CN102869988B - 移植片的评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的方法，其包括求出多核化能力的工序，所述多核化能力为表征所述具有多核化功能的细胞进行多核化的能力的指标，及用于该评价的系统。

Description

移植片的评价方法
技术领域
本发明涉及评价移植片的移植适宜性的方法。
背景技术
虽然近年心脏病治疗在不断革新进步，但仍然没有建立起重症心力衰竭的治疗体系。作为心力衰竭的治疗法，进行的是利用阻滞剂、ACE抑制剂的内科治疗，但对这些治疗不很奏效的重症化的心力衰竭而言，进行辅助人工心脏、心脏移植等置换型治疗，也即外科治疗。
这类成为外科治疗对象的重症心力衰竭包括多种起因，如进行性心脏瓣膜症、高度的心肌缺血所致、急性心肌梗塞和其合并症、急性心肌炎、缺血性心肌病（ICM）、扩张型心肌病（DCM）等所致的慢性心力衰竭及其急性加重等。
根据上述原因和重症度，而应用瓣膜成形术/置换术、冠状动脉架搭桥术、左心室成形术、机械辅助循环等。
其中，对于ICM、DCM所致的高度左心室功能低下导致的心力衰竭而言，仅仅心脏移植和利用了人工心脏的置换型治疗可以视为其的有效治疗方法。但是，这些重症心力衰竭患者的置换型治疗存在慢性的供体不足、需要持续进行免疫抑制、引发合并症等很多需要解决的问题，难以称为适用于所有重症心力衰竭的普适治疗法。
由于这样严峻的心脏移植现状，在一个时期内曾尝试进行巴提斯塔（Batista operation）术等其它外科治疗，虽然其作为心脏移植的代替治疗而广受关注，但最近这些手术的限制也逐渐显现，需要在手术法的改良和适应性的确立方面继续努力。
另一方面，最近认为，作为重症心力衰竭治疗的解决方案，新型再生医疗的开展是必不可少的。
在重症心肌梗塞等中，心肌细胞陷入功能衰竭，进而发生成纤维细胞的增殖、间质纤维化，而呈现心力衰竭。随着心力衰竭的加重，心肌细胞受损直至细胞死亡，由于心肌细胞几乎不发生细胞分裂，因此心肌细胞数减少，心脏功能下降进一步加剧。
对于这类重症心力衰竭患者的心脏功能恢复而言，细胞移植法被认为是有用的，并已经开始了自身骨骼肌成肌细胞的临床应用。
近年，作为其一个例子，通过使用利用组织工程学的温度响应性培养皿，提供一种包括来自于成体心肌以外部分的细胞的、能够用于心脏的三维结构的细胞培养物和其制造方法（专利文献1）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007－528755号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供一种简便且准确地评价包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性的方法。
用于解决问题的方案
如上所述，虽然近年利用再生医疗已开发了应可解决细胞移植的各种问题的各种移植片、尤其是片状细胞培养物等，但现状是所述移植片依然难以制造，成本也高。
但是，本发明人即使在以同样的方法对利用同样的方法制造的移植片进行移植时，遭遇了细胞的存活率、组织化的状态方面产生差异这一此前未知的新课题。为了解决所述课题持续进行了研究，发现骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物中，当将片状的骨骼肌成肌细胞解离、在培养基中孵育该解离细胞时，在形成融合细胞更多的群中，产生更多的促进心肌再生的细胞因子，进而继续进行深入研究，从而完成了本发明。
即，本发明涉及以下方案。
（1）一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的方法，其包括求出多核化能力的工序，所述多核化能力为表征所述具有多核化功能的细胞进行多核化的能力的指标。
（2）根据（1）的方法，求出多核化能力的工序包括：
（i）将1或2个以上的所述移植用试样的一部分解离成单个细胞的步骤、
（ii）对（i）中解离后的细胞进行接种、孵育的步骤、及
（iii）检测（ii）中孵育的细胞培养物中的多核细胞的步骤，
所述方法包括对求出的多核化能力和预先设定的阈值进行比较的工序。
（3）根据（1）或（2）的方法，其中，具有多核化功能的细胞为骨骼肌成肌细胞。
（4）根据（1）～（3）的方法，其中，多核化能力为多核化率。
（5）根据（1）～（3）的方法，其中，具有多核化功能的细胞为骨骼肌成肌细胞，求出的多核化能力为多核化率，将该多核化率大于预先设定的阈值的情况评价为适合用于心脏移植。
（6）一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的系统，其包括：用于检测多核细胞的检测部、及用于求出多核化能力的计算部。
（7）根据（6）的系统，其中，检测部具有用于解析所拍摄的细胞图像的图像解析部。
（8）根据（7）的系统，其中，图像解析部含有用于拍摄进行了染色的细胞的拍摄部，利用该图像解析部进行的解析包括对所述拍摄部拍摄的细胞图像中的细胞区域及细胞核区域进行区分的工序。
发明的效果
根据本发明，能够简便地从移植片中筛选具有更高存活能力及组织化能力的移植片，其结果是能够提高通过移植移植片而进行的再生医疗的治疗效果。此外，通过使用本发明的评价方法，能够在移植片制造中不断地提供高品质的移植片。此外，通过能够用于本发明方法的检测多核细胞的系统，能够简便且准确地检测多核细胞，能够进一步提高本发明的评价精度。
附图说明
图1为表示2种骨骼肌成肌细胞（myoA、myoB）的多核化率的图表。对比myoA和myoB可知myoB的多核化率更高。
图2为表示由上述多核化率不同的两种骨骼肌成肌细胞（myoA、myoB）构成的、2种片状骨骼肌成肌细胞培养物（片A、片B）的细胞因子产生能力的差异的图表。可知，由多核化率高的myoB构成的片B的细胞因子产生量显著高于由多核化率低的myoA构成的片A。
图3：a）是多核化后的骨骼肌成肌细胞的图像。这样的图像是在本发明系统的一个方式中拍摄的。b）为在本发明的一个方式中对a）的图像进行多核细胞检测而成的图。图像中，首先区分细胞区域，进而区分细胞区域中所存在的核区域，对封闭的细胞区域部分中所存在的封闭的核区域的数目进行计数。将具有多个核区域的细胞区域识别为多核细胞。该图的情况下，多核细胞计数为8个。
图4表示本发明系统的一个方式中的、图像解析处理的流程图。图中，各条件分别为，条件1：图像中的核数为100个以下，条件2：图像中的核数为1个以上，条件3：图像中无细胞的区域所占的面积小于50％，条件4：图像中不存在除无细胞的区域、细胞质及核以外的区域。
具体实施方式
本发明涉及一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的方法，其包括求出多核化能力的工序，所述多核化能力为表征所述具有多核化功能的细胞进行多核化的能力的指标。
本发明中的移植用试样典型的是由培养的细胞和／或其产生物构成的，也包括用于填补和／或支持生物体的规定部（例如患部等）的各种材料（填补材料、支持材料）等。移植用试样典型的是用于哺乳动物、例如人和家畜等的疾病、伤病的治疗等，但并非仅限于此。移植片的形状没有特别限定，可以是例如片状、膜状、块状、柱状等各种形状。本发明中，在提及移植用试样时，既可以是指1个移植片，也可以是指由多个移植片构成的移植片集合体。移植片集合体较典型的可以列举出例如同一批次中所制造的移植片的集合体等，但并非仅限于此。
本说明书中，“多核化”是指一个细胞中含有多个细胞核的状态。多核化的原因可以认为是融合、细胞分裂、核内DNA的片段化、细胞或核的摄入、分化等各种原因。本说明书中的“多核化”是指一个细胞中含有多个细胞核的状态，而不论原因如何，因此“多核细胞”是指具有多个细胞核的所有细胞。即，该技术领域中，虽然在语言上将原生动物、菌类中产生的具有多个核的细胞即“多核体”与昆虫、动物等中产生的具有多个核的细胞即“合胞体（也称为合体细胞或融合细胞等）”区别开来，但本申请发明中的“多核细胞”包括这些中的任一种。鉴于其为可包含于移植用试样中的细胞，而优选为合胞体。
本说明书中，“移植适宜性”是表示移植用试样适合于移植的程度的。若对移植适宜性分类，则可以用任意的分类方法进行评价，例如将为某基准以上的设为适合，将低于基准的设为不合，从而将全部分成两部分，也可以分成若干类并根据移植时的适合程度对品质进行评估。
本说明书中，“多核化能力”是以数值等表示移植用试样中的细胞进行多核化的能力的、能够比较的指标，表示移植用试样的特性。本发明中，由移植用试样的一部分求得的多核化能力视为表示所述试样整体的多核化能力的指标。多核化能力只要反映试样中的细胞进行多核化的能力即可，可以为任意。可以列举出例如：对部分试样进行处理后，该处理后的试样中所存在的多核细胞的数、处理后的试样中的具有多核化能力的细胞的多核化率、处理后的试样中的多核细胞中的总核数、该试样中的细胞的平均核数、所产生的细胞因子量、该处理后的试样所保有的蛋白质（例如肌酸激酶、接蛋白、肌球蛋白、肌动蛋白等）的定量、以及可视为与上述等同的数值等，但并非仅限于此。
本发明是基于所述多核化能力可以作为用于评价移植用试样的移植适宜性的基准、这一本发明人新发现的事实而实现的。
本发明中，多核化能力可以用任意方法求出，具体而言，可以根据测定对象、例如多核化处理后的多核细胞数、多核化处理后的试样细胞中的平均核数等而改变。多核化能力既可以由试样直接测定而求出，也可以通过由试样测定的特性值经计算而求出。此外，在由试样测定特性值之前，还可以进行用于测定该特性值的特定的处理。例如，在通过本发明的方法评价骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物时，可以在测定前进行使片状细胞培养物中的细胞进行多核化的处理。测定既可以是侵入性的也可以是非侵入性的。
本发明的一个方式中，在多核化处理后进行多核化能力的测定。具体而言，多核化能力的测定包括：
（i）将1或2个以上的移植用试样的一部分解离成单个细胞的步骤、
（ii）对（i）中解离后的细胞进行接种、孵育的步骤、及
（iii）检测（ii）中孵育的细胞中的多核细胞的步骤。
上述步骤（i）中，将一部分试样散乱地解离成单个细胞。解离方法可以使用本领域技术人员所熟知的方法，典型的可以列举出胰蛋白酶处理等，但并非仅限于此。为了后续步骤，期望步骤（i）的处理对细胞的损伤尽量少。
上述步骤（ii）中，将步骤（i）中散乱地解离的细胞接种在培养基中，进行孵育。所述步骤中，所述解离的细胞被进行多核化处理。因此，用于接种的培养基可以使用可以用于培养细胞的所有培养基，但优选为含有促进多核化的成分的培养基。孵育的条件可以是该技术领域中已知的条件，典型的是37℃、5％CO2等，但并非仅限于此。
上述步骤（iii）中，对步骤（ii）中所孵育的细胞培养物中的多核细胞进行检测。多核细胞的检测可以使用该技术领域中已知的所有方法。典型的方法可以列举出：用染料、荧光物质等将核染色，通过目视和／或拍摄而识别多核细胞的方法，或用荧光物质将核染色，使用流式细胞仪（FCM）等细胞分选仪分选具有一定以上的荧光强度的细胞的方法等，但并非仅限于此。
通过上述步骤（iii）检测多核细胞，由此求出多核化能力。但并非仅限于此，还可以求出例如多核细胞数、多核化率、多核化核数等。求出的多核化能力与预先设定的阈值进行比较。阈值的数值及个数可以根据求取的多核化能力、评价的种类或程度而不同。例如，在使用多核化率作为多核化能力时，可以将具有更高的多核化率的试样判断为更适合，在以5等级进行评价时可以使用4个阈值进行评价，但是并非仅限于此。
阈值可以通过任意方法求出。例如，可以依据经验进行设定，也可以与上述各步骤同样地对1或2种以上基准试样进行处理而测定多核化能力，对该多核化能力进行统计学处理而求出，但并非仅限于此。
本发明中，“具有多核化功能的细胞”只要是可以用于移植用试样的细胞即可，可以使用任意的细胞。典型的是具有分化为骨骼肌能力的细胞，但并非仅限于此。本发明的一个方式中，从移植片在再生医疗中的有用性、细胞的培养及移植片的制作的容易性、制作的移植片的处理性、高有效性等观点出发，具有多核化功能的细胞为骨骼肌成肌细胞。
多核化能力只要反映试样中细胞进行多核化的能力即可，可以使用任意指标，在本发明的一个方式中，从测定的简便性、准确性等观点出发而使用多核化率。本说明书中，“多核化率”是指：对试样中的细胞进行多核化处理后，多核化细胞相对于试样中的总细胞数的比例或可以视为与其同等的比例。因此，既可以求出试样中的总细胞数及多核化细胞数而算出，也可以求出例如随机选择的1或2个以上部分中的多核化率，对其取平均。
下面列举本发明的一个方式来说明本发明，但本发明不受其限定。
本发明的一个方式中，对骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物进行评价。骨骼肌成肌细胞近年被认为是对心脏的再生医疗有用的移植用细胞，其片状细胞培养物适合用作移植片。
为了对上述的片状细胞培养物进行评价，而将片状细胞培养物解离成各个细胞。解离后，对这些细胞进行接种、孵育。在孵育一定时间后，对细胞的核及细胞质进行染色，在显微镜下观察，对多核细胞数及总细胞数进行计数，在多个视野中进行上述操作，算出多核化率。将所得多核化率与预先设定的阈值进行比较，当大于阈值时，可以判断为适合用于心脏移植。
本发明的方法中，非常优选迅速且简便、进而无偏差地准确进行多核细胞的检测。因此，本发明包括一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的系统，其包括：用于检测多核细胞的检测部、及用于求出多核化能力的计算部。利用所述系统进行多核细胞的检测具有客观性，能够进行更准确的评价，此外能够迅速且简便地进行本发明的评价。
所述检测部只要能够对多核细胞和其以外的细胞进行分类即可，可以采用任意系统。例如，可以列举出：以1个细胞中的核信号的大小为指标并以FCM进行分类的系统，对细胞质及核进行染色、拍摄并对该细胞图像进行图像解析从而对多核细胞和其以外的细胞进行分类的系统，或将多核化处理后的细胞再次解离成单个细胞并对其粒度分布进行计测的系统，或上述系统的组合等，但并非仅限于此。检测部的分类结果输出到计算部。
在输出到计算部的同时，还可以输出到用于输出分类结果的记录·输出部。作为记录部，可以列举出例如硬盘、闪存盘等记录介质，打印机等，作为输出部，可以列举出例如显示用监视器、向预先登录的手机、互联网邮件地址的发送等，但并非仅限于此，可以使用本领域技术人员已知的用于记录·输出所有记录·输出部。此外，检测部还可以具备用于输入检测条件等的输入部。作为输入部，可以列举出例如键盘、条形码阅读器、触控面板等，但并非仅限于此，可以使用本领域技术人员已知的所有输入部。
所述计算部为对由检测部输入的分类结果进行分析并计算多核化能力的部分。例如，基于由检测部输入的FCM的信息、通过图像解析而进行分类的多核细胞及其以外的细胞的信息、基于粒度分析的粒度分布信息等，计算多核化率等多核化能力。计算部可以具有用于输入计算条件等的输入部、用于记录·输出计算结果的记录·输出部，此外这些还可以与检测部一起存在。进而，计算部中还可以与预先设定的阈值进行比较。阈值可以是预先记录在记录部中的值，也可以是在检查前输入的值，还可以是对过去的检查结果进行反馈、统计分析的值。
本发明的一个方式中，从能够获得、更直接、准确地分析细胞的各种相关信息等观点出发，优选检测部具有图像解析部。在检测部具有图像解析部的方式中，对所拍摄的图像进行解析的系统的一个方式如下所述，但并非仅限于所述方式。予以说明，以下的方式中，细胞预先被染色，可以使用例如荧光染色、DAPI染色、Hoechst染色、免疫染色、吉姆萨染色染色等本领域技术人员已知的所有对核及/或细胞质染色的方法。
本发明的图像解析作业流程的一个方式如图4所示。本方式中，首先对设置在检测部的试样的观察视野数（a）进行设定。所述设定值既可以是记录在记录部的，也可以是由输入部输入的。接下来，选择所观察的视野，通过拍摄部拍摄所观察的视野的图像。拍摄的图像满足以下4个条件的全部时作为实际分析的图像，不满足其中任何一个时则作为无法分析而删除，并拍摄下一个观察区域，所述条件为：
条件1：图像中的核数为100个以下
条件2：图像中的核数为1个以上
条件3：图像中无细胞的区域所占的面积小于50％
条件4：图像中不存在除无细胞的区域、细胞质和核以外的区域。另外，本方式中，细胞可以进行染色从而将细胞质部分和、核部分区分开。
在图像分析步骤中，首先区分细胞质部分，将其作为细胞区域，分别依次从1到（d）赋予识别号。接下来，选择识别号最小的细胞区域，对确认的细胞数（e）加1，检测所述细胞区域中的核部分，作为核区域。当细胞区域中存在2个以上核区域时，对计测结果（c）加1。然后，删除所选择的细胞，对确认的细胞数e与识别号d进行比较。若d＝e，则判断为视野中所有细胞均已经进行了确认，对观察的视野数（b）加1。若并非d＝e，则按照识别号小的顺序再次返回至细胞区域的选择，反复操作直至d＝e为止。最后，对视野数b和观察的视野数a进行比较，当a＝b时结束分析。若并非a＝b，则移动到下一个视野观察，反复操作直至a＝b为止。
通过上述解析可以获得视野中的多核细胞数c。将视野中的总细胞数d及多核细胞数c作为分析结果输出到计算部，计算多核化率。
以下，基于具体实施例详细地说明本发明，但本发明不受所述例子限定。
实施例
例1.多核化处理
为了调查骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物的多核化率，制备了两种片状细胞培养物（片A及片B），按照以下的方案计测多核化率。
用酶处理骨骼肌成肌细胞的片状细胞培养物，使其完全解离成单核的骨骼肌成肌细胞。将解离片A而得的骨骼肌成肌细胞设为myoA，将解离片B而得的骨骼肌成肌细胞设为myoB。将解离后的细胞接种在培养片上，将培养片放入CO2培养箱中，在37℃、5％CO2的条件下培养14～22小时。
培养后，从CO2培养箱取出培养片，用显微镜观察，使用数码相机拍摄。对多核细胞数进行计数，通过（多核细胞数）÷（总细胞数）×100［％］算出多核化率。细胞质只要相连则判断为1个细胞质，当1个细胞质内包含2个以上的核时，将该细胞判断为1个多核细胞（图3中虚线所包围的区域）。
例2.细胞因子产生能力的比较
接着，对由两种骨骼肌成肌细胞所形成的片状细胞培养物片A及片B的细胞因子产生量进行测定。测定试剂盒使用的是Quantikine Human VEGF（R&D Systems公司制）、QuantikineHuman CXCL12/SDF-1α（R&D Systems公司制）、RayBio HumanHGF ELISA（RayBiotech,Inc公司制）。测定按照各试剂盒所附说明书来实施。
结果示于图1及图2。就多核化率而言，myoA为16.8％左右、myoB为29.6％左右（图1）。此外，就细胞因子产生能力（图2）而言，表明片B的HGF、VEGF及SDF－1产生量显著高于片A。这些细胞因子据说均与心肌再生相关，这暗示了由多核化率高的骨骼肌成肌细胞myoB构成的片B比片A更适合于向心脏移植。
产业上的可利用性
如上所述，通过使用本发明的方法初次使得评价移植片的移植适宜性成为可能，从而能够提高移植的治疗效果。

Claims (6)

1.一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的方法，其包括求出多核化能力的工序，所述多核化能力为表征所述具有多核化功能的细胞进行多核化的能力的指标，
其中，所述具有多核化功能的细胞为骨骼肌成肌细胞，
求出多核化能力的工序包括：
(i)将1或2个以上的所述移植用试样的一部分解离成单个细胞的步骤、
(ii)对(i)中解离后的细胞进行接种、孵育的步骤、及
(iii)检测(ii)中孵育的细胞培养物中的多核细胞的步骤，
所述方法包括对求出的多核化能力和预先设定的阈值进行比较的工序，
其中，求出的多核化能力为多核化率，将该多核化率大于预先设定的阈值的情况评价为适合用于心脏移植。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多核化率是指：对试样中的细胞进行多核化处理后，多核化细胞相对于试样中的总细胞数的比例或可以视为与其同等的比例。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述移植适宜性为选自由HGF、VEGF及SDF-1组成的组中的1或2种以上的细胞因子产生能力。
4.一种对包含具有多核化功能的细胞的移植用试样的移植适宜性进行评价的系统，其包括：用于检测多核细胞的检测部、及用于求出多核化能力的计算部，
其中，所述具有多核化功能的细胞为骨骼肌成肌细胞，
所述多核化能力为多核化的细胞的数或者多核化率。
5.根据权利要求4所述的系统，其中，检测部具有用于解析所拍摄的细胞图像的图像解析部。
6.根据权利要求5所述的系统，其中，图像解析部含有用于拍摄进行了染色的细胞的拍摄部，利用该图像解析部进行的解析包括对所述拍摄部拍摄的细胞图像中的细胞区域及细胞核区域进行区分的工序。
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