CN102850565B - 一种促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法。目前还没有一种操作容易，既快速，又能制备出具有高的生物相容性的柞蚕丝素的生物矿化方法。本发明依次包括如下步骤：将柞蚕蚕茧剪碎，投加到Na2CO3水溶液中脱胶得柞蚕丝素纤维；将柞蚕丝素纤维投加到LiSCN水溶液中溶解后透析，冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，再在六氟丙酮中溶解得柞蚕丝素溶液；将柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上风干得到柞蚕丝素膜；将柞蚕丝素膜浸渍于CaCl2水溶液中，用水和丙酮清洗，风干，再浸渍于Na2HPO4水溶液中，用水和丙酮清洗，风干，重复操作20-35次，从而制得成品。本发明的工艺简单，制备周期短，制备而成的生物材料没有细胞毒性。
Description
技术领域
本发明涉及一种柞蚕丝素的生物矿化方法，尤其是涉及一种促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，属于柞蚕丝素蛋白的加工方法。
背景技术
柞蚕是一种野生蚕，我国每年的柞蚕产量占全世界的90%以上。柞蚕丝素是一种天然高分子蛋白，许多研究表明柞蚕丝素具有良好的生物相容性和机械强度，是一种可降解的生物高分子材料，其降解产物对细胞或者机体无毒副作用，也很少产生免疫排斥或者炎症反应。柞蚕丝素与家蚕丝素相比，在氨基酸的组成上有所不同，柞蚕丝素蛋白中富含丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，这三种氨基酸的含量占柞蚕丝素氨基酸总含量的80％以上。柞蚕丝素的一级结构中的精氨酸、甘氨酸和天门冬氨酸形成Arg–Gly-Asp(RGD)三肽序列，RGD是与细胞黏附有关的特殊三肽结构。机体内细胞与细胞外基质的相互作用、信息交换是通过细胞膜上的整合素与细胞外黏附蛋白进行的，而许多黏附蛋白和胶原都有RGD三肽序列，柞蚕丝素蛋白是天然纤维中少有的几种含RGD序列的蛋白纤维，利用柞蚕丝素的这些优点，可将柞蚕丝素用作创面覆盖材料以及人工皮肤材料、药物缓释材料、人造角膜、食道、心脏瓣膜、血管等不同形状与功能的生物材料，以满足人类对生物材料的不同需求。
柞蚕丝素溶液可以通过两种方法提取，一种是直接提取法：即从成熟的柞蚕蚕体后部丝腺中提取液态的丝素蛋白溶液，此种方法能保持丝素蛋白溶液最大的完整性，蛋白溶液的一级结构不被破坏，但操作比较复杂。另一种为再生提取法：首先将柞蚕蚕茧脱胶，然后用有机溶剂将柞蚕丝素溶解成溶液，此种方法操作简便，但是柞蚕丝素蛋白的结构可能会发生变化。
体内骨组织是由有机质和无机质组成的生物矿化组织，羟基磷灰石具有良好的生物相容性，是构成人体骨骼和牙齿的主要无机成分。由于简单的将羟基磷灰石与天然高分子材料混合所制备出的材料与天然骨相比，在物化性质上有很大的不同，因此采用仿生的方法模拟天然骨的形成机制势在必行。
现在也有一些蚕丝的矿化处理，如公开日为2012年07月04日，公开号为CN102532573A的中国专利中，公开了一种丝胶蛋白/羟基磷灰石复合膜的快速成型方法，该方法是对丝胶蛋白/羟基磷灰石复合膜进行快速成型，不适用于对柞蚕丝素进行生物矿化处理。
综上所述，目前还没有一种工序简单，操作容易，利用仿生方法，既快速，又能制备出具有高的生物相容性的柞蚕丝素的生物矿化方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种工艺简单，制备周期短，制备而成的生物材料不仅没有细胞毒性，而且对细胞具有粘附和促进作用的促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法的特点在于：所述生物矿化方法依次包括如下步骤：
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以（1:25）-（1:35）的浴比投加到质量百分比为0.3%-0.7%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理25-35分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维；
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为8-10mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析2-4天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为9-20份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液；
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜；
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.2-7.6的CaCl2水溶液中浸泡8-12秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜；
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.2-7.6的Na2HPO4水溶液中浸泡8-12秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜；
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为20-35次，从而制得成品。
作为优选，本发明所述步骤（1）中，将柞蚕蚕茧剪碎，以1:30的浴比投加到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理。
作为优选，本发明所述步骤（1）中，脱胶处理30分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
作为优选，本发明所述步骤（2）中，将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A。
作为优选，本发明所述步骤（2）中，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析3天得到溶液B。
作为优选，本发明所述步骤（2）中，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为19份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
作为优选，本发明所述步骤（4）中，将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.4的CaCl2水溶液中浸泡10秒钟。
作为优选，本发明所述步骤（5）中，将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.4的Na2HPO4水溶液中浸泡10秒钟。
作为优选，本发明所述步骤（6）中，重复的次数为30次。
作为优选，本发明所述步骤（1）中，所述Na2CO3水溶液的温度为85-105℃。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：操作简单，制备容易，生产周期短，利用仿生方法研制出一种即快速又具有高的生物相容性的新型高分子矿化材料，丰富了矿化生物材料的类型，也拓展了丝素蛋白的用途。
本发明可以利用柞蚕丝素中的某些功能基团，如羧基，来诱导对磷灰石的异相成核，快速地使磷灰石能够沉积于柞蚕丝纤维表面，制备而成的生物材料不仅没有细胞毒性，而且对细胞具有粘附和促进作用。
通过本发明制备而成的成品具有如下优点：1、优良的机械性能，通过本发明制备而成的成品做成的生物膜与家蚕丝素或者其它天然高分子蛋白做成的生物膜相比，具有很高的弹性形变。2、特有的RGD多肽序列，柞蚕丝素以及结构中所含的RGD多肽序列对细胞的粘附起着重要的作用。3、高含量的谷氨酸和天冬氨酸，具有高度的亲水性和生物矿化功能。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）称取10g柞蚕丝素蚕茧，剪碎，放入到1L 沸腾的Na2CO 3水溶液中进行脱胶处理，在Na2CO 3水溶液中，Na2CO 3的质量百分比为0.5%，脱胶处理30min，重复上述操作一次，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到7.3g柞蚕丝素纤维。
（2）取5g步骤（1）中的柞蚕丝素纤维，投加到35ml浓度为9mol/L的LiSCN 溶液中溶解均匀，得到溶液A，该溶液A为柞蚕丝素与LiSCN的混合溶液。然后将溶液A在去离子水中透析3天，得到溶液B，将溶液B冷冻干燥制成柞蚕丝素粉末，将0.5g柞蚕丝素粉加入到9.5g六氟丙酮溶液中，溶解成柞蚕丝素溶液。
（3）将5ml步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到直径为8.5cm的塑料板上，风干后形成柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜置于pH值为7.4的CaCl2水溶液中浸渍10秒钟，然后依次用去离子水和丙酮进行清洗，清洗后，使用电吹风吹干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH为7.4的Na2HPO4水溶液中10秒，然后依次用去离子水和丙酮清洗，清洗后，使用电吹风吹干，得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为30次，从而制得成品。步骤（4）和步骤（5）的操作过程定为矿化1次的过程。
本实施例中的成品是经过交互浸渍30次后得到的，取交互浸渍30次的样品加工成24孔细胞培养板大小，PBS溶液清洗三次，75%酒精灭菌2个小时，DMEM培养基温浴12小时，3天之后的MG-63细胞培养结果表明：MTT值为1.5，ALP值为0.15。而未添加柞蚕丝素矿化膜的MTT和 ALP值分别为0.76和0.11。
实施例2。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）称取10g柞蚕丝素蚕茧，剪碎，放入到1L沸腾的Na2CO 3水溶液中进行脱胶处理，在Na2CO 3水溶液中，Na2CO 3的质量百分比为0.5%，脱胶处理30min，重复上述操作一次，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到7.3g柞蚕丝素纤维。
（2）取5g步骤（1）中的柞蚕丝素纤维，投加到35ml浓度为9mol/L的LiSCN 溶液中溶解均匀，得到溶液A，该溶液A为柞蚕丝素与LiSCN的混合溶液。然后将溶液A在去离子水中透析3天得到溶液B，将溶液B冷冻干燥制成柞蚕丝素粉末，将1g柞蚕丝素粉加入到9g六氟丙酮溶液中，溶解成柞蚕丝素溶液。
（3）将5ml步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到直径为8.5cm的塑料板中，风干后形成柞蚕丝素膜。
（4）把步骤（3）中的柞蚕丝素膜置于pH值为7.4的CaCl2水溶液中浸渍 10 秒，然后依次用去离子水和丙酮清洗，清洗后，使用电吹风吹干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH为7.4的Na2HPO4水溶液中10 秒，然后依次用去离子水和丙酮清洗，清洗后，使用电吹风吹干，得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为33次，从而制得成品。步骤（4）和步骤（5）的操作过程定为矿化1次的过程。
本实施例中的成品是经过交互浸渍30次后得到的，取交互浸渍30次的样品1mg溶解在1ml三氟乙酸溶液中得到混合液，然后将200微升此混合液加入到24孔中，风干24小时，PBS溶液清洗三次，75%酒精灭菌2个小时，DMEM培养基温浴12小时。3天之后的MG-63细胞结果表明：矿化柞蚕丝素的细胞1小时的粘附率为94.3%，而未加矿化柞蚕丝素的细胞粘附率只有74.6%；矿化柞蚕丝素的细胞48小时后的细胞数为200000个，而未加矿化柞蚕丝素的细胞48小时后的细胞数为150000个。
实施例3。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:25的浴比投加到质量百分比为0.4%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理25分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为9.6mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析2天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为11份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.2的CaCl2水溶液中浸泡9秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.2的Na2HPO4水溶液中浸泡9秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为31次，从而制得成品。
实施例4。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:35的浴比投加到质量百分比为0.65%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，Na2CO3水溶液的温度为85℃。脱胶处理27分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为8.2mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析2.5天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为14份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.3的CaCl2水溶液中浸泡11秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.3的Na2HPO4水溶液中浸泡11秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为32次，从而制得成品。
本实施例中的成品是经过交互浸渍32次后得到的，取交互浸渍32次的样品加工成24孔细胞培养板大小，PBS溶液清洗三次，75%酒精灭菌2个小时，DMEM培养基温浴12小时，3天之后的MG-63细胞培养结果表明：MTT值为1.4，ALP值为0.16。而未添加柞蚕丝素矿化膜的MTT和 ALP值分别为0.75和0.11。
实施例5。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:27的浴比投加到质量百分比为0.35%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理34分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析4天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为18份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.4的CaCl2水溶液中浸泡12秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.4的Na2HPO4水溶液中浸泡12秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为34次，从而制得成品。
实施例6。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:33的浴比投加到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，Na2CO3水溶液的温度为105℃。脱胶处理31分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为9.8mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析3.5天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为16份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.6的CaCl2水溶液中浸泡9秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.6的Na2HPO4水溶液中浸泡9秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为35次，从而制得成品。
本实施例中的成品是经过交互浸渍35次后得到的，取交互浸渍35次的样品1mg溶解在1ml三氟乙酸溶液中得到混合液，然后将200微升此混合液加入到24孔中，风干24小时，PBS溶液清洗三次，75%酒精灭菌2个小时，DMEM培养基温浴12小时。3天之后的MG-63细胞结果表明：矿化柞蚕丝素的细胞1小时的粘附率为95.1%，而未加矿化柞蚕丝素的细胞粘附率只有74.2%；矿化柞蚕丝素的细胞48小时后的细胞数为210000个，而未加矿化柞蚕丝素的细胞48小时后的细胞数为150000个。
实施例7。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:30的浴比投加到质量百分比为0.55%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，Na2CO3水溶液的温度为100℃。脱胶处理30分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为8.5mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析3天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为17份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.5的CaCl2水溶液中浸泡8秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.5的Na2HPO4水溶液中浸泡8秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为26次，从而制得成品。
实施例8。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:29的浴比投加到质量百分比为0.45%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理35分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为8.9mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析3.5天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为9份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.4的CaCl2水溶液中浸泡10秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.2的Na2HPO4水溶液中浸泡9秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为23次，从而制得成品。
本实施例中的成品是经过交互浸渍23次后得到的，取交互浸渍23次的样品加工成24孔细胞培养板大小，PBS溶液清洗三次，75%酒精灭菌2个小时，DMEM培养基温浴12小时，3天之后的MG-63细胞培养结果表明：MTT值为1.5，ALP值为0.16。而未添加柞蚕丝素矿化膜的MTT和 ALP值分别为0.74和0.12。
实施例9。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:31的浴比投加到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理25分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为9.3mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析2.5天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为11份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.6的CaCl2水溶液中浸泡9秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.4的Na2HPO4水溶液中浸泡11秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为32次，从而制得成品。
实施例10。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:30的浴比投加到质量百分比为0.3%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，Na2CO3水溶液的温度为95℃。脱胶处理29分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析3天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为12份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.2的CaCl2水溶液中浸泡8秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.5的Na2HPO4水溶液中浸泡10秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为27次，从而制得成品。
实施例11。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:31的浴比投加到质量百分比为0.7%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理27分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为8.5mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析2天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为16份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.4的CaCl2水溶液中浸泡10秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.5的Na2HPO4水溶液中浸泡12秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为28次，从而制得成品。
实施例12。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:32的浴比投加到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，Na2CO3水溶液的温度为98℃。脱胶处理33分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为9.5mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析4天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为15份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.2的CaCl2水溶液中浸泡9秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.5的Na2HPO4水溶液中浸泡11秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为21次，从而制得成品。
本实施例中的成品是经过交互浸渍21次后得到的，取交互浸渍21次的样品1mg溶解在1ml三氟乙酸溶液中得到混合液，然后将200微升此混合液加入到24孔中，风干24小时，PBS溶液清洗三次，75%酒精灭菌2个小时，DMEM培养基温浴12小时。3天之后的MG-63细胞结果表明：矿化柞蚕丝素的细胞1小时的粘附率为94.8%，而未加矿化柞蚕丝素的细胞粘附率只有74.1%；矿化柞蚕丝素的细胞48小时后的细胞数为190000个，而未加矿化柞蚕丝素的细胞48小时后的细胞数为140000个。
实施例13。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:28的浴比投加到质量百分比为0.4%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理34分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为10mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析3天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为19份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.6的CaCl2水溶液中浸泡10秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.5的Na2HPO4水溶液中浸泡8秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为24次，从而制得成品。
本实施例中的成品是经过交互浸渍24次后得到的，取交互浸渍24次的样品加工成24孔细胞培养板大小，PBS溶液清洗三次，75%酒精灭菌2个小时，DMEM培养基温浴12小时，3天之后的MG-63细胞培养结果表明：MTT值为1.6，ALP值为0.16。而未添加柞蚕丝素矿化膜的MTT和 ALP值分别为0.77和0.12。
实施例14。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:33的浴比投加到质量百分比为0.6%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，Na2CO3水溶液的温度为100℃。脱胶处理30分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析3.5天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为20份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.4的CaCl2水溶液中浸泡8秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.3的Na2HPO4水溶液中浸泡10秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为30次，从而制得成品。
实施例15。
本实施例中促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法依次包括如下步骤。
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以1:27的浴比投加到质量百分比为0.3%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理29分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为8mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析2.5天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为9份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜。
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.3的CaCl2水溶液中浸泡9秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜。
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.4的Na2HPO4水溶液中浸泡8秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜。
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为20次，从而制得成品。
本实施例中的成品是经过交互浸渍20次后得到的，取交互浸渍20次的样品1mg溶解在1ml三氟乙酸溶液中得到混合液，然后将200微升此混合液加入到24孔中，风干24小时，PBS溶液清洗三次，75%酒精灭菌2个小时，DMEM培养基温浴12小时。3天之后的MG-63细胞结果表明：矿化柞蚕丝素的细胞1小时的粘附率为94.9%，而未加矿化柞蚕丝素的细胞粘附率只有73.9%；矿化柞蚕丝素的细胞48小时后的细胞数为210000个，而未加矿化柞蚕丝素的细胞48小时后的细胞数为150000个。
虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，其特征在于：所述生物矿化方法依次包括如下步骤：
（1）将柞蚕蚕茧剪碎，以（1:25）-（1:35）的浴比投加到质量百分比为0.3%-0.7%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理，脱胶处理25-35分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维；所述Na2CO3水溶液的温度为85-105℃；
（2）将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为8-10mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析2-4天得到溶液B，再将溶液B进行冷冻和干燥后制成柞蚕丝素粉末，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为9-20份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液；
（3）将步骤（2）中的柞蚕丝素溶液滴加到塑料板上，再进行风干得到柞蚕丝素膜；
（4）将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.2-7.6的CaCl2水溶液中浸泡8-12秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到柞蚕丝素浸渍膜；
（5）将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.2-7.6的Na2HPO4水溶液中浸泡8-12秒钟，先用去离子水进行清洗，然后用丙酮进行清洗，再进行风干得到一次交互浸渍柞蚕丝素膜；
（6）将步骤（5）中的一次交互浸渍柞蚕丝素膜重复步骤（4）和步骤（5）的操作，重复的次数为20-35次，从而制得成品。
2.根据权利要求1所述的促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，其特征在于：所述步骤（1）中，将柞蚕蚕茧剪碎，以1:30的浴比投加到质量百分比为0.5%的Na2CO3水溶液中进行脱胶处理。
3.根据权利要求1所述的促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，其特征在于：所述步骤（1）中，脱胶处理30分钟后，用去离子水清洗干净，再进行烘干得到柞蚕丝素纤维。
4.根据权利要求1所述的促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，将步骤（1）中的柞蚕丝素纤维投加到浓度为9mol/L的LiSCN水溶液中溶解均匀得到溶液A。
5.根据权利要求1所述的促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，将溶液A放进透析膜中，然后在去离子水中透析3天得到溶液B。
6.根据权利要求1所述的促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，其特征在于：所述步骤（2）中，将重量份数为1份的柞蚕丝素粉末投加到重量份数为19份的六氟丙酮中进行溶解得到柞蚕丝素溶液。
7.根据权利要求1所述的促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，其特征在于：所述步骤（4）中，将步骤（3）中的柞蚕丝素膜浸渍于pH值为7.4的CaCl2水溶液中浸泡10秒钟。
8.根据权利要求1所述的促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，其特征在于：所述步骤（5）中，将步骤（4）中的柞蚕丝素浸渍膜浸渍于pH值为7.4的Na2HPO4水溶液中浸泡10秒钟。
9.根据权利要求1所述的促进细胞生长的柞蚕丝素的生物矿化方法，其特征在于：所述步骤（6）中，重复的次数为30次。
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