CN102827303A

CN102827303A - 一种用新鲜螺旋藻生产螺旋藻多糖的方法

Info

Publication number: CN102827303A
Application number: CN2012103439505A
Authority: CN
Inventors: 唐玉邦; 虞利俊; 韦金河; 严建民; 裴勤; 徐磊
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明涉及一种提取螺旋藻多糖的方法，该方法包括滤去培养液、清洗、提取、分离、浓缩、醇析、洗涤、干燥、粉碎、过筛的步骤。本发明采用澡泥为原料加工减少了螺旋藻烘干过程的设备添置、降低了能源消耗。与用螺旋藻粉提取多糖的方法相比，本发明一方面避免了螺旋藻藻粉在高温烘干过程中对多糖结构的破坏，另一方面避免了烘焦的现象，提高多糖的产出率和质量，减少脱色所需的酒精用量，可以大幅度降低生产成本提高品质。采用新鲜螺旋藻作为原料，无需添加任何化学试剂进行前处理，避免了化学残留。

Description

一种用新鲜螺旋藻生产螺旋藻多糖的方法

技术领域

本发明属于藻类分离精制生物提取技术领域，涉及一种适用于以螺旋藻通过水煮-提取分离-浓缩制成螺旋藻多糖产品的方法，特别涉及一种适合于以新鲜螺旋藻分离精制成高品位螺旋藻多糖的提取新方法。

背景技术

螺旋藻（Spirulina）是一种光合放氧、螺旋形的丝状蓝藻，属于颤藻纲螺旋藻属，被联合国粮农组织和世界卫生组织分别誉为“21世纪最理想的食品”和“人类21世纪的最佳保健品”。在中国，已被列为保健食品。调查显示，今后十年内螺旋藻的年消费量将达l万吨，产品涉及药品，保健食品，化妆品等领域。

螺旋藻多糖是一种酸性杂多糖，是螺旋藻中极为重要的生理活性成分，在抗肿瘤、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗辐射、抗凝血以及提高免疫力等方面具有独特的功效，已成为当前螺旋藻开发研究领域的焦点。（邓中日，游沛清，王小兵.螺旋藻多糖研究进展湖南城市学院学报2005年9月第14卷第3期63—65.）国内外关于螺旋藻多糖的功能性研究较多。有报道研究指出，螺旋藻多糖可显著抑制小鼠骨肉瘤180细胞的增殖和腹水型肝癌细胞DNA、RNA和蛋白质的合成，抑制作用在3～24小时内随时间的延长而提高，不同的癌细胞对螺旋藻多糖的敏感性不一样。广州医学院曾波航等在研究螺旋藻多糖对白血病病人的治疗效果时发现，螺旋藻多糖在体外对正常人自然杀伤细胞（NK细胞）活性无影响，但能不同程度提高初发、复发期病人外周血NK细胞活性，且在白介素-2的激活下能提高白血病病人外周血淋巴因子激活杀伤细胞（LAK细胞）活性。对处于缓解期的急性白血病病人，螺旋藻多糖能使其NK细胞活性恢复正常。螺旋藻多糖提高肿瘤病人NK细胞活性作用与机体带瘤状态有关，当肿瘤负荷小(缓解期)时作用明显（《中国海洋药物》杂志2000年第6期(总第78期)）。张成武、庞启深、许昌邵等的研究发现，螺旋藻多糖和糖蛋白均有抗辐射、抗氧化、提高机体免疫力、促进淋巴细胞转化和抑制癌细胞增殖作用。在对螺旋藻多糖抗辐射机理研究中发现，其抗辐射作用与核酸内切酶的活性和DNA损伤修复酶的增强效应有关（营养学报,1996,l8(3):327.；遗传学报,1988,15(5):374.；中华放射医学与防护杂志,1996，(3):136一138.）。螺旋藻多糖不但对细胞无毒性，而且具有增强骨髓细胞的增殖能力，促进骨髓造血功能，提高白细胞水平，提高巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，增加T淋巴细胞的数量和消除免疫抑制剂的抑制作用等（薛志勇，螺旋藻多糖的研究及应用山东食品科技，2004.No.8.5-6）。同时，螺旋藻多糖与糖蛋白还能改善脂类代谢，降低血浆胆固醇水平，对胃及十二指肠溃疡有一定的辅助疗效。

目前，我国螺旋藻产业化生产已获得成功，其生产和发展过程中的突出问题是：螺旋藻深加工产品处于初级阶段，国内关于螺旋藻多糖提取与纯化技术多停留在实验室研究阶段，应用于生产实践较少。如贾少婷、殷文政在“天然螺旋藻多糖的提取纯化及降血糖活性实验研究”（农产品加工，2007年1月）中介绍的，是以螺旋藻干粉为原料来提取螺旋藻多糖的（取螺旋藻干粉，按固液比1：10加入质量分数为0．1％的焦磷酸钠溶液破壁，采用热水抽提，按固液比为1：9，温度80~C，抽提6h，抽提2次，经转速4000r／min离心取上清液，定容到500mL，放入冰箱备用。取上述上清液50mL，浓缩至20％，将乙醇按4倍添加入浓缩液，在4℃冰箱放置12h取出，用4000r／min转速离心20min。用蒸馏水将粗多糖充分溶解，按固液比为1：8制成溶液，调pH值为7.0，分别加人粗多糖质量3％的中性蛋白酶，在温度50℃保温2．5h，待完全酶解后，采用Sevage法进行脱蛋白处理，提取粗多糖，计算多糖含量）。又如潘秋文、高向东、盛海林等在“螺旋藻多糖的提取工艺研究”（医药导报2004年9月第23卷第9期）中提到的螺旋藻多糖提取方法也是以螺旋藻干粉为原料提取多糖。（将螺旋藻粉碎制得螺旋藻粉，碱水提取后，将提取液经3000r·min离心20min，留上清液，将残渣进行2次提取，将提取液经3000r·min-离心20min。将两次离心所得上清液合并，采用Sevage法去蛋白后得去蛋白多糖，经透析后将透析液用3倍乙醇沉淀，将沉淀物用五氧化二磷真空干燥，即得干品SP）。还有孙远征、张学成、纪雷等在“钝顶螺旋藻多糖提取工艺的研究——三氯乙酸(TCA)法的正交实验优化”中的提取方法也是以螺旋藻干粉为原料（海洋科学／2oo7年／第31卷／第4期）称取100g螺旋藻粉，加入800mL95乙醇，浸泡过夜；3600r／rain离心20rain，37℃烘干藻粉按1：12质量比例加双蒸水，用NaOH将溶液pH值调至10；80℃水浴6h；3600r／rain离心3Omin，取上清，加10%盐酸将上清液pH值调至7.0，后逐滴加入5%三氯乙酸沉淀蛋白，4℃过夜；3 600r／rain离心20min，上清再加5%三氯乙酸沉淀蛋白，静置3h；3600r／rain离心20min，上清加5倍体积95%乙醇沉淀多糖，4℃过夜；3600r／min离心2Omin，取沉淀，用丙酮洗涤沉淀两次，冷冻干燥。总之，由于不同种类的螺旋藻制备的多糖不同，加之提取分离纯化方法的不同，同一螺旋藻制备的多糖也不同，因此，理论上讲螺旋藻多糖的种类繁杂，基本上没有规范的多糖种类名称，妨碍多糖进一步的研究和应用。（湖南城市学院学报(自然科学版)第14卷第3期，2005年9月）

由于现在实验室制备螺旋藻多糖多选用螺旋藻干粉作为原料，而螺旋藻在烘干过程中由于高温一方面会破坏多糖结构，另一方面会产生烘焦的现象，影响多糖的产出率和质量。再者，螺旋藻多糖本身的结构属于糖蛋白，组分较多，如果精制与纯化（指去蛋白）方法不当很可能会降低其活性功能，实验室提取技术步骤复杂涉及到的化学药品多，缺少统一标准，不适应工业化生产需要，去除化学残留、提高多糖活性、扩大多糖生产规模难度很大，从而限制了精制螺旋藻多糖的研究和开发。

目前，螺旋藻深加工产品处于初级阶段，国内有关螺旋藻多糖提取与纯化技术多停留在实验室研究阶段，应用于生产实践较少。尤其以新鲜螺旋藻为原料直接规模化生产螺旋藻多糖还存在以下一些问题有待解决：

1、现有多数科研教学单位的生化实验室缺乏培养螺旋藻的技术以及大面积、工厂化养殖的场所和设备。因此，新鲜螺旋藻不能自给自足，限制了用新鲜螺旋藻提取多糖的进一步试验与研究。局限于用市面上可购买到的螺旋藻粉作为原料提取多糖。

2、广大的螺旋藻生产企业现主要是以螺旋藻粉的形式进行经营的，产品处于初级阶段，缺乏用螺旋藻提取多糖的深加工技术与人才。

3、通过对用螺旋藻藻粉与用新鲜螺旋藻为原料提取多糖的对比，已明确在技术上存在一些提取参数的差异。主要反映在螺旋藻细胞壁的破壁、固液比例、提取温度、提取时间、醇析脱色等方面。本申请通过以下（C-I）改进使得用新鲜螺旋藻为原料提取多糖成为可能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用新鲜螺旋藻提取螺旋藻多糖的方法，以克服上述现有技术所存在的不足之处。

本发明的目的是通过下述技术方案完成的

藻泥直接加水热煮提取螺旋藻多糖的方法，含有以下工艺过程：

1、一种用新鲜螺旋藻生产螺旋藻多糖的方法，

A、滤去培养液：将培养池中正常生长的螺旋藻捞起，倒在筛子上滤去培养液，

B、清洗：将滤去水分和培养液的螺旋藻藻泥用自来水清洗，滤干，反复3次，备用；

C、提取：将制备好的螺旋藻藻泥放入不锈钢加热锅内，加水并加热，提取一段时间；

D、分离：将提取后的混合物注入离心机；

E、浓缩：将液体部分加热浓缩，冷却备用；

F、醇析：将冷却后的浓缩液放入不锈钢桶中加乙醇，弃去上清液，将沉淀物取出；

G、洗涤：将沉淀物继续用乙醇洗涤，将洗涤后的沉淀物滤干；

H、干燥：将滤干后的沉淀物放入真空干燥器内干燥；

I、粉碎、过筛：将干燥后的多糖进行粉碎过筛（60—80目）。

其中，步骤C中，提取液（水）的用量为螺旋藻2－3倍，加热至煮沸，提取3－4个小时，步骤D中，分离机为碟片式离心机或三轴离心机配合管式离心机进行离心，步骤步骤E中，将液体浓缩至原体积1/3－1/5，步骤F中，酒精浓度为95%，加注量为浓缩后溶液的3－4倍，步骤G中，清洗液为95%—无水乙醇，次数为2－3次。

本发明的有益效果是，采用新鲜螺旋藻作为提取螺旋藻多糖的原料，与技术背景所描述的提取方法相比有以下几点益处：

（1）减少了螺旋藻烘干过程的设备添置、降低了能源消耗。

（2）与用螺旋藻粉提取多糖的方法相比，本发明一方面避免了螺旋藻藻粉在高温烘干过程中对多糖结构的破坏，另一方面避免了烘焦的现象，提高多糖的产出率和质量，减少脱色所需的酒精用量，可以大幅度降低生产成本提高品质。（3）本发明采用新鲜螺旋藻作为原料，无需添加任何化学试剂进行前处理，避免了化学残留。

附图说明

图1是生产工艺流程图。

具体实施方式

实施例一

将培养池中正常生长的螺旋藻捞起，倒在宽1米长5米孔径200目的筛子上滤去培养液。积累至25公斤左右时，将滤去水分和培养液的螺旋藻藻泥用自来水清洗5分钟，滤干，反复3次。

将制备好的螺旋藻藻泥放入直径65厘米高60厘米不锈钢加热锅内，加水2倍（50公斤）煮沸，搅拌提取3小时。（不锈钢加热锅可根据生产规模定制大小及数量，并应具备搅拌功能，与用螺旋藻粉提取多糖的工艺相比，省去了藻粉烘干的中间环节，节约了成本减少了烘干过程造成的藻粉炭化）。

冷却后将提取混合物注入碟片式离心机（我们选用的是南京绿洲机器厂生产的DBP-50型）进行固液分离，去除残渣，（具体操作按厂家使用说明书中的规定执行）液体部分保留备用。

将液体部分放入上述不锈钢锅内加热或真空蒸馏器内去除多余水分，浓缩至1／3体积后（冷却）备用。

将冷却后的浓缩液放入直径50厘米高50厘米的不锈钢桶中，加95%乙醇4倍，待凝聚物沉淀后（通常需24小时）去除上清液，将沉淀物（螺旋藻多糖）取出滤去多余乙醇。继续用95%乙醇洗涤2次，至上清液清澈无色为止，将洗涤后的沉淀物滤干。放入真空干燥器内干燥，将干燥后的多糖进行粉碎过筛（60-80目）。

实施例二

生产过程如图1所示。

1、以藻泥为原料，步骤如实施例一

C——将制备好的螺旋藻藻泥25公斤放入直径65厘米高60厘米不锈钢加热锅内，加水75公斤煮沸，搅拌提取4小时。

D——冷却后将提取混合物注入碟片式离心机进行固液分离，去除残渣，液体部分保留备用。共得多糖提取液35.6公斤。

E——将液体部分放入上述不锈钢锅内加热（或真空蒸馏器内）去除多余水分，浓缩至1／5体积后（冷却）备用。共得多糖浓缩液7.1公斤。

F——将冷却后的浓缩液放入直径50厘米高50厘米的不锈钢桶中，加无水乙醇28升，沉淀24小时后去除上清液，将沉淀物（螺旋藻多糖）取出滤去多余乙醇。

G——继续用无水乙醇洗涤，至上清液清澈无色为止，（每次28升，共3次）将洗涤后的沉淀物滤干。

H——将多糖沉淀物放入真空干燥器内干燥24小时。

I——将干燥后的多糖进行粉碎过筛80目。（共得多糖粉236克）

1、以藻粉为原料，步骤如实施例一

C——将螺旋藻藻粉2.5公斤放入直径65厘米高60厘米不锈钢加热锅内，加水100公斤煮沸，搅拌提取4小时。

D——冷却后将提取混合物注入碟片式离心机进行固液分离，去除残渣，液体部分保留备用。共得多糖提取液32.3公斤。

E——将液体部分放入上述不锈钢锅内加热或真空蒸馏器内去除多余水分，浓缩至1／5体积后（冷却）备用。共得多糖浓缩液6.5公斤。

F——将冷却后的浓缩液放入直径50厘米高50厘米的不锈钢桶中，加无水乙醇26升，沉淀24小时后去除上清液，将沉淀物（螺旋藻多糖）取出滤去多余乙醇。

G——继续用无水乙醇洗涤，至上清液清澈无色为止，（每次26，共5次）将洗涤后的沉淀物滤干。

H—将多糖沉淀物放入真空干燥器内干燥24小时。

I——将干燥后的多糖进行粉碎过筛80目。（共得多糖粉192克）

两种原料对比实验表：

10kg藻泥得1kg藻粉，从上表可以明显看出，用藻泥作为原料进行提取多糖，产量上比用藻粉为原料高出23%，所用的乙醇量比藻粉为原料少40%。两者之间差异极为显著。

两种原料，4组重复所得的螺旋藻多糖产量如下表：

方差分析

变异来源	df	SS	MS	F	F_0.01
						处理间	1	3890.9431	3890.9431	6012.16	13.74
误差	6	3.8831	0.6472
						总变异	7	3894.8262

经方差分析结果为极显著。

Claims

1.一种用新鲜螺旋藻生产螺旋藻多糖的方法，包括以下步骤：

D、分离：将提取后的混合物注入离心机；

E、浓缩：将液体部分加热浓缩，冷却备用；

H、干燥：将滤干后的沉淀物放入真空干燥器内干燥；

I、粉碎、过筛：将干燥后的多糖进行粉碎过筛；

其特征在于，步骤C中，提取液的用量为螺旋藻2－3倍，加热至煮沸，提取3－4个小时，步骤D中，分离机为碟片式离心机或三轴离心机配合管式离心机进行离心，步骤步骤E中，将液体浓缩至原体积1/3－1/5，步骤F中，酒精浓度为95%，加注量为浓缩后溶液的3－4倍，步骤G中，清洗液为95%—无水乙醇，次数为2－3次。