CN102872012A

CN102872012A - 一种抑制蛋白激酶的化合物及其用途

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Publication number: CN102872012A
Application number: CN2012104182122A
Authority: CN
Inventors: 刘阳; 马正伟; 邹强; 阳泰; 李丽梅; 李敏惠; 杨淑霞; 王衍堂; 李华; 郑静; 刘进; 罗兴燕
Original assignee: Chengdu Medical College
Current assignee: Chengdu Medical College
Priority date: 2011-11-03
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2032-10-26
Also published as: CN102872012B

Abstract

本发明公开了一种抑制蛋白激酶的化合物及其用途。本发明化合物能够有效抑制蛋白激酶活性，抑制异常活化的T细胞增殖，可用于治疗自身免疫性疾病、恶性肿瘤等疾病，特别是对淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、肝癌、移植排斥反应、过敏和类风湿性关节炎有显著的治疗作用，具有良好的工业应用前景。

Description

一种抑制蛋白激酶的化合物及其用途

技术领域

本发明涉及一种抑制蛋白激酶的化合物及其用途。

背景技术

蛋白激酶（protein kinases）又称蛋白质磷酸化酶(protein phosphakinase)。一类催化蛋白质磷酸化反应的酶。它能把腺苷三磷酸（ATP）上的γ-磷酸转移到蛋白质分子的氨基酸残基上某些丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上，从而改变蛋白质、酶的构象和活性。蛋白质的磷酸化是多种信号传导途径的重要环节，细胞内大部分重要的生命活过程都离不开蛋白质磷酸化。这些酶在调节细胞信号包括细胞增殖和细胞分化中是关键的因素。

蛋白激酶分为5类：蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶、蛋白酪氨酸激酶、蛋白组氨酸激酶、蛋白色氨酸激酶和蛋白天冬氨酰基/谷氨酰基激酶。蛋白激酶在细胞过程的调节和维持起到了重要作用，在许多疾病状态中都观察到了激酶活性异常，所述疾病状态包括：恶性肿瘤，免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、关节炎和其它免疫紊乱、神经系统如老年性痴呆症、阿默海茨症AD等，现已发现超过400种人类疾病与蛋白激酶相关。

蛋白激酶抑制剂，是一类抑制蛋白激酶活性的化合物。根据蛋白激酶的种类，可分为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂，前者又可根据作用部位，分为三组，一组作用于催化区，一组作用于调节区，另一组对调节区和催化区均有作用。目前有多种蛋白激酶抑制剂的相关研究报道，如专利申请：CN201110310167、CN200810028982等。众多研究报道，蛋白激酶抑制剂可以用于治疗由蛋白激酶活化引起的恶性肿瘤、关节炎等疾病，同时，它还能阻止T淋巴细胞的激活，对多种免疫性疾病有治疗作用（周意明，等，酪氨酸蛋白激酶抑制剂的研究进展，2000年6卷3期）。由于蛋白激酶抑制剂的医药用途显著，因此，对该类药物的研究显得格外重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一类抑制蛋白激酶的新化合物。本发明的另一目的在于提供该类化合物的新用途。

具体地，本发明提供了式Ⅰ所示的化合物在制备蛋白激酶抑制剂中的用途，

式Ⅰ

R₁为-OH、-H、烷基、=O、

或-OR₇，其中，R₇为C1-C5的烷基；

R₂为-H、烷基、-R₅-NH-R₆或-R₈OH，其中，R₅为烷基或烯基，R₆为烷基、环烷基，R₈为C1-C5的烷基；

R₃为-H、烷基、C6-10的芳香基、取代的烷基或取代的C6-10芳香基；

或，R₁、R₂与它们连接的碳原子一起形成环烷基、环烷酮基或被取代的环烷基、环烷酮基；

或，R₂、R₃与它们连接的碳原子一起形成环烷基、环烷酮基或被取代的环烷基、环烷酮基；

R₄为N、O或S；

R₉为-H或烷基，R₁₀为C6-10的芳香基；

或，R₉、R₁₀与它们连接的碳原子一起形成C6-10的芳香基或取代的C6-10的芳香基。

进一步地，所述蛋白激酶抑制剂为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂。

其中，所述的蛋白激酶抑制剂是治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心

血管

疾病、糖尿病、感染性疾病、关节炎、免疫紊乱或老年性痴呆症的药物。

进一步地，所述恶性肿瘤是多发性骨髓瘤、淋巴性细胞白血病、粒细胞白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌或乳腺癌；所述自身免疫性疾病是类风湿型关节炎、骨髓增殖性疾病、移植排斥反应、哮喘、红斑狼疮、银屑病、过敏或接触性皮炎。

其中，所述化合物为式Ⅱ化合物、2-(4-苯基-2-噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇、或2-(6-甲氧基-2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇；其中，式Ⅱ化合物的结构式如下

式Ⅱ，

R₁为-OH、-H、烷基、=O、

或-OR₇，其中，R₇为C1-C5的烷基；

R₄为N、O或S。

进一步地，R1为-OH、-H、烷基、=O；

R2为-H、烷基、-R5-NH-R6，其中，R5为烷基或烯基；R6为烷基、环烷基；

R3为-H、烷基；

或，R1、R2与它们连接的碳原子一起形成环烷基、环烷酮基或被取代的环烷基、环烷酮基；

或，R2、R3与它们连接的碳原子一起形成环烷基、环烷酮基或被取代的环烷基、环烷酮基；

R4为N或S。

进一步地，

R₁为-OH、-H、

或-OR₇，所述R₇为C1-C3的烷基；

R₂为-H、C1-C5的烷基、或-R₈OH，所述R₈为C1-C3的烷基；

R₃为-H、C1-C3的烷基、苯基、或卤素取代的C1-C3的烷基；

或，R₂、R₃与它们连接的碳原子一起形成C3-8的环烷基；

R₄为N、O或S。

更进一步地，

R₁为-OH、或-OR₇，所述R7为甲基；

R₂为-H、或-R₈OH，所述R₈为乙基；

R₃为甲基、苯基、或三氟取代的甲基；

或，R₂、R₃与它们连接的碳原子一起形成C5-C6的环烷基；

R₄为N、O或S。

进一步优选地，所述化合物为：

2-(1氢-苯并噻唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇、

2-(1氢-苯并咪唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇、

1-(1,3-苯并噻唑基-2基)-1,5,6,7-四氢-4H-吲唑-4-酮、

1-(1,3-苯并噻唑基-2基)-3,4-二甲基-1氢-吡唑-5-醇、

2-(2-苯并噻唑基)-2,4,5,6-四氢环戊吡唑-3-醇、

1-(2-苯并噻唑基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-醇、

1-(2-苯并噻唑基)-4-(2-羟乙基)-3-甲基-1H-吡唑-5-醇、

2-(2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醋酸酯、

2-(2-苯并噁唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇、或

1-(2-苯并噻唑基)-3-苯基-1H-吡唑-5-醇。

本发明还提供了式Ⅰ所示的化合物，其结构式如下：

式Ⅰ

R₁为-OH、-H、烷基、=O、

或-OR₇，其中，R₇为C1-C5的烷基；

R₄为N、O或S；

R₉为-H或烷基，R₁₀为C6-10的芳香基；

进一步地，所述化合物为式Ⅱ化合物、2-(4-苯基-2-噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇、或2-(6-甲氧基-2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇；其中，式Ⅱ化合物的结构式如下

式Ⅱ，

R₁为-OH、-H、烷基、=O、

或-OR₇，其中，R₇为C1-C5的烷基；

R₄为N、O或S；

当R₂、R₃与它们连接的碳原子一起形成C6的环烷基、R₁为-OH时，R₄不为S。

进一步地，R1为-OH、-H、烷基、=O；

R3为-H、烷基；

R4为N或S；

进一步优选地，所述化合物为：

2-(1氢-苯并咪唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇、

1-(1,3-苯并噻唑基-2基)-1,5,6,7-四氢-4H-吲唑-4-酮、

1-(1,3-苯并噻唑基-2基)-3,4-二甲基-1氢-吡唑-5-醇、

2-(2-苯并噻唑基)-2,4,5,6-四氢环戊吡唑-3-醇、

1-(2-苯并噻唑基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-醇、

1-(2-苯并噻唑基)-4-(2-羟乙基)-3-甲基-1H-吡唑-5-醇、

2-(2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醋酸酯、

2-(2-苯并噁唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇、或

1-(2-苯并噻唑基)-3-苯基-1H-吡唑-5-醇。

实验表明，本发明化合物能够有效抑制蛋白激酶活性、抑制异常活化的T细胞增殖，可用于治疗自身免疫性疾病、恶性肿瘤等疾病，特别是对淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、肝癌、移植排斥反应、过敏和类风湿性关节炎有显著的治疗作用，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1对蛋白激酶活性的影响

图2对移植排斥反应的影响

图3对迟发性变态反应的影响

具体实施方式

实施例12-(1氢-苯并噻唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇（简称化合物1）的制备

混合原料2-环己酮甲酸甲酯（0.264mol），2-肼基苯并噻唑（0.333mol），甲苯700mL,取醋酸1ml（醋酸与原料2-环己酮甲酸甲酯摩尔比约为0.07：1），于1000mL反应瓶，加热120-125℃回流反应5h（TLC监测反应终点）。反应液减压蒸干，残留物加800mL乙醇重结晶，过滤，干燥，得橙黄色固体粉末36g，收率50%，经HPLC测定，化合物纯度达到98.22%，该化合物的结构鉴定数据如下：

ESI-MS:m/z 270(M-1)-

UV(MeOH)λmax=218nm;

1H NMR(DMSO-d6，600MHz)：δ8.01(d,1H,J=7.86Hz),7.78(d,1H,J=7.80Hz),,7.46(t,1H,J=7.6Hz)，7.33(t,1H,J=7.5Hz),2.50(m,2H),2.20(m,2H),1.73(m,2H)，1.67(m,2H)。

13C NMR(DMSO-d6,150MHz);δ162.3,154.6,153.3,148.9,132.2,126.9,124.3,122.6,121.0,102.5,22.3,22.2,21.7,18.7;ESI-MS:m/z 272[M+1]+;HRESIMS m/z calcd for C14H14N3OS[M+1]+272.0852,found 272.0849.

实施例22-(2-苯并噻唑基)-2,4,5,6-四氢环戊吡唑-3-醇（简称化合物5）的制备

除用原料环戊酮酯代替上述反应中的环己酮酯，其余同实施例1制备。实施例31-(2-苯并噻唑基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-醇（简称化合物6）的制备

按反应式混合原料酯（2g，0.011mol），原料肼（2.2g，0.013mol），甲苯70mL,醋酸0.1mL于150mL反应瓶，外加热120-125℃回流反应5h（TLC监测反应终点）。反应液减压蒸干，残留物加70mL乙醇重结晶，过滤，干燥，得白色固体粉末0.23g，收率5%。该化合物的结构鉴定数据如下：

1H NMR(DMSO-d6，600MHz)：δ8.08(d,1H,J=6.0Hz),7.94(d,1H,J=6.0Hz),7.52(t,1H,J=6.0Hz)，7.43(t,1H,J=6.0Hz),5.95(s,1H),3.43(s,1H)。ESI-MS:m/z 284(M-1)-

实施例41-(2-苯并噻唑基)-4-(2-羟乙基)-3-甲基-1H-吡唑-5-醇（简称化合物7）的制备

按实施例3的制备方法，替换反应原料后，制备得白色固体粉末0.89g，收率8%。该化合物的结构鉴定数据如下：

1H NMR(DMSO-d6，600MHz)：δ8.02(d,1H,J=12.0Hz),7.80(d,1H,J=6.0Hz),7.47(t,1H,J=12.0Hz)，7.33(t,1H,J=6.0Hz),3.47(t,2H,J=6.0Hz),2.37(t,2H,J=6.0Hz),2.20(s,3H)。

ESI-MS:m/z 274(M-1)-

实施例52-(6-甲氧基-2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇（简称化合物8）的制备

按照实施例3的制备方法，替换反应原料后，得蓝色粉末0.7g，收率7.0%。

该化合物的结构鉴定数据如下：

1H NMR(DMSO-d6，600MHz)：δ7.67(d,1H,J=6.0Hz),7.62(s,1H),7.05(d,1H,J=6.0Hz)，3.80(s,3H),2.19(s,2H),1.72(d,1H,J=6.0Hz),1.66(d,3H,J=6.0Hz)。

ESI-MS:m/z 300(M-1)-

实施例62-(2-苯并噁唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇（简称化合物10）的制备

按照实施例3的制备方法，替换反应原料后，得灰白色粉末0.1g，收率2.5%。该化合物的结构鉴定数据如下：

1H NMR(DMSO-d6，600MHz)：δ7.68(m,2H),7.33(m,2H),2.17(s,2H),1.72(m,4H)。

ESI-MS:m/z 256(M+1)+

实施例72-(4-苯基-2-噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇（简称化合物11）的制备

按照实施例3的制备方法，替换反应原料后，得灰白色粉末0.9g，收率9.4%。该化合物的结构鉴定数据如下：

1H NMR(DMSO-d6，600MHz)：δ11.69(s,1H),7.97(d,2H,J=6.0Hz),7.71(s,1H),7.43(t,2H,J=6.0Hz),7.33(t,1H,J=6.0Hz),2.53(t,2H,J=6.0Hz),2.19(s,2H),1.73(d,2H,J=6.0Hz),1.67(d,2H,J=6.0Hz)。

ESI-MS:m/z 298(M+1)+

实施例81-(2-苯并噻唑基)-3-苯基-1H-吡唑-5-醇（简称化合物12）的制备

按照实施例3的制备方法，替换反应原料后，得白色固体粉末0.81g，收率8.2%。该化合物的结构鉴定数据如下：

1H NMR(DMSO-d6，600MHz)：δ8.05(d,1H,J=6.0Hz),7.89(m,3H),7.50(m,4H)，7.38(t,1H,J=6.0Hz),6.10(s,1H)。

ESI-MS:m/z 292(M-1)-

实施例92-(2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醋酸酯（简称化合物9）的制备

取实施例1制备的2-(1氢-苯并噻唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇（1.0g，0.0037mol），Ac2O 20mL于100mL反应瓶,回流反应1h（TLC监测反应终点）。反应液减压蒸干，残留物加20mL乙醇重结晶，过滤，干燥，得淡黄色固体粉末0.91g，收率90%。该化合物的结构鉴定数据如下：

1H NMR(DMSO-d6，600MHz)：δ8.02(d,1H,J=6.0Hz),7.85(d,1H,J=6.0Hz),,7.48(t,1H,J=6.0Hz)，7.38(t,1H,J=6.0Hz),2.64(t,2H,J=6.0Hz),2.47(s,3H),2.41(t,2H,J=6.0Hz),1.76(d,2H,J=6.0Hz)，1.68(d,2H,J=6.0Hz)。ESI-MS:m/z 314(M+1)+

以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。

试验例1本发明化合物对蛋白激酶活性的影响

CTLL-2细胞按照1×10⁷个细胞/孔铺平底6孔板，并加入本发明化合物1。IL-2饥饿培养6小时后，加入IL-2，终浓度为100U/ml，孵育10min。收集细胞，600G，5min离心去掉上清，PBS洗涤一次，取细胞沉淀，加入细胞裂解液裂解细胞。收集蛋白供Western-blot检测，待测激酶为磷酸化Akt、磷酸化JAK3以及磷酸化STAT5。

实验结果：结果参见图1。

结果表明，本发明化合物1（实施例1制备）可以抑制蛋白质激酶Akt（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶）、JAK3（酪氨酸激酶）以及STAT5（信号传导及转录激活因子）磷酸化，表明本发明化合物可有效抑制蛋白激酶活性。

试验例2本发明化合物对T细胞的影响

1、对静息T细胞毒性

方法：

1.人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）制备：健康人员献血，利用PBS等比例稀释血液，在10ml尖底玻璃离心管中加入3mlPBMC分离液后，倾斜45℃缓缓加入6ml血液-PBS混合液，600g离心20min，吸取富含PBMC中间层，PBS洗涤2次后用细胞培养基重悬。

2.从PBMC中纯化T细胞：利用MiltenylT细胞磁珠纯化试剂盒从PBMC中分离得到T细胞，步骤如下：上述制备的PBMC细胞悬液，500G离心5分钟，去掉上清；PBS缓冲液1（pH=7.2,含0.5%BSA,2mM EDTA）45μl重悬后加入生物素标记抗CD14,CD16,CD19,CD36,CD56,CD123,and GlycophorinA抗体30μl，混匀后4℃孵育20分钟。加入上述缓冲液1ml 500G，5分钟洗涤细胞，去上清。重悬细胞，安装吸附柱，让细胞悬液通过吸附柱，吸附非T细胞，得到纯化T细胞。

3.T胞按照2×10⁵个细胞/孔，铺96孔板，体积为200μl。化合物最高浓度为50μM，按照5倍梯度稀释，培养72小时后，使用CCK-8染色法检测药物对T细胞毒性。细胞存活率=药物组细胞OD/不加药物组细胞数量×OD。存活率为95%以药物浓度视为对T细胞没有毒性。IC50为药物抑制T细胞活性一半时的浓度。结果参见表1。

2、抑制CD3,CD28双抗刺激的人T细胞增殖

方法：

1.制备含有抗人CD3、CD28双抗的培养基：含抗人CD3抗体2μg/ml PBS包被12小时后，PBS洗涤2次后，加入含有1μg/ml抗人CD28抗体的培养基100μl。

2.羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)：加入CFSE到纯化好的T细胞当中，其中CFSE终浓度为2.5μM，T细胞浓度为1×10⁶个/ml。37°C孵育10分钟，300G离心5分钟，弃上清，加入培养基洗涤2次后，用1μg/ml抗人CD28抗体的培养基重悬后铺96孔板。化合物按照梯度稀释后加入，培养72小时上流式细胞仪进行观察，并计算抑制T细胞增殖的IC50。实验结果：结果参见表1。

表1

注：“NA”表示无抑制活性或活性极低。

T细胞的异常增殖，对自身免疫性疾病和恶性肿瘤的产生有重要影响。实验结果表明，本发明化合物能够显著抑制人活化T细胞，但对静息T细胞没有毒性。说明本发明化合物对T细胞的异常增殖导致的自身免疫性疾病和恶性肿瘤有一定的预防或治疗作用。

试验例3本发明化合物抑制人淋巴细胞瘤细胞增殖

方法：Jurkat细胞按照1500个细胞/孔铺平底96孔板。培养体系中，化合物最高浓度为50μM，按照5倍梯度做药物浓度稀释。化合物作用48小时后加入10μl CCk-8，孵育6h后，利用酶标仪测定450nM波长吸收值。

化合物对肿瘤细胞生长抑制率计算方法按照美国国家癌症研究所（National Cancer Institute,NCI）标准方法进行：当Ti（药物组培养48h，CCK-8显色吸收OD值）≥Tz（不含药物组培养起始时CCK-8显色吸收OD值），肿瘤细胞存活率=[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100，其中C为不含药物组48小时后CCK-8显色吸收OD值；当Ti<Tz时，肿瘤细胞存活率=[(Ti-Tz)/Tz]×100。

实验结果：结果参见表2。

表2

注：“NA”表示无抑制活性或活性极低。化合物编号参见试验例2。

实验结果表明，本发明化合物对淋巴细胞瘤细胞抑制作用明显，其中，化合物1、2、3的抑制作用较优。

试验例4本发明化合物抑制人多发性骨髓瘤细胞增殖

方法：多发性骨髓瘤细胞RPMI8226细胞按照5000个细胞/孔铺平底96孔板。培养体系中，化合物最高浓度为50μM，按照5倍梯度做药物浓度稀释。化合物作用48小时后加入10μl CCk-8，孵育6h后，利用酶标仪测定450nM波长吸收值。药物对肿瘤细胞生长抑制率计算方法按照美国国家癌症研究所（National Cancer Institute,NCI）标准方法进行：当Ti（药物组培养48h，CCK-8显色吸收OD值）≥Tz（不含药物组培养起始时CCK-8显色吸收OD值），肿瘤细胞存活率=[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100，其中C为不含药物组48小时后CCK-8显色吸收OD值；当Ti<Tz时，肿瘤细胞存活率=[(Ti-Tz)/Tz]×100。

实验结果：结果参见表3。

表3

化合物编号参见试验例2。

实验结果表明，本发明化合物对多发性骨髓瘤细胞抑制作用明显。试验例5本发明化合物抑制人乳腺癌肿瘤细胞增殖

方法：人乳腺癌肿瘤细胞MCF-7细胞按照3000个细胞/孔铺平底96孔板。培养体系中，药物最高浓度为50μM，按照5倍梯度做药物浓度稀释。药物作用48小时后加入10μl CCk-8，孵育6h后，利用酶标仪测定450nM波长吸收值。药物对肿瘤细胞生长抑制率计算方法按照美国国家癌症研究所（National Cancer Institute,NCI）标准方法进行：当Ti（药物组培养48h，CCK-8显色吸收OD值）≥Tz（不含药物组培养起始时CCK-8显色吸收OD值），肿瘤细胞存活率=[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100，其中C为不含药物组48小时后CCK-8显色吸收OD值；当Ti<Tz时，肿瘤细胞存活率=[(Ti-Tz)/Tz]×100。

实验结果：结果参见表4。

表4

化合物编号参见试验例2。

实验结果表明，本发明化合物对人乳腺癌肿瘤细胞抑制作用明显。

试验例6本发明化合物抑制人肝癌肿瘤细胞增殖

方法：多人肝癌肿瘤细胞Hep3B按照2500个细胞/孔铺平底96孔板。培养体系中，药物最高浓度为50μM，按照5倍梯度做药物浓度稀释。药物作用48小时后加入10μl CCk-8，孵育6h后，利用酶标仪测定450nM波长吸收值。药物对肿瘤细胞生长抑制率计算方法按照美国国家癌症研究所（National Cancer Institute,NCI）标准方法进行：当Ti（药物组培养48h，CCK-8显色吸收OD值）≥Tz（不含药物组培养起始时CCK-8显色吸收OD值），肿瘤细胞存活率=[(Ti-Tz)/(C-Tz)]×100，其中C为不含药物组48小时后CCK-8显色吸收OD值；当Ti<Tz时，肿瘤细胞存活率=[(Ti-Tz)/Tz]×100。

实验结果：结果参见表5。

表5

化合物编号参见试验例2。

实验结果表明，本发明化合物对人肝癌肿瘤细胞抑制作用明显。

试验例7本发明化合物抑制移植排斥反应的考察

建立不同品系小鼠的皮肤移植模型：选择8～12周C57BL/6与Bal b/c雌性小鼠为实验对象，饲养在SPF级屏障环境内，饲料辐照消毒，垫料和饮用水均高压灭菌。以Balb/c小鼠为受者，C57/BL/6小鼠为供者。供者麻醉后俯卧固定，消毒后约取1cm×1cm的背部皮肤，刮去皮下的脂肪以及血管等组织，放于无菌的生理盐水中备用。受者麻醉后俯卧固定，背部消毒后，取下比供体皮肤稍大一点的皮肤，作为移植床。将供体皮肤平铺于移植床上，对齐后用创可贴固定。

实验共分6组，每组6只小鼠：模型组（生理盐水）、阳性对照组（环孢菌素CsA，5mg/kg/天）、本发明化合物1，2，6，11共4组（50mg/kg/天）（化合物编号参见试验例2）。从移植前一周开始给药，移植后再连续给药一周，均采用腹腔注射给药。

移植排斥反应检测方案：皮肤移植7天后拆掉创可贴，每天观察移植皮片的颜色、硬度、脱落及鼠毛生长情况，如皮片变硬或结痂脱落，则为移植物排斥；皮片柔软或鼠毛生长，则为移植物存活。记录皮片从移植到发生排斥的时间，计算皮片平均生存时间MST。结果参见图2。

结果表明，本发明化合物1，2，6，11均能够明显延长移植物存活时间，作用效果与阳性对照环孢菌素A相当，本发明化合物能够有效抑制移植排斥反应；其中，化合物1的药效作用优于其他化合物。

试验例8：发明化合物抑制迟发型超敏反应(DTH)。

建立二硝基氟苯（DNFB）诱导的小鼠DTH模型：BALB/c小鼠左右脚掌均匀涂布20μl 0.5%（v/v）DNFB溶液(溶于4:1丙酮-橄榄油中)，以单独涂布丙酮/橄榄油溶剂作为对照，每天1次，连续2天。第2次致敏后9天进行激发试验：即在小鼠右耳内外两面均匀涂布10μl 0.5%（v/v）DNFB溶液。72h后用8mm耳肿打耳器，双耳打孔取耳片，称重并计算右耳片增加的重量。动物分组：将35只BALB/c小鼠随机分为A、B、C、D、E、F组，每组5只小鼠。A组为DNFB致敏的阳性组，B组为阳性对照药物CsA。C、D、E、F组分别为本发明化合物1，2，6，11处理组（化合物编号参见试验例2）。从第1次DNFB致敏前两天至取耳片称重为止，按照50mg/kg/天的剂量，腹腔注射一次本发明化合物，阳性对照药物CsA按照5mg/kg/天的剂量，腹腔注射。结果参见图3。

结果表明，本发明化合物1,2,6,11均能够有效抑制迟发型超敏反应。

试验例9：本发明化合物抑制类风湿性关节炎

选择6-10周DBA/1J小鼠，将50ug牛Ⅱ型胶原与等体积完全弗氏佐剂（CFA）完全乳化后皮下注射。21天后以50ug相同抗原与不完全弗氏佐剂（IFA）充分乳化后，加强免疫1次。从第45天开始观察记录。采用1-4计分法：1分，正常；2分，1个关节肿胀；3分，超过1个关节肿胀，但并未累积全部关节；4分，整个爪的严重肿胀或强直。每只爪的评分相加即得到小鼠关节炎症的总评分。关节总评分大于1的小鼠为模型建立成功。

实验分组：常雄性Balb/C小鼠6只，成功建立小鼠类风湿关节炎模型的雄性DBA/1J小鼠30只，每组6只，体重30±4.7g/只，分组情况如下：A．正常小鼠对照组；B．CIA：生理盐水治疗组(阴性对照组)、环孢菌素CsA，15mg/kg/day）、本发明化合物1：2-(1氢-苯并噻唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇、本发明化合物2：2-(1氢-苯并咪唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇，本发明化合物6：1-(2-苯并噻唑基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-醇，本发明化合物11：2-(4-苯基-2-噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇给药组（50mg/kg/day）。第45天为治疗的第一天，选择小鼠后肢内侧进行肌肉注射。给药2周后，对各组小鼠关节炎症评分。结果参见表6。

表6

分组	评分
		Control	1
0.9%NaCl（阴性照组）	4
		环孢菌素A（阳性对照）	2
本发明化合物1给药组	2
		本发明化合物2给药组	2
本发明化合物6给药组	3
		本发明化合物11给药组	1

化合物编号参见试验例2。

实验结果表明，本发明化合物1、2、6、11能够有效治疗类风湿性关节炎，其药效与阳性对照环孢菌素A相当；其中，化合物11的药效作用最强，甚至优于阳性药物。

综上所述，本发明化合物能够有效抑制蛋白激酶活性，能够有效抑制异常活化的T细胞增殖，可用于治疗自身免疫性疾病、恶性肿瘤等疾病，特别是对淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌、肝癌、移植排斥反应、过敏和类风湿性关节炎有显著的治疗作用，具有良好的工业应用前景。

Claims

1.式Ⅰ所示的化合物在制备蛋白激酶抑制剂中的用途，

式Ⅰ

R₁为-OH、-H、烷基、=O、

或-OR₇，其中，R₇为C1-C5的烷基；

R₄为N、O或S；

R₉为-H或烷基，R₁₀为C6-10的芳香基；

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述蛋白激酶抑制剂为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂或酪氨酸激酶抑制剂。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述的蛋白激酶抑制剂是治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、关节炎、免疫紊乱或老年性痴呆症的药物。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述恶性肿瘤是多发性骨髓瘤、淋巴性细胞白血病、粒细胞白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌或乳腺癌；

所述自身免疫性疾病是类风湿型关节炎、骨髓增殖性疾病、移植排斥反应、哮喘、红斑狼疮、银屑病、过敏或接触性皮炎。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述化合物为式Ⅱ化合物、2-(4-苯基-2-噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇、或2-(6-甲氧基-2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇；其中，式Ⅱ化合物的结构式如下

式Ⅱ，

R₁为-OH、-H、烷基、=O、或-OR₇，其中，R₇为C1-C5的烷基；

R₄为N、O或S。

6.根据权利要求1或5所述的用途，其特征在于：

R₁为-OH、-H、

或-OR₇，所述R₇为C1-C3的烷基；

R₂为-H、C1-C5的烷基、或-R₈OH，所述R₈为C1-C3的烷基；

R₃为-H、C1-C3的烷基、苯基、或卤素取代的C1-C3的烷基；

或，R₂、R₃与它们连接的碳原子一起形成C3-8的环烷基；

R₄为N、O或S。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：

R₁为-OH、

或-OR₇，所述R₇为甲基；

R₂为-H、或-R₈OH，所述R₈为乙基；

R₃为甲基、苯基、或三氟取代的甲基；

或，R₂、R₃与它们连接的碳原子一起形成C5-C6的环烷基；

R₄为N、O或S。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述化合物为：

2-(1氢-苯并噻唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇、

2-(1氢-苯并咪唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇、

1-(1,3-苯并噻唑基-2基)-1,5,6,7-四氢-4H-吲唑-4-酮、

1-(1,3-苯并噻唑基-2基)-3,4-二甲基-1氢-吡唑-5-醇、

2-(2-苯并噻唑基)-2,4,5,6-四氢环戊吡唑-3-醇、

1-(2-苯并噻唑基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-醇、

1-(2-苯并噻唑基)-4-(2-羟乙基)-3-甲基-1H-吡唑-5-醇、

2-(2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醋酸酯、

2-(2-苯并噁唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇、或

1-(2-苯并噻唑基)-3-苯基-1H-吡唑-5-醇。

9.式Ⅰ所示的化合物，其结构式如下：

式Ⅰ

R₁为-OH、-H、烷基、=O、

或-OR₇，其中，R₇为C1-C5的烷基；

R₄为N、O或S；

R₉为-H或烷基，R₁₀为C6-10的芳香基；

10.根据权利要求9所述的化合物，其特征在于：所述化合物为式Ⅱ化合物、2-(4-苯基-2-噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇、或2-(6-甲氧基-2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇；其中，式Ⅱ化合物的结构式如下

式Ⅱ，

R₁为-OH、-H、烷基、=O、

或-OR₇，其中，R₇为C1-C5的烷基；

R₄为N、O或S；

11.根据权利要求所述的化合物，其特征在于：所述化合物为：

2-(1氢-苯并咪唑基-2基)-4,5,6,7-四氢-2氢-吲唑-3-醇、

1-(1,3-苯并噻唑基-2基)-1,5,6,7-四氢-4H-吲唑-4-酮、

1-(1,3-苯并噻唑基-2基)-3,4-二甲基-1氢-吡唑-5-醇、

2-(2-苯并噻唑基)-2,4,5,6-四氢环戊吡唑-3-醇、

1-(2-苯并噻唑基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-5-醇、

1-(2-苯并噻唑基)-4-(2-羟乙基)-3-甲基-1H-吡唑-5-醇、

2-(2-苯并噻唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醋酸酯、

2-(2-苯并噁唑基)-4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-3-醇、或

1-(2-苯并噻唑基)-3-苯基-1H-吡唑-5-醇。