CN102864131B

CN102864131B - 一种耐高温阿拉伯多糖酶及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102864131B
Application number: CN201210333857.6A
Authority: CN
Inventors: 王飞; 时号; 李迅; 丁怀海
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2014-08-06
Anticipated expiration: 2032-09-11
Also published as: CN102864131A

Abstract

本发明公开了一种耐高温阿拉伯多糖酶及其编码基因和应用，该阿拉伯多糖酶的氨基酸序列如SEQNO：1所示。该阿拉伯多糖酶具有极强的耐热性能和偏中性pH条件下高活性的特性。在75℃、pH为6.5的条件下酶活性最高，比酶活达到16.7U/mg；该蛋白酶在温度为60℃-85℃、pH为6.0-8.0的范围内，均具有较高的酶活，在75℃的反应体系中，保温2h酶活性保持不变。这些特性使得本发明得到的阿拉伯多糖酶比现有阿拉伯多糖酶具有更大的优越性，适用于75℃以上高温、偏中性pH条件下水果、蔬菜及半纤维素中阿拉伯多糖的降解，具有潜在的工业应用价值。

Description

一种耐高温阿拉伯多糖酶及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物质精炼技术领域，具体涉及一种耐高温阿拉伯多糖酶及其编码基因和应用。

背景技术

阿拉伯多糖是L-阿拉伯糖以α-1,5-糖苷键连接组成的的中性多糖。它们通常聚合度较低（40-50），辅以α-1,3或少量的α-1,2糖苷键相连的分支结构，能从花生、苹果和甜菜等植物组织中分离获得。阿拉伯多糖酶是半纤维素降解酶系中的一种多糖水解酶，通过随机切阿拉伯多糖的α-1,5-糖苷键，将阿拉伯多糖水解为L-阿拉伯糖。临床研究表明，L-阿拉伯糖对蔗糖的代谢转化具有阻断作用，因此在减肥、控制糖尿病等方面具有重要应用前景。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种耐高温阿拉伯多糖酶，以使其满足使用要求。本发明的另一目的是提供一种编码上述耐高温阿拉伯多糖酶的核苷酸序列。本发明还有一目的是提供上述一种耐高温阿拉伯多糖酶的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种耐高温阿拉伯多糖酶，氨基酸序列如SEQ NO：1所示。

一种耐高温阿拉伯多糖酶，其特征在于：氨基酸序列为权利要求1所述的SEQ NO：1序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有阿拉伯多糖酶活性的衍生蛋白质。

一种编码耐高温阿拉伯多糖酶的基因， DNA序列如SEQ NO：2所示。

一种可表达耐高温阿拉伯多糖酶的重组载体，在所述的重组载体上克隆有如SEQ NO：2所示的DNA序列。

一种可表达耐高温阿拉伯多糖酶的重组菌，在所述的重组菌内克隆有如SEQ NO：2所示的DNA序列。

一种扩增编码耐高温阿拉伯多糖酶的基因的方法，所使用的引物对为：Tth-1：5’-GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’；Tth-2：5’-CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3’。

所述的耐高温阿拉伯多糖酶在酶解阿拉伯多糖中的应用。酶解反应温度为60~85℃，pH为6.0~8.0的反应体系。

耐高温阿拉伯多糖酶在降解水果蔬菜和纤维原料中的应用。

上述的重组载体或重组菌在酶解阿拉伯多糖中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的阿拉伯多糖酶具有极强的耐热性能和偏中性pH条件下高活性的特性。在75℃、pH为6.5的条件下酶活性最高，比酶活达到16.7 U/mg；该蛋白酶在温度为60℃-85℃、pH为6.0-8.0的范围内，均具有较高的酶活，在75℃的反应体系中，保温2h 酶活性保持不变。这些特性使得本发明得到的阿拉伯多糖酶比现有阿拉伯多糖酶具有更大的优越性，适用于75℃以上高温、偏中性pH条件下水果、蔬菜及半纤维素中阿拉伯多糖的降解，具有潜在的工业应用价值。

附图说明

图1是Tth arase蛋白的SDS-PAGE图；

图2是Tth arase蛋白的最适温度结果图；

图3是Tth arase蛋白的最适pH结果图；

图4是Tth arase蛋白的热稳定性结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1 嗜热陆地热泉高温神袍菌基因组DNA的提取

取嗜热陆地热泉高温神袍菌Thermotoga thermarum DSM5069（购自德国微生物菌种保藏中心）新鲜菌体10g，悬于5mL 50mM Tris缓冲溶液中（pH8.0），混匀后，在37℃放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55℃放置5min，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30 min，4℃ 13000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀溶于0.5mL TE缓冲液（pH8.0，10mM Tris，1mM EDTA），加入10mg/mL RNase 3μL，37℃保温1h，用等体积的酚-氯仿（24:1）抽提一次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，于-20℃放置30min，4℃ 13000 rpm离心20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，用0.5mL超纯水溶解，备用。

实施例2 阿拉伯糖基因Tth arase的制备

可采用如下方法制备Tth arase基因，也可以采用人工合成的方式得到。

以Thermotoga thermarum DSM5069的总DNA（实施例1制备）为模版，用下述引物对进行PCR扩增：

Tth-1：5’-GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’；

Tth-2：5’-CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3；

在Tth-1引入Nde I酶切位点，在Tth-2引入Xho I酶切位点。

PCR反应体系：1 μL T．thermarum基因组DNA，1μL Tth-1，1μL Tth-2，25μL Premix ExTaq，22μL超纯水。

PCR反应条件：94℃变性5 min；94℃变性30 sec，52℃退火30 sec，72℃延伸3 min，30 Cycles；72℃延伸10min；4℃保温。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化（BIOMIGA，上海）。

实施例3 重组克隆、表达载体pET-20b-Tth arase的构建与验证

将纯化过的PCR产物（实施例2制备）、pET-20b（Novagen）用分别Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8μL无菌水重悬，加入1μL 10×Ligase Buffer和1μL Ligase，于16℃连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含100μg/mL Amp（氨苄青霉素）的培养皿，37℃培养10-12h。

从转化平板上挑取多个单菌落，采用BIOMIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入了所克隆的目的片段（核苷酸长度为1341bp），进而得到重组克隆及表达载体pET-20b-Tth arase，Tth arase的核苷酸如SEQ NO：2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ NO：1所示，将该蛋白命名为Tth arase。

实施例4 重组阿拉伯糖Tth arase的表达与纯化

按常规方法将重组克隆、表达载体pET-20b-Tth arase电转至宿主菌E. coli BL21(DE3)（Novagen），获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基，在37℃温度下，200rpm震荡培养8-12h。将上述4mL菌液接种于含400mL培养基的1000mL摇瓶中，37℃温度下，200rpm震荡培养，当吸光度达到0.6-0.8时，加人200μL的1M IPTG，并在30℃温度下，120rpm诱导表达10-12 h。用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，13000rpm离心15min，收集菌体。用50mL超纯水洗涤并在4℃下，以13000 rpm离心15min，回收菌体，接着用20mL 1×Binding Buffer重悬（0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM imidazole，pH7.9），在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞，并在4℃下13000rpm 离心15min，得到含阿拉伯多糖酶Tth arase的粗提液。

粗提液先经70℃加热处理30min的热处理，除去不耐热的杂蛋白，再用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化（方法见His-Bind Kits，Novagen）。纯化酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE方法进行，结果见图1，1为pET-20b空质粒表达出的蛋白，2为200mM咪唑纯化过后的蛋白，3即表示400mM咪唑纯化过后的Tth arase蛋白，分子量约为43kDa，略比理论值49kDa低。

实施例5 重组阿拉伯糖Tth arase的酶学性质分析

酶活定义为：1min内催化甜菜阿拉伯多糖产生1μmol阿拉伯糖所需的酶量。

（1）最适温度

用pH值为6.5的0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施4中的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。酶活测定反应体系为200μL，由0.2%甜菜阿拉伯多糖100μL，90μL 0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10μL稀释酶液组成；反应体系的pH为6.5。将反应体系在60-100℃温育10 min后，加入300μL DNS试剂终止反应，沸水浴5min后测定550nm的吸光值。实验设3次重复，取平均值作图，结果如图2所示，研究结果表明在75℃时，阿拉伯多糖酶具有最高的酶活性，为16.7U/mg；将此温度下的酶活反应体系的吸光值最为相对活性100%，其它温度下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值作为相对活性。其中，在温度60-85℃的反应体系中酶活性较高。

（2）最适pH

酶活性测定体系为200μL，由0.2%甜菜阿拉伯多糖100μL，pH4.0-8.0的90μL 0.1M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液和10μL稀释酶液组成。将反应体系在75℃温育10min后，加入300μL DNS试剂终止反应，沸水浴5 min后测定550nm的吸光值。实验设3次重复实验，取平均值，结果如图3所示，研究结果表明，在pH为6.5时，阿拉伯多糖酶具有最高的酶活性，为16.7U/mg；将此pH值下的酶活反应体系的作为相对活性100%，其它pH值下酶活反应体系的吸光值与此最高酶活性体系的吸光值的比值作为相对活性。在pH6.0-8.0的条件下，酶活较高。

（3）重组酶热稳定性

用pH值为6.5的0.1 M咪唑-邻笨二甲酸氢钾缓冲液稀释实施例4中的纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释酶液在75℃、80℃、85℃、90℃水浴30min、60min、90min和120min，测定酶的残存酶活。酶活测定反应体系中pH为6.5，测定温度为80℃。实验设3次重复，取平均值，结果如图4所示，研究结果显示，75℃处理2 h未见酶活下降，可见该阿拉伯多糖酶在75℃条件下热稳定非常好，可以快速有效地将甜菜阿拉伯多糖降解为阿拉伯糖。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种耐高温阿拉伯多糖酶及其编码基因和应用

<130> 100

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 447

<212> PRT

<213> Thermotoga thermarum

<400> 1

Met Val Phe Asn Trp Ala Thr Val His Asp Pro Ser Val Ile Lys Val

1 5 10 15

Asn Asp Thr Tyr Tyr Leu Phe Gly Ser His Leu Ala Val Ala Lys Ser

20 25 30

Asn Asp Leu Met Arg Trp Thr Gln Val Asn Leu Asn Val Tyr Lys Gly

35 40 45

Asn Pro Ile Val Pro Asp Ile Gln Gln Asp Leu Lys Glu Ala Val Ser

50 55 60

Trp Ala Arg Ala Asp Ser Ile Trp Ala Pro His Val Ile Arg Met Pro

65 70 75 80

Asp Gly Lys Phe Tyr Met Tyr Tyr Cys Ala Ser Thr Phe Gly Ser Pro

85 90 95

Arg Ser Ala Ile Gly Ile Ala Val Ser Asp Lys Val Glu Gly Pro Tyr

100 105 110

Arg His Tyr Ala Val Ile Leu Arg Ser Gly Gln Thr Pro Ala Asp Gly

115 120 125

Pro Ser Glu Asp Gly Thr Pro Tyr Asn Arg Met Lys His Pro Asn Cys

130 135 140

Ile Asp Pro His Thr Phe Tyr Asp Lys Asp Gly Arg Leu Trp Met Val

145 150 155 160

Tyr Gly Ser Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Ile Ile Glu Leu Asp Pro Asn

165 170 175

Thr Gly Leu Pro Leu Pro Gly Gln Gly Tyr Gly Glu Arg Leu Ile Gly

180 185 190

Gly Asn His Ser Pro Ile Glu Gly Pro Phe Ile Leu Tyr Ser Pro Glu

195 200 205

Thr Asp Tyr Tyr Tyr Leu Phe Val Ser Phe Gly Gly Leu Asp Ser Arg

210 215 220

Gly Gly Tyr Asn Ile Arg Val Met Arg Ser Arg Asn Val Thr Gly Pro

225 230 235 240

Tyr Tyr Asp Ile Glu Gly Asn Asp Ala Arg Glu Cys Met Gly Asp Ala

245 250 255

Arg Thr Thr Glu Gln Phe Gly Val Lys Leu Val Gly Asn Phe Asn Phe

260 265 270

Asn Glu Thr Asn Pro Ile Ser Ala Ala Thr Phe Gly Tyr Val Ser Pro

275 280 285

Gly His Asn Ser Ala Tyr Tyr Asp Pro Asp Thr Ala Arg Tyr Phe Ile

290 295 300

Phe Phe His Thr Arg Phe Pro Gly Arg Gly Glu Ser His Gln Ile Arg

305 310 315 320

Val His Gln Leu Leu Leu Asn Glu Glu Gly Trp Phe Val Met Ala Pro

325 330 335

Phe Pro Tyr Ala Gly Glu Thr Ile Leu Pro Leu Gly Lys Glu Asp Leu

340 345 350

Leu Gly Glu Tyr Met Leu Ile Asn His Gly Lys Gln Ile Thr Ser Asp

355 360 365

Ile Lys Gln Pro Val Arg Ile Val Leu Glu Asp Gly Lys Ile Ser Gly

370 375 380

Ala Ile Glu Gly His Trp Gln Leu Lys Asn Gly Tyr Phe Ile Asp Ile

385 390 395 400

Ser Leu Glu Glu Lys Gly Gln Leu Val Thr Tyr Lys Gly Val Cys Leu

405 410 415

Lys Gln Trp His Pro Thr Glu Lys Lys Trp Val Thr Thr Phe Ser Ala

420 425 430

Val Ser Glu Lys Gly Ile Cys Ile Trp Gly Val Arg Ile Glu Asp

435 440 445

<210> 2

<211> 1341

<212> DNA

<213> Thermotoga thermarum

<400> 2

atggtattca actgggcaac tgtacacgat ccttcagtta tcaaagtcaa tgatacatac 60

tacctttttg gttcacatct tgctgttgct aaatcaaatg atctaatgcg ttggacgcag 120

gtgaatttaa acgtttacaa aggaaatcca atagtacctg atattcagca agatttaaag 180

gaagccgttt cctgggcacg agcagattcg atttgggctc cccatgtcat ccgaatgcca 240

gacggaaaat tttacatgta ctactgcgca tctacttttg gttccccgcg ttccgccata 300

ggtatagcgg tgtctgacaa agttgaagga ccatatagac attatgcagt cattttgaga 360

tctggtcaga caccagccga tggtccaagt gaagatggca caccgtacaa cagaatgaaa 420

catcccaatt gcatagatcc tcatacgttt tacgataaag acggcagatt atggatggtt 480

tatggttcgt actttggagg aattttcatc atcgagcttg atcctaacac tggcttgcca 540

cttccaggac aaggctatgg agaaagactt atcggtggta atcacagccc aatagaagga 600

ccttttatcc tttatagccc agaaaccgat tattactatc ttttcgtgag cttcggggga 660

cttgactcac gcggcggtta taacattcga gttatgcgtt caagaaacgt tactggacca 720

tactatgaca tagaaggcaa tgacgcgcgc gaatgtatgg gcgatgcaag gacaacagag 780

cagtttggag ttaaacttgt tggaaatttc aatttcaatg aaacaaaccc aatcagcgct 840

gcgacatttg ggtatgtatc tcctggtcac aactcagctt actatgaccc agatacggct 900

agatacttca ttttctttca taccagattt ccaggcagag gtgagagtca tcaaattaga 960

gttcaccaac ttctgctgaa cgaagaaggt tggtttgtga tggcaccatt tccatacgct 1020

ggtgaaacca ttttaccttt gggaaaagaa gatttacttg gtgaatacat gttgataaat 1080

catggtaaac agatcactag cgacataaaa caacctgtta ggatagtact agaagatgga 1140

aaaatctctg gtgcaatcga aggacattgg cagctgaaaa atgggtactt tatcgatata 1200

tcccttgaag agaaaggtca actagtaacg tacaaagggg tttgtctaaa acaatggcat 1260

ccaacagaga aaaaatgggt tacaaccttc tctgcagtta gcgaaaaggg aatttgcatc 1320

tggggagttc ggatcgaaga t 1341

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Tth-1引物序列

<400> 3

ggaattccat atggtattca actgggcaac tgtacac 37

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Tth-2引物序列

<400> 4

ccgctcgaga tcttcgatcc gaactcccca g 31

Claims

1.一种耐高温阿拉伯多糖酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ NO：1所示。

2.一种编码权利要求1所述的耐高温阿拉伯多糖酶的基因，其特征在于：DNA序列如SEQNO：2所示。

3.一种可表达耐高温阿拉伯多糖酶的重组载体，其特征在于：在所述的重组载体上克隆有如SEQ NO：2所示的DNA序列。

4.一种可表达耐高温阿拉伯多糖酶的重组菌，其特征在于：在所述的重组菌内克隆有如SEQ NO：2所示的DNA序列。

5.一种扩增编码耐高温阿拉伯多糖酶的基因的方法，其特征在于：所使用的引物对为：Tth-1：5’-GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’；Tth-2：5’-CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3’。

6.权利要求1所述的耐高温阿拉伯多糖酶在酶解阿拉伯多糖中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：酶解反应温度为60～85℃，pH为6.0～8.0的反应体系。