CN102875359A - 一种利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法及其装置和其耦合发酵技术的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法,把过滤后的发酵液流加入萃取塔进行连续逆流液液萃取,其中发酵液作为重相,萃取体系作为轻相,离开萃取塔的萃取液进行反萃取反萃出富马酸或富马酸盐,反萃后的萃取体系返回萃取萃取塔中循环使用;同时,萃余液可先后流经有机溶剂一级捕集槽和有机溶剂二级捕集柱进行二级处理,最后流出的液体返回发酵罐重复利用。本发明还提供了上述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的装置以及用此连续逆流萃取技术耦合发酵技术在连续制备富马酸中的应用方法。通过本发明提供的工艺可以有效解除富马酸发酵过程中的产物抑制,同时可以避免萃取剂对米根霉的毒害,提高富马酸发酵生产水平。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法,及实现此方法的装置,同时涉及利用此种萃取方法耦合发酵技术的在连续制备富马酸中的应用及其应用方法。
背景技术
富马酸(fumaric acid)又称反丁烯二酸,是一种重要的二元有机羧酸,作为重要的有机化工原料和精细化工产品被广泛应用于化工、材料、医药及食品等领域。然而,化学合成富马酸因成本提高和环境污染等原因使得富马酸在食品领域的应用受到限制。以生物质为原料发酵法制备富马酸,由于原料可再生、产品天然、安全性好等优势,受到了越来越多的青睐。
微生物发酵法生产富马酸的过程是典型的产物抑制型发酵过程,未解离的富马酸分子比解离的富马酸根离子产生的抑制作用更为明显,在发酵过程中添加中和剂是解决这一问题的常用方法,不同中和剂的使用,发酵后亦生成不同的盐。在现有的报道中,以碳酸钙为中和剂制备富马酸的产量较高,工业中将富马酸钙转变成富马酸或水溶性好的富马酸盐时,一般会加入硫酸或硫酸盐,该过程会造成固体废弃物(如石膏)的排放,额外地增加环保压力,而且在制备富马酸时因其收率低,造成提取成本的上升,因此,固废污染和高提取成本将成为钙盐中和剂在富马酸产业化应用中的两大主要限制因素。非钙类的中和剂,如钠类或铵(胺)类作中和剂可避免钙类中和剂的问题,在获得富马酸的同时,所制备的富马酸钠或富马酸铵亦可作为苹果酸或天冬氨酸的生产原料,进而直接与下游工艺结合,缩短工艺流程。单纯使用钠类或铵(胺)类中和剂来发酵制备富马酸,无论是糖转化率,还是富马酸的生产能力都很难与碳酸钙中和剂相比,为有效解决这一问题许多研究者将反应与分离耦合技术应用到该过程中来,即在发酵前期通过流加中和剂来调控发酵液pH,待生物量积累到一定程度停止流加中和剂,根据发酵液pH变化自动调节分离单元的开关,通过分离单元分离发酵液中的富马酸进而达到消弱产物抑制、提高糖转化率、减少中和剂用量等目的。G. T. Tsao等人(Simultaneous production and recovery of fumaric acid from immobilized Rhizopus oryzae with a rotary biofilm contactor and an adsorption column [J].Applied and Environmental Microbiology,1996,62(8):2926-2931.)利用离子交换树脂分离单元与旋转生物膜反应器耦合制备富马酸,富马酸产量为85 g/L,产酸强度达到4.25 g/L/h,是目前富马酸产量报道的最高值,然而在该工艺条件下发酵液中富马酸的浓度较低,树脂的吸附能力未能得到有效利用,从而使得发酵过程中树脂使用量相对增加,基于这些问题,付永前等人(专利公开号CN 101235394A)公开一种利用中空纤维膜过滤、纳滤浓缩和离子交换吸附耦合技术分离提取富马酸的方法,提高了树脂的吸附能力,有效降低了树脂在反应分离过程的使用量。同时,Carol A. R. E.(Integration of fermentation and cooling crystallization to produce organic acids[D]. Delft University of Technology,2009.)利用富马酸低溶解度的特性,通过冷却结晶罐与制备富马酸的反应器耦合将未解离的富马酸冷却结晶降低产物抑制,结果表明通过该反应与分离耦合,可直接获得富马酸晶体,且中和剂(氢氧化钠)的用量比常规发酵方式减少37%左右。
反应与分离耦合技术凭借减少产物抑制提高生产率的优势在许多领域有广泛的应用,例如胡纯铿等人(离子交换树脂分离发酵新工艺生产L-苹果酸的研究[J].食品与发酵工艺,1999,25(6):33-36.)利用离子交换树脂分离器与反应器耦合产苹果酸;徐虹(L-丙氨酸制备新技术的研究[D].南京工业大学,1999.)通过控制反应体系的pH值,实现了反应与原位结晶分离耦合生产L-Ala,该技术提高了酶反应速率,显著降低了生产成本;姜岷(授权公开号:CN 101215583 B)公开了一种发酵与膜分单元耦合制备丁二酸的方法,该技术可以有效解除发酵过程中代谢产物对菌体生长的抑制,显著提高丁二酸的生产强度;王鑫昕(发酵分离耦合系统高产丁醇的工艺优化研究[D].四川师范大学,2009.)通过构建丁醇发酵与产物提取工艺的耦合系统,有益效果在于丁醇产量(16.39 g/L)比传统发酵(10.82 g/L)提高了33.98%,底物转化率由传统工艺的75.91%提高到了91.93%。
反应与分离耦合过程中,分离单元有多种,如离子交换树脂、电渗析、冷却结晶、膜分离、溶剂萃取等,每一种分离单元都有自身的优势和弊端,其中溶剂萃取法具有分离效率高、能耗低、生产能力大、设备投资少、浓缩效果好等优点而备受关注,但溶剂萃取的生物相容性也是不可忽视的一个重要问题。
将萃取发酵耦合技术应用到富马酸的在线分离过程中,关键是解决好两方面的问题:一是解决适合萃取的pH值与发酵过程中最适产酸pH值之间的矛盾;二是解决有机溶剂生物相容性的问题。首先,一般而言萃取剂主要萃取未解离的有机酸分子,所以适合萃取的pH值较低,即pH<pKa,而有机酸发酵的最适pH>pKa,以富马酸为例,富马酸的pKa分别为3.03和4.44,而发酵最适pH为4.0-6.0。研究表明,胺类萃取体系对有机酸具有较好的萃取性能,尤其是季铵盐对有机酸的萃取受pH变化影响较小,适合于在线萃取发酵耦合过程,但单独使用季铵盐的弊端是增加反萃的难度,所以针对在较高pH条件下要求萃取体系具有较好萃取能力且反萃容易的问题,可通过使用混胺萃取体系得以有效解决。其次,有机溶剂对微生物的毒性影响有两条途径:溶剂的夹带部分和溶剂的溶水部分,根据不同途径,目前的解决方式也主要分两种,即采用细胞固定化的操作方式和使用无毒的萃取剂或者毒性萃取剂与无毒的稀释剂混合使用的接触方式。
萃取发酵耦合技术是反应与分离耦合过程中重要的组成部分,20世纪80年代中期至今,萃取发酵耦合技术已广泛应用于有机酸、醇类的发酵过程中,V.M. Yabannavar and D.I.C. Wang(Extractive fermentation for lactic acid production [J].Biotechnology and Bioengineering,1991,37:1095-1100.)通过k-卡拉胶固定化Lactobacillus delbrueckii菌种发酵体系与15% Alamine336-油醇萃取分离体系与耦合生产乳酸,乳酸浓度由对照组的34 g/L提高到40 g/L,生产强度达到2.58 g/L/h,提高了1.66倍;2011年美国专利US 20110097773公开了利用萃取发酵生产提取丁醇的方法,同样也取得良好的实验效果。但目前国内外均未有萃取发酵耦合技术在线分离发酵液中富马酸的相关报道。
发明内容
本发明针对所要解决的技术问题是提供一种利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法,包括如下步骤:
(1)发酵液过滤:发酵罐内发酵液经过滤后按每小时发酵罐装液量0~20%(v/v)的流速流出进入萃取塔;
(2)连续逆流液液萃取:发酵液作为重相从萃取塔上端流入,萃取体系作为轻相从萃取塔下端以发酵液1~4倍的流速流入,萃取体系由萃取剂和稀释剂构成,其中萃取剂为伯胺、仲胺、叔胺或季铵盐中的一种或几种;稀释剂为正辛醇、四氯化碳、甲基异丁基甲酮或煤油中的一种或几种,萃取塔转速为30~120r/min;
(3)萃取液处理:从萃取塔塔顶取出的萃取液流入反萃取釜,反萃取釜中以钠盐、铵盐、氨水或无机酸中的一种或几种为反萃剂,从负载有机相中反萃出富马酸或富马酸盐,反萃后的萃取体系返回萃取萃取塔中循环使用。
作为本发明的进一步改进,上述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法还包括步骤(4)萃余液处理:从萃取塔塔釜取出萃余液,先流入有机溶剂一级捕集槽中,捕集剂为对米根霉无毒的植物油,选自大豆油、花生油、葵花油、菜籽油或玉米油中的一种或多种,然后再进入有机溶剂二级捕集柱中,柱中填料为20~200目的活性炭,径高比为1/5~1/15,最后流出的液体返回发酵罐重复利用。
本发明还提供了上述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的装置,包括发酵罐1、萃取塔3、反萃取釜4,顺序串联安装,在发酵罐1内安装砂芯滤头2以过滤罐内发酵液;操作时发酵液顺序流过砂芯滤头2、萃取塔3、反萃取釜4分别进行过滤、萃取、反萃取以实现发酵与萃取分离单元耦合连续制备富马酸。
作为上述装置的进一步改进,在萃取塔3萃余液出口端串联安装有机溶剂一级捕集槽7和有机溶剂二级捕集柱8,其中有机溶剂二级捕集柱8中填料为20~200目的活性炭,径高比为1/5~1/15;操作时从萃取塔3流出的萃余液顺序流过有机溶剂一级捕集槽7和有机溶剂二级捕集柱8进行有机溶剂纯化,最后流出的液体返回发酵罐重复利用。
同时本发明还提供上述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法在耦合发酵技术连续制备富马酸的应用及其应用方法,其步骤包括:
(1)制备产富马酸菌株的种子培养基,其产富马酸菌株为米根霉(Rhizopus oryzae);
(2)制备产富马酸菌株的发酵种子;
(3)制备产富马酸菌株的发酵培养基;
(4)将发酵培养基装入发酵罐,再将发酵种子接入发酵罐;
(5)发酵生产富马酸;
(6)用权利要求1或2中方法连续逆流萃取发酵液中富马酸。
其中步骤(1)所述的制备产富马酸菌株的种子培养基为pH2.0~4.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基;其中糖类为葡萄糖、木糖或蔗糖中的一种或多种;氮源为有机或无机含氮化合物,其中无机含氮化合物为尿素、硫酸铵或氯化铵中的一种或多种,有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或玉米浆中的一种或多种;无机盐为钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、锌盐、硫酸盐或磷酸盐中的一种或多种;
步骤(3)中所述的制备产富马酸菌株的发酵培养基为pH3.0~6.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基;其中糖类为葡萄糖、麦芽浸出物或蔗糖中的一种或多种;氮源为有机或无机含氮化合物,其中无机含氮化合物为尿素、硫酸铵或氯化铵中的一种或多种,有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或玉米浆中的一种或多种;无机盐为钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、锰盐、铁盐、锌盐、硫酸盐或磷酸盐中的一种或多种;
步骤(4)中所述的发酵罐中发酵液的装液量为发酵罐体积的50~80%(v/v),富马酸发酵种子的接种量装液量的5~20%(v/v)。
1、如权利要求5所述连续逆流萃取在耦合发酵技术连续制备富马酸中的应用,其特征在于:步骤(2)中所述的制备产富马酸菌株的发酵种子由以下步骤组成:
a.孢子悬浮液制备:将米根霉接种在斜面培养基上,斜面培养基采用PDA培养基(取新鲜去皮马铃薯100~300g,切成小块,加水1000mL,加热煮沸20~30min,用纱布过滤并补足失水至1000mL,得10%~30%马铃薯浸出液,加蔗糖10~30g,琼脂10~30g,融化后分装,110~121℃灭菌10~30min),斜面放在30~40℃的恒温培养箱中培养5~7d,待孢子成熟后,在无菌条件下,用无菌水、生理盐水、吐温溶液或磷酸盐缓冲溶液洗脱孢子,经8~20层纱布过滤,收集到装有玻璃珠的三角瓶中,置于20~30℃及100~180r/min的摇床中震荡20~60min,孢子浓度控制在105~108个/mL备用;
b.发酵种子培养:三角瓶中种子培养基装液量为三角瓶容量的15~25%(v/v),110~121℃灭菌20~30min,冷却后无菌条件下将孢子悬浮液按0.5~5%(v/v)的装液量接入种子培养基,在温度为30~40℃, 150~220r/min转速下震荡培养15~40h,作为发酵种子。
作为上述连续逆流萃取在耦合发酵技术连续制备富马酸中的应用的进一步改进,步骤(5)中所述的发酵生产富马酸的方法为:温度为30~40℃,搅拌转速为100~600r/min,发酵过程用氨水、氢氧化钠、碳酸钠或碳酸铵中的一种或几种作为中和剂,控制发酵pH在3.0~6.0,发酵12~36h。
本发明利用发酵与萃取分离单元耦合制备富马酸的方法流程图及其装置见图1或2。
有益效果
1.采用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸,有效地消除了富马酸对米根霉的反馈抑制,实现了富马酸的高效发酵,且耦合过程中无需添加任何中和剂。
2.采用的萃取体系为筛选优化后的混胺萃取体系,该体系具有萃取分离因数大、pH适应范围宽、反萃容易等特点,能较好的适用于萃取发酵耦合过程。
3.采用萃余液两级处理工艺,从根本上解决了有机溶剂对菌体的毒化效应,利于菌体的正常生长代谢。
4.反萃过程不仅可以获得浓缩的富马酸溶液,还可以获得相应的浓缩盐,从而进一步延伸到下游产品的生产过程当中,如富马酸铵或富马酸钠可直接作为天冬氨酸和苹果酸的生产原料。
5.该工艺所需的设备投资少,生产过程条件温和,且易于自动化控制和规模放大,具有良好的应用潜力。
附图说明
图1 权利要求3中所述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的装置,其中:1-发酵罐、2-砂芯滤头、3-萃取塔、4-反萃取釜、5-反萃取剂储存器、6-富马酸或富马酸盐收集器。
图2 权利要求4中所述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的装置,其中,1-发酵罐、2-砂芯滤头、3-萃取塔、4-反萃取釜、5-反萃取剂储存器、6-富马酸或富马酸盐收集器、7-有机溶剂一级捕集槽、8-有机溶剂二级捕集柱。
本发明的产富马酸菌株为米根霉(Rhizopus oryzae) ME-F13,其保藏日期为2010年12月16日,保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心,简称为CCTCC,地址为:中国. 武汉. 武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2010351。其已经发表于公布日为2011年09月07日,公布号为CN 102174419A的中国专利申请中。
具体实施方式
下面的实施对本发明作详细说明,但对本发明没有限制。
本发明的产富马酸菌株为米根霉(Rhizopus oryzae)ME-F13,其保藏日期为2010年12月16日,保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心,简称为CCTCC,地址为:中国. 武汉. 武汉大学,保藏编号为CCTCC NO:M 2010351。其已经发表于公布日为2011年09月07日,公布号为CN 102174419A的中国专利申请中。
实施例1:利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸在耦合发酵技术连续制备富马酸。
(1)孢子悬浮液制备:将米根霉(Rhizopus oryzae)ME-F13接种在PDA斜面培养基上(取新鲜去皮马铃薯200g,切成小块,加水1000mL,加热煮沸30min,用纱布过滤并补足失水至1000mL,得20%马铃薯浸出液,加蔗糖20g,琼脂22g,融化后分装, 121℃灭菌20min),斜面放在35℃的恒温培养箱中培养6d,待孢子成熟后,在无菌条件下,用无菌水洗脱孢子,经16层纱布过滤,收集到装有玻璃珠的三角瓶中,置于25℃及150r/min的摇床中震荡30min,孢子浓度控制在107个/mL备用;
(2)发酵种子培养:每250mL的三角瓶中装种子培养基50mL(葡萄糖 30g/L,尿素 2g/L,KH2PO4 0.6g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,ZnSO4·7H2O 0.0176g/L,FeSO4·7H2O 0.000498g/L,初始pH2.60),115℃灭菌30min,冷却后无菌条件下接入2%(v/v)的孢子悬浮液,在温度为35℃,转速为200r/min下震荡培养30h,作为发酵种子;
(3)发酵培养:5L的发酵罐中装入发酵培养基3L(葡萄糖 80g/L,尿素 0.1g/L,KH2PO4 0.1g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,ZnSO4·7H2O 0.0176g/L,FeSO4·7H2O 0.000498g/L),121℃灭菌20min,罐体冷却至室温后接入发酵种子,接种量10%(v/v)发酵罐置于温度为35 ℃、通气量为1 vvm、转速为400 rpm的操作条件下发酵培养,pH由4.0 mol/L的氨水调节至4.0。发酵到24h,米根霉生长进入对数生长中期,发酵液中富马酸和葡萄糖的浓度分别为8.5 g/L和43 g/L,打开发酵液流出泵开关与萃取分离设备耦合,同时停止中和剂的流加,发酵罐的pH调控由萃取发酵自动调节。
(4)萃取分离:萃取分离前将萃取塔、有机溶剂二级捕集槽和模块间连接管道先用1%氢氧化钠浸泡3h进行消毒,再用无菌水冲洗至pH为中性后密封备用,有机溶剂一级捕集槽115 ℃灭菌15min后冷却备用。发酵罐中部分发酵液经发酵罐内置的砂芯滤头过滤,截留的菌体留在发酵罐内,发酵液以300 ml/h的流速流出,发酵液作为重相从萃取塔上端流入,萃取体系作为轻相从萃取塔下端以380 ml/h的流速流入,萃取体系由10% Aliquat 336季铵盐-40% N235-50%煤油构成,萃取塔转速为60 r/min,萃余液以300 ml/h的流速先流入有机溶剂一级捕集槽中,捕集剂为对米根霉无毒的花生油,流出的萃取液再进入有机溶剂二级捕集柱中,柱中填料为30目的活性炭,径高比为1:8,最后流出的液体返回发酵罐继续发酵生产富马酸,待葡萄糖浓度≤5 g/L时停止发酵,以2 mol/L的碳酸氢铵为反萃剂,从负载有机相中反萃出富马酸铵,反萃后的萃取体系返回萃取装置循环使用。
(5)经过以上操作,与单纯用氨水做中和剂的发酵过程相比:发酵周期由67h缩短到60h;糖转化率由22.6%提高到45.9%(消耗葡萄糖223.9g,产富马酸102.7g),提高了2.03倍。以2mol/L碳酸氢铵作反萃剂,反萃相比4:1(o/w),经二级反萃,所获得的富马酸铵浓度分别为140.7g/L和125.0g/L。
实施例2:利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸在耦合发酵技术连续制备富马酸。
(1)按照实施例1中的方法制备孢子液和发酵种子。
(2) 发酵培养:5L的发酵罐中装入发酵培养基3L(葡萄糖 80g/L,尿素 0.1g/L,KH2PO4 0.4g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,ZnSO4·7H2O 0.0176g/L,FeSO4·7H2O 0.000498g/L),115℃灭菌30min,罐体冷却至室温后接入发酵种子,接种量8%(v/v)发酵罐置于温度为33 ℃、通气量为1.2 vvm、转速为300 rpm的操作条件下发酵培养,pH由3.0 mol/L的碳酸钠调节至5.0。发酵到36h,米根霉生长进入对数生长后期,发酵液中富马酸和葡萄糖的浓度分别为14.8 g/L和45 g/L,打开发酵液流出泵开关与萃取分离设备耦合,同时停止中和剂的流加,发酵罐的pH调控由萃取发酵自动调节。
(3) 萃取分离:萃取分离前将萃取塔、有机溶剂二级捕集槽和模块间连接管道先用2%氢氧化钠浸泡2h进行消毒,再用无菌水冲洗至pH为中性后密封备用,有机溶剂一级捕集槽115 ℃灭菌30 min后冷却备用。发酵罐中部分发酵液经发酵罐内置的砂芯滤头过滤,截留的菌体留在发酵罐内,发酵液以460 ml/h的流速流出,发酵液作为重相从萃取塔上端流入,萃取体系作为轻相从萃取塔下端以500 ml/h的流速流入,萃取体系由15% Aliquat 336季铵盐-30% N235-55%煤油构成,萃取塔转速为70 r/min,萃余液以460 ml/h的流速先流入有机溶剂一级捕集槽中,捕集剂为对米根霉无毒的玉米油,流出的萃取液再进入有机溶剂二级捕集柱中,柱中填料为50目的活性炭,径高比为1:6,最后流出的液体返回发酵罐继续发酵生产富马酸,待葡萄糖浓度≤5 g/L时停止发酵,以1.5mol/L的氯化钠为反萃剂,从负载有机相中反萃出富马酸钠,反萃后的萃取体系返回萃取装置循环使用。
(4)经过以上操作,与单纯用碳酸钠做中和剂的发酵过程相比:发酵周期由66h缩短到58h;糖转化率由32.7%提高到50.8%(消耗葡萄糖225.9g,产富马酸114.6g),提高了1.55倍。以1.5mol/L氯化钠作反萃剂,反萃相比4:1(o/w),经二级反萃,所获得的富马酸铵浓度分别为185.9g/L和130.3g/L。
实施例3:利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸耦合发酵技术连续制备富马酸。
(1)按照实施例1中的方法制备孢子液和发酵种子。
(2)发酵培养:7L的发酵罐中装入发酵培养基5L(葡萄糖 100g/L,尿素 0.1g/L,KH2PO4 0.5g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,ZnSO4·7H2O 0.0176g/L,FeSO4·7H2O 0.000498g/L),115℃灭菌30min,罐体冷却至室温后接入发酵种子,接种量15%(v/v)发酵罐置于温度为38 ℃、通气量为0.5 vvm、转速为600 rpm的操作条件下发酵培养,pH由1.0 mol/L的氢氧化钠调节至6.0。发酵到20h,米根霉生长进入对数生长中期,发酵液中富马酸和葡萄糖的浓度分别为5.75 g/L和64 g/L,打开发酵液流出泵开关与萃取分离设备耦合,同时停止中和剂的流加,发酵罐的pH调控由萃取发酵自动调节。
(3)萃取分离:萃取分离前将萃取塔、有机溶剂二级捕集槽和模块间连接管道先用3%氢氧化钠浸泡1.5h进行消毒,再用无菌水冲洗至pH为中性后密封备用,有机溶剂一级捕集槽110 ℃灭菌30 min后冷却备用。发酵罐中部分发酵液经发酵罐内置的砂芯滤头过滤,截留的菌体留在发酵罐内,发酵液以600ml/h的流速流出,发酵液作为重相从萃取塔上端流入,萃取体系作为轻相从萃取塔下端以800 ml/h的流速流入,萃取体系由20% Aliquat 336季铵盐-40% N235-40%煤油构成,萃取塔转速为55 r/min,萃余液以600ml/h的流速先流入有机溶剂一级捕集槽中,捕集剂为对米根霉无毒的大豆油和菜籽油混合物(体积比1:1),流出的萃取液再进入有机溶剂二级捕集柱中,柱中填料为40目的活性炭,径高比为1/7,最后流出的液体返回发酵罐继续发酵生产富马酸,待葡萄糖浓度≤5 g/L时停止发酵,以1.5mol/L碳酸钠为反萃剂,从负载有机相中反萃出富马酸钠,反萃后的萃取体系返回萃取装置循环使用。
(4)经过以上操作,与单纯用氢氧化钠做中和剂的发酵过程相比:发酵周期由72h缩短到60h;糖转化率由12.1%提高到43.0%(消耗葡萄糖494.1g,产富马酸212.4g),提高了3.55倍。以1.5mol/L碳酸钠作反萃剂,反萃相比4:1(o/w),经二级反萃,所获得的富马酸铵浓度分别为176.2g/L和116.7g/L。
实施例4:利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸耦合发酵技术连续制备富马酸。
(1)按照实施例1中的方法制备孢子液和发酵种子。
(2)发酵培养:10L的发酵罐中装入发酵培养基7L(葡萄糖 100g/L,尿素 0.2g/L,KH2PO4 0.4g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,ZnSO4·7H2O 0.0176g/L,FeSO4·7H2O 0.000498g/L),121℃灭菌15min,罐体冷却至室温后接入发酵种子,接种量20%(v/v)发酵罐置于温度为30 ℃、通气量为1.5 vvm、转速为200 rpm的操作条件下发酵培养,pH由2.0 mol/L的碳酸铵调节至3.0。发酵到26h,米根霉生长进入对数生长中期,发酵液中富马酸和葡萄糖的浓度分别为6.24 g/L和54 g/L,打开发酵液流出泵开关与萃取分离设备耦合,同时停止中和剂的流加,发酵罐的pH调控由萃取发酵自动调节。
(3)萃取分离:萃取分离前将萃取塔、有机溶剂二级捕集槽和模块间连接管道先用4%氢氧化钠浸泡2.5h进行消毒,再用无菌水冲洗至pH为中性后密封备用,有机溶剂一级捕集槽115 ℃灭菌20 min后冷却备用。发酵罐中部分发酵液经发酵罐内置的砂芯滤头过滤,截留的菌体留在发酵罐内,发酵液以1L/h的流速流出,发酵液作为重相从萃取塔上端流入,萃取体系作为轻相从萃取塔下端以1.2L/h的流速流入,萃取体系由30% Aliquat 336季铵盐-20% N235-50%煤油构成,萃取塔转速为40 r/min,萃余液以1L/h的流速先流入有机溶剂一级捕集槽中,捕集剂为对米根霉无毒的葵花油,流出的萃取液再进入有机溶剂二级捕集柱中,柱中填料为100目的活性炭,径高比为1/5,最后流出的液体返回发酵罐继续发酵生产富马酸,待葡萄糖浓度≤5 g/L时停止发酵,以2mol/L碳酸铵为反萃剂,从负载有机相中反萃出富马酸钠,反萃后的萃取体系返回萃取装置循环使用。
(4)经过以上操作,与单纯用碳酸铵做中和剂的发酵过程相比:发酵周期由84h缩短到64h;糖转化率由14.2%提高到41.6%(消耗葡萄糖694.7g,产富马酸288.7g),提高了2.93倍。以2mol/L碳酸铵作反萃剂,反萃相比5:1(o/w),经二级反萃,所获得的富马酸铵浓度分别为216.3g/L和157.1g/L。
实施例5:利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸耦合发酵技术连续制备富马酸。
(1)按照实施例1中的方法制备孢子液和发酵种子。
(2)发酵培养:100L的发酵罐中装入发酵培养基60L(葡萄糖 80g/L,尿素 0.3g/L,KH2PO4 0.3g/L,MgSO4·7H2O 0.5g/L,ZnSO4·7H2O 0.0176g/L,FeSO4·7H2O 0.000498g/L),115℃灭菌25min,罐体冷却至室温后接入发酵种子,接种量16%(v/v)发酵罐置于温度为32 ℃、通气量为0.8 vvm、转速为350 rpm的操作条件下发酵培养,pH由2.0 mol/L的氨水调节至3.5。发酵到22h,米根霉生长进入对数生长中期,发酵液中富马酸和葡萄糖的浓度分别为7.04 g/L和47 g/L,打开发酵液流出泵开关与萃取分离设备耦合,同时停止中和剂的流加,发酵罐的pH调控由萃取发酵自动调节。
(3)萃取分离:萃取分离前将萃取塔、有机溶剂二级捕集槽和模块间连接管道先用10%氢氧化钠浸泡1h进行消毒,再用无菌水冲洗至pH为中性后密封备用,有机溶剂一级捕集槽110 ℃灭菌30 min后冷却备用。发酵罐中部分发酵液经发酵罐内置的砂芯滤头过滤,截留的菌体留在发酵罐内,发酵液以6 L/h的流速流出,发酵液作为重相从萃取塔上端流入,萃取体系作为轻相从萃取塔下端以8L/h的流速流入,萃取体系由25% Aliquat 336季铵盐-35% N235-40%煤油构成,萃取塔转速为100 r/min,萃余液以6 L/h的流速先流入有机溶剂一级捕集槽中,捕集剂为对米根霉无毒的菜籽油,流出的萃取液再进入有机溶剂二级捕集柱中,柱中填料为30目的活性炭,径高比为1/7,最后流出的液体返回发酵罐继续发酵生产富马酸,待葡萄糖浓度≤5 g/L时停止发酵,以4mol/L氨水作反萃剂,从负载有机相中反萃出富马酸钠,反萃后的萃取体系返回萃取装置循环使用。
(4)经过以上操作,与单纯用氨水做中和剂的发酵过程相比:发酵周期由70h缩短到50h;糖转化率由23.1%提高到50.0%(消耗葡萄糖4620g,产富马酸2311.6g,提高了2.16倍。以4mol/L氨水作反萃剂,反萃相比5:1(o/w),经二级反萃,所获得的富马酸铵浓度分别为230.8g/L和142.8g/L。
实施例6:权利要求3中所述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的装置。
见图1,包括发酵罐1、萃取塔3、反萃取釜4,顺序串联安装,在发酵罐1内安装砂芯滤头2以过滤罐内发酵液;操作时发酵液顺序流过砂芯滤头2、萃取塔3、反萃取釜4分别进行过滤、萃取、反萃取以实现发酵与萃取分离单元耦合连续制备富马酸。
实施例7:权利要求4中所述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的装置。
见图2,与实施例6中所述装置不同的是,在萃取塔3萃余液出口端串联安装有机溶剂一级捕集槽7和有机溶剂二级捕集柱8,其中有机溶剂二级捕集柱8中填料为20~200目的活性炭,径高比为1/5~1/15;操作时从萃取塔3流出的萃余液顺序流过有机溶剂一级捕集槽7和有机溶剂二级捕集柱8进行有机溶剂纯化,最后流出的液体返回发酵罐重复利用。
Claims (7)
1.一种利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法,包括如下步骤:
(1)发酵液过滤:发酵罐内发酵液经过滤后按每小时发酵罐装液量0~20%的流速流出进入萃取塔;
(2)连续逆流液液萃取:发酵液作为重相从萃取塔上端流入,萃取体系作为轻相从萃取塔下端以发酵液1~4倍的流速流入,萃取体系由萃取剂和稀释剂构成,其中萃取剂为伯胺、仲胺、叔胺或季铵盐中的一种或几种;稀释剂为正辛醇、四氯化碳、甲基异丁基甲酮或煤油中的一种或几种,萃取塔转速为30~120r/min;
(3)萃取液处理:从萃取塔塔顶取出的萃取液流入反萃取釜,反萃取釜中以钠盐、铵盐、氨水或无机酸中的一种或几种为反萃剂,从负载有机相中反萃出富马酸或富马酸盐,反萃后的萃取体系返回萃取萃取塔中循环使用。
2.根据权利要求1所述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法,其特征在于:还包括步骤(4)萃余液处理:从萃取塔塔釜取出萃余液,先流入有机溶剂一级捕集槽中,捕集剂为对米根霉无毒的植物油,选自大豆油、花生油、葵花油、菜籽油或玉米油中的一种或多种,然后再进入有机溶剂二级捕集柱中,柱中填料为20~200目的活性炭,径高比为1/5~1/15,最后流出的液体返回发酵罐重复利用。
3.完成权利要求1所述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的装置,包括发酵罐(1)、萃取塔(3)、反萃取釜(4),顺序串联安装,在发酵罐(1)内安装砂芯滤头(2)以过滤罐内发酵液;操作时发酵液顺序流过砂芯滤头(2)、萃取塔(3)、反萃取釜(4)分别进行过滤、萃取、反萃取以实现发酵与萃取分离单元耦合连续制备富马酸。
4.根据权利要求3所述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的装置,其特征在于:在萃取塔(3)萃余液出口端串联安装有机溶剂一级捕集槽(7)和有机溶剂二级捕集柱(8),其中有机溶剂二级捕集柱(8)中填料为20~200目的活性炭,径高比为1/5~1/15;操作时从萃取塔(3)流出的萃余液顺序流过有机溶剂一级捕集槽(7)和有机溶剂二级捕集柱(8)进行有机溶剂纯化,最后流出的液体返回发酵罐重复利用。
5.根据权利1或2 所述利用胺类萃取剂连续逆流萃取发酵液中富马酸的方法在耦合发酵技术连续制备富马酸的应用及其应用方法,其步骤包括:
(1)制备产富马酸菌株的种子培养基,其产富马酸菌株为米根霉(Rhizopus oryzae);
(2)制备产富马酸菌株的发酵种子;
(3)制备产富马酸菌株的发酵培养基;
(4)将发酵培养基装入发酵罐,再将发酵种子接入发酵罐;
(5)发酵生产富马酸;
(6)用权利要求1或2中方法连续逆流萃取发酵液中富马酸;
其中步骤(1)所述的制备产富马酸菌株的种子培养基为pH2.0~4.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基;其中糖类为葡萄糖、木糖或蔗糖中的一种或多种;氮源为有机或无机含氮化合物,其中无机含氮化合物为尿素、硫酸铵或氯化铵中的一种或多种,有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或玉米浆中的一种或多种;无机盐为钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、铁盐、锌盐、硫酸盐或磷酸盐中的一种或多种;
步骤(3)中所述的制备产富马酸菌株的发酵培养基为pH3.0~6.0的含有糖类的能提供碳源、氮源及无机盐的常规液体培养基;其中糖类为葡萄糖、麦芽浸出物或蔗糖中的一种或多种;氮源为有机或无机含氮化合物,其中无机含氮化合物为尿素、硫酸铵或氯化铵中的一种或多种,有机含氮化合物为蛋白胨、酵母膏、牛肉膏或玉米浆中的一种或多种;无机盐为钾盐、钠盐、镁盐、钙盐、锰盐、铁盐、锌盐、硫酸盐或磷酸盐中的一种或多种;
步骤(4)中所述的发酵罐中发酵液的装液量为发酵罐体积的50~80%,富马酸发酵种子的接种量装液量的5~20%。
6.如权利要求5所述连续逆流萃取在耦合发酵技术连续制备富马酸中的应用方法,其特征在于:步骤(2)中所述的制备产富马酸菌株的发酵种子由以下步骤组成:
a.孢子悬浮液制备:将米根霉接种在斜面培养基上,斜面培养基采用PDA培养基,斜面放在30~40℃的恒温培养箱中培养5~7d,待孢子成熟后,在无菌条件下,用无菌水、生理盐水、吐温溶液或磷酸盐缓冲溶液洗脱孢子,经8~20层纱布过滤,收集到装有玻璃珠的三角瓶中,置于20~30℃及100~180r/min的摇床中震荡20~60min,孢子浓度控制在105~108个/mL备用;
b.发酵种子培养:三角瓶中种子培养基装液量为三角瓶容量的15~25%,110~121℃灭菌20~30min,冷却后无菌条件下将孢子悬浮液按0.5~5%的装液量接入种子培养基,在温度为30~40℃, 150~220r/min转速下震荡培养15~40h,作为发酵种子。
7.如权利要求5所述连续逆流萃取在耦合发酵技术连续制备富马酸中的应用方法,其特征在于:步骤(5)中所述的发酵生产富马酸的方法为:温度为30~40℃,搅拌转速为100~600r/min,发酵过程用氨水、氢氧化钠、碳酸钠或碳酸铵中的一种或几种作为中和剂,控制发酵pH在3.0~6.0,发酵12~36h。
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