CN102860988A - 一种糜蛋白酶组合物冻干粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种糜蛋白酶制剂，具体讲，涉及一种糜蛋白酶组合物冻干粉及其制备方法。本发明的糜蛋白酶组合物冻干粉由糜蛋白酶、右旋糖酐20和山梨醇组成，所述糜蛋白酶、右旋糖酐20和山梨醇的比例为100万单位：1g～1.8g∶0.05g～0.6g。该糜蛋白酶组合物冻干粉平均的孔隙率为85％～98％。本发明还涉及该糜蛋白组合物冻干粉的制备方法。本发明的糜蛋白酶冻干粉针剂外观饱满均一、孔隙率高、复溶性好、稳定性高，并且处方简单，药用辅料添加比例小，对人体的副作用小，安全可靠。本发明对糜蛋白酶冻干粉的制备工艺做了进一步的改进，通过改进配液过程中的温度、配液体积、冻干过程并进行两次除菌。

Description

一种糜蛋白酶组合物冻干粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种糜蛋白酶制剂，具体讲，涉及一种糜蛋白酶组合物冻干粉及其制备方法。

背景技术

糜蛋白酶，英文名称为Chymotrypsin，别名胰凝乳蛋白酶、α-糜蛋白酶、甲-糜蛋白酶。是一种典型的丝氨酸蛋白酶，是脊椎动物的消化酶。在胰脏中以酶前体物质胰凝乳蛋白酶原的形态生物合成，随胰液分泌出去。在小肠受到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的一定的分解，转变成活性的胰凝乳蛋白酶。属于肽链内切酶，主要切断多肽链中的芳香族氨基酸残基的羧基一侧。对其氨基酸序列、高级结构，反应机制的研究还在进展中。牛的α-胰凝乳蛋白酶的氨基酸残基数245个，分子量约2.5万，第57位组氨酸、102位天冬氨酸、195位丝氨酸等三个残基在催化作用中起着中心作用。195位丝氨酸受二异丙基氟磷酸(DFP)的作用受特异的修饰而丧失活性，即所谓丝氨酸蛋白酶。与同样在胰脏里生物合成的胰蛋白酶虽然在结构和催化机制方面关系非常密切，但底物特异性完全不同。

糜蛋白酶制剂是由牛胰中分离制得的一种蛋白分解酶类药，作用与胰蛋白酶相似，能促进血凝块、脓性分泌物和坏死组织等的液化清除。糜蛋白酶具有肽链内切酶及脂酶的作用，可将蛋白质大分子的肽链切断，成为分子量较小的肽，或在蛋白分子肽链端上作用，使氨基酸分出；并可将某些脂类水解。通过此作用能使痰中纤维蛋白和粘蛋白等水解为多肽或氨基酸，使粘稠痰液液化，便于咳出，对脓性或非脓性痰都有效。此外，本药尚能松弛睫状韧带及溶解眼内某些组织的蛋白结构。糜蛋白酶还有促进抗生索、化疗药物向病灶渗透的作用。

注射用糜蛋白酶为蛋白分解酶类药，具有肽链内切酶的作用，使蛋白质大分子的肽链切断，成为分子量较小的肽，或在蛋白分子肽链端上作用，使分出氨基酸。糜蛋白酶制剂还有酯酶作用，使某些脂水解。因此可消化脓液、积血、坏死组织，起创面净化、消炎、消肿作用。此外还能松弛睫状韧带及溶解眼内某些组织的蛋白结构。

鉴于糜蛋白酶的热稳定性较差，其原料需在冷处贮存，而水溶液不稳定，制成注射液或需要高温灭菌的过程，将对糜蛋白酶的稳定性产生较大的影响，所以糜蛋白酶不适合制成注射液或需高温终端灭菌的生产过程。同时由于糜蛋白酶很容易染菌，对于制备过程中的无菌要求很高。同时由于糜蛋白酶是生物大分子，经冻干后的蓬松度较差，溶解速度较慢。为此，本发明提出了一种蓬松度高、稳定性高、生物活性高、无菌化程度高的糜蛋白酶制剂。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出一种糜蛋白组合物的冻干粉制剂。

本发明的第二发明目的在于提出该糜蛋白组合物的冻干粉制剂的制备方法。

为了完成本发明的发明目的，所采用的技术方案为：

本发明涉及一种糜蛋白酶组合物冻干粉，所述糜蛋白酶组合物冻干粉由糜蛋白酶、右旋糖酐20和山梨醇组成，所述糜蛋白酶、右旋糖酐20和山梨醇的比例为100万单位：1g～1.8g∶0.05g～0.6g，优选为100万单位：1.2g～1.6g∶0.08g～0.4g，最优选为100万单位：1.4g∶0.1g。

本发明的第一优选技术方案为：所述糜蛋白酶组合物冻干粉平均的孔隙率为85％～98％；优选90～98％；更优选为95％。

本发明还涉及该糜蛋白酶组合物冻干粉的制备方法，具体包括如下步骤：

1.配制溶液：采用温度为5～10℃注射用水配制6％右旋糖酐20溶液，加入针用活性炭，搅拌，加热至90～100℃15～30分钟，过滤脱炭；

2.于配液罐中加入温度为5～15℃、体积为配液总量60～80％的注射用水，搅拌，依次加入6％右旋糖酐20溶液、20％山梨醇注射液、糜蛋白酶，搅拌至糜蛋白酶完全溶解，补加注射液至配液总量；所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加2～5ml的注射用水；

3.用硫酸溶液或氢氧化钠溶液调节药液的pH值至5.8～6.1，优选6.0；

4.药液经两次滤膜除菌过滤后，备用；

5.滤液分装，半加塞，放入冻干机中进行冷冻干燥。

本发明制备方法的第一优选技术方案为：加入针用活性炭的质量百分比浓度为2％。

本发明制备方法的第二优选技术方案为：步骤(2)中加入糜蛋白酶时配液罐中的溶液温度为5～10℃，优选10℃。

本发明制备方法的第三优选技术方案为：步骤(2)中，所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加3～5ml的注射用水，优选添加3.5～4.88ml的注射用水，进一步优选添加4.02～4.48ml的注射用水。

本发明制备方法的第四优选技术方案为：所述硫酸溶液或氢氧化钠溶液的浓度分别为1mol/L。

本发明制备方法的第五优选技术方案为：步骤(4)中，采用0.2μm滤膜一次除菌过滤及0.2μm滤膜二次终端除菌过滤。

本发明制备方法的第六优选技术方案为：所述的冷冻干燥包括以下步骤：

(1)预冻：搁板温度在5～15℃进箱，并将冻干箱温度以2～6℃/min的速度降至-20～-15℃，保温1～3小时；再将冻干箱温度以0.7～1.2℃/min的速度降至-40～-50℃，等制品温度达-30～-40℃时，计时保温1～3小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-48～-58℃，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.45～0.55℃/min的速度升至4～8℃，保温至水晶消失，然后继续保温1～3小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.5～0.8℃/min升温至25～35℃，待制品温度达20～28℃时，计时保温2～5小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

本发明制备方法的第七优选技术方案为：所述的冷冻干燥包括以下步骤：

(1)预冻：搁板温度在10～15℃进箱，并将冻干箱温度以3～6℃/min的速度降至-20～-15℃，保温1～3小时；再将冻干箱温度以0.7～1℃/min的速度降至-40～-50℃，等制品温度达-30～-40℃时，计时保温1～3小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-48～-58℃，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.45～0.55℃/min的速度升至4～8℃，保温至水晶消失，然后继续保温1.5～3小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.6～0.7℃/min升温至25～33℃，待制品温度达20～24℃时，计时保温2～4小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱；

优选为：

(1)预冻：搁板温度在10℃进箱，将冻干箱温度以4.5～6℃/min的速度降至-20～-18℃，保温1～3小时；再将搁板温度以0.7～0.75℃/min的速度降至-46～-48℃，等制品温度达-35～-38℃时，计时保温2～2.5小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-54～-57℃，打开箱阱阀，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.5℃/min的速度升至6℃，保温至水晶消失，然后继续保温2～2.5小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.65℃/min升温至30℃，待制品温度达22℃时，计时保温3.5小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明。

本发明提出一种糜蛋白酶组合物冻干粉，由糜蛋白酶、右旋糖酐20和山梨醇组成，三者的比例为100万单位：1g～1.8g∶0.05g～0.6g，优选为100万单位：1.2g～1.6g∶0.08g～0.4g，最优选为100万单位：1.4g∶0.1g。

本领域技术人员知道，冻干粉针剂的处方中辅料的成分和含量越少，那么由辅料带来的杂质的种类和含量就越少，由杂质引起的风险就越小，并且辅料本身给注射者带来的风险也就越小，因此本发明采用山梨醇作为赋形剂，经过辅料筛选试验，采用山梨醇作为赋形剂的效果好于甘露醇、葡萄糖等其他原料。

同时，发明人通过实验确定了所添加的山梨醇的比例，山梨醇主要起支架剂的作用，山梨醇添加的比例是影响冻干粉针的外观、复溶性等性质的重要原因之一。现有技术中一般需要添加较多量赋形剂，一般每100万单位糜蛋白酶需要添加赋形剂在1克左右。本发明通过对制备方法的改进，进一步的降低了赋形剂的用量，从而使获得的冻干粉针更易于溶解，溶解速度更快。

经过大量实验，发现当糜蛋白酶、右旋糖酐20与山梨醇的质量比为100万单位：1g～1.8g∶0.05g～0.6g时，采用常规冻干方法冻干时，其冻干效果较差，冻干粉不够疏松，且复溶性不好。本发明为了在采用较少赋形剂的基础上获得更好的冻干效果，对冻干工艺做了研究和改进。本发明采用配液总量的体积为每4000单位的糜蛋白酶添加2～5ml的注射用水，再进行冻干，并对冻干工艺做了进一步的改进，获得的冻干粉的外观为疏松块状物，孔隙率可达85％～98％，复溶性优良。当赋形剂的用量进一步减少，糜蛋白酶、右旋糖酐20与山梨醇的质量比为100万单位：1.2g～1.6g∶0.2g～0.4g时，产品的外观依旧良好，复溶性、澄清度优良。出于节省成本的考虑，最优选二者比例为100万单位：1.4g∶0.1g。

本发明的糜蛋白酶冻干粉针剂外观饱满不萎缩、色泽均一、复溶性好，孔隙率可达85％～98％，冻干粉针剂在20℃贮存24个月后，冻干粉针剂的颜色无变化，并且复溶后的澄清度好，各项指标均无明显变化，具有非常优异的稳定性。

本发明的糜蛋白酶组合物冻干粉的制备方法包括如下步骤：

(1)配制溶液：采用温度为5～10℃注射用水配制6％右旋糖酐20溶液，加入医用活性炭，搅拌，加热至90～100℃15～30分钟，过滤脱炭；

(2)于配液罐中加入温度为5～10℃、体积为配液总量60～80％的注射用水，搅拌，依次加入6％右旋糖酐20溶液、20％山梨醇注射液、糜蛋白酶，搅拌至糜蛋白酶完全溶解，补加注射液至配液总量；所述配液总量的体积为每4000单位的糜蛋白酶添加2～5ml的注射用水；

(3)用硫酸溶液或氢氧化钠溶液调节药液的pH值至5.8～6.1，优选6.0；

(4)药液经滤器二次终端除菌过滤后，备用；

(5)滤液分装，半加塞，放入冻干机中进行冷冻干燥。

本发明根据糜蛋白酶的特点和糜蛋白酶冻干粉针剂处方的特点，对糜蛋白酶冻干粉针剂的制备工艺进行了反复地研究，如：各组分的用量、配液温度、pH值的范围、活性炭的量及吸附时间、脱碳方式、冻干工艺等等，通过选择最合适的组分用量配比、优化生产工艺，所得到的冻干品复溶后的澄明度良好，稳定性好，质量可控。

由于糜蛋白酶对温度敏感，本发明针对糜蛋白酶的热不稳定的特点，在配制药液的过程中先制造一个低温的溶液环境，先将注射用水冷却到5～10℃再用于本产品的制备。将低温注射用水制备的6％右旋糖酐20溶液、20％山梨醇注射液和糜蛋白酶加入体积为配液总量60～80％的5～10℃注射用水中，糜蛋白酶在溶解时放出溶解热，溶解热将及时快速地释放到大量低温的溶液中，释放的溶解热不会对糜蛋白酶本身带来任何影响，搅拌直至糜蛋白酶全部溶解，再补齐至配液总量。

其中，所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加2～5ml的注射用水，现有技术中一般采用了每4000单位的糜蛋白酶添加0.5ml的注射用水的比例，本发明采用较高的配液总量，其目的为：第一，大量的低温注射用水可以保证糜蛋白酶的溶解在低温条件下进行，保证了糜蛋白酶的活性；第二，大量的低温注射用水降低了糜蛋白酶的浓度，使之更不容易发生降解和污染；第三，通过冻干实验证实，增加配液体积，可以使冻干粉具有更好的孔隙度，从而使冻干粉更加蓬松，溶剂速度增加，同时溶解后的澄明度良好。

当配液的体积为待糜蛋白酶处于一个低温稳定溶液环境中之后，再调节pH值，保证了糜蛋白酶冻干粉针剂药液在配制的全过程处于一个稳定的环境中，避免了糜蛋白酶在溶解过程中瞬间释放的溶解热对糜蛋白酶本身带来的不利影响。

本发明对活性炭的用量和使用方法进行了研究，添加质量百分比为2％的活性炭用量即保证可以完全吸附右旋糖旋20药液中的热原、杂质等，提高产品的纯度和成品率，又不会对药液中主药的含量产生影响；采用边脱炭边循环的方法，使得活性炭附着在过滤棒上，使活性炭的吸附能力得到了加强，保证一次、二次0.2μm除菌滤膜的不堵塞而顺利地完成过滤药液，使其除菌过滤效果达到了极佳的状态；提高了过滤药液的澄清度、冻干后溶解性较好。

本发明为了取得良好的冻干效果，对糜蛋白酶的冻干工艺进行了研究，预冻时，搁板温度在5～15℃进箱，干箱温度以2～6℃/min的速度降至-20～-15℃，保温1～3小时；再将冻干箱温度以0.7～1.2℃/min的速度降至-40～-50℃，等制品温度达-30～-40℃时，计时保温1～3小时。本发明采用了两步降温法，由于配液总体积大，所以先用较快的速度降温，降温到一定程度后，保温一段时间，然后再继续以一个相对较慢的速度降温。降温速率越大，溶液的过冷度和过饱和度愈大，临界结晶的粒度则愈小，成核速度越快，容易形成颗粒较多尺寸较小的细晶，因而冰晶升华后，物料内形成的孔隙尺寸较小，干燥速率会比较低，但冻干后复溶性好。相反，慢速冻结容易形成大颗粒的冰晶，冰晶升华后形成的水气逸出通道尺寸较大，有利于提高干燥速率，但干后复水性差。所以冻干粉针剂在预冻阶段都采用较为快速的冷冻工艺。本发明采用了先快、稳定一定温度、再稍慢一点降温的办法。

预冻后，抽真空至10pa以下，将搁板温度以0.45～0.55℃/min的速度升至4～8℃，保温至冰晶消失，确保冰晶在一次升温的过程中保持外形饱满不萎缩、色泽均一，并且干燥后的成品复溶性好，减少了一次升温阶段中最后的保温时间，冰晶消失，只需保温1～3小时，提高了升华效率。另外，本发明中的辅料山梨醇具有较高的崩解温度，有利于升华的进行。

一次干燥后制品中还存有很多细小的冰晶，由于细小冰晶具有很高的表面能，若二次干燥的升温速率较慢，则小冰晶易相互结合形成大冰晶，若二次干燥的升温速率较快，则可能出现干燥不充分现象，而糜蛋白酶又是热不稳定的物质，所以本发明采用先快速升温，将搁板温度以0.5～0.8℃/min的较快速度升至25～35℃，待制品温度达20～28℃，计时保温2～4小时，使得一次干燥后的小冰晶中的水分先快速蒸发，避免小冰晶之间因升温较慢而相互结合形成大冰晶，并确保了糜蛋白酶冻干粉针剂干燥的效果，又确保糜蛋白酶在干燥过程中的保持稳定。

由于糜蛋白酶易感菌，因此，本发明采用了药液经滤器二次终端除菌过滤：两次串联0.2μm除菌滤膜，从而保证了制剂的无菌，保障了制剂的稳定性和活性。

整个冻干过程时间较短，并均以均速率的温度干燥，易于撑握操作。

与现有技术相比，本发明提供的糜蛋白酶冻干粉针剂及其制备方法的有益效果为：

1.本发明提供的糜蛋白酶冻干粉针剂外观饱满均一、复溶性好、稳定性好，有利于稳定地运输和贮存，并且处方简单，药用辅料添加比例小，对人体的副作用小，安全可靠。

2.本发明对糜蛋白酶冻干粉的制备工艺做了进一步的改进，通过改进配液过程中的温度、配液体积、冻干过程并进行两次除菌，从而制备出了一种活性、稳定性、复溶性良好的冻干粉针。

3.针对糜蛋白酶的特点以及糜蛋白酶冻干粉针剂处方的特点，对糜蛋白酶冻干粉针剂的制备工艺进行了大量的研究，提供的制备工艺简单、方便可行、重复性好，很容易实现工业化大生产，并且冻干时间短、废品率低、灯检剔废难度低，节约人力，较短的生产周期、较低的废品率和更低的人力成本，使生产成本大幅度降低，可以产生可观的经济和社会效益。

本发明的具体实施方式仅限于进一步解释和说明本发明的内容，并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

实施例1：

一种糜蛋白酶组合物冻干粉，配方为：糜蛋白酶4000万单位；右旋糖酐20：40g；山梨醇2g。

所述糜蛋白酶组合物冻干粉平均的孔隙率为85％。

所述糜蛋白酶组合物冻干粉的制备方法包括如下步骤：

1.配制溶液：采用温度为10℃注射用水配制6％右旋糖酐20溶液，加入针用活性炭，搅拌，加热至90℃30分钟，再经钛棒脱炭过滤；其中，加入针用活性炭的质量百分比浓度为2％；

2.于配液罐中加入温度为5℃、体积为配液总量60％的注射用水，搅拌，依次加入6％右旋糖酐20溶液、20％山梨醇注射液、糜蛋白酶，搅拌至糜蛋白酶完全溶解，补加注射液至配液总量；所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加4.48ml的注射用水；加入糜蛋白酶时配液罐中的溶液温度为10℃；

3.用硫酸溶液或氢氧化钠溶液调节药液的pH值至6.0；所用的硫酸溶液或氢氧化钠溶液的浓度分别为1mol/L；

4.药液经0.2μm滤膜一次除菌过滤及0.2μm滤膜二次终端除菌过滤；

5.滤液分装，半加塞，放入冻干机中进行冷冻干燥：

(1)预冻：搁板温度在5℃进箱，并将冻干箱温度以2℃/min的速度降至-20℃，保温1小时；

再将冻干箱温度以0.7℃/min的速度降至-40℃，等制品温度达-30℃时，计时保温1～3小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-48℃，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.45℃/min的速度升至4℃，保温至水晶消失，然后继续保温1～3小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.5℃/min升温至25℃，待制品温度达20℃时，计时保温5小时；

检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

实施例2：

一种糜蛋白酶组合物冻干粉，配方为：糜蛋白酶4000万单位；右旋糖酐20：48g；山梨醇6g。

所述糜蛋白酶组合物冻干粉平均的孔隙率为95％。

所述糜蛋白酶组合物冻干粉的制备方法包括如下步骤：

1.配制溶液：采用温度为10℃注射用水配制6％右旋糖酐20溶液，加入针用活性炭，搅拌，加热至90℃25分钟，再经钛棒脱炭过滤；其中，加入针用活性炭的质量百分比浓度为2％；

2.于配液罐中加入温度为5℃、体积为配液总量60％的注射用水，搅拌，依次加入6％右旋糖酐20溶液、20％山梨醇注射液、糜蛋白酶，搅拌至糜蛋白酶完全溶解，补加注射液至配液总量；所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加5ml的注射用水；加入糜蛋白酶时配液罐中的溶液温度为10℃；

3.用硫酸溶液或氢氧化钠溶液调节药液的pH值至6.0；所用的硫酸溶液或氢氧化钠溶液的浓度分别为1mol/L；

4.药液经0.2μm滤膜一次除菌过滤及0.2μm滤膜二次终端除菌过滤；

5.滤液分装，半加塞，放入冻干机中进行冷冻干燥：

(1)预冻：搁板温度在5℃进箱，并将冻干箱温度以6℃/min的速度降至-15℃，保温3小时；

再将冻干箱温度以1.2℃/min的速度降至-50℃，等制品温度达-40℃时，计时保温2小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-48～-58℃，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.45～0.55℃/min的速度升至4～8℃，保温至水晶消失，然后继续保温1～3小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.8℃/min升温至35℃，待制品温度达28℃时，计时保温2小时；

检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

实施例3：

一种糜蛋白酶组合物冻干粉，配方为：糜蛋白酶4000万单位；右旋糖酐20：56g：山梨醇4g。

所述糜蛋白酶组合物冻干粉平均的孔隙率为90～98％。

所述糜蛋白酶组合物冻干粉的制备方法包括如下步骤：

1.配制溶液：采用温度为10℃注射用水配制6％右旋糖酐20溶液，加入针用活性炭，搅拌，加热至100℃15分钟，过滤脱炭；加入针用活性炭的质量百分比浓度为2％；

2.于配液罐中加入温度为10℃、体积为配液总量70％的注射用水，搅拌，依次加入6％右旋糖酐20溶液、20％山梨醇注射液、糜蛋白酶，搅拌至糜蛋白酶完全溶解，补加注射液至配液总量；所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加4.88ml的注射用水；加入糜蛋白酶时配液罐中的溶液温度为10℃；

3.用硫酸溶液或氢氧化钠溶液调节药液的pH值至优选6.0；所述硫酸溶液或氢氧化钠溶液的浓度分别为1mol/L。

4.药液经0.2μm滤膜一次除菌过滤及0.2μm滤膜二次终端除菌过滤。

5.滤液分装，半加塞，放入冻干机中进行冷冻干燥：

(1)预冻：搁板温度在12℃进箱，并将冻干箱温度以4℃/min的速度降至-20℃，保温2小时；再将冻干箱温度以0.8℃/min的速度降至-45℃，等制品温度达-35℃时，计时保温2小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-58℃，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.5℃/min的速度升至8℃，保温至水晶消失，然后继续保温2小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.7℃/min升温至28℃，待制品温度达24℃时，计时保温2小时；

检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱；

实施例4：

一种糜蛋白酶组合物冻干粉，配方为：糜蛋白酶4000万单位；右旋糖酐20：56g；山梨醇16g。所述糜蛋白酶组合物冻干粉平均的孔隙率为98％。

所述糜蛋白酶组合物冻干粉的制备方法包括如下步骤：

1.配制溶液：采用温度为8℃注射用水配制6％右旋糖酐20溶液，加入针用活性炭，搅拌，加热至90～100℃15～30分钟，再经钛棒脱炭过滤；加入针用活性炭的质量百分比浓度为2％；

2.于配液罐中加入温度为12℃、体积为配液总量80％的注射用水，搅拌，依次加入6％右旋糖酐20溶液、20％山梨醇注射液、糜蛋白酶，搅拌至糜蛋白酶完全溶解，补加注射液至配液总量；所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加3.5ml的注射用水；加入糜蛋白酶时配液罐中的溶液温度为10℃；

3.用硫酸溶液或氢氧化钠溶液调节药液的pH值至5.8；所述硫酸溶液或氢氧化钠溶液的浓度分别为1mol/L；

4.药液经0.2μm滤膜一次除菌过滤及0.2μm滤膜二次终端除菌过滤；

5.滤液分装，半加塞，放入冻干机中进行冷冻干燥：

(1)预冻：搁板温度在10℃进箱，将冻干箱温度以4.5℃/min的速度降至-20℃，保温1～3小时；再将搁板温度以75℃/min的速度降至-48℃，等制品温度达--38℃时，计时保温2.5小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-57℃，打开箱阱阀，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.5℃/min的速度升至6℃，保温至水晶消失，然后继续保温2.5小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.65℃/min升温至30℃，待制品温度达22℃时，计时保温3.5小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

实施例5

一种糜蛋白酶组合物冻干粉，配方为：糜蛋白酶4000万单位；72g；山梨醇8g；糜蛋白酶组合物冻干粉平均的孔隙率为95％。

所述糜蛋白酶组合物冻干粉的制备方法包括如下步骤：

1.配制溶液：采用温度为8℃注射用水配制6％右旋糖酐20溶液，加入针用活性炭，搅拌，加热至90～100℃15～30分钟，再经钛棒脱炭过滤；加入针用活性炭的质量百分比浓度为2％；

2.于配液罐中加入温度为10℃、体积为配液总量80％的注射用水，搅拌，依次加入6％右旋糖酐20溶液、20％山梨醇注射液、糜蛋白酶，搅拌至糜蛋白酶完全溶解，补加注射液至配液总量；所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加4.02ml的注射用水；加入糜蛋白酶时配液罐中的溶液温度为10℃；

3.用硫酸溶液或氢氧化钠溶液调节药液的pH值6.0；所述硫酸溶液或氢氧化钠溶液的浓度分别为1mol/L；

4.药液经0.2μm滤膜一次除菌过滤及0.2μm滤膜二次终端除菌过滤；

5.滤液分装，半加塞，放入冻干机中进行冷冻干燥：

(1)预冻：搁板温度在10℃进箱，将冻干箱温度以6℃/min的速度降至-18℃，保温3小时；再将搁板温度以0.75℃/min的速度降至--48℃，等制品温度达-38℃时，计时保温2～2.5小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-54℃，打开箱阱阀，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.5℃/min的速度升至6℃，保温至水晶消失，然后继续保温2.5小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.65℃/min升温至30℃，待制品温度达22℃时，计时保温3.5小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

实验例1 6％右旋糖酐20溶液中针用活性炭用量的确定

采用活性炭除热原和脱色可能会对溶液中药物有吸附作用，因此考察一定浓度的活性炭对糜蛋白酶吸附的影响。

试验方法：于80ml注射用水中加入称取的处方量的6％右旋糖酐20，加热并搅拌至右旋糖酐20完全溶解。将新配制的右旋糖酐20溶液液，分成4等份，其中3份分别加入0.5％(W/W)、1％(W/W)、2％(W/W)的针用活性炭，另一份作未吸附溶液，均搅均，沸腾30分钟，再经钛棒脱炭，量取各组滤液进行分析检测，考察右旋糖酐20药液经不同浓度的活性炭在相同搅拌时间内的相对含量(相对吸附前的溶液)、溶液澄清及颜色、细菌内毒素，分析结果见表1。

表1针用活性炭吸附结果

由分析结果可知：针用活性炭0.5％～2％(W/W)对右旋糖酐20含量均有明显的吸附，经活性炭吸附后溶液澄清度与纯化水比较，均有不同程度的改观，细菌内毒素加入1％和2％均符合规定。综合考虑吸附细菌内毒素的效果和其他指标的影响，我们选择0.3％浓度的针用活性炭进行吸附。

实验例2酸度范围确定

根据注射用糜蛋白酶质量标准(《中国药典》2010年版)的pH值范围为5.5～6.5，基于糜蛋白酶的溶解性和人体的耐受性影响因素，本制剂在配液时，药液的pH值为5.8～6.1，优选为6.0。

实验例3针用活性炭吸附时间的考察

根据以上试验结果，用3％浓度的针用活性炭，经不同的吸附时间，考察针用活性炭对右旋糖酐20的吸附情况，确定针用活性炭的吸附时间。

试验方法：准备80ml的注射用水置不锈钢桶内，加入右旋糖酐20 6g，加热并搅拌至右旋糖酐20完全溶解，加入2％(W/W)针用活性炭，搅均。将新配制的右旋糖酐20溶液80ml，分成3等份，分别加入占药液总体积的2％(W/W)的针用活性炭，分别按表2中的时间进行沸腾搅拌吸附，过滤除炭，再取各滤液进行分析检测，考察糜蛋白酶溶液经相同浓度的活性炭在不同吸附时间的含量变化情况、溶液澄清度及颜色、细菌内毒素的影响，结果见表2。

表2针用活性炭吸附时间的考察

试验结果表明：2％(W/W)浓度的活性炭，在吸附时间10min时溶液澄清度比空白水略浊，20min及30min时，活性炭对右旋糖酐20含量的吸附作用相当，溶液澄清度与纯化水基本相当，细菌内毒素均符合规定。

因此，本制剂活性炭用量的选择浓度为2％(W/W)，室温下吸附时间20min。

实施例4

对比试验：采用实施例3所采用的制备方法，区别在于表3的条件：

表3

制得的冻干粉针的性状见表4；其中，均采用相同的条件测量溶解时间，采用孔隙率测定仪测定粉末的孔隙率。

表4：

根据上述试验可知，在其他条件相同的条件下，采用的配液总量为每4000单位的糜蛋白酶2～5ml的注射用水组，其冻干块状物、疏松、饱满、均一，孔隙率为高，冻干后的澄清度高，复溶时间短；而配液总量为现有技术的各组，其冻干粉的孔隙率低，复溶效果较差。实验例5冻干工艺参数的确定

按照实施例3的制备方法，区别如下，见表5。分别分析所制得的制品，见表6；其中，均采用相同的条件测量溶解时间，采用孔隙率测定仪测定粉末的孔隙率。

表5：冻干工艺参数

表6：糜蛋白酶组合物冻干粉制品分析结果

结果：

由本发明可以看出，采用其他的冻干方法制备的冻干粉的冻干效果与本发明条件的效果要差很多，冻干工艺5、6和7制备的制品为白色块状物，但外观不及工艺9的制品疏松、饱满、均一，其复溶时间和澄清度的也不及工艺9。冻干工艺9制备的样品各项指标分析结果均较好。

实验例6糜蛋白酶冻干粉针剂工艺放大生产结果

以实施例3的生产工艺，进行了放大样品生产，糜蛋白酶冻干粉针剂生产结果及样品检验结果分别见表7和表8。

表7：注射用糜蛋白酶3批生产结果

表8：注射用糜蛋白酶组合物冻干粉样品检验结果

结论：在经过验证的注射用糜蛋白酶3批样品，检验结果均符合所订药品质量标准草案。工艺稳定，质量可控，药品的安全性能有效地得到保障。

取本发明其他实施例制备的冻干粉，采用同样的方法进行试验，取得了相同的实验结果。

实验例7糜蛋白酶冻干粉针剂稳定性研究

(1)加速试验

取实施例3制备的样本在试验期间第1、2、3、6个月末分别取样，对样品的药物性状、胶塞外观、溶解时间、酸度、溶液澄清度与颜色、水分、容器密封性、不溶性微粒、可见异物、细菌内毒素、无菌、含量进行考察。

表9：注射用糜蛋白酶组合物冻干粉加速试验1月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度75％；

包装形式：模拟市售包装。

表8注射用糜蛋白酶组合物冻干粉加速试验2月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度75％；

包装形式：模拟市售包装。

表9注射用糜蛋白酶组合物冻干粉加速试验3月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度75％；

包装形式：模拟市售包装。

表10注射用糜蛋白酶组合物冻干粉加速试验6月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度75％；

包装形式：模拟市售包装。

加速试验结果表明：模拟上市包装于温度30℃，相对湿度75％的条件下(倒置放置)放置6月，各项指标均无明显变化。说明此条件下，本品的稳定性好。

(2)长期试验

样品模拟上市包装，于温度30℃，相对湿度60％的条件下放置(直立放置)，分别于3、6、9、12、18、24、36个月末取样，对样品的药物性状、胶塞外观、溶解时间、酸度、溶液澄清度与颜色、水分、容器密封性、不溶性微粒、可见异物细菌内毒素、无菌、含量进行考察。

表11注射用糜蛋白酶组合物冻干粉长期试验3月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度60％；

包装形式：模拟市售包装。

表12注射用糜蛋白酶组合物冻干粉长期试验9月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度60％

包装形式：模拟市售包装

表13注射用糜蛋白酶组合物冻干粉长期试验24月结果

长期试验结果：于温度30℃，相对湿度60％的条件下放置(直立放置)放置3、6、9、12、18、24、36个月，各项指标均无明显变化。说明此条件下，本品的稳定性好。

配伍试验试验结果表明：参照本品说明书中肌内注射用法用量配制的两种配伍溶液，在室温下6小时内外观、pH值、溶液的澄清度与颜色、不溶性微粒、可见异物、含量、有关物质均基本不变，两种配伍溶液均稳定，满足临床使用需要。

取本发明其他实施例制备的冻干粉，采用同样的方法进行试验，取得了相同的实验结果。

实验例8糜蛋白酶组合物冻干粉针剂稳定性对比试验

(1)加速试验

取实施例3制备的样本在试验期间第1、2、3、6个月末分别取样，对样品的药物性状、胶塞外观、溶解时间、酸度、溶液澄清度与颜色、水分、容器密封性、不溶性微粒、可见异物、细菌内毒素、无菌、含量进行考察。

同时制备对比药物：采用相同的甘露醇作为赋形剂，其他条件同实施例3制备对比药物，制备两个批次。

表14：注射用糜蛋白酶组合物冻干粉对比加速试验1月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度75％

包装形式：模拟市售包装

表14注射用糜蛋白酶组合物冻干粉对比加速试验3月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度75％；

包装形式：模拟市售包装。

表15注射用糜蛋白酶组合物冻干粉对比加速试验6月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度75％；

包装形式：模拟市售包装。

表14注射用糜蛋白酶组合物冻干粉对比加速试验9月结果

规格：4000单位；

存储条件：温度30℃，相对湿度75％；

包装形式：模拟市售包装。

根据上述对比试验可知，采用山梨醇做赋形剂的冻干粉针的稳定性要好于对比药物，孔隙率略好于对比药物。

Claims (10)

1.一种糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征在于，所述糜蛋白酶组合物冻干粉由糜蛋白酶、右旋糖酐20和山梨醇组成，所述糜蛋白酶、右旋糖酐20和山梨醇的比例为100万单位：1g～1.8g∶0.05g～0.6g，优选为100万单位：1.2g～1.6g∶0.08g～0.4g，最优选为100万单位：1.4g∶0.1g。

2.根据权利要求1所述的糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征在于，所述糜蛋白酶组合物冻干粉平均的孔隙率为85％～98％；优选90～98％；更优选为95％。

3.根据权利要求1所述的糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征为在于，所述糜蛋白酶组合物冻干粉的制备方法包括如下步骤：

(1)配制溶液：采用温度为5～10℃注射用水配制6％右旋糖酐20溶液，加入针用活性炭，搅拌，加热至90～100℃15～30分钟，过滤脱炭；

(2)于配液罐中加入温度为5～15℃、体积为配液总量60～80％的注射用水，搅拌，依次加入6％右旋糖酐20溶液、20％山梨醇注射液、糜蛋白酶，搅拌至糜蛋白酶完全溶解，补加注射液至配液总量；所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加2～5ml的注射用水；

(3)用硫酸溶液或氢氧化钠溶液调节药液的pH值至5.8～6.1，优选6.0；

(4)药液经两次滤膜除菌过滤，备用；

(5)滤液分装，半加塞，放入冻干机中进行冷冻干燥。

4.根据权利要求3所述的糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征为在于，加入针用活性炭的质量百分比浓度为2％。

5.根据权利要求3所述的糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征在于，步骤(2)中加入糜蛋白酶时配液罐中的溶液温度为5～10℃，优选10℃。

6.根据权利要求3所述的糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征在于，步骤(2)中，所述配液总量为每4000单位的糜蛋白酶添加3～5ml的注射用水，优选添加3.5～4.88ml的注射用水，进一步优选添加4.02～4.48ml的注射用水。

7.根据权利要求3所述的糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征在于，所述硫酸溶液或氢氧化钠溶液的浓度分别为1mol/L。

8.根据权利要求3所述的糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征在于，步骤(4)中，采用0.2μm滤膜一次除菌过滤及0.2μm滤膜二次终端除菌过滤。

9.根据权利要求3所述的糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征为在于，所述的冷冻干燥包括以下步骤：

(1)预冻：搁板温度在5～15℃进箱，并将冻干箱温度以2～6℃/min的速度降至-20～-15℃，保温1～3小时；再将冻干箱温度以0.7～1.2℃/min的速度降至-40～-50℃，等制品温度达-30～-40℃时，计时保温1～3小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-48～-58℃，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.45～0.55℃/min的速度升至4～8℃，保温至水晶消失，然后继续保温1～3小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.5～0.8℃/min升温至25～35℃，待制品温度达20～28℃时，计时保温2～5小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。

10.根据权利要求9所述的糜蛋白酶组合物冻干粉，其特征为在于，所述的冷冻干燥包括以下步骤：

(1)预冻：搁板温度在10～15℃进箱，并将冻干箱温度以3～6℃/min的速度降至-20～-15℃，保温1～3小时；再将冻干箱温度以0.7～1℃/min的速度降至-40～-50℃，等制品温度达-30～-40℃时，计时保温1～3小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-48～-58℃，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.45～0.55℃/min的速度升至4～8℃，保温至水晶消失，然后继续保温1.5～3小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.6～0.7℃/min升温至25～33℃，待制品温度达20～24℃时，计时保温2～4小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱；

优选为：

(1)预冻：搁板温度在10℃进箱，将冻干箱温度以4.5～6℃/min的速度降至-20～-18℃，保温1～3小时；再将搁板温度以0.7～0.75℃/min的速度降至-46～-48℃，等制品温度达-35～-38℃时，计时保温2～2.5小时；

(2)一次干燥：将冷凝温度降至-54～-57℃，打开箱阱阀，抽真空至10pa以下，将冻干箱温度以0.5℃/min的速度升至6℃，保温至水晶消失，然后继续保温2～2.5小时；

(3)二次干燥：冻干箱以0.65℃/min升温至30℃，待制品温度达22℃时，计时保温3.5小时；检查真空度无变化，结束冻干过程，充氮全压塞，出箱。