JPWO2012023562A1 - 移植片の評価方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を評価する方法であって、前記多核化する機能を有する細胞が多核化する能力を表す指標である多核化能を求めることを含む、前記方法、および該評価のためのシステムに関する。
Description
本発明は、移植片の移植適格性を評価する方法に関する。
近年の心臓病に対する治療の革新的進歩にかかわらず、重症心不全に対する治療体系は未だ確立されていない。心不全の治療法としては、βブロッカーやＡＣＥ阻害剤による内科治療が行われるが、これらの治療が奏功しないほど重症化した心不全には、補助人工心臓や心臓移植などの置換型治療、つまり外科治療が行われる。
このような外科治療の対象となる重症心不全には、進行した弁膜症や高度の心筋虚血に起因するもの、急性心筋梗塞やその合併症、急性心筋炎、虚血性心筋症（ＩＣＭ）、拡張型心筋症（ＤＣＭ）などによる慢性心不全やその急性憎悪など、多種多様の原因がある。
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
これらの原因と重症度に応じて弁形成術や置換術、冠動脈バイパス術、左室形成術、機械的補助循環などが適用される。
この中で、ＩＣＭやＤＣＭによる高度の左室機能低下から心不全を来たしたものについては、心臓移植や人工心臓による置換型治療のみが有効な治療法とされてきた。しかしながら、これら重症心不全患者に対する置換型治療は、慢性的なドナー不足、継続的な免疫抑制の必要性、合併症の発症など解決すべき問題が多く、すべての重症心不全に対する普遍的な治療法とは言い難い。
このような心臓移植の厳しい状況から、一時期、バチスタ手術などの他の外科治療が試みられるようになり、心臓移植の代替治療として大いに注目されるようになったが、最近ではこれらの手術の限界も次第に明らかにされるようになり、手術法の改良や適応の確立に努力が続けられている。
その一方、最近、重症心不全治療の解決策として新しい再生医療の展開が不可欠と考えられている。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
重症心筋梗塞等においては、心筋細胞が機能不全に陥り、さらに線維芽細胞の増殖、間質の線維化が進行し心不全を呈するようになる。心不全の進行に伴い、心筋細胞は傷害されてアポトーシスに陥るが、心筋細胞は殆ど細胞分裂をおこさないため、心筋細胞数は減少し心機能の低下もさらに進む。
このような重症心不全患者に対する心機能回復には細胞移植法が有用とされ、既に自己骨格筋芽細胞による臨床応用が開始されている。
近年、その一例として、組織工学を応用した温度応答性培養皿を用いることによって、成体の心筋以外の部分に由来する細胞を含む心臓に適用可能な三次元に構成された細胞培養物と、その製造方法が提供された（特許文献１）。
本発明の目的は、多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を、簡便かつ正確に評価する方法を提供することにある。
上述のように、近年再生医療による細胞移植の種々の問題を解決するべく様々な移植片、特にシート状細胞培養物などが開発されてきているものの、かかる移植片は依然として製造が困難であり、コストもかかってしまうのが現状である。
ところが本発明者は、同様の手法で製造された移植片を同様の手法で移植した場合であっても、細胞の生着率や組織化の状態に差異が生じるという、従前知られていなかった新たな課題に直面した。かかる課題を解決するべく研究を続ける中で、骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物において、シート状の骨格筋芽細胞を解離し、該解離細胞を培地中でインキュベートした際に融合細胞をより多く形成する群で、心筋再生を促進するサイトカインの産生がより高いことを見出し、さらに鋭意研究を続けた結果、本発明を完成させるに至った。
すなわち本発明は、以下に関する。
（１）多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を評価する方法であって、前記多核化する機能を有する細胞が多核化する能力を表す指標である多核化能を求めることを含む、前記方法。
（２）多核化能を求めることが、
（ｉ）１または２以上の前記移植用試料の一部を個々の細胞に解離するステップ、
（ｉｉ）（ｉ）で解離した細胞を播種し、インキュベートするステップ、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）でインキュベートした細胞培養物中の多核細胞を検出するステップ、
を含み、求めた多核化能と予め設定された閾値とを比較することを含む、（１）の方法。
（１）多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を評価する方法であって、前記多核化する機能を有する細胞が多核化する能力を表す指標である多核化能を求めることを含む、前記方法。
（２）多核化能を求めることが、
（ｉ）１または２以上の前記移植用試料の一部を個々の細胞に解離するステップ、
（ｉｉ）（ｉ）で解離した細胞を播種し、インキュベートするステップ、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）でインキュベートした細胞培養物中の多核細胞を検出するステップ、
を含み、求めた多核化能と予め設定された閾値とを比較することを含む、（１）の方法。
（３）多核化する機能を有する細胞が、骨格筋芽細胞である、（１）または（２）の方法。
（４）多核化能が、多核化率である、（１）〜（３）の方法。
（５）多核化する機能を有する細胞が、骨格筋芽細胞であり、求める多核化能が、多核化率であり、該多核化率が予め設定された閾値よりも大きい場合、心臓移植用に好適であると評価する、（１）〜（３）の方法。
（６）多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を評価するためのシステムであって、多核細胞を検出するための検出部、および多核化能を求めるための計算部を含む、前記システム。
（４）多核化能が、多核化率である、（１）〜（３）の方法。
（５）多核化する機能を有する細胞が、骨格筋芽細胞であり、求める多核化能が、多核化率であり、該多核化率が予め設定された閾値よりも大きい場合、心臓移植用に好適であると評価する、（１）〜（３）の方法。
（６）多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を評価するためのシステムであって、多核細胞を検出するための検出部、および多核化能を求めるための計算部を含む、前記システム。
（７）検出部が、撮像された細胞画像を解析する画像解析部を有する、（６）のシステム。
（８）画像解析部が、染色された細胞を撮像する撮像部を含み、該画像解析部による解析が、前記撮像部により撮像された細胞画像中の細胞領域および細胞核領域を区分することを含む、（７）のシステム。
（８）画像解析部が、染色された細胞を撮像する撮像部を含み、該画像解析部による解析が、前記撮像部により撮像された細胞画像中の細胞領域および細胞核領域を区分することを含む、（７）のシステム。
本発明によれば、移植片の中からより高い生着および組織化能を有するものを簡便に選別することが可能となり、結果として移植片移植による再生医療の治療効果を向上させることが可能となる。また、本発明の評価方法を用いることで、移植片製造において常に品質の高い移植片を提供することが可能となる。また、本発明の方法に用いることができる多核細胞を検出するシステムにより、簡便かつ正確に多核細胞の検出が可能となり、本発明による評価の精度をより高めることが可能である。
本発明は、多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を評価する方法であって、前記多核化する機能を有する細胞が多核化する能力を表す指標である多核化能を求めることを含む、前記方法に関する。
本発明における移植用試料は、典型的には培養した細胞および／またはその産生物で構成されるが、生体の所定部（例えば患部等）を補填および／または支持するための各種の材料（補填材料や支持材料）なども含む。移植用試料は、典型的には哺乳動物、例えば、ヒトや家畜等の疾病、傷病の治療等に用いられるものであるが、これに限定されるものではない。移植片の形状は特に限定されず、例えばシート状、膜状、塊状、柱状等の種々の形状であってよい。本発明において移植用試料といった場合、１の移植片を意味してもよいし、複数の移植片からなる移植片の集団を意味してもよい。移植片の集団は、典型的には例えば同一ロットで製造された移植片の集団などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明における移植用試料は、典型的には培養した細胞および／またはその産生物で構成されるが、生体の所定部（例えば患部等）を補填および／または支持するための各種の材料（補填材料や支持材料）なども含む。移植用試料は、典型的には哺乳動物、例えば、ヒトや家畜等の疾病、傷病の治療等に用いられるものであるが、これに限定されるものではない。移植片の形状は特に限定されず、例えばシート状、膜状、塊状、柱状等の種々の形状であってよい。本発明において移植用試料といった場合、１の移植片を意味してもよいし、複数の移植片からなる移植片の集団を意味してもよい。移植片の集団は、典型的には例えば同一ロットで製造された移植片の集団などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
本明細書において、「多核化」とは、一つの細胞に複数の細胞核が含まれる状態になることをいう。多核化には、融合、細胞分裂、核内ＤＮＡの断片化、細胞または核の取り込み、分化など、様々な原因が考えられる。本明細書における「多核化」は、原因の如何にかかわらず、一つの細胞に複数の細胞核が含まれる状態になることを指し、したがって「多核細胞」は、複数の細胞核を有するあらゆる細胞を意味する。すなわち、当該技術分野において、原生動物や菌類において産生される複数の核を有する細胞である「多核体」と、昆虫や動物などにおいて産生される複数の核を有する細胞である「合胞体（シンシチウムまたは融合細胞などとも呼ばれる）」は文言上区別されるところ、本願発明における「多核細胞」は、これらのいずれをも包含するものである。移植用試料に含まれ得る細胞であることに鑑みれば、好ましくは合胞体である。
本明細書において、「移植適格性」とは、移植用試料が移植に適する度合いを示すものである。移植適格性は、分類できればどのような分類方法で評価されてもよく、例えばある基準以上のものを好適とし、基準未満を不適とするように全体を二分してもよいし、いくつかに分類して移植時の好適度合いによって品質をランク付けしてもよい。
本明細書において、「多核化能」とは、移植用試料中の細胞が多核化する能力を数値などで比較可能にした指標を表し、移植用試料の特性を表すものである。本発明においては、移植用試料の一部から求められた多核化能は、かかる試料全体の多核化能を表すものとみなす。多核化能は、試料中の細胞が多核化する能力を反映したものであればどんなものでもよい。例えば、試料の一部を処理した後に、該処理後の試料中に存在する多核細胞の数、処理後の試料中の多核化する能力を有する細胞の多核化率、処理後の試料中の多核細胞中にある全核数、該試料中の細胞の平均核数、産生するサイトカイン量、該処理後の試料が保持するタンパク質（例えばクレアチニンキナーゼ、デスミン、ミオシン、アクチンなど）の定量、ならびにそれらと同等であるとみなせる数値などが挙げられるが、これに限定するものではない。
本発明は、前記多核化能が、移植用試料の移植適格性を評価するための基準となり得るという、本発明者によって新たに見出された事実に基づいて達成されたものである。
本発明において、多核化能はいかなる方法を用いて求めてもよく、具体的に測定する対象、例えば多核化処理後の多核細胞数や多核化処理後の試料細胞中の平均核数など、に依存して変化し得る。多核化能は、試料から直接測定して求めてもよいし、試料から測定される特性値から計算により求めてもよい。また、試料から特性値を測定する前に、該特性値を測定するための特定の処理を行ってもよい。例えば、骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物を本発明の方法によって評価する場合、シート状細胞培養物中の細胞を多核化させる処理を測定前に行ってもよい。測定は、侵襲的であっても非侵襲的であってもよい。
本発明の一態様において、多核化能の測定を多核化処理後に行う。具体的には、多核化能の測定が、
（ｉ）１または２以上の移植用試料の一部を個々の細胞に解離するステップ、
（ｉｉ）（ｉ）で解離した細胞を播種し、インキュベートするステップ、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）でインキュベートした細胞中の多核細胞を検出するステップ、
を含む。
上記ステップ（ｉ）において、試料の一部を個々の細胞にバラバラに解離する。解離する方法は当業者に十分知られた方法を用いることができ、典型的にはトリプシン処理などが挙げられるが、これに限定されるものではない。後続のステップのため、ステップ（ｉ）の処理に起因する細胞へのダメージは極力少ないことが望まれる。
（ｉ）１または２以上の移植用試料の一部を個々の細胞に解離するステップ、
（ｉｉ）（ｉ）で解離した細胞を播種し、インキュベートするステップ、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）でインキュベートした細胞中の多核細胞を検出するステップ、
を含む。
上記ステップ（ｉ）において、試料の一部を個々の細胞にバラバラに解離する。解離する方法は当業者に十分知られた方法を用いることができ、典型的にはトリプシン処理などが挙げられるが、これに限定されるものではない。後続のステップのため、ステップ（ｉ）の処理に起因する細胞へのダメージは極力少ないことが望まれる。
上記ステップ（ｉｉ）において、ステップ（ｉ）でバラバラに解離した細胞を培地に播種し、インキュベートする。かかるステップにおいて前記解離した細胞が多核化処理される。したがって、播種する培地は細胞を培養するために用いることができるいかなる培地を用いてもよいが、好ましくは多核化を促進する成分を含む培地である。インキュベートの条件は、当該技術分野においてに知られた条件でよく、典型的には３７℃、５％ＣＯ２などであるが、これに限定されるものではない。
上記ステップ（ｉｉｉ）において、ステップ（ｉｉ）でインキュベートした細胞培養物中の多核細胞を検出する。多核細胞の検出には、当該技術分野で知られたあらゆる方法を用いることができる。典型的には、核を色素や蛍光物質などで染色し、目視および／または撮像により多核細胞を識別する方法、あるいは核を蛍光物質で染色し、一定以上の蛍光強度を有する細胞を、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）などのセルソーターを用いて分別する方法などが挙げられるが、これに限定するものではない。
上記ステップ（ｉｉｉ）により多核細胞を検出し、それにより多核化能を求める。これに限定するものではないが、例えば多核細胞数や多核化率、多核化核数などを求めることが可能である。求めた多核化能は、予め設定された閾値と比較される。閾値の数値および個数は、求める多核化能や評価の種類または程度によって異なってよい。これに限定するものではないが、例えば多核化能として多核化率を用いた場合、より高い多核化率を有する試料がより好適であると判断することができるし、５段階で評価するような場合は４つの閾値を用いて評価してよい。
閾値は、どのような方法で求めてもよい。これに限定するものではないが、例えば経験的に設定してもよいし、１または２以上の基準試料を上記各ステップと同様に処理して多核化能を測定し、該多核化能を統計的に処理して求めてもよい。
本発明において、「多核化する機能を有する細胞」は、移植用試料に用いることができる細胞であれば、いかなる細胞であってもよい。典型的には、骨格筋への分化能を有する細胞であるが、これに限定されるものではない。本発明の一態様において、移植片の再生医療における有用性、細胞の培養および移植片の作製の容易性、作製した移植片のハンドリング性、高い有効性などの観点から、多核化する機能を有する細胞が、骨格筋芽細胞である。
多核化能は、試料中細胞の多核化する能力を反映したものであればいかなるものを用いてもよいが、本発明の一態様において、測定の簡便さ、正確さなどの観点から、多核化率を用いる。本明細書中において「多核化率」は、試料中の細胞を多核化処理した後の、試料中の全細胞数に対する多核化細胞の割合を表したもの、またはそれと同等であるとみなせる割合である。したがって、試料中の全ての細胞数および多核化細胞数を求めて算出してもよいし、例えばランダムに選択された１または２以上の部分における多核化率を求め、その平均を求めてもよい。
本発明の一態様を例示して、本発明を以下に説明するが、これは本発明を限定するものではない。
本発明の一態様において、骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物を評価する。骨格筋芽細胞は、近年心臓の再生医療に有用な移植用細胞と考えられており、そのシート状細胞培養物は、移植片として好適に用いられる。
本発明の一態様において、骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物を評価する。骨格筋芽細胞は、近年心臓の再生医療に有用な移植用細胞と考えられており、そのシート状細胞培養物は、移植片として好適に用いられる。
上記のシート状細胞培養物を評価するため、シート状細胞培養物を個々の細胞に解離する。解離した後、これらの細胞を播種し、インキュベートする。一定期間のインキュベート後、細胞の核および細胞質を染色し、顕微鏡下で観察し、多核細胞数および全細胞数を計数し、それを複数視野分行って多核化率を算出する。得られた多核化率を予め設定した閾値と比較し、閾値よりも大きい場合に、心臓移植用として好適であると判断することができる。
本発明の方法において、多核細胞の検出を迅速かつ簡便に、またムラなく正確に行うことが非常に好ましい。したがって、本発明には、多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を評価するためのシステムであって、多核細胞を検出するための検出部、および多核化能を求めるための計算部を含む、前記システムが包含される。かかるシステムによって、多核細胞の検出により客観性を持たせ、より正確な評価をすることが可能となり、また本発明の評価を迅速かつ簡便に行うことが可能となる。
前記検出部は、多核細胞とそれ以外の細胞を分類することが可能であれば、いかなるシステムを採用してもよい。例えば１細胞中の核のシグナルの大きさを指標としてＦＣＭで分類するシステム、細胞質および核を染色して撮像し、その細胞画像を画像解析することによって多核細胞とそれ以外の細胞を分類するシステム、または多核化処理後の細胞を再度個々の細胞に解離させ、その粒度分布を計測するシステム、またはそれらの組み合わせなどが挙げられるが、これに限定するものではない。検出部において分類された結果は、計算部へと出力される。
計算部への出力と同時に、分類結果をアウトプットする記録・出力部へと出力してもよい。記録部としては、例えばハードディスク、フラッシュメモリなどの記録媒体、プリンタなどが挙げられ、出力部としては、例えば表示用モニタ、予め登録された携帯電話やインターネットメールアドレスへの送信などが挙げられるが、これに限定するものではなく、当業者に知られた記録・出力のためのあらゆる記録・出力部を用いられ得る。また検出部は、検出条件などを入力する入力部を備えていてもよい。入力部としては、例えばキーボード、バーコードリーダー、タッチパネルなどが挙げられるがこれに限定するものではなく、当業者に知られたあらゆる入力部が用いられ得る。
前記計算部は、検出部から入力された分類結果を分析し、多核化能を計算する部分である。例えば、検出部から入力されたＦＣＭの情報、画像解析によって分類された多核細胞およびそれ以外の細胞の情報、粒度分析による粒度分布情報などを基に、多核化率などの多核化能を計算する。計算部は、計算条件などを入力するための入力部、計算結果を記録・出力するための記録・出力部を有していてもよく、またこれらは検出部と共有されていてもよい。さらに、計算部において、予め設定された閾値と比較してもよい。閾値は記録部に予め記録されたものでもよいし、検査の前に入力してもよいし、過去の検査結果をフィードバックして統計的に分析されたものでもよい。
本発明の一態様において、細胞に関する様々な情報が得られる、より直接的で正確な分析が可能であるなどの観点から、好ましくは検出部が画像解析部を有している。検出部が画像解析部である態様において、撮像された画像を解析するシステムの一態様を以下に述べるが、かかる態様に限定されない。なお、以下の態様においては、細胞は染色されており、例えば蛍光染色、ＤＡＰＩ染色、ヘキスト染色、免疫染色、ギムザ染色など、核およびまたは細胞質を染色する方法として当業者に知られたあらゆる染色方法を用いることができる。
本発明の画像解析作業フローの一態様を図４に示す。本態様において、検出部にセットされた試料の観察視野数（ａ）をまず設定する。かかる設定値は記録部に記録されたものであってもよいし、入力部から入力されたものであってもよい。次に、観察する視野を選択し、観察視野の画像を撮像部によって撮像する。撮像した画像は、以下の４つの条件
条件１：画像中の核の数が１００個以下
条件２：画像中の核の数が１個以上
条件３：画像中の細胞のない領域の占める面積が５０％未満
条件４：画像中に細胞のない領域、細胞質及び核以外の領域が存在しない
の全てに当てはまるもののみを実際に分析する画像とし、いずれかに当てはまらないものは分析不可として消去し、次の観察視野を撮像する。なお、本態様では、細胞は細胞質部分と、核部分とを区別して染色することができる。
条件１：画像中の核の数が１００個以下
条件２：画像中の核の数が１個以上
条件３：画像中の細胞のない領域の占める面積が５０％未満
条件４：画像中に細胞のない領域、細胞質及び核以外の領域が存在しない
の全てに当てはまるもののみを実際に分析する画像とし、いずれかに当てはまらないものは分析不可として消去し、次の観察視野を撮像する。なお、本態様では、細胞は細胞質部分と、核部分とを区別して染色することができる。
画像を分析するステップにおいては、まず細胞質部分を細胞領域として区分し、それぞれに識別番号を１から（ｄ）まで順に付す。次に識別番号の最も小さい細胞領域を選択し、確認した細胞数（ｅ）に１を加え、前記細胞領域中の核部分を核領域として検出する。細胞領域中に核領域が２個以上存在する場合、計測結果（ｃ）に１を加える。その後選択した細胞を消去し、確認した細胞数ｅと識別番号ｄを比較する。ｄ＝ｅならば視野中全ての細胞を確認したと判断し、観察した視野数（ｂ）に１を加える。ｄ＝ｅでなければ、識別番号の小さい順に再度細胞領域の選択に戻り、ｄ＝ｅとなるまで繰り返す。最後に視野数ｂと観察する視野数ａを比較し、ａ＝ｂならば分析を終了する。ａ＝ｂでなければ、次の視野観察に移り、ａ＝ｂとなるまで繰り返す。
上記解析によって、視野中の多核細胞数ｃが得られる。視野中の全細胞数ｄおよび多核細胞数ｃが分析結果として計算部に出力され、多核化率が計算される。
以下、本発明を具体的な実施例を基に詳細に説明するが、本発明はかかる例に限定されない。
例１．多核化処理
骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物の多核化率を調べるため、二種類のシート状細胞培養物（ＳｈｅｅｔＡおよびＳｈｅｅｔＢ）を調製し、以下のプロトコルにしたがって多核化率を計測した。
骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物を酵素処理し、単核の骨格筋芽細胞に完全に解離させた。ＳｈｅｅｔＡを解離させて得られた骨格筋芽細胞をｍｙｏＡ、ＳｈｅｅｔＢを解離させて得られた骨格筋芽細胞をｍｙｏＢとした。解離させた細胞をカルチャースライドに播種し、ＣＯ２インキュベーターにカルチャースライドを入れ、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４〜２２時間培養した。
骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物の多核化率を調べるため、二種類のシート状細胞培養物（ＳｈｅｅｔＡおよびＳｈｅｅｔＢ）を調製し、以下のプロトコルにしたがって多核化率を計測した。
骨格筋芽細胞のシート状細胞培養物を酵素処理し、単核の骨格筋芽細胞に完全に解離させた。ＳｈｅｅｔＡを解離させて得られた骨格筋芽細胞をｍｙｏＡ、ＳｈｅｅｔＢを解離させて得られた骨格筋芽細胞をｍｙｏＢとした。解離させた細胞をカルチャースライドに播種し、ＣＯ２インキュベーターにカルチャースライドを入れ、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１４〜２２時間培養した。
培養後、ＣＯ２インキュベーターからカルチャースライドを取り出し、顕微鏡観察し、デジタルカメラを用いて撮影した。多核細胞数を計数し、多核化率を（多核細胞数）÷（全細胞数）×１００［％］によって算出した。細胞質は繋がっている限り、１つの細胞質と判断し、１つの細胞質内に２つ以上の核が含まれていた場合、その細胞を１つの多核細胞と判定した（図３の点線で囲まれた領域）。
例２．サイトカイン産生能力の比較
続いて、二種類の骨格筋芽細胞からなるシート状細胞培養物ＳｈｅｅｔＡおよびＳｈｅｅｔＢのサイトカイン産生量を測定した。測定キットには、Quantikine Human VEGF（R&D Systems社製）、Quantikine Human CXCL12/SDF-1α（R&D Systems社製）、RayBio Human HGF ELISA（RayBiotech,Inc社製）を用いた。測定は各キット付属のプロトコールに従って実施した。
続いて、二種類の骨格筋芽細胞からなるシート状細胞培養物ＳｈｅｅｔＡおよびＳｈｅｅｔＢのサイトカイン産生量を測定した。測定キットには、Quantikine Human VEGF（R&D Systems社製）、Quantikine Human CXCL12/SDF-1α（R&D Systems社製）、RayBio Human HGF ELISA（RayBiotech,Inc社製）を用いた。測定は各キット付属のプロトコールに従って実施した。
結果を図１および図２に示す。多核化率についてはｍｙｏＡが１６．８％程度、ｍｙｏＢが２９．６％程度であった（図１）。また、サイトカイン産生能力（図２）については、ＨＧＦ、ＶＥＧＦおよびＳＤＦ−１について、ＳｈｅｅｔＡよりもＳｈｅｅｔＢのほうが顕著に高い産生量を示した。これらのサイトカインはいずれも心筋再生に関与するサイトカインであるといわれており、多核化率の高い骨格筋芽細胞ｍｙｏＢで構成されているＳｈｅｅｔＢの方が、ＳｈｅｅｔＡよりも心臓への移植に適していることを示唆している。
以上のように、本発明の方法を用いることによって初めて、移植片の移植適格性を評価することが可能となり、これによって移植の治療効果を高めることが可能となる。
Claims (8)
- 多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を評価する方法であって、前記多核化する機能を有する細胞が多核化する能力を表す指標である多核化能を求めることを含む、前記方法。
- 多核化能を求めることが、
（ｉ）１または２以上の前記移植用試料の一部を個々の細胞に解離するステップ、
（ｉｉ）（ｉ）で解離した細胞を播種し、インキュベートするステップ、および
（ｉｉｉ）（ｉｉ）でインキュベートした細胞培養物中の多核細胞を検出するステップ、
を含み、求めた多核化能と予め設定された閾値とを比較することを含む、請求項１に記載の方法。 - 多核化する機能を有する細胞が、骨格筋芽細胞である、請求項１または２に記載の方法。
- 多核化能が、多核化率である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 多核化する機能を有する細胞が、骨格筋芽細胞であり、求める多核化能が、多核化率であり、該多核化率が予め設定された閾値よりも大きい場合、心臓移植用に好適であると評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 多核化する機能を有する細胞を含む移植用試料の移植適格性を評価するためのシステムであって、多核細胞を検出するための検出部、および多核化能を求めるための計算部を含む、前記システム。
- 検出部が、撮像された細胞画像を解析する画像解析部を有する、請求項６に記載のシステム。
- 画像解析部が、染色された細胞を撮像する撮像部を含み、該画像解析部による解析が、前記撮像部により撮像された細胞画像中の細胞領域および細胞核領域を区分することを含む、請求項７に記載のシステム。
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