R1与R2即用即混
实施例3
本发明所述的总抗氧化能力检测试剂盒的配制方法为：按下表成分称量和量取，
R1试剂A液
醋酸铵 6.25g
溶于双蒸水中，用醋酸调节PH至3.6，配成250mLA液。
R1试剂B液
TPTZ 0.125mg
30 ~60mmol/L醋酸 0.125mL
双蒸水 25mL
搅拌溶解即可
R2试剂
FeCl3 0.15g
双蒸水 25mL
搅拌溶解即可
R1与R2即用即混
实施例4
本发明所述的总抗氧化能力检测试剂盒的配制方法为：按下表成分称量和量取，
R1试剂A液
醋酸铵 6.25g
溶于双蒸水中，用醋酸调节PH至3.6，配成250mLA液。
R1试剂B液
TPTZ 0.125mg
30 ~60mmol/L醋酸和氢溴酸混合液 0.125mL
双蒸水 25mL
搅拌溶解即可
R2试剂
FeCl3 0.15g
双蒸水 25mL
搅拌溶解即可
R1与R2即用即混
采用以上实施例1的试剂盒对血清的总抗氧化能力检测如下：
采用酶标仪测定总抗氧化能力的具体操作步骤：
(1) 在96孔酶标板的每个检测孔中加入180 μL FRAP工作液（R1与R2的混合溶液）。
(2) 在空白对照孔中加入5μL 蒸馏水或PBS溶液；
在标准曲线检测孔内加入5μL不同浓度的FeSO4标准溶液；
在部分样品检测孔内加入5μL血清，轻轻混匀；另一部分样品检测孔内加入0.15~1.5mmol/L 的Trolox（水溶性维生素E）作为阳性对照。
(3) 37℃孵育3~5min后在波长593nm 处测各孔吸光值，如果测定593nm有困难，也可在585~605nm 波长范围内进行测定。
(4) 根据标准曲线检测孔测定的吸光值做出标准曲线。
(5) 根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。
Claims (3)
1.一种检测总抗氧化能力的试剂盒，其特征在于：其包括R1试剂和R2试剂，R1试剂和R2试剂的体积比为11:1：
a、所述的R1试剂包括A液和B液，A液和B液的体积比为10:1；
所述的A液各组分及其在A液中的浓度范围为：
醋酸盐 1.5×10-2~2.5×10-2g/mL
其余为双蒸水；
调节A液的pH值至3.6；
所述的B液各组分及在B液中的浓度范围为：
络合物TPTZ 2.0×10-3~5.0×10-3 g/mL
30 ~60mmol/L酸 3.0×10-3~5.0×10-3 mL/mL
其余为双蒸水；
b、R2试剂包括氧化剂FeCl3，氧化剂FeCl3在R2试剂中的浓度范围为5×10-3~6×10-3 g/mL，其余为双蒸水。
2.根据权利要求1所述的一种检测总抗氧化能力的试剂盒，其特征在于：所述的醋酸盐为醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵。
3.根据权利要求1所述的一种检测总抗氧化能力的试剂盒，其特征在于：所述的酸为盐酸、氢碘酸、氢溴酸或醋酸中的一种或两种以上混合液。
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