CN102827931A - Pcr-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

Pcr-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法。本发明根据单增李斯特菌hly基因设计扩增引物和测序引物，建立了PCR-焦磷酸测序，从DNA碱基序列水平上检测单增李斯特菌的方法。本发明先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得碱基序列，用NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现，单增李斯特菌hly基因测序引物后的碱基序列具有良好的特异性，测序引物后21个DNA碱基序列为ATCCAGGTGC TCTCGTAAAA G时就可鉴定为单增李斯特菌。

Description

PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法。
背景技术：
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LMO)，简称单增李斯特菌，是一种重要的食源性致病菌，能引起人和动物的李斯特菌病，临床表现为人和动物脑膜炎，败血症及孕妇流产、热性胃肠炎等，且死亡率极高，可达30%以上。随着分子生物学的发展，已有用普通PCR或荧光PCR检测VP的报道，虽然这些方法可达到快速、高通量的目的，但却无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，因此有出现假阳性的可能。焦磷酸测序（pyrosequencing）技术是近年来发明的一项实时地进行短片段DNA测序技术，该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，直接测定测序引物后面的碱基序列，通过提供可靠的序列信息来确认PCR产物，同时由于主要分析PCR产物双链中的一条链的序列，避免了由于DNA链的二级结构造成的人工假象，使测序结果更加准确。
发明内容：
本发明的目的是提供简便、快捷、准确性高、特异性强的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法。
本发明根据单增李斯特菌LMO溶血素基因hly(GenBank:DQ054589)，设计扩增引物和测序引物，建立了结合PCR-焦磷酸测序检测LMO的方法，达到从DNA碱基序列水平上快速、准确检测单增李斯特菌LMO的目的，从而实现了本发明的目的。
本发明的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物：
PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；（如SEQ ID NO.1所示）
         下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；（如SEQ ID NO.2所示）
测序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT（如SEQ ID NO.3所示）。
本发明的第二个目的是提供PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为：
PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；（如SEQ ID NO.1所示）
         下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；（如SEQ ID NO.2所示）
测序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT（如SEQ ID NO.3所示）。
本发明的第三个目的是提供非诊断目的的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
（2）使用上述PCR引物进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用上述测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，测序引物后的21个DNA碱基序列为ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG时，判断样品中含有单增李斯特菌。
优选，所述的PCR反应，其扩增体系50μL，PCR Mix Buffer 25μl，Taq酶5μl，MgCl2 1μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板1μl，去离子水14μl，所述的PCR反应条件为预变性95℃4min；95℃15s，65℃30s,，72℃30s，43个循环；72℃12min。
本发明根据单增李斯特菌hly基因设计扩增引物和测序引物，建立了PCR-焦磷酸测序，从DNA碱基序列水平上检测单增李斯特菌的方法。本发明先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得碱基序列，用NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现，单增李斯特菌hly基因测序引物后的碱基序列具有良好的特异性，测序引物后21个DNA碱基序列为ATCCAGGTGCTCTCGTAAAA G时就可鉴定为单增李斯特菌。试验结果显示，检测的16株LMO前21个碱基序列均与ATCCAGGTGC TCTCGTAAAA G序列完全匹配，而阪崎肠杆菌等对照菌株未测出DNA碱基序列或测出结果与测序引物后的21个碱基序列不匹配。模拟样品检测结果，焦磷酸测序结果与传统检测方法一致，但在检测周期上传统方法需要培养、划线分离、生化鉴定等，需要4d-5d，而焦磷酸测序方法增菌一次增菌24h、第二次增菌18-24，核酸提取、PCR扩增和焦磷酸测序3h-4h，整个试验45h-48h完成，简便快捷，而且可通DNA碱基序列的水平上检测LMO，避免了单纯PCR扩增检测易污染造成的假阳性结果，准确性高。
附图说明：
图1是单增李斯特菌hly基因的PCR扩增产物电泳图，其中M：50bpmaker、1：LMO ATCC19115、2-16：LMO1-LMO15、17：去离子水；
图2是单增李斯特菌特异性试验PCR扩增产物电泳图，M:50bpmaker、1:LMO ATCC19115、2:阪崎肠杆菌、3:大肠杆菌、4:痢疾志贺氏菌、5:金黄色葡萄球菌、6:粪链球菌、7:藤黄微球菌、8:肺炎克雷伯氏菌、9：小肠结肠炎耶尔森氏菌、10：去离子水；
图3是LMO ATCC19115焦磷酸测序结果图；
图4是LMO1焦磷酸测序结果图；
图5是LMO2焦磷酸测序结果图；
图6是LMO3焦磷酸测序结果图；
图7是LMO4焦磷酸测序结果图；
图8是LMO5焦磷酸测序结果图
图9是LMO6焦磷酸测序结果图；
图10是LMO7焦磷酸测序结果图；
图11是LMO8焦磷酸测序结果图；
图12是LMO9焦磷酸测序结果图；
图13是LMO10焦磷酸测序结果图；
图14是LMO11焦磷酸测序结果图；
图15是LMO12焦磷酸测序结果图；
图16是LMO13焦磷酸测序结果图；
图17是LMO14焦磷酸测序结果图；
图18是LMO15焦磷酸测序结果图；
图19是大肠杆菌焦磷酸测序结果图；
图20是金黄色葡萄球菌焦磷酸测序结果图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1材料和方法
菌株信息：单增李斯特菌菌株共16株，其中标准菌株1株-单增李斯特菌ATCC19115，食品中分离的菌株15株，菌株信息见表1。阴性对照株8株，分别为阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、金黄色葡萄球菌CMCC26003、粪链球菌ATCC2921、藤黄微球菌CMCC28001、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221。上述菌株来自中国普通微生物菌种保藏管理中心、中国药品生物制品鉴定所和广东出入境检验检疫局技术中心。所有菌株均经VITEK2和API试剂条进行确证。
表1：单增李斯特菌菌株信息
Figure BDA00002016846100051
1.2主要仪器和试剂：焦磷酸测序PyroMark lD系统-瑞典Biotage公司；PCR扩增仪-PE9700型；核酸提取仪-日本PSS公司；PCR用Buffer、dNTP、琼脂糖、PCR分子量标记（50-500bp）Taq酶-宝生物工程(大连)有限公司；链亲和素标记磁珠（sepharose beads）-GE.Healthcare公司；焦磷酸测序用酶、dNTP、结合缓冲液（Binding Buffer）、退火缓冲液（Annealing Buffer）、变性缓冲液（Denaturation Buffer）、洗涤缓冲液(Washing Buffer)等-QIAGEN上海办事处；李氏增菌肉汤LB1、LB2-北京陆桥有限公司。
1.3引物设计：根据单增李斯特菌的hlyA基因(GenBank:DQ054589)序列中的保守区域，用PyroMark Assay Design软件设计引物和测序引物，上游引物F:AGTATACCACGGAGATGCAGTGA，下游引物R:GGCAAATCAATGCTGAGTGTT，测序引物S:AATTTCGAGCCTAACCT，扩增片段为249bp，下游引物5/端标记生物素，委托宝生物工程(大连)有限公司合成。
1.4模板制备：所有菌株均用LB1增菌夜30℃±1℃培养24h，移取0.1mL，转种于LB2增菌液内，于30℃±1℃培养18h-24h。取1ml菌悬液移入离心管，12000r/min离心5min去上清，用1ml去离子水漂浮沉淀，12000r/min离心3min去上清，重复两次，最后加200μl去离子水在核酸提取仪上提取DNA，作为DNA模板，用于PCR扩增。
1.5PCR扩增体系及电泳参数：扩增体系50μL，PCR Mix Buffer25μl，Taq酶5μl，MgCl2 1μl，10μM上、下游引物各2μl(上游引物F:AGTATACCACGGAGATGCAGTGA，下游引物R:GGCAAATCAATGCTGAGTGTT)，DNA模板1μl，去离子水14μl。循环参数为，预变性95℃4min；95℃15s，65℃30s,，72℃30s，43个循环；72℃12min，4℃保存。PCR扩增产物一部分在2%琼脂糖凝胶上电泳，另一部分用于焦磷酸测序。
单增李斯特菌的hly基因PCR扩增结果，16株LMO均扩增出249bp大小的DNA片段（图1），特异性试验结果如图2所示，由图2可以看出，阪崎肠杆菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、粪链球菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌未见扩增条带，只有第5泳道金黄色葡萄球菌在200bp-250bp处有扩增带。
1.6单链模板制备及焦磷酸测序：将15μl PCR产物转移至96孔PCR板中，加入2μl磁珠（sepharose beads），20μl结合缓冲液(Binding Buffer)和43μl纯水，常温震荡混20min；打开真空泵，将真空预装工具prep tool在高纯水中清洗30秒，将prep tool移到96孔PCR板中，抓取其中的磁珠，待磁珠基本抓取完毕后将携带有磁珠的prep tool放入70％乙醇中5秒，再分别在变性缓冲液Denaturation Buffer和洗涤缓冲液Washing Buffer中各清洗20s～30s，prep tool放在装有退火预混液PSQ 96板(预先加入43μl退火缓冲液Annealing Buffer和2μl10μM测序引物S:AATTTCGAGCCTAACCT)的上方，关掉真空泵，轻轻摇动释放磁珠，将PSQ 96板在80℃放置5min，自然冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。测序程序采用SQA模式，按ATCG的碱基排列顺序，依次循环加入15次，根据软件给出的剂量在试剂仓中加入底物混合物、酶混合物和4种脱氧核糖核苷酸，将PSQ96孔板和试剂仓放入PyroMark lD系统中进行焦磷酸测序。测序峰及相应的DNA碱基序列由仪器SQA软件自动分析产生。
1.7焦磷酸测序结果判断：
16株LMO焦磷酸测序结果，根据模版浓度等条件的不同，测出37bp-64bp大小不等的DNA碱基序列（表2，图3-图18），而阪崎肠杆菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、粪链球菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌对照菌株未测出DNA碱基序列（图19，本研究只列出大肠杆菌焦磷酸测序结果图）。图2第5泳道的金黄色葡萄球菌焦磷酸测序结果，测的碱基序列为ATCCAGGTGCTCTCAGTAAAGCAGTATTGCTAGTAAGTTAAGTAAAG（图20），该序列与ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG比对，匹配的DNA碱基数仅为14个，即：ATCCAGGTGCTCTC，因此判定为非LMO。16株LMO测序所得DNA碱基序列，分别与测序引物后的DNA序列比对，发现100%匹配的DNA碱基数为21bp-39bp，所有有效测序结果均超过21个碱基，表明设计的hlyA基因扩增引物和测序引物的特异性较好，并且可用测序引物后的前21个DNA碱基序列ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG来特异性地检测LMO。
表2：16株单增李斯特菌焦磷酸测序碱基序列结果
Figure BDA00002016846100081
焦磷酸测序是测序引物后的第一个碱基开始测序，在NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现，hly基因测序引物后的21个DNA碱基序列，即ATCCAGGTGC TCTCGTAAAA G，可鉴定为单增李斯特菌。因此，检测所得DNA碱基序列如与上述序列100%匹配，则判断为单增李斯特菌。
1.8模拟样品检测：以无菌操作分别秤取25g猪肉、对虾加入到含有225ml LB1增菌液的均质袋中，分别加入1ml用已调好浓度的102cfu/ml LMO ATCC19115菌悬液，在拍击式均质器上连续均质1min-2min，于30℃±1℃培养24h，移取0.1ml，转种于10ml LB2增菌液内，于30℃±1℃培养18h-24h。然后取一部分按步骤1.4、1.5、1.6提取DNA并进行焦磷酸检测，另一部分按GB 4789.30-2010《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》继续进行检测。
结果显示，添加LMO ATCC19115菌悬液的猪肉、对虾模拟样品，都焦磷酸测序出ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTA ATAACAAATC，即其测序引物后的前21个碱基序列为：ATCCAGGTGC TCTCGTAAAA G，检测结果与预期结果相符，表明样品中含有单核细胞增生李斯特菌。按照GB 4789.30-2010《食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》检测的模拟样品，均分离鉴定出LMO，结果与本发明建立的焦磷酸测序方法一致。
Figure IDA00002016847000021

Claims (4)

1.一种PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物：
PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；
         下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；
测序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT。
2.一种PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为：
PCR引物：上游引物F：AGTATACCACGGAGATGCAGTGA；
         下游引物R：GGCAAATCAATGCTGAGTGTT；
测序引物S：AATTTCGAGCCTAACCT。
3.一种非诊断目的的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
（2）使用权利要求1所述的PCR引物进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用权利要求1所述的测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，测序引物后的21个DNA碱基序列为
ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG时，判断样品中含有单增李斯特菌。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR反应，其扩增体系50μL，PCR MixBuffer 25μl，Taq酶5μl，MgCl2 1μl，10μM上、下游引物各2μl，DNA模板1μl，去离子水14μl，所述的PCR反应条件为预变性95℃4min；95℃15s，65℃30s,，72℃30s，43个循环；72℃12min。
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