CN102846644A

CN102846644A - 天然五环三萜类化合物在制备抑制凝血因子Xa活性药物中的用途

Info

Publication number: CN102846644A
Application number: CN2012103157299A
Authority: CN
Inventors: 李友宾; 沈舒; 王琼
Original assignee: Jiangsu Provincial Insititute of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Jiangsu Provincial Insititute of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2012-08-30
Filing date: 2012-08-30
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明涉及天然五环三萜类化合物或其药学可接受的盐或酯，以及包含该类型化合物的药物组合物。该类化合物可以从多种植物，特别是从牛膝、泽兰、白桦、女贞子、甘草等分离得到。本发明涉及的五环三萜类化合物基于对凝血因子Xa的抑制，所述含有五环三萜类化合物或其药学可接受的盐或酯可以有效地作为抗凝血药用于治疗血栓栓塞。本发明还涉及该类化合物或其生理上可接受的盐或酯能够通过因子Xa活性的抑制加以治疗或预防的疾病如血栓栓塞性疾病的治疗和预防中的用途以及用于此类疾病的药剂的制备中的使用。本发明进一步涉及含有五环三萜类化合物或其生理上可接受的盐或酯和一起混合或结合的惰性载体的组合物。

Description

天然五环三萜类化合物在制备抑制凝血因子Xa活性药物中的用途

技术领域

本发明涉及天然五环三萜类化合物作为药物的新用途，所述化合物是分离自植物。这些化合物表现出对凝血因子Xa(FXa)的直接抑制作用。另一方面,本发明涉及五环三萜类化合物,它们的药物上可接受的盐或酯,及其药物学上可接受的组合物,它们在哺乳动物中用作有效和特异性的抗凝剂用于各种心脑血管疾病的预防和治疗。

背景技术

血栓形成是心血管疾病发病率和死亡率高的重要原因，包括急性冠脉综合征（ACS）（即不稳定型心绞痛心肌梗死），心源性猝死，周边动脉闭塞，缺血性中风，下肢深静脉血栓形成（DVT）和肺栓塞（Wong PC,et al.Journal of thrombosis and thrombolysis,2011，31:478-492）。抗凝药物(anticoagulants)被广泛用于静脉和动脉血栓栓塞性疾病的预防和治疗。传统的抗凝药主要为普通肝素(UFH)、低分子量肝素(LMWH)和华法林(warfarin)。在过去的半个世纪中华法林作为唯一的口服抗凝剂而成为预防血栓的一线药物。在20世纪90年代初的几次大规模的临床试验表明华法林在预防房颤病人的血栓方面优于大多数抗血小板药物，从此华法林变成了金标准。然而，在临床实践中，其药理特征存在许多限制，例如其狭窄的治疗窗，起效和失效缓慢，抗凝强度被含维生素K的食物减弱，和许多药物有相互作用有时会引起出血并发症而需要监测国际标准化比值（INR），肝素和普通肝素为非胃肠道给药，容易导致出血也需要实验室监测以调整剂量。（Atarashi H，et al.Circulation Journal，2011，75:1819-1820）。传统的抗凝药均为凝血因子的间接抑制剂，均作用于多个凝血因子。这些缺点给病人和医疗机构带来诸多不便，频繁地临床检测费用昂贵。亟待研发新一代安全、有效、使用方便的抗凝药物。

FXa处在内外源凝血途径交汇的中心位置，又处在凝血酶的上游，由于在凝血酶原酶复合物催化凝血酶原转变成凝血酶的过程中还存在生物信号的放大，因此Xa因子抑制剂可能较凝血酶抑制剂更为有效（TurpieAGG，et，al.Arteriosclerosis,thrombosis,andvascular biology,2007，27:1238-1247）。研究结果也表明FXa抑制剂通过降低凝血酶的生成产生抗凝效果，这样减少了凝血酶介导的凝血作用和对血小板的激活而不影响已经存在的凝血酶活性（Leadley RJ，et，al.Current topics in medicinal chemistry,2001，1:151-159）。FXa与凝血酶相比具有相对缓慢激活的动力学，治疗和出血的平衡更易于掌握。FXa也不能直接活化血小板，对凝血瀑布也不存在正反馈作用。因此，抑制FXa被公认为抗凝治疗的理想靶标（Cabral KP，et，al.Nature Reviews Cardiology，2012，19）。FXa抑制剂成为抗凝剂研究的新热点。

1987年从美洲水蛭分得第一个天然的FXa抑制剂Antistasin，为119个氨基酸的多肽，动力学研究显示它是一个缓慢的，紧密结合的，高效的FXa抑制剂（抑制常数Ki0.3–0.6nM）。稍后从毛白钝缘软蜱中分得另一直接FXa抑制剂TAP，为60氨基酸的多肽，也是缓慢地和FXa紧密结合（Ki为0.6nM）。这两个天然的或其重组合成产物在动物凝血过程模型中的抗凝血作用和那些直接凝血酶抑制剂及间接凝血酶或间接FXa抑制剂（UFH）比较，结果显示直接FXa抑制剂也许是一个对抗凝血更有效的途径，而且可以提供一个更广阔的治疗窗口，特别是考虑到基本的止血过程。这一系列结果鼓舞人们开始对FXa专一性的、小分子直接抑制剂的研究。早期合成的小分子抑制剂如DX-9065a、YM60828等，DX-9065a能和FXa迅速直接地可逆地结合(Ki为41nM)，但生物利用度极低。后来磺达肝癸钠（戊多糖，FXa间接抑制剂）为选择性FXa抑制剂具有临床有效的抗凝作用提供了直接证据，促使人们对早期的小分子抑制剂进行结构优化，合成了利伐沙班(Rivaroxaban)、阿哌沙班(Apixaban)、贝曲西班(Betrixaban)、伊多塞班(Edoxaban)、奥米沙班(Otamixaban)、非德沙班(Fidexaban)等（结构式见图2）。其中利伐沙班和阿哌沙班分别于2008和2011年在欧洲和美国上市。口服有效的FXa因子抑制剂其化学结构都带有肽的特征，其药效团模型分子中均有一个肽键，这增加了药物的不稳定性。多数化合物具有强碱性基团（脒或胍），导致口服给药后的药代动力学性质很差。进一步研究表明，脒基高度偏碱可能是脒类物质影响心血管功能(如降低血压和心率)副作用的原因。为了避免其副作用常在此类化合物中引人酸性的羧基可降低整个分子的碱度。这就仍然需要显示出合适的药理活性强度和药物代谢特色的抗凝物质。需要具有不同于先前发现的化合物的桥基和官能团的组合的化合物。

五环三萜类化合物广泛存在与植物界，是许多中药的主要有效成分，如人参、牛膝、夏枯草、女贞子等。

五环三萜类化合物的制备方法包括从植物中提取纯化和以苷元半合成制备方法等。已有CN00123317.3；Synthetic Communication，1997，,2:1607-1612；等等专利和文献报道。苷元多数有商品供应。

五环三萜类化合物上市药主要有齐墩果酸、甘草次酸等用于肝炎的治疗。目前，一些五环三萜类化合物已被报道具有抗肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡以及抗AIDS的作用（中国新药杂志，2004，6：1098-1102）。

发明内容

本发明公开了天然五环三萜类化合物用于制备直接抑制FXa从而产生抗凝作用的药物的用途。具体而言，是一类不同于以往合成的FXa抑制剂的化合物类型。这些化合物还适合用于预防或治疗血栓栓塞性疾病。

本发明所述的抗凝化合物、其药学上可接受的盐或酯和溶剂化物和水合物以及药物制剂具有高活性和选择性。所述化合物及盐或酯本身也可以是前药，仅通过代谢作用被活化。本发明还涉及包含上述化合物或其盐作为活性成分的药物组合物。本发明还描述了这些活性成分在预防或治疗血栓栓塞病症的应用。

本发明涉及下述化学式的化合物：

其中R1为H或葡萄糖醛酸或葡萄糖醛酸甲酯，R2为H或葡萄糖醛酸，R3为H或OH。

具体实施方式

实施例1

牛膝中齐墩果酸-3-O-β-D-（6＇-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷的制备

牛膝干燥根15kg，以乙醇回流提取3次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，得乙醇提取物3.4千克，该提取物以水分散后，石油醚脱脂3次，乙酸乙酯萃取3次，减压回收乙酸乙酯，得乙酸乙酯萃取物67克。乙酸乙酯萃取物硅胶柱层析，以氯仿-甲醇进行梯度洗脱，薄层层析检示，氯仿：甲醇：乙酸乙酯（9：1:1）展层，Rf0.57流分合并，然后用RP-18中压柱层析分离纯化，甲醇：水（68：32）洗脱，得到产品齐墩果酸-3-O-β-D-（6＇-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷1.2克，含量大于75％。

齐墩果酸-3-O-β-D-（6＇-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷：无定形粉末，Libermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性，香草醛-浓硫酸显紫红色。¹HNMR(500MHz,DMSO-d₆)δ：0.71，0.75，0.86，0.87，0.87，0.97，1.09(each3H，s，CH₃)，5.22(1H，brs，H-12)，4.28(1H，d，J=8.0Hz，糖端基氢)，3.66(3H，s，CO₂Me)。¹³CNMR(300MHz，DMSO-d₆)，δ：38.0(C-1)，25.5(C-2)，88.1(C-3)，38.6(C-4)，54.9(C-5)，17.7(C-6)，32.0(C-7)，38.6(C-8)，47.0(C-9)，36.2(C-10)，23.3(C-11)，121.5(C-12)，143.8(C-13)，40.8(C-14)，27.5(C-15)，22.6(C-16)，45.6(C-17)，41.3(C-18)，45.4(C-19)，30.3(C-20)，33.3(C-21)，32.7(C-22)，27.1(C-23)，16.3(C-24)，15.0(C-25)，16.8(C-26)，25.5(C-27)，178.5(C-28)，32.1(C-29)，22.8(C-30)，105.5(C-1＇)，73.6(C-2＇)，75.9(C-3＇)，71.6(C-4＇)，75.2(C-5＇)，169.6(C-6＇)，51.7(-OMe)。

实施例2

五环三萜类化合物对因子Xa抑制活性的测定

人类凝血因子Xa（FXa）的酶活性通过FXa特异性的显色底物来测定。在这种情况下，因子Xa从显色底物中将对硝基苯胺清除。在微孔板上以下述方式完成测定。

将待测化合物分别以溶剂DMSO分别配制成不同浓度梯度的溶液,分别测定不同五环三萜类化合物在不同浓度时对FXa的抑制率。以抑制剂的抑制率-抑制浓度作回归曲线并计算IC₅₀。酶活性测定，反应液包括pH=8.34，含0.3M NaCl的磷酸盐缓冲液（0.0650M Na2HPO4，0.00167M KH2PO4）20μl，2.5μg/ml的FⅩa溶液20μl，样品溶液0.2μl，于37℃温育30min后加入20μl浓度为2.5mg/ml的底物溶液开始反应。对照组以溶剂DMSO代替样品溶液，空白组以缓冲液代替FⅩa溶液。反应开始后分别测量反应体系第0.5-5min在405nm处的吸光度，每0.5min测一次。通过连续速率法，将所测得的吸光度（A）对时间（T）做回归曲线，曲线的斜率代表了酶反应的速度，反应了酶的活性，与对照组的回归曲线斜率相比则可反映抑制剂对酶抑制作用的强弱。对照组的回归曲线斜率为Vi，样品组的回归曲线斜率为V₀，样品的抑制率（I%）=（Vi-V₀）/Vi。

测试结果：表1列出了部分五环三萜类化合物对人FXa的抑制活性数据，结果显示部分五环三萜类化合物对人FXa的抑制活性较强。

表1部分五环三萜类化合物对人FXa的抑制活性

实施例3

五环三萜类化合物对因子Xa作用的专一性测试

本发明的化合物特别是作为凝血因子Xa的选择性抑制剂时，并不抑制或者仅仅在特别高的浓度下才会抑制其它的丝氨酸蛋白酶，如凝血酶或纤溶酶或胰蛋白酶。通过测试与其它的人丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，纤溶酶）的测试物质的抑制作用，以得出专一性的FXa的抑制作用。选择齐墩果酸-3-O-β-D-（6＇-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷、甘草酸和白桦酸作为代表测试。

分别测定化合物齐墩果酸-3-O-β-D-（6＇-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷、甘草酸和白桦酸抑制Human Thrombin（人凝血酶）、Human Plasmin（人纤溶酶）及Human Trypsin（人胰蛋白酶）的半数抑制浓度（IC50），并与其抑制FXa的IC50相比较。凝血酶配制浓度：5NIH/mL；纤溶酶配制浓度100μg/mL；胰蛋白酶配制浓度12.5μgg/mL；底物CS-21(66)配制浓度5mg/mL；底物CS-11（22）配制浓度：2.5mg/mL。其余反应条件和实验方法同测定FXa的IC50一致。

结果齐墩果酸-3-O-β-D-（6＇-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷抑制人凝血酶的IC50为1742μmol/L，对人纤溶酶为94μmol/L，对人胰蛋白酶为229μmol/L。对人FXa的IC50为15μmol/L，显示出该化合物对Fxa具有较强的专一性；甘草酸抑制人凝血酶的IC50为465μmol/L，对人纤溶酶为73μmol/L，对人胰蛋白酶为667μmol/L,对人FXa的IC50为32μmol/L，显示出该化合物对Fxa具有较强的专一性；白桦酸抑制人凝血酶的IC50为32μmol/L，对人纤溶酶为14μmol/L，对人胰蛋白酶为10μmol/L,对人FXa的IC50为25μmol/L，显示出该化合物对FXa的专一性较差。

实施例4

抗凝血效果的测定

1）甘草次酸延长血浆凝血酶原时间（PT）的作用（体外）

采集SD大鼠的静脉血，立即与0.109mol/L枸橼酸钠溶液按9:1的比例充分混匀。以每分钟3000转离心10min～15min，分离出上层贫血小板血浆。2h内按照凝血酶原时间测定试剂盒说明书，在各种浓度的测试物质或合适的溶剂存在下用全自动血凝仪测定凝血酶原时间（PT）。结果显示甘草次酸可剂量依赖性的延长血浆凝血酶原时间，根据最小二乘法回归曲线算得出甘草次酸体外延长血浆凝血酶原时间2倍的浓度(PT2)为2.06mmol/L。结果见表2。

表2甘草次酸体外延长血浆PT的测定(n=6)

药物浓度（mmol/L）	凝血时间(S)M±SD
		空白对照	19.00±0.23
1.75	28.35±5.65
		1.86	29.73±3.06
1.97	35.73±5.01
		2.08	40.10±3.94
2.19	40.84±6.74
		2.30	44.23±5.80

2）甘草次酸抗血栓形成效果的测定（体内）

健康Wistar大鼠，体重230-300g随机分成5组，分别为正常对照组、血塞通组(80mg／kg)、甘草次酸低中高组(40、80、160mg／kg)，每组8只，雌雄各半。腹腔注射乌拉坦(20%，5mL／kg)麻醉。打开腹腔小心剥离下腔静脉。在左肾静脉正下的下腔静脉上相距1cm打两松散结。诱导血栓前5-60分钟静脉给予不同剂量的甘草次酸。腔静脉注入组织凝血活酶(3mg/kg体重)扎紧近端结扎线立即形成瘀血。注入凝血活酶20分钟后扎紧远端结并剪下结扎段。取出段内血栓，用滤纸沾去血栓表面的浮血，置60℃烤箱烤1h，冷却后称重。药物对血栓抑制率(%)=(空白组血栓重量一给药组血栓重量)／空白组血栓重量×100%。甘草次酸对大鼠及家兔静脉血栓模型有较好的抑制作用，大鼠静脉血栓模型中，甘草次酸各剂量组与空白组相比差异有统计学意义。结果见表3。

表3甘草次酸对大鼠静脉血栓形成的影响(±s。n=8)

与空白组比较^*P<0.01

实施例5

药学组合物的实际实施例

本发明的化合物可制成以下的药物制剂:

片剂：取上述某一单体化合物或其药学可接受的盐100g，用适量注射用水分散，加入乳糖200g，混匀，加100mg硬脂酸镁，加水适量制软材，干燥，颗粒压片，制成1000片。

注射液:使本发明的化合物或其药学可接受的盐溶解于浓度低于饱和溶解度的生理相容的溶剂（如0.9%氯化钠溶液、5%葡萄糖溶液或30%PEG400溶液）中。将溶液进行无菌过滤并装入无菌无热源的注射容器中。

Claims

1.具有以下化学式所代表的天然五环三萜类化合物及其生理上可接受的盐或酯在制备抑制凝血因子Xa活性药物中的用途，

2.如权利要求1所述的天然五环三萜类化合物及其生理上可接受的盐或酯在制备抑制凝血因子Xa活性药物中的用途，其特征为制备的为治疗和预防哺乳动物中血栓性疾病的药物。

3.如权利要求2所述的天然五环三萜类化合物及其生理上可接受的盐或酯在制备抑制凝血因子Xa活性药物中的用途，其特征为所述的药物中还包含可药用的载体和/或助剂物质。

4.如权利要求2所述的天然五环三萜类化合物及其生理上可接受的盐或酯在制备抑制凝血因子Xa活性药物中的用途，其特征为制备的为治疗和预防人类心血管疾病或血栓病症的药物。

5.如权利要求3所述的天然五环三萜类化合物及其生理上可接受的盐或酯在制备抑制凝血因子Xa活性药物中的用途，其特征为制备的为治疗和预防人类心血管疾病或血栓病症的药物。

6.如权利要求2或权利要求3所述的天然五环三萜类化合物及其生理上可接受的盐或酯在制备抑制凝血因子Xa活性药物中的用途，其特征为用途为治疗和预防由感染或外科手术引起的有关近侧血管和深血管血栓形成的并发症。

7.如权利要求4所述的天然五环三萜类化合物及其生理上可接受的盐或酯在制备抑制凝血因子Xa活性药物中的用途，其特征为制备的药物治疗和应用的疾病包括：

急性冠脉综合症、心肌梗死、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、溶栓治疗后或冠脉血管成形术后发生的闭塞性冠脉血栓、血栓形成导致的脑血管综合症、栓塞性中风、血栓形成性中风、短暂性脑缺血发作、静脉血栓形成、深部静脉血栓形成、肺栓塞、凝血病、弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜闭塞性血栓、血管炎、与肝素诱导的血小板减少有关的血栓形成疾病、与体外循环有关的血栓形成并发症、与器械操作有关的血栓形成并发症以及与假体装置安装有关的血栓形成并发症。